asti 31 ottobre/IC applicata

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Cromatografia Ionica Applicata – Versione 14
Cromatografia Ionica Applicata.
Un’introduzione
Dipl.- Ing. Claudia Eith
Prof. Dr. Maximilian Kolb
Prof. Dr. Andreas Seubert
Dr. Kai Henning Viehweger (Editor)
Monografia Metrohm
8.792.2001 d
8.792.2003 e
Traduzione a cura di Bellomi Sara e Ricci Loretta
–1–
4/15/2001
Sommario
1 Gli Autori
3
2 Introduzione
4
3 Parte Teorica
5
3.1
La storia e l’importanza della cromatografia ionica
5
3.2
Teoria della cromatografia
6
3.2.1
Classificazione e terminologia in cromatografia
6
3.2.2
Concetti teorici per descrivere il processo cromatografico.
9
3.3
Principi base della cromatografia ionica (IC)
13
3.3.1
Terminologia e classificazione in LC
13
3.3.2
Scambio ionico
14
3.3.3
Formazione di coppia ionica
15
3.3.4
Esclusione ionica
15
3.4
Modelli di ritenzione in cromatografia ionica
16
3.4.1
Modelli di ritenzione in cromatografia anionica.
17
3.4.2
Modelli di ritenzione in cromatografia cationica
22
3.5
I sistemi di rivelazione in cromatografia ionica
24
3.5.1
Metodi di rivelazione elettrochimici
25
3.5.2
Metodi di rivelazione spettroscopici
28
3.6
Fasi Stazionarie in cromatografia ionica
29
3.6.1
Panoramica delle fasi stazionarie più comuni
29
3.6.2
Fasi stazionarie per cromatografia anionica
31
3.6.3
Fasi stazionarie in cromatografia cationica
32
3.6.4
Scambiatori cationici basati su gel di silice
32
3.6.5
Scambiatori cationici basati su polimeri organici
32
3.6.6
Scambiatori cationici pellicolari
32
3.6.7
Fasi stazionarie in cromatografia di esclusione ionica
33
3.6.8
Il significato della capacità di uno scambiatore ionico
33
3.7
Eluenti in cromatografia ionica
34
3.7.1
Cromatografia anionica
34
3.7.2
Cromatografia cationica
37
4
Sezione sperimentale
Errore. Il segnalibro non è definito.
4.1
Informazioni pratiche di lavoro
40
4.2
Esperimenti che percorrono l'intera teoria sulla cromatografia ionica
43
4.2.1
Esperimento 1- cromatografia ionica con e senza soppressione chimica
43
4.2.2
Esperimento 2- Capacità di una colonna di separazione
46
4.2.3
Esperimento 3 - Selettività delle colonne di separazione
48
4.2.4
Esperimento 4- Calibrazione, limiti di rilevabilità e di determinazione in cromatografia
ionica
52
4.2.5
Esperimento 5- Alterazione della selettività con l'impiego di eteri corona (18 Crown-6) 55
4.2.6
Esperimento 6- Alterazione della selettività con l'impiego di agenti complessanti.
58
4.2.7
Esperimento 7- Tecnica di preconcentrazione
63
4.3
Esempi di determinazione di anioni
66
4.3.1
Esperimento 8- Anioni nell’ acqua potabile
66
4.3.2
Esperimento 9- Anioni nell’ etanolo e alcoolici
69
4.3.3
Esperimento 10- Anioni nella lattuga
75
4.3.4
Esperimento 11- Acido Fosforico nelle bevande della Cola
77
4.3.5
Esperimento 12- Acidi organici nel vino
82
4.3.6
Esperimento 13- Contaminanti nel borato- determinazione di cloruro e solfato in soluzioni
di borace
86
4.3.7
Esperimento 14- Anioni nelle acque di scarico
90
4.3.8
Esperimento 15-Determinazione del fuoruro nella pasta dentifricia
94
4.3.9
Esperimento 16- Anioni nello zucchero bianco e grezzo
97
4.3.10 Esperimento 17- Contaminanti nel perossido di idrogeno
101
4.4
Esperimenti di determinazione di cationi
107
4.4.1
Esperimento 18- Metalli alcalini e alcalini terrosi nell' acqua potabile
107
4.4.2
Esperimento 19- Determinazione di metalli di transizione
110
4.4.3
Esperimento 20- contaminanti nel gel di silice - determinazione di calcio e magnesio 115
4.4.4
Esperimento 21- Cosmetici
e protezione dalla corrosione: determinazione di
etanolammine e metalli alcalini
118
4.4.5
Esperimento 22- Metalli alcalini ed alcalino terrosi nel vino
121
5 Riferimenti bibliografici
125
–2–
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Gli Autori
Claudia Eith
Ha studiato chimica alla Fachhochschule di Aalen e frequentato un trimestre di applicazioni pratiche
nel settore di analisi delle acque potabili e di scarico ad Adelaide (Australia); dal 2000 lavora nella
divisione R&D di Metrohm AG.
Maximilian Kolb
Ha studiato chimica alla Technical University di Monaco, con una tesi nel settore della catalisi
Omogenea, in seguito per cinque anni ha coordinato la divisione per la qualità dell’acqua dell’autorità
competente di Traunstein. Dal 1982 è docente alla Fachhochschule di Aalen; si occupa di tecnologia
ambientale chemiometria e analisi ambientale.
Andreas Seubert
Ha studiato Chimica ad Hannover, laurea nel 1990: «Ultratrace analysis in highly pure refractory
metals with trace-matrix separation by ion chromatography». Riceve l’abilitazione nel 1995 con una
tesi dal titolo: «On-line HPLC-atomic spectrometry coupling applications in elemental analysis», Nel
periodo 1998 - 2000 è professore supplente di Chimica Analitica nell’Università di Kassel, dal Marzo
2000 tiene la medesima cattedra alla Philipps University di Marburg.
Kai Henning Viehweger
Ha studiato Chimica ad Amburgo, con una tesi nel settore dell’analisi inorganica. La tesi di laurea
riguardava la ricerca sui sistemi ecologici estuarini e marini. Dal1996 lavora per Metrohm AG sezione
Marketing come Responsabile internazionale vendite per la Cromatografia Ionica
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Introduzione
Lo studio delle cose che non si manifestano direttamente è sempre stata una sfida. Le ragioni di ciò
variano dalla semplice curiosità fino alle concrete esigenze della sopravvivenza. Ci sono parecchi
modi di sollevare il velo della conoscenza. Il più semplice è usare i nostri sensi: udito, tatto, olfatto,
gusto e vista. Fin dai primordi dell’Alchimia, questi erano gli strumenti di indagine. Per questo motivo
gli acidi hanno un sapore acido. Il Bromo deriva il suo nome dal greco bromos che significa fetido e lo
stesso vale per il Cromo che ad occhio nudo appare colorato ed infatti il suo nome deriva dalla radice
linguistica “chroma” che significa colore. Persino alcune interiezione degli alchimisti traggono la loro
origine dalle difficoltà di discernimento che i loro sensi incontravano nello studio della materia;
l’apostrofe “sei un cobalto” derivava dall’influsso negativo che la presenza di questo elemento aveva
sulla produzione del ferro.
Molte cose specifiche non sono visibili direttamente. O sono troppo mescolate, o i sensi umani non
sono in grado di percepirle. È a questo punto che entra in gioco l’analisi. Essa è in grado di estrarre
informazioni precise da miscele assolutamente omogenee di componenti, informazioni che non siamo
in grado di raccogliere con i soli sensi.
Un esempio di ciò è l’analisi degli ioni che sono parte integrante praticamente di ogni materiale vivente
o inanimato. L’organismo è pieno di queste piccole molecole cariche ma nessun senso umano ne ha
esperienza diretta. Gli ioni sono responsbili della trasmissione degli impulsi nervosi, assicurano il
processo digestivo, garantiscono il controllo della pressione sanguigna e del tasso di ossigeno nel
sangue. Il mare è salato e abbiamo sete perché ci sono gli ioni, e ancora sono i costituenti ionici che
sono alla base dell’alimentazione di ogni organismo vivente – dai batteri all’uomo.
La conoscenza della distribuzione degli ioni nell’ambiente è necessaria per lo studio dei meccanismi
ecologici e biochimici. Per esempio la concentrazione ionica in un alimento è un indice della sua
commestibilità.
Ci sono molte tecniche per la determinazione qualitativa (in base al tipo) e quantitativa ( in base alla
concentrazione) degli ioni. Una di queste è la Cromatografia Ionica. Cromatografia significa
sostanzialmente ”scrivere con i colori”. All’origine infatti l’analisi tradizionale separava e poi
determinava in modo visivo le sostanze in base al loro colore. Tuttavia non tutti gli ioni si
caratterizzano per colori visibili e comunque i metodi di determinazione sono oggi cambiati anche se il
nome della tecnica è rimasto lo stesso.
La Cromatografia ionica è solo una delle tecniche della grande famiglia dei metodi cromatografici. Per
semplificare possiamo dire che essa si applica all’analisi di ioni che trasportino una o due cariche.Per
il passato la Cromatografia Ionica o “IC” era una tecnica molto costosa ma oggi è diventata più
economica e per questo si è diffusa come uno strumento analitico universale e potente nella sua
semplicità.
Questo manuale di Cromatografia ionica applicata si propone di dimostrare che la IC non è un mero
riferimento analitico astratto ma un mezzo per fornire una risposta immediata a problemi pratici e
quotidiani come: Si può nutrire i bambini con la sola acqua potabile? Quanto nitrato troviamo negli
spinaci? Perché i lavaggi in lavatrice diventano ogni giorno più costosi? La nostra acqua di scarico è
inquinante?
Poiché un lavoro analitico pratico accurato è impossibile senza una base teorica in questa monografia
troverete informazioni dettagliate in una sezione separata dedicata alla teoria.
«Cromatografia Ionica Applicata» ha lo scopo di fornire i principi base dell’IC ma anche i princi
generali delle tecniche Cromatografiche. La Cromatografia può fare davvero molto: dal soddisfare
pienamente la curiosità scientifica fino a consentire la salvaguardia della salute in ambienti inquinati.
–4–
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3 Parte Teorica
3.1 La storia e l’importanza della cromatografia ionica
Gli inizi della Cromatografia Ionica (IC) o, più esattamante, della Cromatografia di scambio ionico
risalgono alla metà del secolo scorso. Tra il 1935 e il 1950 le conoscenze sugli scambiatori ionici e
sulle possibili applicazioni furono estese notevolmente grazie al “progetto Manhattan”. Negli anni ‘50 e
’60 furono messi a punto i modelli teorici per la comprensione del fenomeno dello scambio ionico e
della tecnica cromatografica che su di esso si basa. Negli anni ‘70 entrarono in uso i detectors continui
che permisero di ottenere un notevole sviluppo dalla tecnica cromatografica a bassa pressione a
quella ad alta prestazione.
Tabella 1 Storia degli scambiatori ionici e della cromatografia ionica, la tecnica analitica che si basa
sul loro impiego.
c.a. 1850
1935
2+
Terreni come scambiatori ionici per il Mg Thomson & Way
+
2+
Ca e NH4
Polimeri di condensazione solfonati e aminati Adams/Holmes
(fenolo/formaldeide)
1942
Resine PS/DVB solfonate come scambiatori D'Alelio
di cationi (Manhattan Project)
1947
Resine PS/DVB aminate come scambiatori di Mc Burney
anioni
1953
Cromatografia ad esclusione ionica
Wheaton, Baumann
1957
Scambiatori ionici macroporosi
Corte,Meyer, Kunin e co
1959
Principi teorici di base
Helfferich
1967-70
Scambiatori ionici pellicolari
Hovath, Kirkland
LC
HPLC
1975
Cromatografia di scambio ionico con Small,Stevens,Baumann
rivelazione conduttimetrica con l'impiego di
uno "stripper"
1979
Rivelazione conduttimetrica senza “stripper”
Gjerde,Fitz,Schmuckler
1976-80
Cromatografia di coppia ionica
Waters,Bidlingmeier,
Horvath e co.
Il termine “cromatografia ionica” fu inventato nel 1975 con l'introduzione della rivelazione
conduttimetrica associata ad un abbattimento chimico della conducibilità ad opera di Small, Stevens e
Baumann; esso fu in seguito utilizzato per lungo tempo a scopi di marketing come nome di marca.
Nel mentre, il termine abbreviato "cromatografia ionica" entrò nell'uso comune per indicare il gruppo di
tecniche che includeva la cromatografia a scambio ionico, ad esclusione ionica e di coppia ionica,
tutte comunque incluse nella grande famiglia delle tecniche di cromatografia liquida ad alta
prestazione (HPLC) [1]. La IC è predominante oggigiorno come tecnica per la determinazione degli
anioni, mentre per la determinazione dei cationi rimane privilegiata la tecnica dell'assorbimento
atomico spettrofotometrico che è però poco adatta per la determinazione dei precursori elettronegativi
di anioni dal 5° al 7° gruppo del sistema periodico degli elementi.
Il più importante campo di applicazione per la cromatografia anionica è oggi l'analisi di routine dei
sistemi acquosi, di importanza vitale nel controllo delle acque potabili [2,3,4]. La IC viene applicata
anche per la determinazione delle specie elementari nei complessi anionici, cosa che è molto
importante in ambito ambientale. Il terzo grande campo di applicazione per la cromatografia anionica
è l'analisi di ultratracce nei processi chimici ultrapuri richiesti dall'industria dei semiconduttori.
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Gli scambiatori ionici più diffusi in HPLC sono polimeri a particelle sferiche con diametro compreso tra
5 e 15 Ym. Vari metodi vengono impiegati per funzionalizzare con opportuni "gruppi ancora" la
superficie polimerica, la funzione di questi gruppi è di distanziare le catene polimeriche in modo da
non limitare le prestazioni dei gruppi funzionali di scambio ionico presenti sulle catene stesse. Il
numero totale di gruppi funzionali è indicato come capacità dello scambiatore ed è una caratteristica
fondamentale dello scambiatore stesso.
I materiali di produzione commerciale per l’impiego in cromatografia ionica hanno in genere una bassa
capacità, compresa tra 50 e 100 Ymol per colonna. La ragione di ciò è legata al fatto che il sistema di
rivelazione più diffuso per gli ioni è quello a conducibilità. Esso richiede che il sistema dell’eluente
abbia una conducibilità bassa per garantire una alta sensibilità nella rivevazione degli analiti. Ora, con
resine a bassa capacità si possono impiegare per l’eluizione dalla colonna soluzioni acquose anche
molto diluite di NaOH o di tampone carbonato/bicarbonato riducendo così la conducibilità la quale può
essere ulteriormente diminuita con i sistemi di soppressione chimica [2,4].
I gruppi funzionali più importanti in cromatografia anionica sono il Tipo I (TMA, trimetilammonio-) e il
Tipo II (DMEA, dimetiletanolammonio-). La struttura dei gruppi funzionali ha un’influenza decisiva sul
comportamento selettivo del materiale di impaccamento della colonna perchè l’interazione tra la fase
stazionaria e gli anioni dell’analita ha luogo proprio sul gruppo funzionale. Allo stadio attuale delle
nostre conoscenze sembra che la polarità dei gruppi funzionali, dipendente dal numero di catene
idrossietileniche (-CH2CH2OH) legate all’azoto quaternario, sia un fattore chiave [2,4].
Con il termine cromatografia ionica ci si riferisce, in maniera abbastanza generale a tutte le tecniche
HPLC con rivelazione on-line per la separazione di specie ioniche, indipendentemente dal tipo di
apparecchiatura strumentale che si utilizza [5]. Ma è la cromatografia ionica per l’analisi degli anioni
che ha avuto lo sviluppo maggiore grazie anche alla grandissima varietà di colonne di separazione,
sistemi di eluizione, e detector che sono attualmente disponibili per effettuare l’analisi. La ragione di
questo sviluppo va ricercata nel fatto che esistono pochi altri processi abbastanza semplici di
separazione degli anioni. I metodi gravimetrici e volumetrici sono limitati sia in sensibilità che in
selettività. La gascromatografia, che pure ha avuto grande sviluppo a partire dal 1965 non ha portato
grosse rivoluzioni nella determinazione degli anioni, e questo perché in gascromatografia è necessario
derivatizzare gli ioni non volatili, procedura che ha un riflesso negativo sulla sensibilità del metodo
rendendolo inadatto all’analisi di tracce [6].
D’altro canto per quanto riguarda l’analisi di cationi, esistono alternative alla IC estremamente potenti,
come ad es. le tecniche spettrofotometriche come la ICP-AES/MS. Per questo motivo l’importanza
della cromatografia cationica è trascurabile rispetto alla anionica anche se in alcune applicazioni come
la determinazione dei metalli alcalini, degli alcalino terrosi e dell’azoto ammoniacale nelle acque
potabili, ha una certa importanza. Infine per lo studio della speciazione dei composti ionici in
combinazione con gli opportuni detectors elemento-specifici diviene una tecnica irrinunciabile. Una
panoramica completa delle applicazioni IC nei vari settori si può trovare nei lavori di Haddad et.al. e di
Weiss [2,4].
3.2 Teoria della cromatografia
3.2.1 Classificazione e terminologia in cromatografia
La cromatografia è un metodo chimico-fisico di separazione di sostanze presenti in una miscela.
L’effetto di separazione viene ottenuto attraverso una serie ripetuta di distribuzioni successive delle
sostanze in miscela tra due fasi, una fase stazionaria e l’altra mobile [7,8].
Le tecniche cromatografiche vengono classificate in base allo stato fisico di queste due fasi:
Figura 1
mobile.
Classificazione dei metodi cromatografici in base allo stato fisico delle fasi stazionarie e
Un’ulteriore classificazione può esser fatta in base alla natura del processo principale responsabile
della separazione, per esempio l’adsorbimento o la ripartizione, o in base al tipo di supporto
cromatografico (in colonna o piano) [9].
–6–
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Parametri di ritenzione.
Quando si separa cromatograficamente una miscela di sostanze si realizza un equilibrio di
distribuzione tra la fase stazionaria e quella mobile che è diverso per ogni componente presente nella
miscela. La separazione è efficiente solo se i coefficienti di distribuzione D dei singoli componenti
sono abbastanza diversi tra loro. D viene definito come il rapporto di concentrazione di una sostanza
A ripartito tra la fase stazionaria (indice S) e la fase mobile (indice M).
DA =
[A] S
[A] M
(1)
Perciò sostanze con un coefficiente di distribuzione D elevato saranno trattenute in colonna più
fortemente di quelle con coefficienti più piccoli. La separazione cromatografica viene rappresentata a
mezzo di cromatogrammi che riportano il segnale del detector, proporzionale alla concentrazione o
profilo di massa degli analiti, in funzione o del volume di eluizione della fase mobile o del tempo [8].
Come si evidenzia nell'equazione 2, il tempo totale di residenza tR di una sostanza nella fase
stazionaria è la somma del tempo di ritenzione netto tS che corrisponde al reale tempo di residenza
lungo il percorso di migrazione, e del tempo di percorrenza della fase mobile non soggetta ad alcuna
interazione o tempo morto tM.
tR = t S + tM
(2)
A causa della formazione di canali preferenziali, processi di diffusione o irregolarità nell'equilibrio
raggiunto tra le fasi mobile e stazionaria, alcuni analiti possono passare attraverso la fase stazionaria
più lentamente o più rapidamente rispetto al loro tempo di ritenzione netto tS. Questo significa che un
cromatogramma sarà costituito nel caso ideale da picchi Gaussiani (Figura 2).
Figura 2
Cromatogramma di eluizione di una separazione in cromatografia ionica con indicazione
delle grandezze più importanti.
Come risultato della diffusione, che aumenta al crescere del tempo di residenza in fase stazionaria, la
larghezza del picco di una sostanza aumenta con il tempo di ritenzione. Questo fenomeno è
caratteristico di tutti i metodi cromatografici.
Come già detto, nel caso ideale un picco cromatografico ha una distribuzione Gaussiana. Nella figura
3 si vede un esempio di distribuzione Gaussiana.
–7–
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Figura 3
Grandezze più importanti in una distribuzione Gaussiana.
L'ampiezza a metà altezza del picco si chiama mezza ampiezza b0,5, e corrisponde a 2,354 volte la
varianza
della distribuzione. L’ampiezza di base w è definita come la differenza tra i punti di
intersezione delle tangenti alla curva con l'asse y prese in modo che w equivalga a 4 volte la varianza
della funzione di Gauss. Entrambe le quantità sono una misura della prestazione di una colonna di
separazione cromatografica e, nel caso di un picco di forma ideale, possono essere usate per
calcolatore il numero di piatti teorici.
Lo scostamento dalla forma ideale del picco può essere descritto con il fattore di asimmetria T.
Questo è definito come il rapporto tra le distanze A e B tra l'asse centrale ed i lati della distribuzione al
10% della loro altezza (Figure 2 e 3) e può essere calcolato con la formula:
T=
B
.
A
(3)
Per picchi Gaussiani risulta T= 1. Una variazione verso un valore di T più grande corrisponde ad un
picco descritto dal termine “tailing”, mentre se T tende a valori inferiori il picco viene definito “fronting”.
In pratica si cerca di lavorare con un fattore d'asimmetria da T= 0.9 a 1.1.
Fattore di ritenzione, selettività e risoluzione
Poichè il tR, tempo di ritenzione totale, dipende largamente dalle condizioni cromatografiche, è solo
sotto precise condizioni che è caratteristico di una sostanza particolare e quindi tale da poter essere
usato per la sua identificazione qualitativa. Si introduce una grandezza adimensionale, il fattore di
ritenzione k’ che permette paragoni tra sistemi cromatografici diversi. Esso fornisce informazioni su
quanto più a lungo una sostanza rimane nel percorso di migrazione o nella fase mobile [8]. Il fattore di
ritenzione è matematicamente definito come il prodotto tra il coefficiente di distribuzione D ed il
rapporto tra i volumi della fase stazionaria e mobile, oppure come il rapporto tra il tempo di ritenzione
netto e il tempo morto. E' possibile anche eseguire il calcolo utilizzando la lunghezza della distanza di
migrazione L e la velocità u della fase mobile (Equazione 4):
k' = D
VS
t
u tR
= S =
-1
VM
tM
L
(4)
Per valori piccoli di k’ una sostanza eluisce vicino al tempo morto o al volume morto del sistema
cromatografico; questo significa che la separazione sarà povera. Se k’ è molto grande questo implica
che, sebbene la separazione risulti buona, il tempo di residenza nel percorso di migrazione è lungo ed
il picco diviene più largo. Nel caso Ideale il fattore di ritenzione dovrebbe essere tra 2 e 5.
–8–
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Due sostanze saranno separate adeguatamente solo se i loro fattori di ritenzione differiscono l'uno
dall'altro sufficientemente. Il coefficiente di selettività , anche noto come fattore relativo di
separazione, è una misura della separabilità di due sostanze ed è definito come segue:
(5)
Se due sostanze non possono essere separate allora = 1 e si ha coeluizione. Più grande è il valore
di , migliore risulta la separazione. Comunque, con l'aumento di anche il tempo richiesto per la
separazione aumenta, così in pratica si ricercano coefficienti di selettività intorno ad = 1.5 [10].
Il coefficiente di selettività non descrive la qualità della separazione. La risoluzione R invece non
tiene conto solo delle posizioni relative dei picchi, ma anche dei valori della mezza ampiezza (b0,5) e
della base (w), come si può vedere nell'quazione 6.
(6)
Se la differenza tra i tempi di ritenzione di due picchi è grande in relazione alle loro basi o mezze
ampiezze allora la risoluzione è buona. Se si presume una simmetria del picco ideale, due sostanze
con R= 0.5 risultano ancora ben separate. Per una separazione qualitativa R dovrebbe essere 1
(separazione - 4 ), per la quantificazione si ricerca una risoluzione tra R = 1.2 e 1.5 [25]. Risoluzioni
intorno ad R = 2 (separazione - 8 ) sono da evitare perchè i tempi d'analisi sarebbero troppo lunghi.
3.2.2
Concetti teorici per descrivere il processo cromatografico.
Il modello teorico della separazione a stadi
Il modello teorico della separazione a stadi si rifà ai modelli per il processo di distillazione [11]. Si
divide la fase stazionaria in sezioni singole, gli stadi della separazione o piatti teorici, sui quali in teoria
si realizza un equilibrio completamente reversibile e molto rapido tra la fase mobile e quella
stazionaria e che viene raggiunto istantaneamente. Perciò la prestazione (efficienza) di un sistema
cromatografico migliora quanto più alto è il numero di stadi teorici della separazione .
Il numero di piatti teorici N può essere determinato direttamente dal cromatogramma usando la
varianza oppure l'ampiezza di base e la ampiezza a metà altezza ed si calcola come segue [12]:
t
N = 16 R
w
2
= 8 ln (2)
tR
b 0,5
2
=
tR
2
(7)
Invece del numero di piatti teorici si può descrivere la prestazione della colonna di separazione con
l'altezza equivalente del piatto teorico HETP:
(8)
Dalle equazioni 5 - 8 si può vedere che una fase stazionaria con un numero molto grande di piatti
teorici può separare anche sostanze i cui coefficienti di selettività o risoluzione differiscano di poco. Le
equazioni permettono anche il calcolo del numero di piatti teorici che è necessario per risolvere un
problema di separazione.
Il modello teorico della separazione a stadi può essere usato per spiegare la registrazione di picchi
Gaussiani, infatti si presume che, a causa del flusso e dei processi di diffusione, verrà raggiunto solo
un equilibrio non istantaneo e perciò incompleto tra le fasi mobile e stazionaria. Questo implica un
processo di allargamento del picco in modo che se una sostanza interessa una stretta zona all'inizio
–9–
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del percorso di migrazione chiaramente investe una zona sempre più larga al crescere del tempo di
residenza nella fase stazionaria.
Il calcolo del numero di piatti teorici secondo l' equazione 7 presume che la forma del picco sia ideale;
tuttavia, questo raramente accade in realtà. Con forme di picco asimmetriche il calcolo deve essere
eseguito secondo il metodo dei momenti [13]. L’Equazione 9 tiene conto del fattore di asimmetria e
produce valori approssimati più sensati.
N = 41,7
tR
b 0,5
2
(9)
T + 1,25
Un numero di piatti effettivi n, che rappresenta l'efficienza della separazione reale più da vicino del
numero di piatti teorici N, si ottiene con la correzione data dal fattore di ritenzione [k''] e si calcola
come segue:
n =N
k'
k'+1
2
(10)
La teoria dinamica ( teoria di Van Deemter)
Il punto debole del modello teorico della separazione a stadi è che la distillazione e la cromatografia si
basano su due processi fisico-chimico completamente diversi. Inoltre nessuna considerazione viene
fatta sull'influenza di parametri importanti che sono sperimentalmente accessibili e che non dipendono
dal tipo o dalla qualità della fase stazionaria [14, 15]. Questi potrebbero essere:
• velocità di flusso della fase mobile
• diametro delle particelle nella fase stazionaria
• spessore dello strato di films sulla superficie del materiale di impaccamento
Inoltre grandezze come i coefficienti di diffusione nelle fasi mobile e stazionaria, la temperatura o il
volume del detector sono molto importanti per l'efficienza della separazione in cromatografia liquida.
La teoria dinamica sviluppata daVan Deemter è, in teoria, una estensione del modello teorico della
separazione a stadi che tiene conto dei limiti delle condizioni non-ideali [16]. Le assunzioni che si
fanno sono le seguenti:
• non si ha il raggiungimento dell'equilibrio
• si hanno ritardi nel trasporto di massa nelle fasi stazionaria e mobile
• nessuna velocità omogenea di flusso nella fase mobile attraverso l'intera sezione trasversale
della colonna
• si verificano fenomeni di diffusione adirezionali e formazione di canali nella fase stazionaria
• si ha diffusione longitudinale indipendente dalla velocità della fase mobile e direttamente
proporzionale al tempo di residenza nel cammino di migrazione
La relazione tra gli effetti dinamici menzionati sopra e l'altezza equivalente di un piatto teorico è data
dall' equazione di Van Deemter:
HETP = A +
B
+C u
u
(11)
I tre termini A, B e C dipendono in modi diversi dalla velocità del flusso u della fase mobile. I termini A
e B descrivono l'intero trasporto di massa attraverso la fase stazionaria; il termine C è determinato
dalle interferenze al raggiungimento dell'equilibrio tra le fasi mobile e stazionaria.
Il termine A descrive la diffusione vorticosa, che può essere considerata la causa dell'allargamento
del picco dovuto all'effetto dei percorsi multipli. Questo termine è noto anche come fattore di
impaccamento ed è indipendente della velocità del flusso lineare u della fase mobile, almeno in prima
approssimazione. La relazione seguente si applica ad A:
A=2
dp
(12)
Nell'Equazione (12) dp è il diametro medio delle particelle nella fase stazionaria e
descrive
l'irregolarità statistica dell'impaccamento che dovrebbe essere il più omogeneo possibile e consistere
di particelle uniformi.
Il termine B descrive la diffusione longitudinale nel verso o contro la direzione di flusso della fase
mobile. E’ di particolare importanza per le colonne capillari usate in gascromatografia (GC), perchè i
coefficienti di diffusione nei gas sono più alti che nei liquidi di un fattore 4 o 5 della potenza di dieci. B
– 10 –
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è calcolato come il prodotto del coefficiente di diffusione nella fase mobile DM ed il fattore di tortuosità
o ostruzione , che descrive la porosità della fase stazionaria.
B=2
DM
(13)
Poichè l'importanza della diffusione decresce al crescere della velocità del flusso della fase mobile
questo implica che B è inversamente proporzionale a u.
Il termine C è noto come termine di trasferimento di massa. Il ritardo nel trasferimento di massa tra la
fase mobile e stazionaria di solito ha una grande influenza sull'allargamento del picco. Le Interferenze
al raggiungimento dell'equilibrio tra le fasi mobile e stazionaria sono più pesanti se “u” aumenta, cosa
che viene espressa nella formula con una proporzionalità diretta con la velocità del flusso lineare. I
ritardi nel trasferimento di massa dipendono dal fatto che i coefficienti di diffusione nella fase
stazionaria DS sono molto inferiori se paragonati a quelli della fase mobile; questo è il motivo per cui le
particelle che sono residenti nei pori della fase stazionaria sono maggiormente ritardate rispetto al
massimo del picco man mano che esso procede con la fase mobile. Il termine C può essere ridotto
notevolmente se il cammino di diffusione è corto e il processo di trasferimento è rapido. Questo si può
ottenere principalmente localizzando i pori sulla superficie del materiale di riempimento così che solo
pochi si trovino effettivamente nell'interno della fase stazionaria. Il termine C di trasferimento di massa
si calcola come segue:
C=
16 k'
dp 2
(1 + k') D S
(14)
La rappresentazione grafica dell'equazione di van Deemeter mostra una curva iperbolica, dal cui
punto di minimo si ricava la velocità di flusso u corrispondente alla minima altezza dei piatti teorici
(numero massimo di piatti) (Figura 4).
Figura 4
Rappresentazione dei singoli termini della teoria di Van Deemter e della curva risultante
dalla quale si può calcolare la velocità ottimale di flusso.
Anche la teoria dinamica si basa su presupposti ideali. In realtà i tre termini A, B e C sono indipendenti
fra loro solo in prima approssimazione, esiste un'influenza addizionale della velocità del flusso u sulla
diffusione vorticosa (Termine A). Il Termine C può essere suddiviso in due termini CM e CS, che
descrivono il trasferimento di massa dalla fase mobile (CM) nella fase stazionaria e viceversa (CS).Per
questi motivi l'equazione di Van Deemter originale è stata modificata per numerose applicazioni in
HPLC, GC e TLC [17, 18].
Cromatografia liquida moderna (LC)
La cromatografia liquida LC va intesa come un termine generico per indicare i numerosi metodi di
separazione della moderna cromatografia liquida. Può essere usata per una grande varietà di
sostanze ed è caratterizzata da una efficienza analitica eccellente. La LC include anche la
cromatografia ionica (IC) che è attualmente il metodo di separazione più importante usato nella
chimica analitica moderna [3].
L' HPLC rappresenta uno sviluppo ulteriore della cromatografia classica liquida (LC). In LC classica,
introdotta da Tswett nel 1906, le colonne erano di vetro con un diametro da 1 a 5 cm ed una
lunghezza fino a 500 cm; queste venivano riempite con fasi di separazione con particelle di dimensioni
comprese tra 150 e 200 Ym. Anche separazioni di miscele semplici di sostanze potevano richiedere
spesso diverse ore con un'efficienza di separazione media. Con la comprensione del processo
– 11 –
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cromatografico che si raggiunse in seguito (Equazione 11) divenne chiaro che un aumento dell'
efficienza si poteva ottenere solo con una riduzione drammatica del diametro delle particella della fase
stazionaria; tutavia, questo ha comportato una revisione completa dell'equipaggiamento usato per la
cromatografia.
A partire dal 1970 è divenuta disponibile una tecnologia strumentale sufficientemente sofisticata per
gestire le alte contropressioni dell'ordine dei 10-50 MPa che sono necessarie quando si usano
materiali d'impaccamento costituiti da particelle con diametri da 3 a 10 Ym e colonne di separazione di
lunghezze da 125 a 250 mm x ID di 4 mm.
Come risultato della drammatica miniaturizzazione l’HPLC è diventata un metodo di separazione
puramente analitico; in contrasto la LC classica oggi viene praticamente usata solo a scopi preparativi.
I vantaggi principali della HPLC in paragone alla LC classica sono:
•
•
•
•
•
•
efficienza cromatografica eccellente
processo in continuo
rivelazione in linea delle sostanze separate
alta sensibilità e riproducibilità
utilizzazione del tempo di ritenzione per l'identificazione qualitativa delle sostanze
tempi d'analisi brevi
Indipendentemente dal campo di applicazione, un sistema HPLC consiste principalmente dei
componenti mostrati in Figura 5: la pompa ad alta prestazione con il serbatoio per la fase mobile
(eluente), l'iniettore (sistema d’introduzione del campione), la colonna di separazione e il sistema di
rilevazione (inclusa la derivatizzazione, l'acquisizione dei dati e l'elaborazione).
Figura 5
Configurazione dell'unità HPLC o IC con l'illustrazione delle componenti più importanti.
A parte la colonna di separazione, la pompa è il cuore di ogni sistema HPLC. Deve potere trasportare
l'eluente in modo uniforme, costante e con pulsazioni minime, anche lavorando con contro-pressioni
alte. Questo significa che è necessario usare un iniettore di campione speciale con un apposito loop.
Per questo scopo si usa normalmente una valvola a sei vie; il sistema è in grado di riempire di
campione il loop che ha un volume definito e lavora a pressione standard e quindi di trasferirlo al
sistema HPLC funzionante ad alta pressione . La composizione della fase mobile ed il tipo di colonna
di separazione devono essere adattate al problema analitico da risolvere. Questo dicasi anche per la
scelta del sistema di rilevazione. Oggigiorno tutta la parte di acquisizione dei dati e di elaborazione è
eseguita a computer. Questa configurazione di base di un sistema HPLC può essere esteso
virtualmente a piacere per risolvere ogni problema analitico particolare.
Principi di separazione in cromatografia liquida.
Una classificazione delle tecniche HPLC può essere fatta in base alla diversa natura fisico-chimica
dell'interazione tra le sostanze nel campione e la fase stazionaria. Benchè in realtà esistano di solito
diversi meccanismi responsabili della buona riuscita di una separazione [9], si può fare una
classificazione sommaria in rapporto ai meccanismi di separazione seguenti:
•
•
•
adsorbimento
ripartizione
esclusione dimensionale
– 12 –
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•
•
•
•
affinità
scambio ionico
formazione di coppia ionica
esclusione ionica
La cromatografia di adsorbimento è caratterizzata da reazioni di interfaccia, in cui una sostanza
liquida o gassosa subisce un arricchimento in fase solida. Modelli diversi sono disponibili per fornire
una descrizione qualitativa e quantitativa dei processi di adsorbimento; in questa sede forniremo solo i
riferimenti alla letteratura della chimica-fisica attinente [19]. Vengono comunemente distinte due
tecniche diverse. Nella cromatografia a fase normale la fase stazionaria è di solito gel di silice e perciò
notevolmente più polare della fase mobile (generalmente idrocarburi). In cromatografia di fase inversa
le condizioni sono esattamente l'opposto. Per ragioni pratiche che concernono principalmente la
manipolazione dell'eluente, oggi viene usata praticamente solo la RPC [3, 9].
Nella cromatografia di ripartizione la fase stazionaria è un liquido che è immiscibile con la fase
mobile. La separazione si basa sulla differenza di solubilità degli analiti nelle due fasi. Nel caso ideale
la legge di Nernst regola la ripartizione. Questo meccanismo di separazione gioca un ruolo
importante, particolarmente in gas-cromatografia dove le colonne capillari sono rivestite con liquidi di
separazione che vengono usati come fase stazionaria. La cromatografia di ripartizione può entrare in
gioco anche in HPLC se la fase stazionaria di gel di silice viene modificata con idrocarburi non-polari,
come le cosidette fasi octadeciliche.
La cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) realizza la separazione in ragione delle
dimensioni molecolari come risultato di un effetto di setaccio. Gel di silice o resine polimeriche
organiche con una definita struttura porosa vengono usate come fase stazionaria. Gli analiti più piccoli
possono diffondere nei pori e vengono così rallentati. Al crescere delle dimensioni della molecola la
interazione con i pori diviene meno probabile, fino a quella dimensione molecolare che viene esclusa
completamente dai pori e praticamente eluisce nel volume morto della colonna. La SEC è molto usata
nello studio dei polimeri e in analisi biologica.
La cromatografia di affinità realizza la separazione di miscele di sostanze sulla base di forze di
interazione selettive o specifiche. Interazioni molto specifiche possono essere osservate tra anticorpi
ed antigeni (teoria della chiave - buco della serratura), così come con gli enzimi i loro substrati. In
pratica gli enzimi o gli anticorpi vengono chimicamente immobilizzati sulla fase stazionaria. Se c'è il
substrato o l'antigene corrispondente nel campione allora esso viene rallentato con selettività estrema.
Per queste ragioni la cromatografia di bioaffinità è indispensabile nel settore dell'analisi di sostanza
attive (farmacologia).
La cromatografia di scambio ionico (IC) quella di coppia ionica e la cromatografia di esclusione
ionica verranno trattate in dettaglio nella sezione seguente.
3.3 Principi base della cromatografia ionica (IC)
3.3.1 Terminologia e classificazione in LC
La cromatografia di scambio ionico o cromatografia ionica (IC) è una tecnica HPLC. Secondo la
convenzione IUPAC la cromatografia di scambio ionico si definisce come segue [7, 8]:
"La separazione in cromatografia di scambio ionico si basa su differenze nella affinità di scambio
ionico dei singoli analiti. Se vengono separati ioni inorganici e possono essere rilevati da un detector
a conducibilità o attraverso una rilevazione UV indiretta anche in questi casi si parla di cromatografia
ionica."
Per diverse ragioni questa definizione è una scelta infelice. La tecnica di rilevazione dovrebbe essere
tenuta distinta dal meccanismo di separazione. Inoltre, la limitazione del termine “cromatografia
ionica” a ioni inorganici è difficilmente comprensibile visto che in pratica in ogni sistema ioni organici
ed inorganici sono presenti contemporaneamente e soprattutto possono essere separati ed identificati
simultaneamente.
Una definizione più vecchia, generale e più appropriata per definire la cromatografia ionica [20] è la
seguente:
"La cromatografia ionica include tutte le separazioni cromatografiche rapide in fase liquida di
ioni eseguite in colonne accoppiate con sistemi di rilevazione e quantificazione a flusso posti
in linea."
– 13 –
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Questa definizione caratterizza la cromatografia ionica indipendentemente dal meccanismo di
separazione e dal metodo di rilevazione e allo stesso tempo la distingue dallo scambio ionico classico.
I meccanismi di separazione seguenti sono caratteristici della cromatografia ionica:
•
•
•
scambio ionico
formazione di coppia ionica
esclusione ionica
I singoli metodi cromatografici si distinguono in base al meccanismo di separazione principale usato.
In pratica la cromatografia di scambio ionico è chiamata più semplicemente cromatografia ionica (IC),
mentre la cromatografia di coppia ionica (IPC) e la cromatografia di esclusione ionica (IEC) vengono
considerate sue applicazioni più specializzate.
3.3.2 Scambio ionico
La cromatografia di scambio ionico (IC) si basa sulla reazione chimica stechiometrica tra ioni in
soluzione e, normalmente sulla presenza di una sostanza solida dotata di gruppi funzionali in grado di
fissare ioni come risultato di forze di interazione elettrostatiche. Nel caso più semplice per la
cromatografia cationica si tratta di gruppi solfonici mentre per la cromatografia anionica si usano
gruppi ammonici quaternari. In teoria ioni con la stessa carica dovrebbero essere scambiati in modo
completamente reversibile tra le due fasi. Il processo di scambio ionico conduce a una condizione di
equilibrio. La direzione verso cui l'equilibrio si sposta dipende dall'affinità degli ioni coinvolti verso i
gruppi funzionali della fase stazionaria. La Figura 6 mostra il diagramma schematico dei processi di
scambio per cationi ed anioni. Gli ioni dell'analita vengono indicati con A mentre gli ioni dell'eluente
che competono con essi per le posizioni di scambio vengono indicati con E.
Figura 6
Rappresentazione schematica del processo di scambio ionico in cromatografia ionica.
A sinistra: scambio cationico, a destra: scambio anionico
Aspetti termodinamici del processo di scambio ionico
Gli scambiatori ionici normalmente sono costituiti di una fase solida alla cui superficie sono fissati dei
gruppi ionici come conseguenza della condizione di elettroneutralità che prevede sempre un
controione di carica opposta nelle vicinanze del gruppo funzionale. Il controione di solito proviene
dalla fase mobile ed è perciò anche chiamato ione dell'eluente.
-
-
Se viene introdotto un campione di analita che contiene due ioni A e B , questi entrano in
competizione rapidamente con gli ioni dell'eluente E e verranno trattenuti nei pressi della carica fissa
prima che vengano a loro volta scalzati dallo ione dell'eluente. In cromatografia anionica si verificano i
seguenti equilibri reversibili:
resin - N+R3 E– + A–
resin - N+R3 A– + E–
(15)
resin - N+R3 E– + B–
resin - N+R3 B– + E–
(16)
-
-
Se le affinità di A e B ai gruppi funzionali sono diverse allora la separazione è possibile. La costante
di equilibrio KA è nota anche come coefficiente di selettività e per lo ione A si calcola come segue :
– 14 –
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(17)
Assumendo che la concentrazione degli ioni dell'eluente sia più alta di quella degli ioni dell'analita e
che differiscano di diverse potenze di dieci si può considerare [E ] costante nelle fasi mobile e
stazionaria. Questo implica che si può calcolare il coefficiente di distribuzione DA (Equazione 1) ed il
fattore di ritenzione k'A (Equazione 4). Più rigorosamente, tali calcoli sono corretti se le concentrazioni
nell' Equazione 17 vengono sostituite con le attività; altrimenti la formula è valida in condizioni di
diluizione infinita [19]. In linea di principio le attività degli ioni nella fase stazionaria non sono
determinabili [4]. Per gli scambiatori ionici di bassa capacità che vengono impiegati più di frequente,
per i quali si deve usare come fase mobile soluzioni di elettroliti molto diluite, le attività possono
essere trascurate. Tali approssimazioni molto grossolane sono del tutto errate per materiali di
impaccamento ad alta capacità (> 200 [mmol]/ g) e con eluenti concentrati; questi mostrano chiare
variazioni dal comportamento "ideale".
3.3.3 Cromatografia di coppia ionica
Con la cromatografia di coppia ionica è possibile separare gli stessi analiti della cromatografia di
esclusione ionica, ma il meccanismo della separazione è completamente diverso. Le fasi stazionarie
impiegate sono materiali a polarità completamente invertita rispetto a quelli usati in cromatografia di
ripartizione. All’eluente viene aggiunto un reagente di coppia ionica quali ad es. tensioattivi anionici o
cationici come i sali di tetra-alchilammonio o di acidi n-alchilsolfonici. Insieme con gli ioni di carica
opposta dell'analita il reagente di coppia ionica forma una coppia ionica neutra, che viene rallentata
nella fase stazionaria da interazioni di tipo idrofobico. La separazione si realizza in virtù delle diverse
costanti di formazione della coppia ionica e dei loro diversi gradi di adsorbimento. La Figura 7 mostra
un modello semplificato di scambio ionico statico in cui si presume che le interazioni con l'analita
abbia luogo solo dopo l'adsorbimento del reagente di coppia ionica nella fase stazionaria.
Figura 7
Illustrazione schematica del modello statico di scambio ionico in cromatografia di coppia
ionica (IPC). Il principio di separazione si applica sia agli anioni che ai cationi.
3.3.4 Esclusione ionica
La cromatografia di esclusione ionica (IEC) viene usata principalmente per la separazione di acidi o
basi deboli [2,4]. Di particolare rilievo è l'uso della IEC nell'analisi di acidi deboli come gli acidi
carbossilici, i carboidrati, gli acidi fenolici o amminici. La Figura 8 illustra il principio di separazione in
IEC usando come esempio un acido carbossilico R- COOH .
– 15 –
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Figura 8
(IEC)
Esclusione di Donnan come principio di separazione in cromatografia di esclusione ionica
Come materiale di impaccamento in IEC generalmente si utilizza uno scambiatore di cationi
completamente solfonato i cui gruppi acidi solfonici sono elettricamente neutri e i cui controioni sono
protoni. In eluenti acquosi i gruppi funzionali sono idratati e formano una sorta di membrana caricata
negativamente (membrana di Donnan). Tale membrana può essere attraversata solo da molecole
neutre o non-dissociate come l'acqua. Gli acidi organici carbossilici possono essere separati solo
usando come fase mobile acidi minerali forti come l'acido solforico. A causa del basso valore delle
costanti acide (valori di pKA) degli acidi carbossilici questi sono presenti in forma praticamente
indissociata anche in eluenti fortemente acidi e perciò possono attraversare la membrana di Donnan
e venire adsorbiti sulla fase stazionaria, mentre gli ioni solfato provenienti dalla dissociazione
completa dell'acido solforico sono esclusi.
La Figura 9 illustra la tipica dipendenza del volume di eluizione di un acido dal suo valore di pKA in
presenza di una separazione di esclusione ionica. Si possono riconoscere chiaramente l'adsorbimento
sovrapposto (catene lunghe di acidi carbossilici, H2S) ed i limiti della finestra pratica di lavoro.
Nell'esempio finale gli acidi carbossilici si separano per la differenza nei valori delle loro pKA.
Figura 9
Dipendenza del volume di eluizione dal valore della pKA degli acidi in cromatografia di
esclusione ionica
3.4 Modelli di ritenzione in cromatografia ionica
Nel caso ideale la ritenzione di un analita in cromatografia ionica è determinata solo dalla sua affinità
verso i gruppi funzionali dello scambiatore di ioni. Questa affinità può essere descritta con una
reazione chimica, la reazione di scambio ionico, e può essere spiegata tramite la legge di azione di
massa.
– 16 –
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Con i modelli di ritenzione descritti di seguito si tenta di fare predizioni basate sulla legge di massa sul
comportamento nei confronti della ritenzione di analiti presenti in particolari condizioni
cromatografiche. Nei casi in cui tali modelli risultano appropriati per spiegare le osservazioni
macroscopiche allora col loro aiuto è possibile, per esempio, ottimizzare un sistema di eluizione per
problemi di separazione specifici.
3.4.1 Modelli di ritenzione in cromatografia anionica.
Le osservazioni seguenti inizialmente riguardano l'eluizione per spostamento isoionico essendo
questo il meccanismo più semplice in cromatografia ionica. Nel caso presente si riferisce alla
cromatografia anionica, ma le stesse considerazioni valgono similmente per la cromatografia
cationica. Solo quando agenti complessanti vengono aggiunti all'eluente è necessario ampliare il
modello di ritenzione, come verrà descritto nella sezione: "Modelli di ritenzione per eluizione in
presenza di agenti complessanti" (sezione 3.4.2).
Modelli di ritenzione per eluenti monoanionici
Presupponendo una condizione di elettroneutralità, il modo più semplice per descrivere un modello di
y–
ritenzione per spostamento isoionico è quello in cui uno ione dell'eluente E compete con un'anione
xy–
dell'analita A per i gruppi funzionali della fase stazionaria [4]. La concentrazione degli anioni E
dell'eluente rimane costante nel tempo (eluizione isocratica).
All'inizio del processo cromatografico i siti di scambio su una colonna di separazione con una capacità
y–
xQ sono occupati da anioni dell'eluente E . Se si introduce un campione contenente lo ione A
dell'analita allora si stabilisce l'equilibrio seguente tra la fase stazionaria (indice S) e la fase mobile
(indice M):
y · AMx– + x · ESy–
y · ASx– + x · EMy–
(18)
In accordo con la legge di azione di massa questo equilibrio può essere descritto da una costante
termodinamica di equilibrio. Se si tengono in considerazione le attività degli ioni partecipanti allora si
ottiene la seguente costante termodinamica di equilibrio
K A,E
y
[A Sx ] y [E My ] x _ A Sx
=
[A Mx ] y [E Sy ] x _ yA x
M
_ Ex y
M
_
(19)
x
E Sy
Poichè le attività degli ioni partecipanti non possono essere determinate, sia nella fase stazionaria che
xin quella mobile l'attività viene posta uguale a 1. Inoltre se per l'anione A dell'analita vengono ora
introdotte due quantità definite nella sezione 3.2.1, il coefficiente di distribuzione DA ed il fattore di
ritenzione k'A,
DA =
[A] S
[A] M
con k' A = D A
VS
VM
(20)
allora l' Equazione 19 può essere scritta come di seguito:
K A,E = k' A
VM
VS
y
[E My ]
[E Sy ]
x
(21)
y–
Essendo la concentrazione degli ioni dell'eluente E normalmente più alta di quella degli anioni
xdell'analita A di vari ordini di grandezza, una buona approssimazione può essere ottenuta
y–
assumendo che tutti i gruppi funzionali siano occupati da E . In base a questa assunzione la
y–
concentrazione di E non determinabile nella fase stazionaria può essere sostituita dai parametri più
facilmente accessibili come la capacità di scambio Q e la carica dell'anione dell'eluente y:
[E Sy ] =
Q
y
(22)
– 17 –
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Questo significa che l'Equazione 21 può essere scritta come di seguito:
K A,E = k
'
A
y
VM
VS
Q
y
x
[E My ]
x
(23)
x-
Il fattore di ritenzione k'A dell'anione dell'analita A può essere ricavato facilmente da un
cromatogramma. L'Equazione 23 viene quindi risolta esplicitando questa quantità.
1
V
Q
k 'A = S (K A,E ) y
VM
y
x
y
y
M
[E ]
x
y
(24)
Questa equazione è di importanza cruciale per la cromatografia anionica poichè fornisce una
relazione quantitativa tra il fattore di ritenzione k'A e diversi parametri sperimentalmente determinabili
come la concentrazione dell'eluente e la capacità di scambio. In pratica si usa, per ragioni di
chiarezza, la versione logaritmica dell'Equazione 24.
log k' A =
x
Q
1
log K A,E + log
+ log
y
y
y
x
log [E My ]
y
con
=
VS
VM
(25)
Dall’Equazione 25 si può vedere che:
•
•
•
y–
Aumentando la concentrazione dell'eluente [E ] si accelera l'eluizione
o fattori di ritenzione più grandi derivano da costanti di equilibrio KA, E più grandi, più alte
capacità di scambio Q ed un più grande rapporto tra i volumi di fase .
nxx-,
Analiti multivalenti A sono ritardati più fortemente che i monovalenti A
y–
o almeno finché la concentrazione dell'eluente [E ] è relativamente bassa. Questo
fenomeno è conosciuto anche come elettroselettività.
nyy–
Eluenti multivalenti E hanno un potere di eluizione più alto che i monovalenti E
nxo l'eluizione di analiti multivalenti A è influenzata più fortemente da un aumento delle
y–
x-.
concentrazioni di ioni dell’eluente monovalenti E che quella di analiti monovalenti A
In prima approssimazione si può assumere che i coefficienti di selettività sono indipendenti da Q in
condizioni di
costante; come espresso nella proporzionalità seguente:
(26)
Dall’Equazione 26 si può vedere che se la capacità di scambio Q viene aumentata allora la
y–
concentrazione dell'eluente [E ] deve essere aumentata proporzionalmente per mantenere invariati i
fattori di ritenzione. Questa è la ragione per cui fasi a bassa capacità di separazione sono usate
normalmente in cromatografia ionica, dato che alte concentrazioni dell'elettrolita renderebbero
praticamente impossibile il più importante metodo di rivelazione in cromatografia ionica, la rivelazione
della conducibilità.
y–
Per ottimizzare le condizioni della separazione si varia di solito la concentrazione dell'eluente [E ]. Se
tutti gli altri parametri che compaiono nell'Equazione 25 sono tenuti costanti allora l'equazione può
essere semplificata come segue:
log k' A = C1
x
log [E My ]
y
(27)
Una rappresentazione grafica dell'Equazione 27 dà una linea retta con una pendenza m= - x / y ed
un'intercetta sull'asse C che contiene le quantità Q, e KA, E. Se l’eluente usato è monoanionico allora
m è definita anche come la carica effettiva. La Figura 10 mostra il risultato dell'Equazione 27 per varie
combinazioni di eluenti ed anioni dell'analita caricati in modo diverso.
– 18 –
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Figura 10 Rappresentazione grafica dell'Equazione 28 per varie combinazioni di eluenti ed anioni
dell'analita con carica diversa [4].
L'Equazione 27 è stata confermata in numerose pubblicazioni; sempre nell'ipotesi di considerare
l'utilizzo di materiali a bassa capacità di separazione ed eluenti diluiti.
Se la capacità di scambio Q è fatta variare mentre gli altri parametri rimangono costanti, allora
l'Equazione 25 può essere semplificata in:
log k' A = C +
x
Q
log
y
y
(28)
La rappresentazione grafica di questa equazione è simile alla Figura 10, ma con una pendenza
positiva. Investigazioni cromatografiche sulla variazione di Q fino ad oggi sono state eseguite solo per
la separazione di cationi divalenti. Questo ha dimostrato che, in contrasto ad assunzioni precedenti, il
fattore di ritenzione ed i coefficienti di selettività non possono essere considerati indipendenti dalla
capacità di scambio. Per l'ottimizzazione di problemi di separazione è chiaro che oltre alla
y–
concentrazione dell'eluente [E ] anche la capacità di scambio Q è una proprietà importante.
Le considerazioni fin qui svolte considerano la presenza di un solo anione dell'analita. Se due anioni
xzdiversi A e B (*) competono per i gruppi funzionali allora vale la seguente legge per i coefficienti di
selettività KA, B:
K A,B =
[A Sx ] z
[A Mx ] z
[B Mz ] x
[A Sz ] x
(29)
Tenendo conto dell'Equazione 20 si ottiene per cominciare la selettività
a A,B =
k' A
[A Sx ] [B Mz ]
=
k' B
[A Mx ] [B Sz ]
(30)
E quindi dopo conversione le Equazioni 31a e b,
log
A.B
=
k' V
1
x z
log K A,B +
log B M
z
z
VS
(31a)
log
A.B
=
k' A VM
1
x z
log K A,B +
log
x
z
VS
(31b)
che si possono semplificare per analiti con la stessa carica (x= z):
log a A,B =
1
log K A,B
z
(32)
o
log a A,B =
– 19 –
1
log K A,B
x
(33)
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Per la selettività tra due anioni dell'analita di carica simile questo significa:
•
•
la selettività è solo una funzione dei coefficienti di selettività KA, B e delle cariche z e x,
y–
con KA,B costante la selettività non dipende né dalla concentrazione [E ] nè dalla
composizione chimica dell'anione eluente (!)
Se A e B hanno cariche diverse allora:
a la selettività dipende dal fattore di ritenzione di uno dei due analiti,
•
i due fattori di ritenzione k'A e k'B non sono indipendenti l'uno dall'altro (!)
Nelle Equazioni dalla 31 alla 33 è particolarmente interessante notare che le selettività di due anioni
inizialmente non dipende né dalla composizione chimica nè dalla carica dell'anione eluente, purchè il
rapporto fase-volume ed il coefficiente di selettività siano costanti. Comunque, in pratica una
y–
variazione di selettività può essere ottenuta con una variazione di [E ], poichè due analiti con la
stessa carica possono avere proprietà chimiche diverse, per esempio polarizzabilità e grado di
idratazione; questo può risultare in affinità diverse per la fase stazionaria. Comunque, queste
interazioni non sono tenute in considerazione nella derivazione classica.
Modelli di ritenzione per eluenti con diversi anioni
Le osservazioni precedenti si riferivano a sistemi di eluizione con un solo tipo di anione eluente. In
pratica sono generalmente presenti diverse specie eluenti, per esempio nel tampone carbonato/
bicarbonato o in acidi polibasici come l'acido fosforico, la cui dissociazione e quindi la distribuzione
nelle varie specie dipende fortemente dal pH.
Persino in casi semplici in cui nessuno degli anioni eluenti partecipanti è coinvolto nell'equilibrio acidobase, la relazione tra il fattore di ritenzione k' e la concentrazione dell'eluente [E-] non può essere
rappresentata nella forma di una relazione semplice bilogaritmica come l'Equazione 28. Questo è
possibile solo se la concentrazione o il potere di eluizione degli altri anioni eluenti può essere
trascurato; ciò corrisponderebbe allora, di nuovo al modello di ritenzione per eluenti monoanionici.
In letteratura si trovano descritti diversi modelli che si occupano di eluenti polianionici; questi sono
discussi brevemente nel seguito:
•
•
•
modello dell'equilibrio dominante [21]
modello della carica effettiva [22-24]
modello delle specie eluenti multiple [25, 26]
-
2-
3-
-
Se si considera un eluente fosfato con le specie H2PO4 , HPO4 e PO4 , (nel seguito indicati con H2P ,
2
HP - e P ) e lo ione monovalente dell'analita A allora il si ottengono i seguenti equilibri:
A M + H2PS
A S + H 2PM
;
x1
(34)
AM +
1
2
HPS2
AS +
1
2
HPM2
;
x2
(35)
AM +
1
3
PS3
AS +
1
3
PM3
;
x3
(36)
Qui le quantità x1_3 corrispondono alle frazioni di ritenzione di cui ciascuna reazione particolare è
responsabile, perciò risulta:
x1 + x2 + x3 = 1
(37)
Sia il modello dell'equilibrio dominante che il modello della carica effettiva postulano la presenza di
una carica particolare per l'anione eluente, anche se ci sono diverse specie presenti; questo significa
che si può usare il modello di ritenzione per eluenti monanionici (vedi sopra).
Il modello dell'equilibrio dominante assume che l'equilibrio nell’ Equazione 36 sia completamente
spostato a destra, poichè P3- è legato più fortemente alla fase stazionaria che H2P- e HP2- come
risultato della sua carica più alta. Questo significa che solo P3- è decisivo per l'eluizione così che la
– 20 –
4/15/2001
carica dell'anione dell'eluente è - 3. Tuttavia, in pratica questo modello raggiunge un buon accordo
con i dati sperimentali solo per analiti multivalenti [4].
Nel modello della carica effettiva una carica effettiva viene calcolata, tenendo in considerazione il
23valore del pH, le frazioni molari delle possibili specie H2P , HP e P [22]. Utilizzando queste ultime
insieme con le concentrazioni esistenti delle specie eluenti si può ottenere una relazione analoga
all'Equazione 27. Comunque, è necessario per un tale tipo di calcolo che le selettività delle specie
eluenti non differiscano grandemente rispetto agli ioni dell'analita A . Il modello della carica effettiva è
soprattutto appropriato per il caso di analiti monovalenti [ 4].
In realtà il modello delle specie eluenti multiple è più appropriato per la descrizione di eluenti i cui
componenti sono chimicamente derivati l'uno dall'altro. Le osservazioni seguenti sono basate sul
modello di Mongay et al. [ 27], che è un ulteriore sviluppo del lavoro di Jenke e Pagenkopf [25].
Le Equazioni 34 a 36 possono essere usate per esprimere l'equilibrio globale nella colonna di
separazione (Equazione 38). Considerando l'Equazione 37, le costanti di equilibrio KA,P possono
essere definite per il processo di scambio secondo l’Equazione 39, se le attività vengono trascurate.
(38)
K A,P
[A S ]
=
[A M ]
[H2PM ] X1/1 [HPM2 ] X2 /2 [HPM3 ] X3 /3
[H2PS ] X1/1 [HPS2 ] X2 /2 [HPS3 ] X3 /3
(39)
Il trattamento matematico descritto sotto segue il procedimento per la derivazione del modello di
ritenzione per eluenti monanionici. Si deve tenere soprattutto presente quanto segue:
•
•
•
la (possibile) dissociazione dell'anione dell'analita A23la concentrazione totale delle specie eluenti: cP = [H3P] + [H2P ] + [HP ] + [P ]
l'entità delle interazioni tra le specie eluenti ed i gruppi funzionali
L'introduzione dei fattori di ritenzione k'A (Equazione 20) e della capacità Q (Equazione 22) fornisce,
dopo ulteriore rielaborazione matematica, un'espressione complicata per k'A [ 28]; questa viene data
qui solo in una sua forma logaritmica ed ulteriormente semplificata:
log k' A = C 3
x1 x 2 x 3
+
+
1
2
3
log c P
(40)
in cui C3 è una costante che, come nell'Equazione 27, contiene quantità come il rapporto fase-volume,
la capacità e la costante dell'equilibrio; cP è il totale delle concentrazioni delle specie eluenti.
Dall'Equazione 40 si può dedurre che le pendenze delle linee rette in un grafico bi-logaritmico
dovranno risultare sempre più piccole di quelle relative al modello semplice di ritenzione per eluenti
monanionici (Equazione 27), poichè il totale tra parentesi è sempre più piccolo di uno. E chiaro anche
che il valore del pH ha un'influenza decisiva sulla relazione bi-logaritmica.
Per specie eluenti che non sono chimicamente derivate l'una dall'altra Janos et al. hanno fornito un
modello che è stato sviluppato per descrivere eluenti contenenti un tampone fosfato con aggiunta di
perclorato [29]. Questo modello è stato dedotto secondo considerazioni simili a quelle descritte sopra,
ma in aggiunta si deve considerare un equilibrio di scambio di un ulteriore ione eluente monovalente. I
calcoli forniscono espressioni molto complicate per il fattore di ritenzione; queste possono essere
drasticamente semplificate per eluenti neutri o acidi. Se solo una singola specie eluente monovalente
è presente in aggiunta al perclorato allora si ottiene l'Equazione 41 in cui x e y rappresentano i
contributi delle reazioni di equilibrio corrispondenti (x: tampone fosfato, y: perclorato) alla ritenzione.
Come negli altri modelli, C è una costante, mentre il fattore "a", che non è definito più precisamente,
tiene in considerazione quanto più fortemente lo ione perclorato è legato alla fase stazionaria rispetto
alle specie fosfatate coinvolte.
– 21 –
4/15/2001
(41)
Quando come nell' Equazione 41 i termini fra parentesi sono sempre più piccoli di uno, la pendenza
del grafico bi-logaritmico è sempre minore di quanto previsto dal più semplice modello di ritenzione.
Nelle applicazioni attuali il modello fornisce un buon accordo coi dati sperimentali. Comunque, la
forma sopra descritta non può essere usata per sistemi di eluizione alcalini.
3.4.2 Modelli di ritenzione in cromatografia cationica
In cromatografia cationica si possono individuare due gruppi di modelli di ritenzione. Un gruppo si
occupa dei cationi di metalli alcalini ed alcalino-terrosi e richiede solamente un sistema di eluizione
basato sullo spostamento isoionico. In questo caso la fase stazionaria ha come gruppi funzionali
gruppi carbossilici. Nella separazione di ioni metallici con due o più cariche l'uso di un agente
complessante è essenziale; la sua influenza sulla ritenzione è descritta di seguito.
Modelli di ritenzione per eluenti monocationici
Le spiegazioni fornite nella sezione "Modelli di Ritenzione per eluenti monoanionici" valgono in modo
analogo per la cromatografia cationica con eluizione per spostamento isoionico. In pratica il discorso
riguarda la determinazione di metalli alcalini ed alcalino-terrosi, ioni ammonio ed ammine a catena
+
corta. A parte gli ioni H , cationi organici come l'acido 2,3-diaminopropionico (DAP) sono usati come
cationi eluenti in combinazione con acido cloridrico diluito. A seconda del pH fissato per l'eluente DAP
è presente nelle forme ioniche (1) e (2) (Figura 11). Dopo soppressione è presente la forma
zwitterionica (3) , che non ha conducibilità propria.
Figura 11
Specie ioniche dell'acido diamminopropionico
Modelli di ritenzione per eluizione in presenza di agenti complessanti
In cromatografia cationica eluenti che contengono un agente complessante in aggiunta al catione
n+
dell'eluente E sono usati per la separazione di ioni alcalino terrosi, metalli di transizione e metalli
pesanti. Gli agenti complessanti usati sono principalmente acidi dicarbossilici H2L come l'acido
tartarico, l'acido ossalico, l'acido citrico ed anche l'acido piridindicarbossilico. Gli analiti formano
2complessi di stabilità diversa con gli anioni degli agenti complessanti HL e L ; anche la loro
stechiometria differisce. Come risultato del processo di complessazione la carica effettiva, cioè la
carica che l'analita presenta in un periodo medio di tempo, è ridotta. Poichè questo accade in base
alle cinetiche di formazione dei complessi ed alle costanti di stabilità dei complessi, le differenze in
selettività aumentano e anche la separazione di analiti molto simili diviene possibile. Oltre allo
scambio ionico, la formazione di complessi è decisiva per la separazione di ioni metallici con carica
elevata.
(42)
(43)
– 22 –
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(44)
Per prendere in considerazione l'influenza dell'agente complessante sulla separazione in
cromatografia ionica il modello di ritenzione per spostamento isoionico (vedi Sezione "modelli di
ritenzione per eluenti monoanionici" a pagina 17) viene esteso. Il valore M è introdotto come una
quantità condizionante che descrive il grado di formazione del complesso dell'analita. La frazione M
di ioni dell'analita liberi nella fase mobile è data da
aM =
[Me ]
[Me ]
=
] + [MeHL ] + [MeL ] + [MeL ] [Me']
x+
[Me
x+
x+
x 1
x 2
(45)
x 4
2
x+
con [Me ] concentrazione totale degli ioni del metallo. Il valore di M può essere calcolato dalle
costanti di formazione dei complessi, dalla costante di dissociazione dell'acido carbossilico e dal pH
dell'eluente. Se si considera la formazione del complesso allora si ottiene la seguente espressione per
il coefficiente di distribuzione DMe:
DMe =
[MeR x ] = a [MeR x ]
M
[Me']
[Me x+ ]
(46)
x+
Se si assume che solo gli ioni liberi dell'analita Me interagiscono con i gruppi carbossilici o solfonici e
z+
+
che c(E )>> c(H ), allora si ottiene la seguente espressione in luogo della Equazione 21:
K Me, E
k' Me
=
aM f
y
Q
y
x
[E ]
y+ x
(47)
In maniera simile all'Equazione 25 la forma logaritmica dell'Equazione 47 è la seguente:
log k' Me = log
M
+
Q
x
1
log K Me,E + log + log
y
y
y
x
y+
log [E M
]
y
(48)
x+
Se intervengono diverse specie metalliche cationiche contemporaneamente, per esempio Me e
(x-1)+,
allora è possibile ottenere un singolo picco nel cromatogramma per tutti gli analiti coinvolti.
MeHL
Il numero di picchi che si ottengono dipende dalle cinetiche degli equilibri di complessazione e
decomplessazione nella fase mobile. Si ottiene solo uno picco se l'equilibrio di complessazione si
instaura più rapidamente nella fase mobile rispetto al tempo di residenza del complesso nella fase
stazionaria. D'altra parte se il processo di complessazione avviene lentamente allora si possono
ottenere picchi asimmetrici o multipli.
Se si assume che tutte le specie metalliche presenti nella fase mobile possono interagire con la fase
stazionaria allora si ottiene l'espressione seguente per k'exp fattore di capacità dell'analita, determinato
sperimentalmente:
(49)
y+
Considerazioni sulla dipendenza del fattore di capacità dalle quantità condizionanti Q, [E ] ed M .
richiedono che la relazione presentata nell'Equazione 48 sia usata come base, dal momento che gli
analiti divalenti principalmente formano complessi neutri o anionici con forti agenti complessanti.
Calcolo dei valori di
M
.
Secondo l'Equazione 45, il valore M è definito come il rapporto della concentrazione degli ioni liberi
del metallo sulla concentrazione totale degli ioni metallici. Le concentrazioni delle specie metalliche
presenti nella fase mobile possono essere calcolate dalle relative costanti di formazione dei complessi
e dalle costanti di dissociazione acida degli acidi carbossilici usati.
Se negli eluenti viene usato acido tartarico come agente complessante allora si formano
principalmente complessi neutri MeL 1: 1 con gli alcalino terrrosi ed i metalli di transizione e metalli
– 23 –
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+
pesanti, insieme con minori quantità del complesso idrogeno-tartrato MeHL . Per eluenti come l'acido
tartarico si ottiene la seguente espressione per il calcolo del valore di M.
aM =
[Me ]
] + [MeL ] + [MeHL ] = 1 + K
2+
[Me
2+
+
1
MeL a L c L + K MeHL a HL c L
dove cL è la concentrazione totale di acido tartarico e
2dell'acido HL e L .
HL
e
L
(50)
sono le frazioni molari degli anioni
2-
A parte i complessi 1: 1, alcuni ioni metallici formano complessi stabili MeL con l'acido ossalico e/o
con l'acido piridindicabossilico, così che M può essere calcolato come segue:
[Me ]
2+
aM =
[Me ] + [MeL] + [MeL ]
2+
2
2
=
1
2
1 + K MeL a L c L + K MeL K MeL 2 a L c L
2
(51)
Calcolo della dissociazione dell'acido
Il pH e la concentrazione dell'agente complessante nella fase mobile determinano la concentrazione
nell'intorno del legante e perciò l'entità della complessazione dell'analita. Consideriamo un acido
biprotico ed i due stadi di dissociazione:
(52)
(53)
con le costanti dell'acido KS1 e KS2. Le frazioni molari H2L, HL e L usate per calcolare il valore
sono ottenute dalle leggi di azione di massa dei singoli stadi di deprotonazione:
aH2L =
[H2L] + [HL ] + [L2 ] [H+ ]2 + K S
[H ]
[H ] + K
[HL ]
=
[H L] + [HL ] + [L ] [H ]
[ ]
[H ] + K
[H2L]
+ 2
=
+
1
aHL =
2
2
aL =
+ 2
+ K S1
+
S1
K S2
K S1 K S2
2
2
S1
K S2
K S1 H +
+ 2
[L ]
=
[H L] + [HL ] + [L ] [H ]
2
M
[ ]
+ K S1 H + + K S1 K S2
(54)
(55)
(56)
3.5 I sistemi di rivelazione in cromatografia ionica
Diversi metodi sono usati per la determinazione di sostanze nel settore dell'HPLC, la selezione di un
detector appropriato deve essere fatta sempre in base al problema analitico da risolvere. Le qualità
richieste pe un detector possono essere riassunte come segue:
•
•
•
•
•
alta sensibilità nella misura e tempi di risposta brevi
segnale di misura proporzionale alla concentrazione dell'analita (ampio intervallo di linearità)
piccole variazioni della linea di base (deriva)
basso rumore di fondo
volumi richiesti quanto più possibile piccoli per ridurre l'allargamento dei picchi
– 24 –
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Una differenziazione generale si fa tra detector selettivi e non-selettivi. Mentre un detector selettivo
risponde direttamente a una proprietà dell'analita, detector non-selettivi reagiscono a una modifica di
una delle proprietà fisiche dell'intero sistema di eluizione causata dall'analita. I detector usati in
cromatografia ionica non differiscono in principio da quelli usati per le tecniche "convenzionali" di
HPLC ed in questa sezione saranno menzionati almeno i sistemi di rivelazione più importanti. Il
detector IC universale e più frequentemente usato è quello a conducibilità.
3.5.1
Metodi di rivelazione elettrochimici
Detector a conducibilità
La misura della conducibilità, conosciuta anche come misura conduttimetrica, copre una frazione di
mercato del 55% nel settore della cromatografia ionica [4]. Se si considera il numero di cromatografi
ionici che è stato venduto allora questa frazione è probabilmente molto più alto. La misura di
conducibilità si basa su un principio di rivelazione non-selettivo; in questo caso sono possibili sia
determinazioni dirette che indirette. Poichè come fase mobile in cromatografia ionica sono
frequentemente usate soluzioni acquose di elettroliti, il detector deve poter rispondere a variazioni
relativamente piccole della conducibilità totale dell'eluente causate dagli ioni dell'analita. Utilizzando le
cosiddette tecniche di soppressione la conducibilità propria di alcuni eluenti può essere drasticamente
ridotta; nel caso di anioni di acidi forti ad esempio si ottiene un notevolmente miglioramento della
sensibilità qualora venga utilizzata la soppressione della conducibilità dell’eluente.
La conducibilità k rappresenta il reciproco della resistenza R di un liquido posto tra due elettrodi di
area A a distanza L.
= L / (A R)
La conducibilità equivalente
(57)
di una soluzione può essere determinata come:
=
/c
(58)
e la variazione di conducibilità con la concentrazione può essere determinata
La conducibilità limite
in base all'Equazione 59. Le costanti A e B sono costanti empiriche della sostanza .
=
– (A + B
)
c
La conducibilità di un elettrolita si ottiene sommando le conducibilità ioniche di
=c(
Figura 12
–
Anion
+
+
Cation)
(59)
–
Anion
e
+
Cation
:
(60)
Schema di una cella per misure di conducibilità.
Secondo la legge di Kohlrausch, la conducibilità di una soluzione diluita è proporzionale alla somma
delle conducibilità di tutti gli ioni moltiplicate per le loro concentrazioni.
=
i
ci
(61)
1000
– 25 –
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-1
2
1
dove k è la conducibilità in S cm , la conducibilità limite in S cm (z mol) e c la concentrazione in z
-1
[mol] L (z corrisponde alla carica dello ione). Il fattore 1000 proviene dal fatto che 1 litro è uguale a
3
1000 cm .
La variazione della conducibilità causata dall'analita è proporzionale alla sua concentrazione
nell’eluato,
h =
(g S
gE ) c S
1000
(62)
dove S ed E indicano rispettivamente lo ione dell'analita e dell'eluente. Poichè nella determinazione
della conducibiltà si misura una variazione della conducibilità, in cromatografia ionica si hanno in
realtà solo piccole alterazioni nella conducibilità rispetto all'alta conducibilità di fondo. Questo significa
che risulta vantaggioso mantenere la conducibilità di fondo la minore possibile.
Figura 13 Variazioni della conducibilità dell'eluato durante la separazione di una miscela multicomponente mediante cromatografia ionica. I grafici sono per un eluente con alta (rosso) e bassa (blu)
conducibilità
In cromatografia ionica la conducibilità di un eluato può essere determinata o direttamente o dopo
passaggio attraverso un soppressore. Queste versioni sono conosciute come tecniche a singolacolonna e tecniche di soppressione a due colonne. La versione che è da preferirsi può essere
determinata facendo un calcolo approssimativo.
Se si usa la rivelazione diretta della conducibilità in cromatografia anionica allora la sensibilità della
misurazione definita dal kPeak dipende dalla differenza tra le conducibilità equivalenti dell'analita e
degli anioni dell'eluente; con i cloruri come analita e carbonato come anione dell'eluente si ottengono
le equazioni seguenti:
–
Cl–
Peak
! cAnalyte (
Peak
! cAnalyte • 4
–
–
CO32–)
"
Peak
! cAnalyte (76 – 72)
Se l'eluente è adattato ai bisogni di rivelazione del conducibilità diretta allora sostituendo l'eluente
carbonato con un eluente ftalato si ottiene la sensibilità seguente:
–
Cl–
Peak
! cAnalyte (
Peak
! cAnalyte • 38
–
–
Phthalate)
"
Peak
! cAnalyte (76 – 38)
Se, d'altro canto, la conducibilità dell'eluente è chimicamente soppressa (per scambio dei cationi
+
dell'eluente con H ), la sensibilità dipende dalla somma delle conducibilità equivalenti dell'anione
+
dell'analita e dallo ione H ; in tal caso vale allora la seguente espressione per Cl anione dell'analita:
Peak
! cAnalyte (
–
Cl–
+
+
H+)
"
– 26 –
Peak
! cAnalyte (76 + 350)
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Peak
! cAnalyte • 426
Da questo rapido calcolo si può vedere che, per anioni, la rivelazione diretta della conducibilità è
meno sensibile di un fattore 10 rispetto alla rivelazione della conducibilità dopo soppressione chimica.
Ripetendo il calcolo descritto per gli anioni per la cromatografia cationica nel caso di rivelazione diretta
+
+
della conducibilità (NaCl/ HCl), con Na come analita e H come catione dell'eluente si ottengono le
equazioni seguenti per la sensibilità Peak della misurazione :
+
Na+
Peak
! cAnalyte (
Peak
! cAnalyte • (–300)
–
+
H+)
"
Peak
! cAnalyte (50 – 350)
Se, d'altro canto, la conducibilità dell'eluente è chimicamente soppressa (per scambio degli anioni
dell'eluente Cl- con OH-), vale la seguente espressione:
+
Na+
Peak
! cAnalyt (
Peak
! cAnalyt • 248
+
–
OH–)
"
Peak
! cAnalyt (50 + 198)
Questo significa che la sensibilità è migliore con rivelazione diretta della conducibilità di cationi che
con rivelazione della conducibilità dopo soppressione chimica.
Tabella 2
di vari ioni
Conducibilità equivalente
Cationi
+
H
+
Li
+
Na
+
K
+
NH4
2+
½ Mg
2+
½ Ca
2+
½ Sr
2+
½ Ba
2+
½ Zn
2+
½ Hg
2+
½ Cu
2+
½ Pb
2+
½ Co
1
3+
/3 Fe
+
N(Et)4
+
2
–1
(S cm eq )
350
39
50
74
73
53
60
59
64
52
53
55
71
53
70
33
Anioni
–
OH
–
F
–
Cl
–
Br
–
I
–
NO2
–
NO3
–
HCO3
2–
½ CO3
–
H2PO4
2–
½ HPO4
3–
1
/3 PO4
2–
½ SO4
–
CN
–
SCN
Acetato
½ Ftalato
Propionato
Benzoato
Silicato
½ Ossalato
2
–1
(S cm eq )
198
54
76
78
77
72
71
45
72
33
57
69
80
82
66
41
38
36
32
30
74
Le configurazioni dei soppressori per cromatografia ionica possono essere riassunte in due categorie:
o come soppressori a letto impaccato operanti in discontinuo come mostrato in Figura 14 o come
soppressori a membrana operanti in continuo. Il soppressore a letto impaccato usato da Metrohm è
costituito da tre unità di soppressione posizionate su un rotore; mentre un'unità opera come
soppressore la seconda viene rigenerata e la terza viene risciaquata con acqua. Dopo l'esecuzione di
un'analisi il rotore viene ruotato di 120 gradi e la colonna che è appena stata rigenerata e sciacquata
viene usata come soppressore. Questo rende possibile un'operatività semi-continua.
– 27 –
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Figura 14
Rappresentazione schematica di un soppressore a letto impaccato.
Il soppressore a membrana mostrato in Figura 15 lavora in continuo lavora ma, come risultato dell'uso
di membrane a scambio ionico, è soggetto a saturazione della superficie della membrana che riduce
la capacità di soppressione ed infine cessa di funzionare.
Figura 15
Rappresentazione schematica di un soppressore a membrana.
Detector amperometrici
I rivelatori voltammetrici possono essere usati per tutti i composti che possiedono gruppi funzionali
che possono essere facilmente ridotti o ossidati. Il rivelatore amperometrico è la versione più
importante. In questo rivelatore un certo potenziale è applicato tra un elettrodo di lavoro ed un
elettrodo di riferimento. Se ad un analita elettrochimicamente attivo si applica un potenziale di
mezz'onda tale da ossidarlo o ridurlo si otterrà un passaggio di corrente tra gli elettrodi; questo
fornisce il segnale di misura. La rivelazione amperometrica è molto sensibile; la velocità di
conversione solo il 10%. Al di là di alcuni cationi (Fe3+, Co2+) sono per lo più anioni come nitriti,
nitrati, tiosolfati così come alogeni e pseudo-alogeni che possono essere determinati nel settore di
analisi ionica in questo modo. Le più importanti applicazioni stanno, comunque, nell'analisi degli
zuccheri per cromatografia ionica e nell'analisi clinica. Per il suo diverso principio di funzionamento, il
rivelatore coulometrico fornisce un ribaltamento quantitativo senza, comunque, produrre un
aumento di sensibilità.
Detector potenziometrici
Nella rivelazione potenziometrica sono usati elettrodi iono-sensibili, alcuni dei quali hanno una
selettività molto alta. Malgrado l’alto grado di miniaturizzazione a cui si è arrivati questi sensori non
funzionano ancora in modo affidabile; questo ancora causa problemi nella pratica. Questa è la ragione
perchè finora la rivelazione potenziometrica è limitata a alcune applicazioni speciali, particolarmente
nel settore della cromatografia ionica.
3.5.2
Metodi di rivelazione spettroscopici
Detector fotometrici
A seguito del suo ampio campo di applicazioni il metodo fotometrico o UV/ VIS di rivelazione è il più
importante usato in HPLC, dato che virtualmente tutte molecole organiche contengono gruppi
cromofori che possono assorbire nello spettro UV o VIS. Naturalmente l'eluente usato non deve
– 28 –
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assorbire nell'intervallo di lunghezze d'onda usato. Con rivelazione diretta al massimo di assorbimento
di un analita la rivelazione UV/ VIS è praticamente selettiva. Sostanze che hanno soltanto un
assorbimento limitato o nessun assorbimento in tutto l'intervallo di lunghezze d'onda impiegate
possono essere determinate indirettamente misurando l'assorbimento del massimo del sistema di
eluizione. Nel campo dell'analisi di ioni inorganici la rivelazione UV/ VIS gioca un ruolo marginale.
Mentre tra gli anioni semplici solo analiti come il nitrato, bromuro o ioduro assorbono, analiti importanti
come il fluoruro, il solfato o il fosfato possono essere determinati solo indirettamente [4]. Molti cationi
non assorbono per nulla, ma metalli multivalenti e di transizione in particolare possono essere
convertiti in una post-colonna di derivatizzazione con precursori di chelanti come il PAR o il Tiron e
formare complessi colorati. Analiti redox-attivi come il bromato ed altri ioni alogenati possono essere
analizzati con rivelazione UV/ VIS dopo aver subito una reazione in una post-colonna contenente un
indicatore elettrochimicamente attivo .
Detector a fluorescenza
La rivelazione a fluorescenza che è una tecnica molto sensibile e possibile ogni qualvolta gli analiti
possono essere eccitati a fluorescenza; questo è principalmente il caso di composti organici con
estesi sistemi elettronici-p. Ciò significa che applicazioni tipiche si trovano nei campi dell'analisi clinica
ed organica. In connessione con la cromatografia ionica la misura della fluorescenza è usata in pochi
3+
casi speciali, poichè solo ioni particolari come Ce sono direttamente accessibili e ioni non
fluorescenti possono essere rivelati solo dopo derivatizzazione. E’ estremamente difficile sviluppare
sistemi di eluizione per questo metodo di rivelazione a causa della sua grande sensibilità ad
interferenze da contaminanti. Inoltre l’intervallo di risposta lineare del metodo è relativamente stretto
(spesso meno di due ordini di grandezza) a causa di effetti di auto-assorbimento.
Tecniche di accoppiamento
Le cosiddette tecniche di accoppiamento rappresentano il collegamento di un sistema
cromatografico con un metodo analitico indipendente, di solito spettrometrico [3]. In anni recenti questi
metodi sono aumentati grandemente in importanza. Benchè l'accoppiamento di un gascromatografo
con uno spettrometro di massa (GC-MS) sia ormai consueto, l'accoppiamento invece di HPLC con
metodi spettrometrici causa grandi problemi tecnici. In HPLC classica, per esempio nell'analisi di
composti organici, sono disponibili accoppiamenti con un spettrometro di massa (LC-MS), con
spettrometri-IR (LC-FTIR) e spettrometri di risonanza magnetica nucleare (LC-NMR) [3]. In particolare,
potenti rivelatori di spettrometria atomica sono usati in cromatografia ionica (IC). Esempi sono la
spettrometria di emissione atomica e di massa a plasma accoppiato inductivamente (IC-ICP-AES,
MS); come risultato della loro specificità nei confronti degli elementi e sensibilità questi metodi
forniscono risultati eccellenti. Questa è la ragione per cui, malgrado il loro costo relativamente alto, tali
sistemi sono usati per l'analisi di specie elementari e nell'analisi di ultratracce di elementi.
Rifrattometria
La rifrattometria differenziale (rivelatore RI o Indice di Rifrazione) è un metodo di rivelazione basato
su un metodo ottico. Esso è completamente non-specifico ed è appropriato per un uso universale dato
che la quantità misurata è la variazione dell'indice di rifrazione dell'eluente puro causata dall'analita.
Tuttavia, la grande sensibilità alla temperatura dell'indice di rifrazione dei mezzi implica che il metodo
è molto suscettibile ad interferenze. Purché la temperatura sia assolutamente stabile il metodo ha un
intervallo lineare di tre ordini di grandezza. Poiché ioni semplici inorganici hanno un indice di rifrazione
estremamente basso possono essere determinati solo indirettamente usando eluenti a cui sono stati
aggiunti composti altamente rifrattivi.
3.6 Fasi Stazionarie in cromatografia ionica
Per avere una buona efficienza in cromatografia ionica si richiedono materiali di impaccamento con
particelle molto piccole e più sferiche possibile inoltre la distriduzione dimensionale deve essere molto
stretta. Vengono usate particelle con diametri da 2 a 10 Ym. Inoltre il materiale di impaccamento
dovrebbe essere caratterizzato da cinetiche di scambio ionico il più rapide possibile, parametro
importante quanto le dimensioni delle particelle.
3.6.1 Panoramica delle fasi stazionarie più comuni
In cromatografia ionica si dispone di una vasta serie di materiali organici ed inorganici come fasi
stazionarie che hanno in comune gruppi funzionali posizionati sulla superficie in grado di scambiare
ioni. Possono essere usate le classi seguenti di sostanze [4]:
– 29 –
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Resine a polimero organico modificato
•
•
•
•
•
•
gel di silice modificati
sali inorganici (e.g.polifosfati)
vetri
zeoliti
ossidi di metalli (e.g. Al2O3)
derivati della cellulosa
Oltre a questi, esistono anche sistemi con una struttura molto complessa, per esempio gli scambiatori
anionici con gruppi funzionali costituiti da metalli alcalini legati alla fase stazionaria tramite eteri
corona. In pratica i più utilizzati sono resine polimeriche organiche modificate e gel di silice. La Figura
16 riporta una veduta d'insieme dei materiali di separazione in uso in IC:
Figura 16 Fasi stazionarie comunemente usate in cromatografia ionica [4]
Tutte le fasi stazionarie possono essere ulteriormente suddivise in base al tipo di applicazione
(cromatografia anionica o cationica) o in base alla struttura del gruppo funzionale. I materiali di
impaccamento a gel di silice furono i primi ad essere usati. Benchè abbiano una efficienza di
separazione molto buona e siano meccanicamente molto stabili, la loro instabilità chimica consente di
usarli solo nel range di pH tra 2 e 7.
E' dal 1980 che sono disponibili per la cromatografia gli scambiatori ionici con fase stazionaria
composta da polimeri organici prodotti modificando resine di adsorbimento già disponibili in
commercio. I materiali di impaccamento più moderni utilizzano o copolimeri di polistirenedivinilbenzene (PS-DVB) o polimeri di metacrilato (MMA).
Questi due tipi di polimero di base differiscono tra loro principalmente nella polarità. Il PS-DVB è
completamente non-polare ed è rappresentativo delle fasi RP mentre i polimeri MMA sono
relativamente polari. Questa caratteristica rappresenta un vantaggio in IC perchè le fasi di
separazione più polari hanno una minore tendenza a dare interazioni secondarie come
l'adsorbimento.
Il vantaggio più grande nell'impiego di resine polimeriche organiche è la loro grande stabilità chimica
in tutta la finestra di pH. Dopo aver risolto alcuni problemi iniziali la loro efficienza cromatografica è
diventata simile a quella del gel di silice. Tutavia, il MMA può avere una stabilità meccanica limitata, e
questo limita la lunghezza della colonna di separazione e la velocità massima di flusso dell'eluente
utilizzabili.
Un'ulteriore distinzione va fatta oggi tra due tipi di fasi stazionarie che differiscono per il principio
costruttivo; scambiatori ionici a superficie funzionalizzata e scambiatori ionici pellicolari. Nel primo tipo
i gruppi funzionali sono localizzati direttamente sulla superficie del polimero o nei pori; nei materiali
pellicolari le particelle, di dimensioni molto piccole (sempre funzionalizzate in superficie), si legano a
particelle centrali più grandi [4]. Il legame può essere meccanico o risultare da interazioni idrofobiche
o elettrostatiche. La Figura 17 mostra la configurazione dei due tipi di materiale di impaccamento
usando come esempio uno scambiatore di anioni.
– 30 –
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Figura 17
Struttura per scambiatori a superficie funzionalizzata (a) e pellicolari (b).
I materiali di impaccamento di tipo pellicolare hanno un'efficienza cromatografica più alta dovuta ad un
eccellente trasferimento di massa funzione di cammini di diffusione relativamente corti e di gruppi
funzionali relativamente lontani e quindi più esposti rispetto al materiale di base. Tuttavia, la stabilità
chimica di queste fasi di separazione è notevolmente minore di quella dei materiali a
funzionalizzazione superficiale.
3.6.2 Fasi stazionarie per cromatografia anionica
Il gruppo funzionale più comune in cromatografia anionica viene normalmente ottenuto per
funzionalizzazione amminica sulla superficie del polimero. In pratica i gruppi funzionali che prevedono
l’azoto come atomo centrale sono praticamente gli unici in uso per la separazione di anioni in
cromatografia ionica. Questo è dovuto alla loro inconsueta stabilità chimica ed al fatto che i sostituenti
possibili all'atomo d'azoto sono praticamente illimitati.
I gruppi ammonio vengono generati sulla superficie del polimero convertendo un gruppo R con
un'ammina. I residui alchilici all'azoto carico positivamente possono essere molto vari. Nel caso più
semplice R = H ed si forma uno ione ammonio primario. Questo gruppo può essere deprotonato a
valori di pH più alti perdendo così la carica. Perciò questo tipo di materiale di impaccamento ha una
capacità di scambio che dipende dal pH dell'eluente e per questo si dicono debolmente basici. Se gli
atomi di idrogeno vengono sostituiti da gruppi alchilici si ottengono gruppi ammonici primari, secondari
e terziari al crescere del numero di sostituzioni; anche questi possono subire deprotonazione tranne
quando tutti i residui R sono gruppi alchilici, e in questo caso la carica ovvero la capacità di scambio
restano invariate col pH dell'eluente. Quello che si ottiene è uno scambiatore anionico quaternario
fortemente basico. In cromatografia una capacità indipendente dal pH è una proprietà di pregio e
perciò i materiali completamente alchilati sono i più comuni. Per applicazioni speciali come l'analisi di
proteine o le tecniche di preconcentrazione vengono invece impiegati materiali debolmente basici.
I due gruppi funzionali più importanti in cromatografia anionica sono ricavati dalla trimetilammina
(TMA) e dalla dimetiletanolammina (DMEA). Praticamente tutti i materiali commerciali sono di questi
due tipi. I gruppi TMA sono anche noti in letteratura come Tipo I, i DMEA come Tipo II. Altri gruppi
funzionali simili a quelli menzionati sopra sono illustrati in Figura 18:
Figura 18
TMA:
EDMA:
DMEA:
Panoramica dei gruppi funzionali più importanti menzionati in questo lavoro
trimetilammina (Type I)
DEMA: dietanolmetilammina
etildimetilammina
TEA: trietanolammina
dimetiletanolammina (Type II)
La distribuzione esatta dei gruppi funzionali nei materiali commerciali derivati del Tipo I o II è tenuta
ben segreta [4].
– 31 –
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3.6.3 Fasi Stazionarie in cromatografia cationica
In cromatografia cationica sono in uso sia materiali a base di gel di silice che materiali polimerici. In
contrasto con la cromatografia anionica che generalmente usa eluenti alcalini, in cromatografia
cationica si lavora in condizioni che permettono l'uso del gel di silice.
3.6.4 Scambiatori cationici a base di gel di silice
Gli scambiatori di cationi a base di gel di silice si distinguono in due categorie: quelli direttamente
funzionalizzati e quelli che vengono rivestiti da un polimero.
Praticamente l'unico esempio di materiale funzionalizzato è costituito dagli scambiatori fortemente
acidi funzionalizzati con gruppi solfonici [a2, a4]. Questi presentano una buona efficienza
cromatografica, ma non sono adatti per la determinazione simultanea di metalli alcalini e alcalino
terrosi a causa della grande differenza di affinità tra i due gruppi.
Nel caso del gel di silice rivestito a polimero, la cosiddetta fase di Schomburg, la superficie del silicato
è rivestita con un "prepolimero" che viene successivamente immobilizzato con la tecnica del crosslinking. Per susseguente funzionalizzazione si ottengono poi vari tipi di scambiatore. Per ottenere
scambiatori di cationi debolmente acidi si usa l'acido polibutadienmaleico (PBDMA) che viene
reticolato con tecniche in-situ [30]. Come conseguenza del fatto che lo strato di polimero è sottile, tra 1
a 5 nm [31] i percorsi di diffusione dell'analita sono brevi e quindi il grado di efficienza cromatografica
risulta molto alto.
Esiste un considerevole numero di applicazioni per gli scambiatori a base di gel di silice, per esempio
una delle più comuni è la separazione simultanea dei metalli alcalini e alcalino terrosi. E' possibile
eseguire anche la separazione dei metalli di transizione e dei metalli pesanti. Tuttavia, ci sono diversi
svantaggi nell'uso di scambiatori ionici a base di gel di silice:
•
A [pH]< 2 il legame tra la matrice della silice ed il gruppo funzionale diviene sempre più
debole; questo conduce a un'erosione graduale dei gruppi funzionali e ad una perdita in
capacità.
•
A [pH]> 7 la solubilità del gel di silice aumenta notevolmente; questo implica una riduzione
della stabilità meccanica dell'impaccamento, si frantumano le particelle e si forma un volume
morto in testa alla colonna.
3.6.5 Scambiatori cationici a base di polimeri organici.
La matrice più diffusa è la resina prodotta dalla copolimerizzazione di stirene con divinilbenzene. Le
limitazioni menzionate per il gel di silice qui non esistono; possono essere usati in tutta la finestra di
pH da 0 a14 e sono anche inerti al fluoruro. Benchè la loro resistenza alla pressione sia minore di
quella del gel di silice generalmente è ancora adeguata. Eccezione sono alcune resine a base di
metacrilato.
La maggioranza degli scambiatori cationici disponibili commercialmente usano gruppi funzionali
solfonici. Questi sono legati all'anello aromatico o direttamente oppure per mezzo di una catena
spaziatrice detta spacer, la cui lunghezza è variabile. Gli scambiatori solfonici con una catena
spaziatrice hanno una efficienza cromatografica notevolmente migliore; la lunghezza della catena
spaziatrice è di importanza secondaria. Non sono adatti per la determinazione simultanea di metalli
alcalini e alcalino terrosi perchè anche in questo caso la differenza di affinità è troppo grande.
3.6.6 Scambiatori cationici pellicolari
Questo tipo di scambiatore presenta una struttura a doppio strato: si parte da particelle di substrato
completamente solfonate che vengono dapprima circondate da un strato di particelle amminate e poi
da uno di particelle di latex solfonate. L'ancoraggio si ottiene per interazione elettrostatica e di Van der
Waals. Il diametro relativamente grande delle particelle di substrato (10-30 [mm]) determina una
contropressione relativamente più bassa. Il diametro più piccolo (20-250 nm) delle particelle di latex
permette cammini di diffusione brevi con conseguenti processi dello scambio rapidi e perciò
un'efficienza di colonna molto alta. Lo svantaggio dei materiali pellicolari è la loro sensibilità ai solventi
organici [32] ed alle fasi mobili con una forza ionica elevata, in questo caso le particelle di latex
vengono rimosse gradualmente.
E' possibile determinare simultaneamente i metalli alcalini e alcalino terrosi usando una versione
modificata in cui lo strato amminato viene legato in modo covalente. Tuttavia, le differenze in
selettività tra potassio, magnesio e calcio sono grandi così che i tempi d'analisi richiesti sono
– 32 –
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relativamente lunghi. Questo fenomeno può essere ricondotto alla elevata forza acida dei gruppi
solfonici presenti.
3.6.7 Fasi stazionarie in cromatografia di esclusione ionica
La scelta di fasi stazionarie per IEC è molto limitata. La formazione della membrana di Donnan da
parte di gruppi funzionali dissociati è importante per il processo di separazione. Il loro numero
dovrebbe essere relativamente alto ed inoltre il materiale di impaccamento dovrebbe evitare
l’adsorbimento dell'analita nella fase stazionaria per quanto possibile. Poichè gli analiti principali sono
derivati dell'acido carbossilico e zuccheri, l'obiettivo è lavorare su superfici il più polari possibili. Le
cinetiche della reazione di scambio ionico non sono limitanti poichè la separazione è basata su un
meccanismo di esclusione. Polimeri PS/ DVB a bassa reticolazione sono quasi l'unico tipo impiegato;
essi sono completamente solfonati.
3.6.8 Il significato della capacità di uno scambiatore ionico
Come il tipo di matrice ed il tipo di gruppo funzionale, la capacità di scambio Q è una quantità decisiva
per caratterizzare uno scambiatore ionico. Fornisce informazioni sul numero di siti che sono disponibili
per lo scambio ionico [33].
La capacità di scambio è espressa normalmente in grammi di materiale di impaccamento disidratato,
oppure in microequivalenti (Yeq/ g) o micromoli (Ymol/g) [2]. Per scopi analitici gli scambiatori ionici
possono essere divisi grossolanamente secondo la loro capacità in:
•
•
•
materiali a bassa capacità:
materiali a media capacità:
materiali ad alta capacità:
Q< 100 Ymol/ g
100< Q< 200 Ymol/ g
Q> 100 Ymol/ g
Le fasi stazionarie usate per gli scambiatori ionici classici sono tutte del tipo ad alta capacità con un
valore compreso tra 3 e 5 mmol/g [4].
La definizione di capacità sopra riportata si basa sul presupposto che venga raggiunto l'equilibrio
completo tra la fase stazionaria e la fase mobile; perciò si tratta della definizione della capacità statica.
Invece con il termine di capacità dinamica (effettiva) si intende il numero di gruppi funzionali che è
davvero disponibile durante un processo cromatografico. Quest’ultima è sempre più piccola della
capacità statica [2, 4].
La capacità di scambio può essere determinata in diversi modi [33]:
•
•
•
volumetricamente o titrimetricamente
con l'analisi elementare
per determinazione dei tempi di ritenzione
Tutti i metodi forniscono diversi valori di Q per lo stesso materiale. I metodi volumetrici sono molto
usati nella pratica. Nel caso di scambiatori anionici la colonna impaccata o il definito quantitativo di
resina vanno caricati, per esempio con una soluzione di cloruro in modo che in tutti i siti della colonna
sia presente il cloruro. Si effettua quindi una eluizione del cloruro con nitrato. L'ammontare di cloruro
eluito, corrispondente alla capacità di scambio statica se siamo in condizioni di equilibrio, può essere
titolata con una soluzione di AgNO3 e perciò quantificata.
La dipendenza dal pH degli scambiatori ionici può essere di solito trascurata. Per gli scambiatori di
cationi la capacità dei gruppi debolmente acidi dell'acido carbossilico (R-COOH) si manifesta solo a
valori di pH alti (deprotonazione), mentre il gruppo solfonico fortemente acido (R-SO3H) è sempre
completamente deprotonato e fornisce una capacità indipendente dal pH.
Considerando i modelli di ritenzione (Sezione 3.4) è ovvia l'importanza di Q per la selezione
dell'eluente e del sistemi di rivelazione. La rivelazione a conducibilità era praticamente impossibile da
realizzare con eluenti con una forza ionica elevata, a prescindere dalle particolarità della tecnica che
si fosse usata. Questa è la ragione per cui, dall'introduzione della cromatografia ionica nel 1975,
venivano impiegate solo colonne a bassa capacità di separazione. E per questo che l'impiego di
scambiatori ionici ad alta capacità è stato segnalato solo nelle applicazioni IC in combinazione con
tecniche di rilevazione che non sono così fortemente limitate dal sistema d'eluizione, per esempio la
rivelazione UV / VIS [2, 4].
Mentre i materiali di separazione a bassa capacità sono molto appropriati per l'analisi di campioni con
una bassa forza ionica, appena la forza ionica aumenta rapidamente si manifestano effetti di
sovraccarico perchè il numero di gruppi funzionali è basso; col risultato che si ottengono picchi
– 33 –
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deformi e una drammatica caduta dell'efficienza. Si osservano problemi anche se gli analiti sono
presenti in concentrazioni molto diverse tra loro; questa situazione è frequente nell' analisi di
ultratracce.
3.7 Eluenti in cromatografia ionica
Come in tutte le separazioni LC, anche in cromatografia ionica la fase mobile è il parametro più facile
da variare per influenzare la separazione. Invece la colonna di separazione ed il sistema di rilevazione
sono nella maggior parte dei casi predefiniti.
La scelta di un sistema d'eluizione appropriato può essere fatta usando differenti criteri. In
cromatografia anionica i parametri che comunque vanno tenuti in considerazione sono [4]:
•
•
•
•
•
la compatibilità col metodo di rivelazione
natura chimica e concentrazione dell'eluente ionico
pH
la capacità tamponante
il contenuto di solvente organico (modificatori)
In letteratura [2,4,5] la discussione sulle fasi mobili da sciegliere verte principalmente sulla definizione
della loro adeguatezza per la tecnica a colonna singola o per la tecnica con sopressione chimica. Sarà
così anche nel nostro caso, sebbene il punto focale del soggetto di questo lavoro vogliamo che resti la
capacità di scambio Q della colonna di separazione. Chiariamo brevemente i termini "tecnica a singola
colonna" e "tecnica con soppressore". Come nella sezione precedente, le osservazioni saranno
limitate principalmente alla cromatografia anionica.
3.7.1
Cromatografia anionica
Tecnica a singola colonna
Nella tecnica a singola colonna, che fu introdotta in cromatografia ionica da Gjerde e colleghi nel 1979
[33], l'uscita della colonna di separazione viene connessa direttamente al detector; questa è la
configurazione classica di un apparato HPLC. Per distinguerlo dalla seconda tecnica principale di IC
questa tecnica è chiamata anche "cromatografia ionica non-soppressa". L'eluente contenente gli
analiti lascia la colonna di separazione senza venir alterato chimicamente. Il numero di sistemi
dell'eluizione possibili con diverse caratteristiche chimiche è quasi illimitato. Oltre al problema della
separazione in se stesso, c'è solo un'altro aspetto che va tenuto in debita considerazione: la
compatibilità dell'eluente con il detector. Per esempio se viene impiegato l'UV diretto come tecnica di
rivelazione allora l'eluente non deve assorbire nella zona spettrale di interesse. Nella tecnica a
colonna singola non c'è nessuna limitazione per il sistema di rilvelazione così che in linea di principio
tutti i detector usati in HPLC vanno bene.
Se si lavora con la tecnica a singola colonna e con scambiatori anionici di bassa capacità (Q< 100
Ymol/ colonna di separazione) si può sciegliere fra una vasta serie di eluenti con diverse
caratteristiche chimiche. La concentrazione degli eluenti è dell’ordine di mmol/ kg o anche inferiore.
Inoltre, si possono anche usare sostanze come quelle elencate di seguito [4] ed in alcuni casi anche
agenti complessanti come EDTA o borato-mannitolo.
•
•
•
•
•
acidi carbossilici aromatici
acidi carbossilici alifatici
acidi solfonici
idrossidi alcalini
acidi inorganici come H2SO4, HCl o H3PO4
Di questi la classe più importante è rappresentata dagli acidi carbossilici aromatici ed i loro sali. In
Figura 19 illustriamo i casi più comuni:.
– 34 –
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Figura 19 Strutture dei più importanti acidi carbossilici aromatici usati con la tecnica della singola
colonna.
Questa classe di sostanze viene usata così frequentemente perchè le soluzioni degli acidi ed i loro
sali hanno un potere di eluizione molto alto combinato con una conducibilità propria relativamente
bassa, così che possono essere usati per la rivelazione con i sistemi a conducibilità diretta. Usando
acidi polibasici la carica e perciò il potere d'eluizione può essere controllato con il pH. Tuttavia, in
questo caso il pH deve essere controllato con grande precisione. Gli acidi carbossilici aromatici hanno
un alto assorbimento nell'UV così che si possono usare vantaggiosamente nella rivelazionen UV/ VIS
indiretta.
Anche per gli acidi aromatici solfonici come l'acido para-toluensolfonico si possono fare in linea di
principio le stesse considerazioni; essi sono sempre completamente deprotonati e perciò non
possiedono capacità tampone. Il loro potere di eluizione si controlla solo agendo sulla concentrazione.
Gli acidi carbossilici alifatici come l'acido ossalico o l'acido citrico hanno una conducibilità propria alta
ma sono trasparenti nell'UV, così che possono essere usati per la rivelazione UV / VIS diretta. Questo
vale anche per acidi alifatici solfonici, il più comune è l'acido metansolfonico. Gli omologhi superiori di
queste due classi di composti a catena idrocarburica lunga sono caratterizzati da una conducibilità
equivalente bassa e questo consente di usarli con tecniche di rivelazione in conducibilità diretta [2,4].
Gli idrossidi alcalini hanno un uso molto limitato nella tecnica a colonna singola, perchè lo ione OH- ha
la più bassa affinità per il gruppo ammonio quaternario di tutti i possibili anioni nell'eluente. Perciò
bisogna usare concentrazioni dell'eluente così alte anche per colonne a capacità basse che solo la
rivelazione a conducibilità indiretta dà buoni risultati. Invece la rivelazione UV/VIS è praticabile
facilmente, perché lo ione idrossido ha un assorbimento caratteristico sotto i 220 nm ad elevate
concentrazioni.
Nel caso degli acidi inorganici o dei loro sali vista la loro dissociazione completa e l'alta conducibilità
ad essa associata è possibile impiegare solo rivelatori fotometrici. Nel caso dell'acido fosforico e dei
sali fosfato si può controllarne la capacità tampone ed il potere di eluizione agendo sul pH dell'eluente.
Per la maggior parte degli eluenti appena menzionati è possibile l'uso di altri sistemi di rivelazione
come quello amperometrico o fluorimetrico o ancora con tecniche accoppiate. Per l'impiego degli
eluenti menzionati con questi tipi di detector vi rimandiamo alla letteratura attinente [2,4,5].
Tecnica con soppressore
La tecnica con soppressore chimico è la tecnica di rivelazione originalmente introdotta con la IC [1]. A
differenza della tecnica a singola colonna, questo metodo usa solo la rivelazione a conducibilità. Nella
tecnica con soppressore o "cromatografia ionica soppressa" il così detto soppressore viene inserito tra
la colonna di separazione ed il detector [2,4]. Sia l'eluente che gli analiti vengono chimicamente
modificati nel soppressore, questa operazione è di particolare importanza per la susseguente misura
di conducibilità. Il soppressore ha il compito di abbattere la conducibilità dell'eluente e, se possibile, di
aumentare la rivelabilità degli analiti.
Il principio di soppressione chimica viene illustrato dalle Equazioni 63 e 64 per un'applicazione di
cromatografia anionica. Si impiega come eluente NaHCO3 , lo ione cloruro è l'analita. La soppressione
+
viene eseguita con uno scambiatore cationico fortemente acido del tipo H .
-
R-SO3 H + Na + HCO3
+
+
R-SO3 Na + H2O + CO2
(63)
- +
R-SO3 H
+
+
R-SO3 Na
(64)
-
+ Na + Cl
-
+
+
-
+ H + Cl
Nel caso più semplice il soppressore consiste di una colonna che viene inserita dopo la colonna di
separazione, da qui l'origine del termine più vecchio "tecnica a due colonne". L'eluente bicarbonato di
sodio viene neutralizzato secondo l' Equazione 63, in cui gli ioni sodio vengono sostituiti da protoni.
Questo abbassa drasticamente la conducibilità dell'eluente. L'analita Cl non viene alterato (Equazione
+
+
64), ma il suo controione Na viene sostituito con H che ha una conducibilità equivalente
– 35 –
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notevolmente più grande [19]. Poichè il detector registra come segnale la somma delle conducibilità
dell'analita e del suo controione, le due reazioni descritte hanno come risultato un chiaro
miglioramento della sensibilità.
+
Le colonne con scambiatori cationici del tipo ad H che venivano originalmente utilizzate come
soppressori causavano un considerevole allargamento dei picchi. Inoltre dovevano operare in
discontinuo perchè lo scambiatore di cationi doveva essere rigenerato. Questo è il motivo per cui i
sistemi continui a membrana sono stati subito prediletti non appena introdotti, in questi l'agente
rigenerante, di solito acido solforico diluito, e l'eluente vengono fatti passare l'uno sull'altro in un
sistema in controcorrente [6].
Malgrado i suoi vantaggi la tecnica del soppressore ha anche diversi svantaggi cruciali. In pratica in
cromatografia ionica si possono sopprimere con successo solo gli eluenti derivati dagli idrossidi
alcalini e dai carbonati. Gli anioni di acidi più deboli, come l'acetato o il fluoruro, sono quasi
completamente protonati dopo la reazione di soppressione, così che la loro rivelabilità viene
abbassata di molto in confronto con la tecnica della singola colonna. I cationi ad alta valenza devono
essere rimossi prima dell'analisi perchè formano idrossidi insolubili che precipitando in colonna di
separazione possono bloccarla.
Come è stato chiarito, la tecnica del soppressore è sinonimo di impiego della soppressione chimica
dell'eluente e di una rilevazione diretta della conducibilità [2, 4]. Questa tecnica è insolitamenta diffusa
in cromatografia anionica, e questo principalmente perchè in molti casi è più sensibile della rivelazione
di conducibilità diretta accoppiata alla tecnica della singola colonna. La conducibilità propria degli
eluenti classici per la tecnica a singola colonna (per es. 2 mmol/ Kg di ftalato, pH= 8) è di 200 YS/ cm.
Per eluenti sopprimibili essa risulta più bassa almeno di una potenza di dieci.
La soppressione chimica della conducibilità è possibile solo per alcuni eluenti. Si tratta di soluzioni di
[4]:
•
•
•
•
idrossidi alcalini
carbonati e bicarbonati alcalini
2borati (B4O7 )
amminoacidi
In pratica degli eluenti menzionati sopra solo gli idrossidi alcalini e le soluzioni tampone dei carbonati
sono di grande importanza, e ciò implica quindi una scelta della fase mobile molto limitata.
Lo ione idrossido è uno ione estremamente debole, così che anche con materiali di separazione a
bassa capacità si deve lavorare a concentrazioni elevate sopra le 50 mmol/kg. Se si impiegano gruppi
funzionali molto polari allora la forza di ritenzione relativa dell'OH può essere aumentata
notevolmente sfruttando la selettività dell'idrossido. Con eluenti del tipo OH si può intervenire sui
tempi di ritenzione o sulla selettività solo agendo sulla concentrazione.
L'uso di carbonati e bicarbonati permette di avere sistemi di eluizione più flessibilii. Entrambe le
2-,
specie, HCO3 e CO3 si convertono in acido carbonico H2CO3 dopo soppressione; questo è
dissociato solo in piccolissima parte. Per quanto concerne il potere di eluizione il bicarbonato è solo
leggermente più forte dell'idrossido, mentre il carbonato è un eluente forte.
Emtrambi gli anioni sono normalmente copresenti; questo eluente quindi si caratterizza per un effetto
tampone e quindi per un potere d'eluizione che può essere facilmente controllato agendo sulle
concentrazioni dei due componenti ed sul rapporto tra di esse. Grazie alle cariche delle due specie
ioniche presenti nell'eluente la selettività nei confronti di analiti monovalenti o divalenti può essere
influenzata in modo selettivo. Il rapporto di concentrazione dei due ioni dell'eluente può essere
aggiustato con grande precisione agendo sul pH, per questo si trova che il pH degli eluenti del tipo
2HCO3 / CO3 varia tra 8 e 11. Sempre per conseguenza di quanto visto sopra per eluenti del tipo OH
l'eluizione può essere accelerata con l'uso di fasi stazionarie con gruppi funzionali polari.
Entrambi i sistemi d'eluizione possono venire usati con successo con scambiatori anionici
funzionalizzati in superficie, solo quando o la matrice (copolimero del metacrilato) o il gruppo
funzionale hanno una polarità molto alta. Con colonne di separazione del tipo PS-DVB si sono
osservate per gli analiti deboli (es, nitrato e bromuro) simmetrie di picco molto povere e tempi di
ritenzione lunghi e questo anche usando gruppi funzionali polari. Con materiali pellicolari questi effetti
non sono così marcati e ciò spiega l'uso molto esteso che se ne fa nelle tecniche di soppressione
[2,4].
– 36 –
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3.7.2
Cromatografia cationica
3.7.2.1 Cromatografia cationica di metalli alcalini, alcalino terrosi e dello ione ammonio con
rivelazione a conducibilità
Gli eluenti di uso più comune nella separazione dei metalli alcalini e dello ioni ammonio così come
delle ammine alifatiche a catena breve su fasi stazionarie solfonate sono gli acidi minerali HCl e HNO3
[4]. La concentrazione dell'acido nell'eluente viene scelta in funzione del tipo e della capacità dello
scambiatore di cationi usato ed è generalmente di alcune mmol/L. I cationi divalenti come le terre
alcaline non possono essere eluite con acidi minerali perchè hanno un'alta affinità per la fase
stazionaria e l'aumento della concentrazione dell'acido renderebbe la rivelazione troppo insensibile o
impossibile la soppressione. Come alternativa per la separazione degli ioni dei metalli alcalino terrosi
si può usare una base organica come l'etilendiammina. A valori di pH bassi essa è protonata ed è
presente come catione divalente.
L'analisi simultanea dei metalli alcalini ed alcalino terrosi su scambiatori cationici fortemente acidi
viene eseguita principalmente con eluenti che contengono acido cloridrico e acido 2,3diamminopropionico [2]. Controllando il pH è possibile alterare il grado di protonazione dei gruppi
amminici e perciò il potere di eluizione dell'acido 2,3-diamminopropionico (vedi Sezione: Modelli di
ritenzione per eluenti monocationici).
Nei sistemi senza soppressione si possono usare come eluenti anche gli acidi organici deboli oltre che
gli acidi minerali. Acidi organici abbastanza diffusi sono l'acido ossalico, l'acido citrico, l'acido tartarico.
Agenti complessanti come l'acido 2,6-piridin-dicarbossilico (PDCA) e il 18-crown-6 vengono usati per
influenzare selettivamente i tempi di analisi di singoli cationi.
Ci sono due diversi tipi di rilevazione a conducibilità. Se la conducibilità di fondo dell'eluente è alta, per
+
esempio utilizzando acidi minerali diluiti a causa dell'elevata conducibilità di H , allora è possibile la
rilevazione della conducibilità diretta solo con analiti con una conducibilità chiaramente più bassa
dell'eluente. Questo significa che si produrranno picchi negativi che tuttavia, si possono convertire in
un cromatogramma normale per inversione delle polarità del detector o anche semplicemente per via
grafica. Se la qualità del detector di conducibilità non permette misurazioni sensibili di conducibilità a
un livello così alto allora è necessario usare la soppressione anche in cromatografia cationica. La
costruzione di soppressori per cromatografia cationica è più difficile che per la anionica ed essi hanno
durate molto più brevi rispetto a quelli anionici.
3.7.2.2 Cromatografia cationica dei metalli di transizione dei metalli alcalino terrosi con
derivatizzazione post-colonna e rilevazione fotometrica
+
+
I cationi monovalenti come H o Na non sono adatti come eluente per la separazione dei metalli di
transizione e dei metalli pesanti perchè i coefficienti di selettività di questi analiti differiscono di poco a
parità di numero di carica. Tuttavia la separazione si può realizzare introducendo un equilibrio
secondario. A tal fine si impiegano come eluenti acidi carbossilici che formano complessi (vedi Figura
20) come l'acido citrico, l'acido ossalico e l'acido tartarico. Insieme con gli ioni del metallo questi
formano complessi neutri o anionici (vede Sezione: Modelli di ritenzione in cromatografia ionico).
Figura 20
Vari acidi carbossilici usati come eluenti in cromatografia cationica.
Complessando i cationi del metallo la densità di carica effettiva degli analiti viene ridotta.
Concomitantemente le diverse costanti di formazione dei complessi dei singoli ioni metallici
aumentano la selettività della separazione. Il meccanismo dell'eluizione è dovuto al dislocamento
isoionico da parte del controione (effetto di spinta) e alla formazione del complesso (effetto trainante)
da parte dei leganti presenti [4].
2+,
La Figura 21 mostra gli equilibri tra gli analiti M
partecipano al meccanismo d'eluizione.
2-
+
l'agente complessante L ed i controioni E che
– 37 –
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Figura 21 Diagramma schematico degli equilibri che partecipano al processo di scambio [4].
+
L'entità dello spostamento isoionico da parte dei controioni E è determinato dall'affinità del catione
per la fase stazionaria. Con controioni monovalenti il catione con l'affinità più grande per la fase
stazionaria ha una maggiore forza eluente. L'influenza dell'agente complessante può essere variata
agendo sul pH e sulla concentrazione dell'eluente. Inoltre il potere di eluizione può essere influenzato
impiegando diversi agenti complessanti o anche usando come controione un catione divalente.
Mentre entrambi i tipi di rilevazione a conducibilità disponibili sono appropriati per la rivelazione di
metalli alcalini, gli ioni dei metalli di transizione e dei metalli pesanti possono essere determinati solo a
mezzo di misurazioni di conducibilità diretta e senza soppressore. Infatti con la reazione di
soppressione questi metalli vengono convertiti in idrossidi sostanzialmente insolubili. La rilevazione
diretta della conducibilità è possibile solo quando si usano eluenti con una conducibilità di fondo bassa
e scambiatori cationici a bassa capacità.
Queste sono le ragioni per cui la derivatizzazione post-colonna con formazione di complessi metallici
rilevabili fotometricamente è la tecnica più usata per la rilevazione dei metalli di transizione. Dopo aver
lasciato la colonna di separazione l'eluato si mescola con una reagente metallocromico in un postreattore; questo reagisce con gli analiti per formare complessi del metallo colorati che possono essere
rilevati fotometricamente. Esiste una grande varietà di azo-composti che possono essere usati come
agenti coloranti [2, 4]; questi reagiscono con quasi tutti i cationi metallici. I metalli di transizione e i
lantanidi per esempio reagiscono con il 4-(2-piridilazo)resorcinolo (PAR) (Figura 22) per formare
complessi colorati. Lantanidi e attinidi possono essere analizzati impiegando l'acido 2,7-bis(2arsenofenilazo)1,8-diidrossinaftalene-3,6-disolfonico (Arsenazo III). L'acido pirocatecol-3,5-disulfonico
(Tiron) è invece adatto per la derivatizzazione post-colonna dell'alluminio.
Figura 22 Struttura dell'indicatore PAR
Il PAR viene impiegato principalmente per la rilevazione degli ioni dei metalli di transizione. Forma
complessi colorati con Fe Co, Ni, Cu, Zn, Mn, Pb e Cd che assorbono a lunghezze d'onda tra 490 e
4
-1
-1
520 nm con coefficienti di assorbimento fino a 10 L mol cm rilevabili fotometricamente. La
sensibilità del metodo è dovuta al fatto che i coefficienti di estinzione del complesso metallo-PAR
sono grandi comparati col coefficiente di assorbimento dei reagenti alle lunghezze d'onda di lavoro.
3.7.2.3 Cromatografia di esclusione ionica
In IEC la scelta del sistema di eluizione come del materiale d'impaccamento, non è mai molto
entusiasmante. Si va dall'acqua pura agli acidi minerali diluiti. Quando si seleziona il sistema più
appropriato è anche necessario prendere in considerazione le limitazioni sul sistema di rilevazione. I
sistemi di rilevazione più usati restano comunque il fotometrico e la conducibilità. Con la rilevazione
– 38 –
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fotometrica gli acidi solforico e perclorico diluiti sono gli eluenti più usati per via della loro perfetta
trasparenza nell'UV. Quando si lavora in rivelazione a conducibilità, l'acido solforico diluito è l'eluente
preferito perchè produce buoni cromatogrammi con un minimo di equipaggiamento (non è necessaria
la soppressione). In combinazione con un soppressore per cromatografia cationica si usa l' acido
cloridrico diluito.
La concentrazione dell'acido nell'eluente determina il grado di dissociazione degli analiti e perciò
anche il loro grado di ritenzione la quale, in genere, diminuisce al crescere della concentrazione
dell'acido. La forma del picco è pure influenzata dalla concentrazione dell'acido. Per gli acidi organici
l'acqua pura di solito non è un buon eluente a causa dell’adsorbimento crescente, benchè produca
risultati eccellenti per il carbonato e l'acido borico.
– 39 –
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4
Sezione sperimentale
La sezione pratica di questo manuale presenta esperimenti che forniscono nel loro complesso
un'introduzione particolareggiata al mondo della cromatografia ionica. Si parte con un gruppo di
esperimenti che coprono tutta la teoria della cromatografia ionica (capitolo 4.2); la seconda parte
(capitolo 4.3) continua con determinazioni di anioni e la terza e ultima parte (capitolo 4.4) tratta
l'analisi di cationi organici ed inorganici.
In linea di principio gli esperimenti possono essere eseguiti su qualunque cromatografo ionico.
Tuttavia, l'equipaggiamento minimo dello strumento deve soddisfare i seguenti requisiti:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
pompa a doppio pistone a basse pulsazioni
controllo del flusso secondo le esigenze dettate dalla colonna
valvola di iniezione elettronica
possibilità di inserire loop con volumi diversi per il campione e colonne di preconcentrazione
soppressione elettronica per anioni e cationi
soppressione chimica per anioni
detector a conducibilità con stabilizzazione della temperatura, se possibile migliore di ±0.01 °C
alloggiamento isolato termicamente ed elettronicamente
predisposizione operativa per anioni e cationi
consigliato il controllo da computer
Tutti i sistemi IC, modulari e compatti della Metrohm rispondono a queste esigenze nella loro
concezione di base. Tuttavia, il modello 792 IC Basic è disegnato espressamente per l'addestramento
e l'insegnamento ed è perciò l'ideale per eseguire gli esperimenti seguenti.
Figura 23 Il Metrohm 792 IC Basic: espressamente sviluppato per l'addestramento e
l'insegnamento
4.1 Informazioni pratiche di lavoro
Crescita batterica
Per prevenire la crescita batterica, l'eluente e le soluzioni di lavaggio e rigenerazione dovrebbero
essere sempre preparate di fresco e non usate per periodi di tempo troppo lunghi. Se la crescita
batterica o la formazione di alghe si dovesse comunque verificare allora si consiglia di aggiungere
all'eluente il 5% di metanolo o acetone. Se si impiegano soppressori a membrana questo non è
possibile perchè la membrana viene distrutta dai solventi organici. Tuttavia, il modulo di soppressione
Metrohm "MSM" è resistente al 100% a tali solventi.
Analisi di cationi
Nell' esecuzione di ciascuna analisi il campione deve essere acidificato (pH 2.5 - 3.5) con acido nitrico
(circa 100 YL 2 mol/ L HNO3 a 100ml di campione), altrimenti i cationi divalenti non danno risultati
riproducibili.
– 40 –
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Grado chimico
Tutti i reagenti usati dovrebbero essere almeno di grado p.a. (grado analitico) o puriss. (purissimo). Gli
standard usati devono essere specifici per cromatografia ionica; per esempio il sale di sodio dovrebbe
essere in acqua, non in acido.
Sorgenti di contaminazione
Tutte le soluzioni, i campioni, le soluzioni di rigenerazione, l'acqua e gli eluenti dovrebbero essere
esenti da particelle che possono danneggiare o bloccare la colonna di separazione (aumento di
pressione in colonna). Questo problema è particolarmente importante quando si preparano gli eluenti
inquanto questi flussano in colonna continuamente (500-1000 mL per giorno di lavoro, la quantità
giornaliera di campione è invece circa 0.5 mL).
Degassaggio dell'eluente
Per evitare la formazione di bolle si raccomanda che l'acqua usata per preparare l'eluente venga
degasata prima di aggiungere i reagenti. Il degasamento si ottiene applicando il vuoto con una pompa
da vuoto o con una pompa ad acqua per circa 10' o ancora usando un bagno ad ultrasuoni.
Protezione ambientale
Uno dei grandi vantaggi della cromatografia ionica è che si lavora con sistemi acquosi. Perciò i
reagenti impiegati in IC sono sostanzialmente non tossici e non inquinanti. Tuttavia la dovuta cura va
posta nello smaltimento di acidi, basi, solventi organici o standard di metalli pesanti ogni volta che se
ne fa uso.
Spegnimento dello strumento
Se il cromatografo ionico non viene usato per un periodo più lungo di 1 settimana, la colonna di
separazione dovrebbe essere rimossa ed il cromatografo ionico andrebbe risciaquato con una
soluzione metanolo/acqua (1: 4). Particolare attenzione va posta nel pulire tutte e tre le celle del
soppressore.
Informazioni di sicurezza
È buona norma indossare occhiali protettivi, abbigliamento protettivo e, se necessario i guanti
protettivi quando si eseguono tutti gli esperimenti. Assicurarsi di osservare le frasi di rischio riportate
in etichetta in tutti i prodotti chimici impiegati.
Scelta della colonna
La maggior parte degli esperimenti descritti sono eseguiti su colonne economiche - Metrosep Anion
Dual 1 per anioni e Metrosep C2 per cationi. Queste colonne forniscono una buona separazione in
tutti gli esperimenti descritti. Ovviamente i prodotti Metrosep includono varie altre colonne di
separazione che hanno un'efficienza notevolmente maggiore, ma sono anche più costose.
Conservazione delle colonne di separazione
•
Colonna per anioni Metrosep Anion Dual 1 (6.1006.020)
Per una conservazione senza utilizzo, a breve termine (giorni) la cartuccia della colonna si conserva
nel suo alloggiamento chiuso. Per una conservazione più lunga (settimane) la colonna va conservata
al buio nel suo contenitore di deposito riempito con acetone/ acqua (1: 9).
– 41 –
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Figura 24 Colonna Metrosep Anion Dual 1 (6.1006.020) con supporto
•
Colonna per anioni Metrosep A Supp 5 (6.1006.530)
La colonna va conservata in eluente.
•
Colonna per cationi Metrosep C2 (6.1010.210)
La colonna va conservata in eluente ed in frigorifero (4 °C). È essenziale che la colonna non resti mai
a secco.
Figura 25 Colonna per cationi Metrosep C2 (6.1010.210)
•
Colonna per cationi Nucleosil 5SA (6.1007.000)
Per la conservazione a breve termine (giorni) la colonna si conserva in eluente, per la conservazione
a lungo termine (settimane) in metanolo/ acqua (1: 4).
•
Colonna Metrosep Organic Acids (6.1005.200)
Per la conservazione a breve termine (giorni) la colonna si conserva in eluente, per la conservazione
a lungo termine (settimane) in acqua deionizzata.
•
Colonne di separazione di altre marche
Si rimanda alle istruzioni del produttore.
Qualità dell'acqua
In cromatografia ionica si impiegano prevalentemente mezzi acquosi. Perciò la qualità dell'acqua è
cruciale per avere buoni risultati. Se la qualità dell'acqua è insoddisfacente anche i risultati lo saranno.
Inoltre c'è il pericolo di danneggiare lo strumento e la colonna di separazione. L'acqua deionizzata che
si impiega dovrebbe avere perciò una resistività di 18.2 M# ed essere libera da particelle. A tal
proposito è importante che l'acqua venga filtrata attraverso un filtro da 0.45 Ym.
– 42 –
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4.2 Esperimenti che percorrono l'intera teoria sulla cromatografia ionica
4.2.1
Esperimento 1 - Cromatografia ionica con e senza soppressione chimica
La conducibilità equivalente
è sempre data dalla somma delle conducibilità equivalente di tutti gli
–
+
e cationi
in soluzione:
anioni
=
+
–
+
In linea di principio la conducibilità aumenta con la concentrazione dell'elettrolita o degli ioni. In realtà
una relazione lineare esiste solo per soluzioni diluite dato che dipende dalla concentrazione (legge
di Kohlrausch). I valori che si trovano nelle tabelle (vedi capitolo "detector a conducibilità") forniscono
in realtà i valori di
– conducibilità equivalente in soluzioni a diluizione infinita.
L'entità della conducibilità equivalente dipende in larga misura dalla temperatura (± 2% / °C). In
particolare, per misurazioni senza soppressione chimica, e cioè in pratica con una conducibilità di
fondo alta, gli errori causati da una variazione in temperatura sono estremamente visibili. Perciò le
fluttuazioni della temperatura del detector non dovrebbero essere più grandi di 0.01 °C.
In cromatografia anionica senza soppressione chimica, in cui la conducibilità di fondo è soppressa
elettronicamente, l'eluente dovrebbe avere la conducibilità più bassa possibile. In questo caso è utile
impiegare i sali degli acidi deboli come lo ftalato, il salicilato e il benzoato. I valori misurati senza
soppressione chimica sono la differenza di conducibilità equivalente tra lo ione del campione e lo ione
dell'eluente.
$ ~(
P
–
E)
Picchi negativi si osservano quando la conducibilità dello ione del campione è più bassa di quella dello
ione dell'eluente. Un esempio di ciò è l'anione fosfato: a pH= 5 è presente principalmente come
2
è di 33 Sxcm /mol, risulta più bassa di quella dello
H2PO4 e poichè la sua conducibilità equivalente
2
ftalato che è di 38 Sxcm /mol; ne risulta quindi un picco negativo e molto piccolo. Si può ovviare a ciò
2lavorando ad un pH più alto, a cui il fosfato sia presente come HPO4 con una conducibilità
2
di 57 Sxcm /mol.
equivalente
Quando la conducibilità di fondo viene abbattuta chimicamente si parla di cromatografia ionica con
soppressione chimica. L'eluente con una conducibilità alta viene convertito con una reazione postcolonna (la reazione di soppressione) in un'eluente con un conducibilità bassa.
–
2–
Nell'analisi di anioni questo si ottiene utilizzando come eluenti sali di acidi deboli, come HCO3 , CO3
3–
+
e BO3 . Tutti i cationi presenti nell'eluente e nel campione vengono scambiati con H nel soppressore.
L'eluente forma in questo modo degli acidi che sono debolmente dissociati in base alla reazione
seguente:
-
+
Na + HCO3
+
+
+H Na
%%
%%& H2CO3
L' acido carbonico che si forma è presente principalmente come CO2 + H2O. La conducibilità
+
rimanente è quindi molto bassa. Poichè anche i controioni degli anioni vengono sostituiti con H nel
soppressore, si può scrivere l'equazione seguente:
+
-
Na + Cl
+
+
+H Na
%%
%%& H+ + Cl+
-
Invece di quella dell’Na e del Cl originariamente presenti nel campione, ora viene misurata la
+
conducibilità equivalente di H e Cl che è notevolmente più alta rispetto ad una conducibilità di fondo
più bassa. Teoreticamente ci si aspetta un segnale aumentato di un fattore dieci rispetto alla misura
senza soppressione chimica. Tuttavia, l'aumento in sensibilità osservato in pratica è solo di un fattore
2-4.
A differenza della calibrazione lineare caratteristica delle condizioni di lavoro senza soppressione
chimica, in questo caso la funzione di calibrazione migliore è quadratica; questo significa che per il
calcolo è necessario fare una calibrazione multi-punto. La finestra di concentrazione ad interpolazione
lineare è notevolmente più piccola (circa 1/ 20 - 1/ 50) di quando si lavora senza soppressione
chimica.
Contenuto informativo
•
Principi di configurazione di un sistema IC
– 43 –
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•
Differenze di lavoro con e senza soppressione chimica
•
Determinazione delle diverse sensibilità dei due metodi
Esperimento 1a – Analisi senza soppressione chimica
Tabella 3
Parametri- Esperimento 1a
Colonna
6.1006.020 Metrosep Anion Dual 1 (3 x 150 mm)
Eluente
8 mmol/ L acido ftalico, 2% acetonitrile;pH= 4.1 (TRIS)
conducibilità circa 400 YS/cm
Campioni
standard (fluoruro, cloruro, nitrito, bromuro, nitrato, fosfato, solfato)
Metodo
exp_01_n.mtw
Sistema
anionsupp.smt
Flusso
0.5 mL/min
Pressione
3 MPa
Tempo dell'analisi
20 min
Loop
100 YL
Polarità
+
Preparazione dell'eluente
Dissolvi 1.33 g di acido ftalico in 20 mL di acetonitrile ed una piccola quantità di acqua e porta a 1 L.
Aggiusta il pH a 4.1 per aggiunta di circa 1 g di TRIS (solido). Prima di aggiungere i reagenti degasa
l'acqua impiegata applicando il vuoto di una pompa a getto d'acqua per 10 min o usando un bagno ad
ultrasuoni.
Cromatogramma 1 Soluzione standard
Tabella 4
Componenti - Esperimento 1a
Picco
Componente
[tR] [ min]
Conc.[mg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
1
Fluoruro
3.6
5
2310
51
– 44 –
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2
Cloruro
4.9
5
3680
71
3
Nitrito
5.7
5
3670
36
4
Bromuro
6.7
10
3960
63
5
Nitrato
7.8
10
3890
74
6
Solfato
10.9
10
3430
88
7
picco di sistema
17
Esperimento 1b - Analisi con soppressione chimica
Tabella 5
Parametri - Esperimento 1b
Colonna
Eluente
2.4 mmol/L NaHCO3 / 2.5 mmol/L Na2CO3 + 2% acetone.
conducibilità dopo soppressione chimica circa 16 YS/ [cm]
Campione
Metodo
exp_01_s.mtw
Sistema
asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
3 MPa
Tempo d'analisi
16 min
Loop
20 YL
Soppressore
soluzioni rigeneranti: 50 mmol/ L H2SO4, acqua ultrapura.
autostep con valvola di iniezione in posizione “fill”
Polarità
+
Dissolvi 265 mg di sodio carbonato (anidro) e 201.5 mg di bicarbonato di sodio in 980 mL di acqua
ultrapura. Quindi aggiungi 20 mL acetone.
– 45 –
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Cromatogramma 2 Soluzione Standard
Tabella 6
Componenti - Esperimento 1b
Picco
Componente
tR [min]
Conc. [mg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
1
Fluoruro
3.8
2
2780
48
2
Cloruro
5.7
5
4100
81
picco di sistema
6.8
3
Nitrito
7.3
5
3900
46
4
Bromuro
8.6
10
4510
69
5
Nitrato
10.4
10
4480
87
6
Fosfato
11.7
10
3220
43
7
Solfato
14.4
10
3660
113
Il picco di sistema è significativamente più piccolo che nell'esperimento 1a, cromatogramma 1, e può
perciò essere individuato solo impostando un fondo scala di conducibilità molto basso.
4.2.2 Esperimento 2 - Capacità di una colonna di separazione
Se i picchi si presentano tagliati o sagomati a pinna di squalo, o hanno tempi di ritenzione non
costanti, o picchi scodati o prolati, tutti questi problemi possono avere una causa comune:
sovraccarico della colonna.
Ciascuna colonna ha un numero limitato di siti di scambio ionico. Prima che il campione venga
iniettato essi sono occupati interamente dagli ioni dell'eluente. Quando il campione viene iniettato, lo
scambio ionico comincia ad aver luogo: ioni dell'eluente si scambiano con ioni del campione e ioni del
campione con ioni dell'eluente. Poichè ciascuna specie ionica differisce nella sua costante di legame,
ciascuna eluisce attraverso la colonna con una sua velocità. Il risultato è la separazione della miscela
di sostanze in uscita e perciò il cromatogramma.
Questo processo funziona perfettamente solo se il numero di siti di scambio è sostanzialmente più
alto del numero dei legami richiesti dal campione iniettato. Per esempio una colonna con una capacità
di 1 meq (milliequivalente) può legare un massimo di 1 mmol di ioni monovalenti.
Un secondo effetto che ha un'influenza negativa sulla separazione è il fatto che in linea di principio
ciascuno ione può agire come uno ione dell'eluente. Se la colonna è sovraccaricata allora la maggior
parte degli ioni dell'eluente è sostituito da ioni del campione. Questo implica modifiche incontrollabili
degli equilibri della colonna e la separazione diviene peggiore.
La capacità di una colonna può essere determinata occupando tutti i siti con ioni cloruro. Dopo un
lavaggio con acqua deionizzata il cloruro viene eluito con un'eluente carbonato e successivamente
quantificato con un’analisi in cromatografia ionica o con una titolazione argentometrica.
Nell'esperimento seguente la concentrazione di cloruro è stata aumentata fino ad ottenere il
sovraccarico della colonna. Alcuni degli effetti associati a questa condizione vengono descritti di
seguito:
•
i tempi di ritenzione degli ioni che seguono divengono più corti
•
il picco dello ione dominante è tagliato
•
il picco dello ione dominante scoda
•
il numero di piatti teorici (TP) diminuisce
•
Il rapporto area/altezza peggiora (ad area costante, l'altezza del picco diminuisce) e la simmetria
del picco diminuisce.
La simmetria del picco diminuisce anche nel caso in cui siano bloccati i setti porosi della colonna, o
aumentato il volume morto o, ancora, per effetto di assorbimento sul materiale della colonna.
– 46 –
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•
Spiegazione dei seguenti parametri cromatografici: tempo di ritenzione, risoluzione, area,
numero di piatti teorici, simmetria e rapporto area/altezza
•
Influenza di un componente dominante sui componenti con una concentrazione inferiore: modifiche dei parametri sopra menzionati
Tabella 7
Parametri - Esperimento 2
Colonna
Eluente
2.4 mmol/ L NaHCO3/ 2.5 mmol/ L Na2CO3+ 2% acetone
campione
standard (fluoruro, cloruro, nitrito, bromuro, nitrato, fosfato, solfato), +
NaCl (circa 1g)
Metodo
exp_02_s.mtw
Sistema
asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
3 MPa
Tempo d'analisi
16 min
Loop
20 YL
Soppressore
soluzioni rigeneranti: 50 mmol/ L H2SO4, acqua ultrapura;
Polarità
+
Dissolvi 265 mg di sodio carbonato (anidro) e 201.5 mg di carbonato acido di sodio in 980 mL di
acqua ultrapura e quindi aggiungi 20 mL di acetone.
Cromatogramma 3 a Soluzione standard con una concentrazione molto alta di cloruro
– 47 –
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Cromatogramma 3b Soluzione standard con una concentrazione molto alta di cloruro; ingrandimento
di parte del cromatogramma 3a
Commenti
Il cloruro di sodio va pesato. I tempi di ritenzione dei picchi così come il numero di piatti teorici e l'area
possono variare con la quantità di NaCl pesata.
L'enorme picco del cloruro interferisce con la valutazione dei picchi seguenti. Perciò l'Identificazione
corretta dei singoli picchi è possibile solo aggiungendo alla soluzione del campione aliquote note
(spike) dei rispettivi anioni da determinare.
4.2.3 Esperimento 3 - Selettività delle colonne di separazione
Per ioni mono e divalenti la forza dell'eluente contro il logaritmo del tempo di ritenzione dà una
correlazione lineare. La pendenza di questa retta è maggiore per gli ioni divalenti che per i
monovalenti. Ne consegue che l'aumento nella forza d'eluizione dell'eluente ha un'influenza molto più
grande sui tempi di ritenzione degli ioni divalenti che sul tempo di ritenzione dei monovalenti.
L'influenza è evidente sullo ione solfato. Al crescere della concentrazione dell'eluente, l'eluizione del
solfato si accelera in modo vistoso rispetto agli ioni monovalenti.
In generale se gli ioni dell'eluente sono divalenti hanno un potere eluente maggiore che i monovalenti
giacchè possono formare due legami con la fase stazionaria e perciò competono maggiormente con la
stessa.
A parità di molarità l'idrossido di sodio ha un pH più alto che il carbonato/bicarbonato. Il potere di
eluizione dell'OH è minore di quello del carbonato acido perchè la sua interazione con la fase
stazionaria non è altrettanto forte.
Il tempo di ritenzione dello ione fosfato dipende fortemente dal valore del pH. A valori di pH alti
2–
3–
l'equilibrio si sposta da HPO4 verso PO4 . Se viene aggiunto idrossido di sodio ad un eluente sodio
carbonato, ne risulta un incremento del tempo di ritenzione del fosfato mentre i tempi di ritenzione di
tutti gli altri ioni diminuiscono.
•
Confronto fra eluenti con anioni monovalenti e divalenti
•
Confronto fra gli eluenti idrossido di sodio e carbonato/ bicarbonato
•
Influenza del pH dell'eluente sulla ritenzione del fosfato
– 48 –
4/15/2001
Tabella 8
Parametri - Esperimenti dal 3a al 3d
Colonna
Eluenti
a) 2.5 mmol/ L Na2CO3/ 2.4 mmol/ L NaHCO3
b) 4 mmol/ L Na2CO3/ 1 mmol/ L NaHCO3
c) 4 mmol/ L Na2CO3/ 1 mmol/ L NaOH
d) 1 mmol/ L Na2CO3/ 4 mmol/ L NaOH
conducibilità dopo soppressione chimica circa 17 YS/ cm
Campione
Metodo
Exp_03_s.mtw
Sistema
Asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
3 MPa
Tempo dell'analisi
a) 14 min
b) 11 min
c) 11 min
d) 24 min
Loop
20 YL
Soppressore
Polarità
+
Esperimento 3a - 2.5 mmol/ L Na2CO3/ 2.4 mmol/ L NaHCO3
Dissolvi 265 mg di sodio carbonato (anidro) e 201.5 mg di bicarbonato di sodio in 1 L di acqua
ultrapura.
– 49 –
4/15/2001
Cromatogramma 4 Soluzione standard - 2.5 mmol/ L Na2CO3/ 2.4 mmol/ L NaHCO3
Tabella 9
Componenti - Esperimento 3a
Picco
Componente
tR [min]
Conc. [mg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
1
Fluoruro
Cloruro
Nitrito
Bromuro
Nitrato
Fosfato
Solfato
3.5
5.1
6.6
7.6
9.1
9.8
11.8
2
5
5
10
10
10
10
2733
4003
3344
4156
4199
2902
3442
47
81
48
69
91
47
118
2
3
4
5
6
7
Esperimento 3b - 4 mmol/ L Na2CO3/ 1 mmol/ L NaHCO3
Dissolvi 424 mg di carbonato di sodio (anidro) e 84 mg bicarbonato di sodio in 1 L di acqua ultrapura.
Cromatogramma 5 Soluzione standard - 4 mmol/ L Na2CO3/ 1 mmol/ L NaHCO3
Tabella 10 Componenti - Esperimento 3b
Picco
Componente
tR [min]
Conc. [mg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
1
Fluoruro
Cloruro
Nitrito
Bromuro
Nitrato
Fosfato
Solfato
3.3
4.6
5.8
6.8
7.7
8.0
8.7
2
5
5
10
10
10
10
2422
3696
2797
3970
4456
3500
3120
50
83
47
69
37
102
123
2
3
4
5
6
7
Esperimento 3c - 4 mmol/ L Na2CO3/ 1 mmol/ L NaOH
Dissolvi 424 mg carbonato di sodio (anidro) e 40 mg NaOH in 1 L di acqua ultrapura.
– 50 –
4/15/2001
Cromatogramma 6 Soluzione standard - 4 mmol/ L Na2CO3/ 1 mmol/ L NaOH
Tabella 11 Componenti - Esperimento 3c
Picco
Componenti
tR [min]
Conc. [mg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
1
Fluoruro
Cloruro
Nitrito
Bromuro
Nitrato
Fosfato + Solfato
3.2
4.4
5.5
6.3
7.5
8.0
2
5
5
10
10
10 /10
2386
3699
3624
3997
3597
1772
51
84
47
70
91
175
2
3
4
5
6
Esperimento 3d - 1 mmol/ L Na2CO3/ 4 mmol/ L NaOH
Dissolvi 106 mg di carbonato di sodio (anidro) e 160 mg di NaOH in 1 L di acqua ultrapura.
– 51 –
4/15/2001
Cromatogramma 7 Soluzione standard - 1 mmol/ L Na2CO3/ 4 mmol/ L NaOH
Tabella 12 Componenti - Esperimento 3d
Picco
Componente
tR [min]
Conc. [mg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
1
Fluoruro
Cloruro
Nitrito
Bromuro
Nitrato
picco di sistema
Solfato
Fosfato
3.6
5.0
6.1
6.9
8.0
9.4
12.5
21.2
2
5
5
10
10
2935
4131
4096
4490
4417
56
91
53
74
100
10
10
3671
2836
126
47
2
3
4
5
6
7
8
4.2.4
Esperimento 4 - Calibrazione, limiti di rilevabilità e di determinazione in cromatografia
ionica
Parametri importanti per i metodi di determinazione analitici sono l’intervallo di linearità, il limite di
rilevabilità e il limite di determinazione. I metodi matematici per la loro determinazione sono definiti
come standard, per esempio il DIN 32645.
Con il detector a conducibilità per la valutazione delle concentrazione si usa di solito l'area del picco.
L'area del picco è proporzionale alla concentrazione di una sostanza. Se l'area del picco viene posta
in grafico contro la concentrazione si esegue la calibrazione. Senza soppressione chimica la
dipendenza è lineare. Con soppressione chimica diventa in prima approssimazione una funzione
quadratica. I programmi di acquisizione dati calcolano la funzione di calibrazione automaticamente.
Nel caso di picchi fortemente scodati o non ben separati o per i quali il rapporto area/altezza è molto
variabile si usa di preferenza l'altezza del picco, in questi casi infatti la valutazione basata sulle aree
conduce a errori non trascurabili.
Il limite di rilevabilità è la concentrazione minima di un analita che può essere ancora rilevata con
incertezza statistica nota. Teoricamente si può calcolare la concentrazione più piccola che può essere
distinta da un valore di bianco.
Ci sono due metodi per calcolare il limite di rilevabilità:
- Metodo del valore del bianco
Una soluzione di un bianco (soluzione che non contiene lo ione di interesse ma produce un suo
segnale in corrispondenza dello ione da determinare) viene analizzata ripetutamente e fornisce per la
concentrazione "0" (valore X) dei valori misurati (valori di Y) la cui varianza (frequenza massima
– 52 –
4/15/2001
media) viene utilizzata come il valore di bianco. Utilizzando la curva di calibrazione si assegna ad un
valore di concentrazione sull'asse X il massimo valore di Y; questo è il limite di rilevabilità.
- Metodo della curva di calibrazione
Questo metodo viene impiegato quando non è possibile determinare un valore di bianco. Nel metodo
della curva di calibrazione si eseguono determinazioni multiple a diverse concentrazioni dello ione di
interesse. Si ottiene un intervallo di confidenza dalla deviazione standard della distribuzione. In questo
modo la concentrazione" 0" viene a corrispondere ad un particolare intervallo per Y. La funzione di
calibrazione viene usata per assegnare l’intervallo di Y ad un intervallo di concentrazione il cui valore
massimo è il limite di rilevabilità.
Il rapporto segnale/rumore viene usato spesso per definire il limite di rilevabilità. Per esempio il limite
di rilevabilità è definito come la concentrazione dell'analita alla quale il segnale misurato è 3 , 5 o 7
volte il rumore di fondo.
Il limite di determinazione invece viene raggiunto quando l'errore di misura diventa uguale ad un
particolare valore rispetto al valore analitico, per esempio 1/3. Solo a queste condizioni nella
refertazione analitica si può assegnare un valore numerico alla concentrazione dell’analita, altrimenti
l'errore di misura è troppo grande in confronto al valore analitico. A grandi linee si può dire che il limite
di determinazione deve essere più alto del limite di rilevabilità di un fattore tre.
•
Cosa significa calibrazione?
•
Confronto tra la calibrazione a singolo punto e a multipunto - stima dell'errore
•
Determinazione del rumore di fondo
•
Stima del limite di rilevabilità
Esperimento 4a - Determinazione di anioni con soppressione chimica
Tabella 13 Parametri - Esperimento 4a
Colonna
Eluente
2.4 mmol/ L NaHCO3/ 2.5 mmol/ L Na2CO3+ 2% acetone;
campione
Metodo
exp_04_s.mtw
Sistema
asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
3 MPa
Tempo dell'analisi
16 min
Loop
20 YL
Soppressore
Polarità
+
Dissolvi 265 mg di carbonato di sodio (anidro) e 201.5 mg di bicarbonato di sodio in 980 mL di acqua
ultrapura, quindi aggiungi 20 mL acetone.
– 53 –
4/15/2001
Cromatogramma 8 Sovrapposizione - Soluzioni standard a diverse concentrazioni
Tabella 14 Component i- Esperimento 4a
Picco
Componente
tR [min]
1
Fluoruro
Cloruro
picco di sistema
Nitrito
Bromuro
Nitrato
Fosfato
Solfato
3.9
5.6
6.8
7.5
8.6
10.3
11.7
14.3
2
3
4
5
6
7
8
Conc. [mg/L]
Livello1
1
1
Livello 2
5
5
Livello 3
25
25
Livello4
50
50
1
1
1
1
1
5
5
5
5
5
25
25
25
25
25
50
50
50
50
50
Esperimento 4b - Determinazione di anioni senza soppressione chimica
Tabella 15 Parametri - Esperimento 4b
Colonna
Eluente
8 mmol/ L acido ftalico, 2% acetonitrile; pH= 4.1;
conducibilità circa 400 YS/ cm
campione
Metodo
Exp_04_n.mtw
Sistema
anonsupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
3 Mpa
Tempo dell'analisi
20 min
Loop
100 YL
Polarità
+
– 54 –
4/15/2001
Dissolvi 1.33 g di acido ftalico in 20 mL di acetonitrile ed una piccola quantità di acqua e porta a 1 L.
Aggiusta il pH a 4.1 con TRIS (solido).
Cromatogramma 9 Sovrapposizione - Soluzioni standard con diverse concentrazioni
Picco
Componente
tR [min]
1
Fluoruro
Cloruro
Nitrito
Bromuro
Nitrato
Solfato
picco di sistema
3.6
4.9
5.7
6.6
7.7
11.0
17.0
2
3
4
5
6
7
Conc. [mg/L]
Livello 1
1
1
1
1
1
1
Livello 2
5
5
5
5
5
5
Livello 3
25
25
25
25
25
25
Livello 4
50
50
50
50
50
50
4.2.5 Esperimento 5 - Alterazione della selettività con l'impiego di eteri corona (18 Crown- 6)
I tempi di ritenzione dei cationi possono essere alterati per aggiunta all’eluente di agenti complessanti.
L'agente complessante agisce come un legante, il catione dell'analita è incluso come ione metallico
centrale. Più un legante è selettivo rispetto ad uno ione metallico centrale, più forte sarà l'influenza sul
tempo di ritenzione. Nel caso ideale i tempi di ritenzione degli altri cationi si alterano solo leggermente.
Gli agenti complessanti si usano per ottenere una migliore separazione degli ioni dei metalli alcalini.
L'aggiunta dell'etere corona 18 Crown-6 all'eluente permette di ottenere una migliore separazione di
Na+, NH4+ e K+. Per esempio, l'etere corona si aggiunge all'eluente per migliorare la separazione tra
Na+ e NH4+ nella determinazione di tracce di NH4+ in acque naturali. L'aumento nel tempo di
ritenzione del K+ è particolarmente evidente. Questo si spiega con la formazione di un complesso tra
K+ e l'etere dibenzo-18-crown-6 (18 Crown-6). Il K+ si inserisce esattamente nella "gabbia" dell'etere,
complessato attraverso i doppietti elettronici degli atomi di ossigeno. Dopo la complessazione la
molecola da separare è notevolmente più grande e con la stessa carica. Questo significa che il tempo
di ritenzione del potassio aumenta in funzione dell’aumentato ingombro sterico.
– 55 –
4/15/2001
O
O
O
+
K
O
O
O
Figura 26
Potassio - 18 Crown-6
Il nome 18 Crown-6 indica che il sistema ad anello è costituito da 18 atomi di cui 6 sono atomi di
ossigeno. Gli eteri corona non svolgono un ruolo importante solo in cromatografia ionica, vengono
usati anche come fase iono-selettiva negli elettrodi al potassio. Inoltre sono responsabili del trasporto
di atomi di potassio attraverso le membrane cellulari.
•
Effetto di un complessante molto selettivo sui tempi di ritenzione
•
Chiarimento dell'effetto in un confronto con l'Esperimento 6
Tabella 17 Parametri - Esperimenti 5a e 5b
Colonna
6.1010.210 Metrosep C2 (4 x 100 mm)
Eluente
a) 4 mmol/ L acido tartarico / 0.75 mmol/ L acido dipicolinico
b) 4 mmol/ L acido tartarico / 0.75 mmol/ L acido dipicolinico
+ 0.25 mmol/ L etere corona
Campione
standard (litio, sodio, ammonio, potassio, calcio, magnesio
+ 2 mmol/ L HNO3)
Metodo
exp_05_c.mtw
Sistema
cation.smt
Flusso
1 mL/ min
Pressione
8 MPa
Tempo dell'analisi
12 min
17 min
Loop
10 YL
Polarità
-
Esperimento 5a - Eluente senza etere corona
Dissolvi 600 mg di acido tartarico e 125 mg di acido dipicolinico in 100 mL di acqua ultrapura sotto
riscaldamento ed quindi porta a 1 L con acqua ultrapura.
– 56 –
4/15/2001
Cromatogramma 10
Soluzione standard - eluente senza etere corona
Tabella 18 Componenti - Esperimento 5a
Picco
Componente
tR [min]
Conc. [mg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
1
Litio
Sodio
Ammonio
Potassio
Calcio
Magnesio
2.7
3.6
4.2
6.1
8.1
9.9
1
5
5
10
10
10
4270
4640
3640
2890
2950
2310
14
18
19
17
33
65
2
3
4
5
6
Esperimento 5b - Eluente con etere corona
riscaldamento, aggiungi 132 mg di etere corona e porta a 1 L con acqua ultrapura.
– 57 –
4/15/2001
Cromatogramma 11
Soluzione standard - eluente con etere corona
Picco
Componente
tR [min]
Conc. [mg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
1
Litio
Sodio
Ammonio
Calcio
Magnesio
Potassio
2.8
4.1
5.1
9.3
10.6
14.9
1
5
5
10
10
10
4250
4550
3260
2170
2200
1910
14
18
19
33
66
17
2
3
4
5
6
4.2.6 Esperimento 6- Alterazione della selettività con l'impiego di agenti complessanti.
Per l'analisi di magnesio, sodio e potassio in presenza di zinco e calcio si sfrutta la tendenza dello
zinco e del calcio a formare complessi con l'acido dipicolinico (DPA, acido 2,6-piridindicarbossilico).
O
C
N
O
Me
O
C
2+
O
H
H
2+
Figura 27 Complesso Me
acido dipicolinico
La costante dell'equilibrio di formazione del complesso:
2+
Me
2+
+ (DPA) o [Me(DPA)]
è diversa per ciascun metallo.
In funzione del pH, si formano i seguenti complessi (rimozione crescente di H+ al crescere del pH):
+
2+
2+
[Me (DPA)]
condizioni acide
H
+
+H
+
2+
+
[Me (DPA)]
H
2+
condizioni debolmente acide
0
[Me (DPA)]
+
+H
condizioni alcaline
– 58 –
4/15/2001
Questo significa che, in funzione del pH, il complesso formato ha una doppia carica positiva, una
singola carica positiva, o è neutro.
Il criterio primario della separazione su una colonna a scambio cationico è la carica degli ioni da
separare. I complessi neutri non vengono rallentati mentre i complessi con una tripla carica positiva
vengono legati molto fortemente. Come risultato della costante di formazione del complesso e del pH
il complesso ha una certa carica media di equilibrio. Questa carica di equilibrio determina il tempo di
ritenzione. In base a questo criterio l'eluizione di ioni metallici divalenti può essere accelerata se viene
aggiunto acido dipicolinico in un determinato intervallo di pH.
Non vi sarà invece nessuna influenza sui tempi di ritenzione di ioni metallici monovalenti, perchè non
formano complessi con l'acido dipicolinico.
•
Influenza della costante di formazione del complesso sul tempo di ritenzione - confronto tra
zinco e calcio
•
Comportamento di altri ioni dei metalli di transizione
•
Influenza del valore del pH sulla carica totale del complesso
•
Spiegazione degli effetti in confronto con l'Esperimento 5
Tabella 20 Parametri - Esperimenti dal 6a al 6d
Colonna
6.1010.210 Metrosep C2 (4 x 100 mm)
Eluente
a) 4 mmol/ L acido tartarico;
b) 4 mmol/ L acido tartarico+ 0.1 mmol/ L acido dipicolinico;
c) 4 mmol/ L acido tartarico+ 0.25 mmol/ L acido dipicolinico;
d) 4 mmol/ L acido tartarico+ 0.75 mmol/ L acido dipicolinico;
Campione
standard (sodio, zinco, potassio, calcio, magnesio+ 2 mmol/ L HNO3)
Metodo
exp_06_c.mtw
sistema
cation.smt
Flusso
1 mL/ min
Pressione
7 MPa
Tempo d'analisi
a) 23 min
b) 20 min
c) 16 min
d) 13 min
Loop
10 YL
Polarità
-
Esperimento 6a - Eluente: 4 mmol/ L acido tartarico
Dissolvi 600 mg acido tartarico in 1L acqua ultrapura.
– 59 –
4/15/2001
Cromatogramma 12
Soluzione standard - eluente: 4 mmol/ L acido tartarico
Picco
Componente
[tR] min
Conc.[mg/ L]
TP
Area [HS/cm*s]
1
2
3
4
5
Sodio
Potassio
Zinco
Magnesio
Calcio
4.3
7.8
11.2
14.4
19.5
5
10
5
10
10
4450
2330
2330
2010
2640
17
16
11
63
34
Esperimento 6b - Eluente: 4 mmol/ L acido tartarico + 0.1 mmol/ L acido dipicolinico
Dissolvi 600 mg di acido tartarico e 17 mg adi cido dipicolinico sotto riscaldamento in 100 mL di acqua
ultrapura e porta a 1L.
– 60 –
4/15/2001
Cromatogramma 13
dipicolinico
Soluzione standard - eluente: 4 mmol/ L acido tartarico + 0.1 mmol/ L acido
Picco
Componente
tR [min]
Conc. [mg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
1
2
3
4
5
Zinco
Sodio
Potassio
Magnesio
Calcio
1.9
4.4
7.6
14.8
17.9
5
5
10
10
10
554
4390
2750
2100
2720
6.7
17
16
64
33
Esperimento 6c - Eluente: 4 mmol/ L acido tartarico + 0.25 mmol/ L acido dipicolinico
Dissolvi 600 mg di acido tartarico e 42 mg di acido dipicolinico sotto riscaldamento in 100 mL di acqua
ultrapura e porta a 1L.
– 61 –
4/15/2001
Cromatogramma 14
dipicolinico
Soluzione standard - eluente 4 mmol/ L acido tartarico + 0.25 mmol/ L acido
Picco
Componente
tR [min]
Conc. [mg/L] TP
Area [mS/cm*s]
–
1
2
3
Zinco
Sodio
Potassio
Calcio + Magnesio
'1.1
4.3
7.8
14.4
5
5
10
10 + 10
18
17
98
4450
2330
2010
Esperimento 6d - Eluente: 4 mmol/ L acido tartarico + 0.75 mmol/ L acido dipicolinico
Dissolvi 600 mg di acido tartarico e 125 mg di acido dipicolinico sotto riscaldamento in 100 mL di
acqua ultrapura e porta a 1L.
– 62 –
4/15/2001
Cromatogramma 15
acido dipicolinico
Soluzione standard - eluente: 4 mmol/ L di acido tartarico + 0.75 mmol/ L di
Tabella 24 Componenti - Esperimento 6d
Picco
Componente
tR [min]
Conc. [mg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
–
1
2
3
4
Zinco
Sodio
Potassio
Calcio
Magnesio
'1.1
3.8
6.4
8.5
10.5
5
5
10
10
10
4540
2900
2630
2190
17
17
33
67
Commenti
Tutte le soluzioni devono essere conservate in vasi di plastica. Per una determinazione corretta del
sodio deve essere evitato il vetro. Il pH dello standard e delle soluzioni campione deve essere tra 2.5
e 3.5.
Dopo aver cambiato l'eluente lasciare il sistema in attività fino ad ottenere una linea di base costante.
Cromatogrammi 14 e 15: lo zinco viene complessato dall'acido dipicolinico ed eluisce col il volume
morto della colonna.
4.2.7 Esperimento 7- Tecnica della preconcentrazione
l'iniezione del campione in cromatografia ionica viene realizzata impiegando un loop integrato nella
valvola di iniezione. Lo standard operativo prevede un volume di loop di 20 YL per gli anioni e 10 YL
per i cationi. Con un semplice sistema IC dotato di questo tipo di loop si raggiungono limiti di
rilevabilità di 100 Yg/ L o 100 ppb senza nessun problema.
Utilizzando loop più grandi, per esempio da 100 YL, i limiti di rilevabilità possono essere abbassati
quasi di un fattore dieci. Tuttavia, volumi di campione più grandi producono un picco dell'acqua
sostanzialmente più grande, cosa che impedisce la valutazione di picchi che eluiscono presto. In
aggiunta, si accentua l'asimmetria dei picchi.
Un metodo semplice per abbassare i limiti di rilevabilità di diversi ordini di grandezza è la
preconcentrazione del campione. Una colonna di preconcentrazione viene installata al posto del loop.
Un volume di campione molto consistente - 5 mL nel nostro esempio - viene fatto passare attraverso
la colonna di preconcentrazione. In linea di principio, questa colonna è impaccata con lo stesso
materiale usato nella colonna di separazione. Questo assicura che tutti gli anioni o cationi della
soluzione campione da analizzare (per esempio acqua ultrapura) siano trattenuti completamente e
– 63 –
4/15/2001
quindi arricchiti sulla colonna. Tuttavia, la preconcentrazione funziona solo se il campione non
contiene ioni ad alte concentrazioni.
La capacità della colonna di preconcentrazione è significativamente più piccola di quella della colonna
di separazione. Per eluire gli ioni del campione arricchito col volume più piccolo possibile, l'estrazione
da parte dell'eluente viene eseguita in contro-corrente ovvero la direzione del flusso durante l'eluizione
è opposta rispetto alla direzione del flusso durante la preconcentrazione.
Di solito, si impiega un'eluente alcalino in combinazione con la soppressione chimica.
Figura 28 Tecnica della preconcentrazione: a sinistra posizione di riempimento "fill”, a destra
posizione di iniezione "inject"
La tecnica della preconcentrazione permette di determinare concentrazioni dell’ordine dei ppt anche
con un sistema cromatografico semplice.
•
Che cos'è la preparazione del campione?
•
Dove sta l'interfaccia tra la cromatografia ionica e la preparazione del campione?
•
Qual'è il vantaggio della preconcentrazione del campione?
•
Quali sono i limiti del metodo?
•
Perchè si usano eluenti alcalini con la soppressione chimica?
•
Qual'è l'effetto del sistema CO2 / carbonato nel campione?
Tabella 25 Parametri - Esperimento 7
Colonna
Eluente
Campione
acqua ultrapura
Metodo
exp_07_s.mtw
Sistema
asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
4 Mpa
Tempo dell'analisi
16 min
Colonna di preconcentrazione
6.1006.300 Metrosep anion
Volume del campione
5 mL su colonna di preconcentrazione
Soppressore
– 64 –
4/15/2001
Polarità
+
ultrapura ed aggiungi 20 mL di acetone.
Cromatogramma 16
Soluzione standard (1 ppb di ciascun anione) per l'analisi di acqua ultrapura
Tabella 26 Componenti - Esperimento 7- Standard
Picco
Componente
tR [min]
Conc. [mg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
1
Fluoruro
+
Acetato
Cloruro
picco di sistema
Nitrito
Bromuro
Nitrato
Fosfato
Solfato
3.8
1+1
1620
5.4
5.7
6.8
7.4
8.6
10.3
11.6
14.1
1
3090
5.2
1
1
1
1
1
3270
3970
3600
3290
2980
2.3
1.3
1.9
0.7
1.1
2
3
4
5
6
7
8
– 65 –
4/15/2001
Cromatogramma 17
Acqua ultrapura
Tabella 27 Componenti- Esperimento 7- Acqua ultrapura
tR [min]
Picco
Componente
1
2
Cloruro
5.7
picco di sistema 6.8
Conc. [Hg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
0.030
2240
0.17
Commenti
Lavare accuratamente tutti i recipienti, le siringhe ed il sistema diverse volte; utilizzare recipienti di
plastica.
4.3 Esempi di determinazione di anioni
4.3.1 Esperimento 8 - Anioni nell’ acqua potabile
L'acqua potabile è il nostro alimento più importante. Si tratta principalmente di acque interstiziali e di
superficie. Le acque di superficie comprendono le acque dei laghi e delle riserve, l'acqua di filtrazione,
l'acqua di falda arricchita da acque di superficie e di fiume.
Secondo la DIN 2000 l'acqua potabile deve soddisfare i seguenti requisiti:
•
deve essere incolore, limpida, fresca, inodore e insapore.
•
se possibile dovrebbe essere naturalmente priva di agenti patogeni o rischiosi per la salute
•
non dovrebbe contenere sali in quantità eccessiva, in particolare quelli responsabili della durezza,
il ferro, il manganese, e le sostanze organiche (torba e acidi umici)
•
non dovrebbe causare corrosione
•
è necessario che sia disponibile una quantità sufficiente a soddisfare i bisogni di tutta la
popolazione. Perciò a seconda del grado di inquinamento si impiegano diversi metodi per il
trattamento delle acque potabili.
La vagliatura; rimuove il terriccio e le particelle più grandi.
La filtrazione su sabbia; la filtrazione è più fine inoltre nella sabbia avvengono importanti processi di
biodegradazione che purificano l'acqua.
La filtrazione su carbone attivo; si assorbono le sostanze organiche disciolte, come i pesticidi.
– 66 –
4/15/2001
La rimozione di ferro e manganese per ossidazione di Fe(II) e Mn(II); questo processo è necessario
per evitare che abbia luogo spontaneamente nelle tubazioni dell'acqua potabile causando torbidezza
marrone o flocculazione.
La disinfezione; è necessaria quando l'acqua non è libera da agenti patogeni. Si impiegano a tale
scopo cloro, ozono, diossido di cloro e l'irraggiamento UV.
La clorazione preventiva prima dell'immissione nelle tubazioni dell'acqua potabile per prevenire la
crescita batterica nel trasporto al consumatore.
Figura 29 Trattamento dell'acqua potabile - diagramma di Tommaso Seilnacht, Tuttling
•
Studio dell' alimento "Numero 1"
•
Controllo dell'informazione sulle etichette delle bottiglie di acqua minerale
Tabella 28 Valori limite per l'acqua potabile (Repubblica Federale Tedesca)
Fluoruro
1.5
mg/ L come F-
Nitrato
50
mg/ L come NO3-
Nitrito
0.1
mg/ L come NO2-
Cloruro
250
mg/ L
Solfato
250
mg/ L
Colonna
Eluente
Campione
acqua potabile (acqua di rubinetto, acqua minerale)
Metodo
exp_08_s.mtw
Sistema
asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
3 MPa
– 67 –
4/15/2001
Tempo dell'analisi
16 min
Loop
20 YL
Soppressore
Polarità
+
Cromatogramma 18
Acqua potabile di Herisau, Svizzera
Tabella 30 Componenti - Esperimento 8 - Acqua potabile
Picco
1
2
3
4
5
Componente
Fluoruro
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Solfato
tR [min]
3.7
5.8
6.8
10.3
14.4
Conc. [mg/L]
0.05
6.5
TP
2680
2500
Area [HS/cm*s]
1.2
104
8.4
14.4
4560
3670
74
68
– 68 –
4/15/2001
Cromatogramma 19
Acqua minerale senza anidride carbonica
Tabella 31 Componenti - Esperimento 8- Acqua minerale senza anidride carbonica
Picco
1
2
3
4
5
6
Componente
Fluoruro
Cloruro
picco di sistema
Bromuro
Nitrato
Solfato
tR [min]
3.7
5.7
6.8
8.5
10.3
14.3
Conc. [mg/L]
1.5
14.1
TP
2560
2980
Area [HS/cm*s]
35
226
0.075
1.4
300
4810
4400
3830
0.5
12
3400
Commenti
L'acqua minerale addizionata di CO2 deve essere degasata prima della misura - perchè?
4.3.2 Esperimento 9 - Anioni nell’etanolo e negli alcoolici
E' possibile eseguire la determinazione degli anioni in solventi organici, anche se in genere ciò
comporta l'inconveniente di un picco di sistema molto pronunciato all'inizio del cromatogramma. Si
riporta come esempio l'analisi di gin, whiskey ed etanolo.
Per raggiungere limiti di rilevabilità più bassi si può impiegare la tecnica della preconcentrazione
(vede capitolo 4.2.7). In alcuni casi, tuttavia, la matrice del campione (è il caso dell'etanolo) può
interferire grandemente con la determinazione, deformando i picchi e impedendo una corretta
valutazione (vedi cromatogramma 25). E’ allora necessario rimuovere la matrice per lavaggio della
colonna di preconcentrazione con acqua ultrapura (eliminazione della matrice). In questo modo si
ottengono cromatogrammi migliori (vedi cromatogramma 24).
La tecnica di eliminazione della matrice può essere usata anche per analizzare solventi polari ed
apolari.
Un metodo alternativo per rimuovere la materia organica da soluzioni acquose è l'impiego di colonne
di preparazione del campione RP (fase inversa).
•
Analisi di alimenti
•
Influenza della matrice
•
Preparazione del campione
•
Preconcentrazione del campione ed eliminazione della matrice
– 69 –
4/15/2001
Tabella 32 Parametri - Esperimenti dal 9a al 9c
Colonna
Eluente
Campione
a) Gin b) Whiskey c) etanolo
Metodo
exp_09_s.mtw
Sistema
asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
5 MPa
Tempo dell'analisi
a) 17 min b) 33 min c) 17 min
Loop
a)100 YL b)100 YL c) 500 YL su colonna di preconcentrazione
6.1006.300 Metrosep Anion; per eliminare la matrice lavare con 2 mL
di acqua ultrapura
Soppressore
Polarità
+
ultrapura. Quindi aggiungi 20 mL di acetone.
Esperimento 9a- Determinazione di anioni nel gin
Cromatogramma 20
Soluzione standard per l'analisi del gin
– 70 –
4/15/2001
Tabella 33 Componenti- Esperimento 9a - Standard
Picco
1
2
3
4
5
Componente
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Solfato
Ossalato
Cromatogramma 21
tR [min]
5.5
7.0
9.6
13.0
14.9
Conc. [mg/L]
0.1
TP
4240
Area [HS/cm*s]
7.8
0.02
0.4
0.02
2980
3320
3710
0.9
22
0.7
Analisi del gin
– 71 –
4/15/2001
Tabella 34 Componenti - Esperimento 9a - Gin
Picco
1
2
3
4
Componente
Cloruro
Nitrato
Solfato
Ossalato
tR [min]
5.6
9.7
13.0
14.9
Conc. [mg/L]
0.11
0.014
0.43
0.013
TP
2230
3360
3260
3920
Area [HS/cm*s]
8.8
0.6
23.5
0.5
Esperimento 9b - Determinazione di anioni nel whiskey
Cromatogramma 22
Soluzione standard per l'analisi del whiskey
– 72 –
4/15/2001
Tabella 35 Componenti - Esperimento 9b - Standard
Picco
1
2
3
4
5
6
7
Componente
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Fosfato
Malato
Solfato
Ossalate
Cromatogramma 23
tR [min]
5.5
7.0
9.6
10.8
12.1
13.0
14.9
Conc. [mg/L]
1
TP
4700
Area [HS/cm*s]
84
0.5
0.5
0.5
1
1
3640
2960
3730
3350
3250
20
11
306
56
41
Conc. [mg/L]
1.3
TP
3300
Area [HS/cm*s]
167
0.22
0.43
0.81
0.88
1.91
4000
3510
4580
3040
3540
8.7
9.6
5.8
49
79
Analisi del whiskey
Tabella 36 Componenti - Esperimento 9b - Whiskey
Picco
1
2
5
6
7
8
9
Componente
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Fosfato
Malato
Solfato
Ossalato
tR [min]
5.6
7.3
9.8
10.9
12.4
13.1
15.1
Commenti
I picchi 3, 4 e 10 non sono stati quantificati.
– 73 –
4/15/2001
Esperimento 9c - Determinazione di anioni in etanolo con preconcentrazione ed eliminazione
della matrice
Cromatogramma 24
Determinazione di anioni in etanolo con eliminazione della matrice
Tabella 37 Componenti - Esperimento 9c - Etanolo con eliminazione della matrice
Picco
1
2
3
4
5
Componente
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Solfato
Ossalato
Cromatogramma 25
tR [min]
5.3
6.8
9.3
12.3
14.1
Conc. [mg/L]
0.021
TP
3570
Area [HS/cm*s]
9.5
0.013
0.046
0.018
3940
2130
3250
2.8
14
3.8
Determinazione di anioni in etanolo senza eliminazione della matrice
– 74 –
4/15/2001
Tabella 38 Componenti - Esperimento 9c - Etanolo senza eliminazione della matrice
Picco
Componente
Nessun picco
tR [min]
Conc. [mg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
Commenti
Lavare completamente tutti i contenitori, le siringhe ed il sistema diverse volte; usare recipienti di
plastica
4.3.3 Esperimento 10 - Anioni nella lattuga
Il nitrato entra nel corpo umano tramite l'acqua potabile, ma anche assumendo ortaggi, insalata, ecc.
La WHO (World Health Organization) raccomanda che il consumo giornaliero di nitrato non superi i
220 mg per persona. In Germania il consumo giornaliero medio di nitrato suggerito è di 130 mg per
persona. Circa il 5% di questo quantitativo proviene da carne e insaccati; il rimanente è diviso nei
contributi equivalenti dell'acqua potabile e dei vegetali.
Il nitrato può avere un effetto negativo sulla salute umana in diversi modi. Di per sè è relativamente
non tossico. Solo in grandi quantità può portare a infiammazioni del tratto gastro-intestinale. Tuttavia,
in certe condizioni, e particolarmente in presenza di batteri presenti anche nella bocca umana, esso
viene ridotto a nitrito da parte dall' enzima nitrato-riduttasi.
–
–
NO2
NO3
2+
Il nitrito può convertire l'emoglobina, il colorante rosso del sangue, a metaemoglobina (Fe viene
3+
ossidato a Fe ). A differenza dell'emoglobina la forma ridotta non trasporta ossigeno nel sangue.
Negli esseri umani adulti il danno può essere compensato da reazioni metaboliche. Invece il
metabolismo dei bambini fino a 5 mesi non è ancora in grado di farlo. Il risultato è una mancanza di
ossigeno nel sangue del bambino che si manifesta in una colorazione bluastra della pelle. La cianosi
o metaemoglobinemia può qualche volta condurre alla morte.
Inoltre nell'ambiente acido dello stomaco il nitrito può reagire con le ammine secondarie introdotte con
+
le medicine e alcuni generi alimentari; due atomi di H del gruppo ammonio vengono sostituiti da
residui alchilici formando nitrosammine.
Figura 30 Formazione di nitrosammine per reazione del nitrito con le ammine secondarie
Le nitrosammine sono fra gli agenti cancerogeni più pericolosi che si conoscano.
•
Analisi di generi alimentari
•
Controllo specifico del nitrito e del nitrato negli alimenti.
Colonna
Eluente
Campione
Lattuga
Metodo
exp_10_s.mtw
Sistema
asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
5 MPa
– 75 –
4/15/2001
Tempo dell'analisi
20 min
Loop
20 YL
Soppressore
Polarità
+
Tagliare la lattuga, frullarla, aggiungere acqua ultrapura (rapporto 1: 100) e filtrare.
Cromatogramma 26
Soluzione standard per l'analisi della lattuga
– 76 –
4/15/2001
Tabella 40 Componenti - Esperimento 10 - Standard
Picco
1
2
3
4
5
6
7
Componente
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Fosfato
Malato
Solfato
Ossalato
Cromatogramma 27
tR [min]
5.3
6.7
9.3
10.4
11.8
12.7
14.6
Conc. [mg/L]
5
TP
4480
Area [HS/cm*s]
80
5
5
10
2
0.1
4320
2990
3140
3330
3500
42
24
26
22
0.9
Conc. [mg/L]
540
TP
4260
Area [HS/cm*s]
86
410
540
1160
206
10
4240
2960
2180
2800
2300
34
25
30
23
1
Analisi della lattuga (diluizione 1: 100)
Tabella 41 Componenti- Esperimento 10 - Lattuga
Picco
1
2
4
5
6
7
8
Componente
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Fosfato
Malato
Solfato
Ossalato
tR [min]
5.3
6.6
9.4
10.4
11.8
12.6
14.5
Commenti
4.3.4 Esperimento 11- Acido fosforico nelle bevande della Cola
La Coca-Cola è una bibita analcolica che contiene anidride carbonica e caffeina. Fu inventata nel
1885 dal farmacista americano Pemberton. Fra i suoi ingredienti ci sono l'estratto della noce di 'cola',
delle arance amare e di fagioli di carruba, l' essenza di zenzero, il 12% zucchero, lo 0.28% di acido
fosforico (pH= 2.7), caramello come colorante e anidride carbonica. Il contenuto di caffeina è 16 mg su
100 mL.
Molte bevande che contengono la cola sono disponibili sul mercato (Pepsi Cola, Club Cola, RiverCola,
Afri Cola, ecc.); le composizioni sono leggermente differenti dalla Coca-Cola.
La determinazione dell'acido fosforico contenuto nelle bevande della cola è fondamentale
nell'industria dell'imbottigliamento di queste bevande giacchè gli imbottigliatori ricevono il concentrato
– 77 –
4/15/2001
e lo diluiscono per imbottigliarlo. La diluizione viene controllata col contenuto finale in acido fosforico,
la cui determinazione deve essere molto accurata.
L' acido fosforico è un acido tribasico (pKA1= 2.161, pKA2= 7.207, pKA3= 12.325). La distribuzione nelle
varie specie dipende dal pH come si può vedere nel diagramma seguente:
Figura 31 Effetto tampone dell' acido fosforico nell’intervallo di pH tra 6 e 8
Una miscela di fosfato primario e secondario viene impiegata frequentemente come soluzione
2–
–
24tampone nella finestra di pH 6-8 (dal 90% H2PO + 10% HPO4 al 10% H2PO4 + 90% HPO4 ).
Vedi anche l'equazione di Henderson-Hasselbalch (equazione dell' effetto tampone)
pH = pK S + lg
c( A )
c( HA)
•
•
Chimica dell'acido fosforico
•
Influenza del pH sulla separazione cromatografica
•
Riproducibilità statistica
Tabella 42 Parametri- Esperimenti dall' 11a all' 11c
Colonna
Eluente
Campione
bevande della Cola
Metodo
exp_11_s.mtw
Sistema
asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
3 Mpa
Tempo dell'analisi
18 min per la Coca-Cola, 30 min per la Coca-Cola Light
Loop
20 YL
Sopressore
– 78 –
4/15/2001
Polarità
+
Cromatogramma 28
Soluzione standard per l'analisi di bevande della cola
Tabella 43 Componenti - Esperimenti 11a - 11c- Standard
Picco
1
2
3
4
5
Componente
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Fosfato
Solfato
tR [min]
5.3
6.7
9.4
10.5
12.7
Conc. [mg/L]
1
TP
4140
Area [HS/cm*s]
15
1
50
1
4220
3250
2950
8.0
261
13
– 79 –
4/15/2001
Esperimento 11a - Analisi della Coca-Cola
Cromatogramma 29
Analisi della Coca-Cola (diluizione 1: 10)
Tabella 44 Componenti- Esperimento 11a
Picco
1
2
3
4
5
Componente
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Fosfato
Solfato
tR [min]
5.3
6.8
9.5
10.5
12.8
Conc. [mg/L]
5.9
TP
3100
Area [HS/cm*s]
8.9
5.9
510
11.0
5000
3370
3520
4.7
266
14
Esperimento 11b- Analisi della Coca-Cola Light
– 80 –
4/15/2001
Cromatogramma 30
Analisi della Coca-Cola Light (diluizione 1: 10)
Picco
1
2
3
4
5
Componente
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Fosfato
Solfato
tR [min]
5.3
6.7
9.4
10.5
12.8
Conc. [mg/L]
6.0
TP
2990
Area [HS/cm*s]
9.2
7.3
663
14.4
4290
1850
1630
5.8
346
19
Commenti
Esperimento 11c - Riproducibilità delle misure di fosfato nella Coca-Cola
Cromatogramma 31
Sovrapposizione di 8 misure (campione non diluito)
Tabella 46 Riproducibilità delle misure.
Cromatogramma Area Fosfato
[HS/cm*s]
1
3627
2
3629
3
3626
4
3626
5
3636
6
3638
7
3639
8
3638
Deviazione standard: sotto 0.2%
Conc. Fosfato.
[mg/L]
519
520
519
519
521
521
521
521
Commenti
La bevande devono essere degasate. Nell'analisi della Coca Cola Light il picco del ciclamato usato
come dolcificante cade sotto il picco del fosfato.
– 81 –
4/15/2001
4.3.5 Esperimento 12 - Acidi organici nel vino
Secondo la legge tedesca sul vino, il vino è il prodotto che si ottiene esclusivamente dalla
fermentazione alcoolica completa o parziale dell'uva fresca o pigiata o del succo estratto dagli acini. Il
succo d'uva contiene di 12-25% di carboidrati (glucosio, fruttosio) e lo 0.9-1.5% di acidi. Il più
importante è l'acido L- (+) tartarico (2R, 3R) e l'acido malico, ma possono essere presenti anche
l'acido citrico, l'acido chetoglutarrico, l'acido succinico e l'acido lattico.
Un criterio importante per la stima del succo d'uva è il grado Oechsle (Oe°); più è alto più zucchero
contiene il succo. Tale grado indica il numero di grammi di cui 1 L di succo a 20 °C è più pesante di 1
L di acqua distillata. Per esempio un succo con una densità di 1.115 kg/ L (115 g più di 1 L d'acqua )
ha un grado Oechsle di 115°. Dai gradi Oechsle si risale tramite un semplice calcolo al contenuto di
zucchero e di alcool. Da 1.7 g di zucchero si produce 1 mL (0.794 g) di etanolo. Alla frazione di
volume alcoolico del 12- 15% la fermentazione si arresta perchè i fermenti vengono uccisi dall'alcool
che essi stessi hanno prodotto.
L'aroma del vino si compone di 600-800 componenti: idrocarburi, alcooli, aldeidi, chetoni, acidi, esteri,
lattoni, eteri, fenoli e molti altri ancora.
Di interesse analitico sono l'acido 2R, 3R-tartarico, l'acido malico, l'acido citrico, l'acido lattico e
l'acido succinico. Il contenuto di acido totale (calcolato come acido tartarico) è di solito tra 5.5 e 8.5
g/L. L' acido acetico, l'acido propionico e acidi grassi superiori insieme ad un contenuto anormalmente
alto di acido lattico sono caratteristici del vino avariato e vi si formano per opera di specifici
microrganismi.
COOH
2
H C OH
3
HO C H
COOH
Figura 32 Acido L- (+) tartarico, nella forma (2R, 3R)
La fermentazione alcoolica prende luogo secondo l'equazione seguente:
C6H12O6 + 2 ADP + 2 P
2 C2H5OH + 2 CO2 + 2ATP
Abbreviazioni: ADP= adenosina difosfato, ATP= adenosina trifosfato, P= fosfato
Gli acidi organici deboli vengono analizzati utilizzando la cromatografia ad esclusione ionica (vedi
capitoli 3.3.4, 3.6.7 e 3.7.2.3).
– 82 –
4/15/2001
– 83 –
-= non identificabile
±= presente in tracce (circa 5 mg/ L), non quantificato
+= tracce
3-M-2,3-DHBS= acido 3-metill-2,3-di-idrossi-butirrico
Note
4/15/2001
7977
12.9
Acido L-Ascorbico
Acidi totali
11.1
2.1
Acido Galatto-uronico
Acido Glucuronico
–
59.0
Acido Gluconico
Acido Mucinico
45.7
41.1
Acido -chetoglutarico
9491
9.0
11.7
3.4
+
357.2
29.8
1.0
20.6
+
150.2
Acido Piruvico
Acido Gliossilico
138.9
27.5
24.9
Acido -Idrossi glutarico
Acido Citrico
53.7
94.5
994
Acido Citramalico
5080
±
1586
±
3-M-2,3-DHBS
±
Acido Tartarico
±
Acido triglicerico
62.6
3971
43.5
Acido Anglicerico
2364
1.3
1.9
1.9
31.9
260.1
13.0
Portugieser
Rotwein
Acido Malico
1789
Acido D- + L-lattico
1.8
3.7
Acido Glutarico
Acido Glicolico
44.2
Acido Fumarico
2.1
194.0
Acido Succinico
Acido c- or t- Aconitico
15.7
Acido Ossalico
Vino
tipico di
alta
qualità
6349
13.7
14.1
3.8
–
54.5
38.6
17.8
+
241.1
18.2
63.0
1428
3850
±
±
50.1
319.8
+
+
4.5
24.6
205.8
11.0
Kabinett
6302
10.1
19.7
5.8
–
95.9
36.8
12.4
+
222.8
24.5
18.6
1431
3871
±
±
39.5
159.8
+
5.5
2.6
28.3
282.1
45.8
Spätlese
6474
9.8
22.0
7.9
4.1
452.1
55.7
16.8
4.0
298.6
28.4
46.8
817
4235
±
±
59.0
151.0
1.4
4.9
2.3
20.8
230.2
16.0
Auslese
Riesling
6744
9.6
43.4
14.5
20.4
337.2
35.6
8.6
6.1
287.3
20.6
48.2
1251
2251
±
±
53.0
2141
6.9
6.4
7.0
36.0
149.2
21.7
Beerenauslese,
Eiswein
5685
12.0
10.0
1.7
–
53.9
41.0
17.6
2.9
200.7
18.8
31.3
1280
2893
±
±
49.6
793
3.7
1.4
2.6
20.9
243.8
16.7
Silvaner
Kabinett
5284
10.4
17.3
6.0
+
131.1
33.7
22.7
1.8
221.7
15.3
33.8
1014
3163
±
±
87.0
221.0
3.4
2.5
2.2
51.8
215.1
40.9
Spätlese
5565
9.7
23.2
7.6
4.5
373.9
40.3
18.6
1.1
240.2
26.9
24.2
805
3410
±
±
68.8
208.1
1.7
1.6
1.9
27.0
264.9
15.4
Auslese
Müller-Thurgau
7333
8.5
34.3
10.2
11.2
540
27.5
33.0
3.1
335.1
22.2
41.0
887
2897
±
±
49.9
2096
5.8
4.5
6.2
40.6
269.2
19.5
Beerenauslese
Tabella 47 Acido contenuto nei vini tedeschi in mg/L (valori medi su 4 o 2 analisi; sono state
conservate le denominazioni tedesche )
•
•
Cromatografia a esclusione ionica
•
Quali ioni si determinano in cromatografia a esclusione ionica?
Colonna
6.1005.200 Metrosep Organic Acids (7.8 x 250 mm)
Eluente
0.5 mmol/ L H2SO4/ acetone (85: 15)
Campione
vino bianco, vino rosso
Metodo
exp_12_o.mtw
Sistema
orgacids.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
3 Mpa
Tempo dell'analisi
20 min
Loop
20 YL
Polarità
+
Miscela di 0.5 mmol H2SO4 (850 mL) ed acetone (150 mL).
Diluisci il campione di vino 1: 100 e filtra attraverso un filtro 0.45 Ym.
Cromatogramma 32
Soluzione standard per la determinazione di acidi organici nel vino
– 84 –
4/15/2001
Tabella 49 Component i- Esperimenti 12a e 12b - Standard
Picco
1
2
3
4
5
6
Componente
Citrato
Tartrato
Malato
Succinato
Lattato
Acetato
picco di sistema
tR [min]
7.2
7.5
8.3
9.9
10.8
13.1
15.9
Conc. [mg/L]
5
20
5
5
20
10
TP
26200
7990
9210
7140
8830
11500
Area [HS/cm*s]
1.1
31
4.5
1.2
11
1.2
Esperimento 12a - Determinazione degli acidi organici nel vino bianco
Cromatogramma 33
Determinazione degli acidi organici nel vino bianco (diluizione 1: 100)
Picco
1
2
4
7
8
9
Componente
Citrato
Tartrato
Malato
Succinato
Lattato
Acetato
picco di sistema
tR [min]
7.2
7.5
8.2
9.8
10.7
13.0
15.8
Conc. [mg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
1210
8430
19
350
2190
710
5660
8820
5200
0.8
13
0.8
Commenti
– 85 –
4/15/2001
Esperimento 12b - Determinazione degli acidi organici nel vino rosso
Cromatogramma 34
Determinazione degli acidi organici nel vino rosso (diluizione 1: 100)
Picco
1
2
4
7
8
9
Componente
Citrato
Tartrato
Malato
Succinato
Lattato
Acetato
picco di sistema
tR [min]
7.2
7.5
8.2
9.9
10.8
13.1
15.9
Conc. [mg/L]
TP
Area [HS/cm*s]
2230
8300
34
410
1560
1010
10500
9570
7950
1.0
8.9
1.1
Commenti
I picchi 3, 5 e 6 non sono stati quantificati; citrato e malato non sono quantificabili correttamente.
4.3.6
Esperimento 13 - Contaminanti nel borato- determinazione di cloruro e solfato in
soluzioni di borace
La borace (tetraborato di sodio, Na2B4O7·10 H2O, Na2[B4O5(OH)4]·8H2O) ha la struttura seguente:
OH
O
HO
B
O
B
O
B
O
B
OH
2 Na
8 H2O
O
OH
Figura 33
"Borace" (tetraborato di sodio, Na2B4O7·10 H2O; Na2[ B4O5 (OH) 4] ·8H2O)
Molti ossidi dei metalli si sciolgono nella borace fusa con formazione di colori caratteristici. Questa
tecnica è nota nell'analisi chimica inorganica qualitativa come "perla di borace". La borace è impiegata
anche nella produzione del vetro, delle ceramiche vetrificate, delle porcellane e nelle tecniche di
saldo-brasatura dove viene impiegata come flussante. A 100 °C la borace perde 5 molecole d'acqua e
diviene pentaidrata, forma nota come "borace del gioielliere." In combinazione con un flusso di
saldatura distrugge i contaminanti di superficie che sono principalmente strati di ossido. Questi
– 86 –
4/15/2001
impedirebbero la formazione della lega tra il saldante (esso stesso una lega di argento, rame e
stagno) ed il materiale di base.
Le soluzioni di sodio tetraborato (borace) sono impiegate nel circuito di raffreddamento interno delle
centrali nucleari, agendo come assorbitori di neutroni. La purezza del materiale è estremamente
importante perchè tracce di cloruro e solfato causano la corrosione della tubatura, cosa da evitare
assolutamente.
L'acido borico H3BO3 o B(OH)3 è un acido monobasico molto debole il cui valore di pKA è di 9.25,
vicino a quello dell' HCN. L' acido borico non è un donatore di H+ (definizione di acido di Brønsted),
ma piuttosto un accettore di OH- ( definizione di acido di Lewis):
B(OH)3 + HOH
-
+
H + B(OH)4
In cromatografia ionica senza soppressione chimica si impiega un'eluente acido con pH= 4.1 per la
determinazione dei contaminanti nel borato. Infatti a questo pH il borato è presente quasi interamente
come acido borico B(OH)3. A differenza degli anioni carichi negativamente, l'acido borico non
interagisce con la fase stazionaria della colonna di separazione. Questo significa che eluisce nel
volume morto.
Invece, con la soppressione chimica è necessario utilizzare l'eluente debolmente basico
carbonato/bicarbonato. E sebbene sia possibile separare il borato come anione, la rilevabilità non è
buona. La causa di questo può essere ricondotta al soppressore, che scambia tutto l' Na+ con ioni H+.
Come risultato, si forma l'acido borico che è un acido debole.
L'elevata concentrazione di acido borico disturba il cromatogramma, rendendo la determinazione degli
anioni quasi impossibile. L'eliminazione della matrice (vede capitolo 4.3.2) rappresenta la migliore
soluzione al problema.
Nelle centrali è necessario controllare le tracce di anioni presenti in campioni d'acqua contenente il 24% di acido borico. In questi casi si applica la tecnica dell'eliminazione della matrice con
preconcentrazione del campione (vedi cromatogramma 37).
•
Acidi forti e deboli
•
Confronto tra misurazioni con e senza soppressione chimica
•
•
Esperimento 13a – Misura senza soppressione chimica
Tabella 52 Parametri - Esperimento 13a
Colonna
Eluente
8 mmol/ L acido ftalico, 2% acetonitrile; pH = 4.1 (TRIS);
Campione
1 g/ L borace in acqua ultrapura, addizionato con 1 ppm di cloruro e
solfato
Metodo
exp_13_n.mtw
Sistema
anonsupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
2 MPa
Tempo dell'analisi
23 min
Loop
100 YL
Polarità
+
– 87 –
4/15/2001
Dissolvi 1.33 g di acido ftalico in 20 mL di acetonitrile ed una piccola quantità di acqua, aggiungi la
soluzione all'acqua degasata e porta a 1 L. Aggiusta il pH a 4.1 per aggiunta di circa 1 g di TRIS
(solido).
Cromatogramma 35
chimica
Borato arricchito con 1 ppm di cloruro e di solfato - senza soppressione
Picco
1
2
Componente
Cloruro
Solfato
picco di sistema
tR [min]
4.4
9.0
19
Conc. [mg/L]
1
1
TP
2790
3270
Area [HS/cm*s]
12
8.4
Esperimento 13b - Determinazione con soppressione chimica
Tabella 54 Parametri - Esperimento 13b
Colonna
Eluente
Campione
1 g/ L borace in acqua ultrapura, arricchito con 1 ppm di cloruro e di
solfato
Metodo
exp_13_s.mtw
Sistema
asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
2 MPa
Tempo dell'analisi
16 min
Loop
20 YL
Soppressore
Polarità
+
– 88 –
4/15/2001
Dissolvi 265 mg di carbonato di sodio (anidro) e 201.5 mg di bicarbonato di sodio in 980 mL acqua
Cromatogramma 36
Borato arricchito con 1 ppm di cloruro e di solfato - con soppressione chimica
Picco
1
2
Componente
Cloruro
Solfato
tR [min]
5.4
13.7
Conc. [mg/L]
1
1
TP
4170
3290
Area [HS/cm*s]
15
11
Cromatogramma d'esempio - Determinazione di tracce di anioni in acido borico con
preconcentrazione ed eliminazione della matrice
Tabella 56 Parametri - cromatogramma dell'Esempio
Colonna
6.1006.100 Metrosep Anion Dual 2 (4.6 x 75 mm)
Eluente
0.8 mmol/ L NaHCO3/ 5.5 mmol/ L Na2CO3
Campione
soluzione acquosa al 4% di acido borico
Flusso
0.8 mL/ min
Pressione
4.6 MPa
Tempo dell'analisi
25 min
Introduzione del
campione
2 mL di campione vengono fatti passare attraverso la colonna di
preconcentrazione dove gli anioni in tracce vengono trattenuti.
Sucessivamente la colonna di preconcentrazione va lavata con acqua
ultrapura per rimuovere l'acido borico (eliminazione della matrice) ed
quindi inserita nel cammino dell'eluente (Inject). Il le tracce di anioni
arricchite vengono rieluite, e trasportate alla Metrosep Anion Dual 2 per la
separazione.
Soppressore
soluzioni rigeneranti : 50 mmol/ L H2SO4, acqua ultrapura;
Polarità
+
– 89 –
4/15/2001
Dissolvi 583 mg di carbonato di sodio (anidro) e 67.2 mg di bicarbonato di sodio in 1 L di acqua
ultrapura.
Cromatogramma 37
Determinazione di anioni in tracce in acido borico al 4% con
preconcentrazione ed eliminazione della matrice
Tabella 57 Componenti - cromatogramma d'esempio
Picco
1
3
4
5
Componente
Cloruro
Nitrato
Fosfato
Solfato
tR [min]
5.7
12.6
15.6
20.9
Conc. [Hg/L]
15.6
4.1
15.5
35.8
4.3.7
Esperimento 14 - Anioni nelle acque di scarico
Negli impianti di trattamento biologico la purificazione delle acque di scarico avviene principalmente
con l'impiego di batteri. Le sostanze organiche vengono ossidate quasi completamente per consumo
di ossigeno.
Sostanze organiche + O2
CO2 + H2O + cell mass
Oltre all'ossidazione delle sostanze organiche, l'ammonio può essere ossidato a nitrato in impianti
appositi (nitrificazione).
+
–
NH4 + 2 O2
NO3 + H2O + 2 H
+
Sucessivamente nei reattori anaerobici i batteri utilizzano il nitrato al posto dell'ossigeno per
l'ossidazione delle sostanze organiche (denitrificazione).
–
–
2 CO2 + 2 OH + 2 H2O + N2(
Sostanze organiche + 2 NO3
+
–
3+
Il fosfato, un nutriente come l’NH4 e l’NO3 , viene precipitato per aggiunta in soluzione di sali di Fe .
Oltre alla determinazione dei così detti parametri totali, quali richiesta biochimica di ossigeno (BOD),
richiesta chimica di ossigeno (COD) e carbonio organico totale (TOC), che sono una misura del carico
– 90 –
4/15/2001
+
–
3–
organico delle acque analizzate, anche l'analisi di NH4 , NO3 , PO4
invece vengono controllati solo in circostanze speciali.
2-
-
è importante. Il Cl e il SO4
Negli impianti comunali di trattamento tedeschi con più di 100'000 equivalenti di popolazione (1
equivalente di popolazione è il flusso di liquame pro capite) sono stati fissati i seguenti limiti:
BOD
15
mg/L
COD
75
mg/L
NH4-N
10
mg/L*
Ntot
18
mg/L* (somma di NH4-N, NO2-N, NO3-N)
PO4-Ptot
1
mg/L
* Si riferiscono ad una temperatura dell'acqua di scarico di 12 °C, perchè la nitrificazione viene
influenzata grandemente dalla temperatura.
Con i simboli NH4-N, NO2-N, NO3-N si indica che i valori riportati si riferiscono al solo azoto contenuto
nei rispettivi ioni ; lo stesso vale per PO4-P.
•
Analisi ambientale
•
Tecniche di preparazione del campione
•
Analisi di miscele di sostanze con grandi differenze di concentrazione - range dinamico di
concentrazione.
Colonna
Eluente
Campione
di acqua di scarico Municipale (da Herisau, Svizzera)
Metodo
exp_14_s.mtw
Sistema
asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
2 MPa
Tempo dell'analisi
15 min
Loop
20 YL
Soppressore
autostep con valvola di iniezione in posizione di “fill”
Polarità
+
La filtrazione del campione è assolutamente essenziale. Utilizzare per esempio i Minisart della
Sartorius o i one-way filter holders della Schleicher& Schüll con una porosità dell' ordine dei 0.45 Ym o
meno. Soluzioni apparentemente limpide possono contenere particelle molto fini che danneggiano la
colonna.
– 91 –
4/15/2001
Esperimento 14a - Acqua in ingresso all'impianto di trattamento
Cromatogramma 38
trattamento
Soluzione standard per l'analisi dell'acqua in ingresso all'impianto di
Tabella 59 Componenti - Esperimento 14a - Standard
Picco
1
2
3
4
Componente
Cloruro
Nitrato
Fosfato
Solfato
Cromatogramma 39
tR [min]
5.2
9.1
10.3
12.5
Conc. [mg/L]
100
2
5
100
TP
3470
4330
3040
3820
Area [HS/cm*s]
2270
16
21
1470
Analisi dell'acqua in ingresso all'impianto di trattamento
– 92 –
4/15/2001
Tabella 60 Componenti - Esperimento 14a - acqua in ingresso all'impianto di trattamento
Picco
1
5
6
7
Componente
Cloruro
Nitrato
Fosfato
Solfato
tR [min]
5.2
9.2
10.3
12.5
Conc. [mg/L]
128
2.1
7.0
132
TP
2980
4620
3040
3720
Area [HS/cm*s]
2910
16
30
1940
Commenti
I picchi 2, 3, 4 e 8 non sono stati quantificati.
Esperimento 14b - Acqua in uscita dall'impianto di trattamento
Cromatogramma 40
trattamento
Soluzione standard per l'analisi dell'acqua in uscita dall'impianto di
Picco
1
2
3
4
Componente
Fluoruro
Cloruro
Nitrato
Solfato
tR [min]
3.6
5.2
9.1
12.5
Conc. [mg/L]
0.1
5
10
5
– 93 –
TP
2900
4140
4210
3420
Area [HS/cm*s]
2.1
78
87
53
4/15/2001
Cromatogramma 41
Analisi dell'acqua in uscita dall'impianto di trattamento
Tabella 62 Componenti - Esperimento 14b - Acqua in uscita dall'impianto di trattamento
Picco
1
2
4
5
Componente
Fluoruro
Cloruro
Nitrato
Solfato
tR [min]
3.6
5.2
9.2
12.5
Conc. [mg/L]
0.05
7.3
8.5
6.8
TP
2900
3870
4390
3460
Area [HS/cm*s]
1.1
114
73
71
Commenti
Il picco 3 non è stato quantificato.
4.3.8 Esperimento 15 - Determinazione del fluoruro nella pasta dentifricia
Gli ingredienti principali dei dentifrici sono:
• acqua - dal 30 al 40%
• agenti pulenti - sono sostanze insolubili, inorganiche che intensificano l'azione di pulizia dello
spazzolino da denti. Le particelle di cui sono costituite sono di solito < 15 Ym. Comunemente
vengono impiegati a tale scopo Al2O3, CaCO3, CaHPO4·2H2O, SiO2·H2O, silicati di sodio e
alluminio
• fluoruro - aumenta la resistenza dello smalto dei denti contro l'attacco da parte degli acidi prodotti
dalla placca batterica. I fluoruri partecipano alla mineralizzazione dello smalto dei denti (la parte
inorganica dello smalto consiste principalmente di fosfato di calcio, idrossiapatite, carbonato di
calcio, fosfato di magnesio, fluoruro e cloruro di calcio). Questo significa che il fluoruro è importante
per la prevenzione della carie. I composti del fluoro usati più di frequente sono il fluoruro di sodio, il
monofluorofosfato di sodio e i fluoruri di ammonio quaternari, che contengono anche ioni fluoruro
liberi. In alcuni paesi il fluoruro viene aggiunto all'acqua potabile.
Figura 34 Monofluorofosfato di sodio
– 94 –
4/15/2001
• tensioattivi (per esempio il Laurylsolfato sodico)- abbassano la tensione superficiale ed aiutano a
distribuire il dentifricio uniformemente. Aumentano l'effetto pulente, particolarmente nei punti che è
difficile raggiungere con lo spazzolino da denti.
Altri ingredienti dei dentifrici sono per esempio:
• umidificanti (come il glicerolo, il sorbitolo e il glicole polietilenico) - migliorano la stabilità alle
basse temperature e prevengono l'essicazione.
•
leganti e addensanti (per esempio la sodio-carbossimetilcellulosa ) - prevengono la separazione
in due fasi liquida e solida.
•
dolcificanti (per esempio la saccarina)- migliorano il gusto del dentifricio.
•
conservanti (per esempio l'acido 4-idrossibenzoico) - vengono impiegati per proteggere il
dentifricio contro la decomposizione batterica.
•
sostanze aromatiche - vengono aggiunte per aumentare la gradevolezza del dentifricio ma
anche per accrescere l'impressione dell'azione igenica. Questi includono l'essenza di menta, il
mentolo, l'essenza d'anice, l'olio di eucalipto, oli aromatici, l'olio di agrumi.
L'analisi del dentifricio in cromatografia ionica determina il contenuto di fluoruro proveniente dal
fluoruro di sodio e dal mono fluoro fosfato di sodio contemporaneamente.
Commenti
Il citrato eluisce dalla colonna Metrosep Anion Dual 1 (3 x 150 mm) solo dopo circa 90 min.
Per questo per verificare se il citrato è presente nel dentifricio, nell'Esperimento 15b si impiega la
precolonna Metrosep Anion Dual 1 (6.1006.030) invece della colonna di separazione Metrosep Anion
Dual 1.
•
Controllo di qualità
•
Esperimento 15a - Dentifricio senza citrato
Tabella 63 Parametri- Esperimento 15a
Colonna
6.1006.020 Metrosep anion Dual 1 (3 x 150 [mm])
Eluente
Campione
dentifricio (senza citrato)
Metodo
exp_15_s.mtw
Sistema
asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
3 MPa
Tempo dell'analisi
50 min
Loop
20 YL
Soppressore
autostep con la valvola di iniezione in posizione “fill”
Polarità
+
– 95 –
4/15/2001
Dissolvi 1 g di dentifricio in 19 mL di acqua ultrapura e quindi filtra con filtri da 0.45 Ym.
Cromatogramma 42
Dentifricio senza citrato (diluizione 1: 20)
Picco
1
2
3
4
5
6
7
8
Componente
Fluoruro
Formiato
Chloruro
picco di sistema
Monofluoro fosfato
Fosfato
Solfato
Saccarina
tR [min]
3.9
4.5
5.6
6.7
10.2
11.5
14.1
42.6
Conc. [mg/L]
1304
52
66
TP
1357
1643
4325
Area [HS/cm*s]
1663
19.8
55.3
260
1346
160
4527
3047
3831
1917
3.1
55.4
880
179
Esperimento 15b - Dentifricio con citrato
Tabella 65 Parametri- Esperimento 15b
Colonna
6.1006.030 Metrosep Anion Dual 1 precolumn cartridge
Eluente
Campione
dentifricio (con citrato)
Metodo
exp_15b_s.mtw
Sistema
asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
3 MPa
Tempo dell'analisi
25 min
Loop
20 YL
Soppressore
– 96 –
4/15/2001
Polarità
+
Dissolvi 1 g di dentifricio in acqua ultrapura (diluizione 1: 20) e quindi filtra con filtri da 0.45 Ym .
Cromatogramma 43
Dentifricio con citrato (diluizione 1: 20)
Picco
1
2
Componente
Saccarina
Citrato
tR [min]
8.2
16.2
Conc. [mg/L]
160
2600
TP
510
267
Area [HS/cm*s]
177
360
4.3.9 Esperimento 16 - Anioni nello zucchero raffinato e grezzo
Gli zuccheri sono composti organici con un gruppo carbonilico che forma semi-acetali e diversi gruppi
idrossilici. Normalmente il nome "zucchero" viene usata per indicare un disaccaride particolare, il
saccarosio.
– 97 –
4/15/2001
Figura 35 Il disaccaride saccarosio.
Nella produzione di zucchero dalla barbabietola da zucchero, la barbabietola vene dapprima lavata e
tritata; quindi viene eseguita un'estrazione in acqua in un'unità di diffusione in controcorrente. In
questo modo si estraggono i costituenti solubili - zucchero, sali, acidi, proteine, pectine. La maggior
parte dei costituenti non-zuccherini viene precipitata per aggiunta di calce viva (CaO). Nel passaggio
successivo viene usata anidride carbonica (CO2) per precipitare l'idrossido di calcio in eccesso come
CaCO3. Dopo filtrazione la soluzione di zucchero viene concentrata in evaporatori a multiplo effetto
per ottenere il "sugo denso" che filtrato di nuovo e ulteriormente concentrato separa la "massacotta".
Lo zucchero viene da qui separato per centrifugazione e, dopo purificazione (per ricristallizzazione), si
ottiene un cristallo bianco come neve, lo zucchero con una purezza del 99.95%. Le acque di
centrifugazione hanno l’aspetto di uno sciroppo marrone chiamato 'melassa'.
Lo zucchero grezzo si ottiene da una purificazione meno spinta e talvolta viene colorato usando la
melassa. Oltre ai contaminanti organici, contiene metalli alcalini e alcalino terrosi e anioni; ed ha
anche un diverso sapore rispetto al cristallo bianco di zucchero.
I contaminanti organici devono essere eliminati prima della determinazione degli anioni e si usa a tale
scopo una colonna RP (fase inversa).
•
•
Controllo di processo
•
Controllo di generi alimentari ad alto contenuto di zucchero, es. miele
Colonna
Eluente
Campione
a) zucchero raffinato;
b) zucchero grezzo
Metodo
exp_16_s.mtw
Sistema
asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
4 Mpa
Tempo dell'analisi
17 min
Loop
100 YL
Sopressore
Polarità
+
ultrapura. Quindi aggiungi 20 mL acetone.
Dissolvi lo zucchero in acqua ultrapura (diluizione 1: 10) e filtra attraverso un filtro 0.45 Ym .
– 98 –
4/15/2001
Esperimento 16a - Zucchero raffinato
Cromatogramma 44
Soluzione standard per l'analisi dello zucchero raffinato
Tabella 68 Componenti - Esperimento 16a - Standard
Picco
1
2
3
4
5
6
Componente
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Malato
Solfato
Ossalato
tR [min]
5.5
7.0
9.6
12.0
12.9
14.8
Conc. [mg/L]
0.1
TP
4408
Area [HS/cm*s]
8.1
0.1
0.1
0.1
0.1
3682
3587
2995
3260
4.0
1.2
5.9
3.7
– 99 –
4/15/2001
Cromatogramma 45
Analisi dello zucchero raffinato (diluizione 1: 10)
Tabella 69 Componenti - Esperimento 16a - Zucchero raffinato
Picco
1
2
3
4
5
6
Componente
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Malato
Solfato
Ossalato
tR [min]
5.5
7.2
9.8
12.2
13.1
15.0
Conc. [mg/L]
1.3
TP
4183
Area [HS/cm*s]
10.3
0.8
1.5
0.9
1.4
4157
2833
3404
3432
3.2
1.8
5.2
5.3
Esperimento 16b- Zucchero grezzo
Cromatogramma 46
Soluzione standard per l'analisi di zucchero grezzo
Picco
1
2
3
4
5
6
7
Componente
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Fosfato
Malato
Solfato
Ossalato
tR [min]
5.3
6.9
9.6
10.7
12.1
13.0
14.9
Conc. [mg/L]
20
TP
3640
Area [HS/cm*s]
2200
0.1
10
5
5
1
3700
3330
3430
3600
3220
3.9
245
62
294
40
– 100 –
4/15/2001
Cromatogramma 47
Analisi di zucchero grezzo (diluizione 1: 10)
Tabella 71 Componenti - Esperimento 16b- Zucchero grezzo
Picco
1
2
3
4
5
6
7
Componente
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Fosfato
Malato
Solfato
Ossalato
tR [min]
5.4
7.2
9.7
10.8
12.2
13.0
14.9
Conc. [mg/L]
217
TP
3480
Area [HS/cm*s]
2380
1.8
84
55
74
6.9
2870
3320
3840
3980
3530
7.0
205
68
435
28
Commenti
Nel caso dello zucchero grezzo i contaminanti possono eluire a tempi di ritenzione maggiori; questo
potrebbe interferire coi cromatogrammi successivi se si imposta un tempo per la corsa troppo breve.
Per questo è buona norma che lo zucchero raffinato sia analizzato prima dello zucchero grezzo.
4.3.10 Esperimento 17- Contaminanti nel perossido di idrogeno
Il perossido di idrogeno puro (H2O2) fonde a 0.4 °C e bolle a 150 °C e si prepara per cristallizzazione
frazionata e solo sotto condizioni di sicurezza molto severe. H2O2 è commercialmente disponibile in
soluzione acquosa con concentrazioni del 35, 50, 60 o 70%. Queste soluzioni vengono purificate in
scambiatori ionici o per distillazione. La decomposizione fortemente esotermica di H2O2 in H2O ed O2
non è spontanea, ma i metalli pesanti agiscono da catalizzatori.
2 H2O2 ===> 2 H2O + O2 + 196.2 kJ
L'effetto catalitico del metallo pesante sulla decomposizione viene inibito per aggiunta di stabilizzanti
come i fosfati, l'EDTA, o gli stannati. La proprietà più caratteristica di H2O2 è il suo potere ossidante. Il
suo potenziale standard (E0) è +1.8 V a pH= 0 e +0,78 V a pH= 14.
Il perossido di idrogeno è uno dei prodotti più importanti nel settore dei prodotti chimici di base con
una produzione annuale di 2.7 milioni di tonnellate. Viene prodotto industrialmente per reazione di
conversione dell'idroantrachinone con O2 atmosferico. Il processo produce l'antrachinone
corrispondente e H2O2. L'antrachinone nuovamente ridotto ad idroantrachinone, per reazione con
idrogeno elementare in presenza di un catalizzatore al palladio, viene riciclato nel sistema.
Una larga parte della produzione di H2O2 viene utilizzata nei processi di sbiancamento della carta e
della cellulosa. In molti paesi in effetti gli sbiancanti al cloro (con Cl2 o ClO2), che producono acque
non facilmente biodegradabili perchè contenenti composti organici clorurati, sono stati completamente
– 101 –
4/15/2001
o parzialmente sostituiti con altri metodi. In questo contesto l'H2O2 è divenuta un'alternativa
fondamentale.
Altri campi di applicazione sono:
•
la rimozione di ferro e manganese dall'acqua potabile.
•
la detossificazione delle acque di scarico contenenti cianuri (CN , CNO ), un esempio sono le
acque di scarico dei bagni galvanoplastici, con H2O2 o H2O2/H2SO4.
•
la combinazione di H2O2 e di radicali HO (idrossile) prodotti per irragiamento UV; fornisce un
ossidante estremamente forte (E0= +2.8 V), di interesse per la purificazione di scarichi
speciali.
•
lo sviluppo di un metodo per la produzione di ossido di propilene da propene e H2O2 (si
impiegano catalizzatori a strato sottile al titanio) metodo molto promettente rispetto a quello
con la cloridrina che è estremamente inquinante.
•
fra i prodotti secondari dell’H2O2, il perborato di sodio e il percarbonato di sodio sono i più
importanti; impiegati come sbiancanti nei detersivi in polvere.
•
H2O2 è impiegato nell'industria elettronica per la pulizia dei wafer di silicio e dei circuiti
stampati.
–
–
La determinazione di contaminanti in H2O2 è di grande importanza soprattutto nell'industria elettronica.
Anche le più piccole tracce di ioni estranei (ng/L o ppt) diminuiscono significativamente la resa del
wafer, per esempio, la presenza di fosfato introduce difetti di tipo n (negativo) nel reticolo cristallino
della silice.
A concentrazioni elevate il perossido di idrogeno influisce negativamente sia sulla colonna di
separazione che sull'equilibrio carbonatico dell'eluente (vedi cromatogramma 49). Per questo per
l'analisi di tracce di ioni si usa la tecnica di eliminazione della matrice (vedi capitolo 4.3.2) coi vantaggi
seguenti: primo, le soluzioni concentrate possono essere analizzate senza diluizione; secondo, si
possono analizzare volumi di campione più grandi (preconcentrazione).
•
Controllo di processo
•
•
•
Selettività di colonne diverse
Colonna
Eluente
Campione
perossido di idrogeno 30%, suprapur
Metodo
exp_17_s.mtw
Sistema
asupp.smt
Flusso
0.5 mL/ min
Pressione
2 MPa
Tempo dell'analisi
17 min
Colonna di
preconcentrazione
6.1006.300 Metrosep Anion
Introduzione del
campione
1 mL di campione in colonna di preconcentrazione; per l'eliminazione della
matrice lavare con 1 mL di acqua ultrapura
Sopressore
– 102 –
4/15/2001
Polarità
+
Introduzione del campione
Lavare il sistema completamente con acqua ultrapura, quindi caricare 1 mL di campione nella colonna
di preconcentrazione e lavare con 1 mL di acqua ultrapura.
Cromatogramma 48
Soluzione standard per la determinazione di anioni nel perossido di idrogeno
– 103 –
4/15/2001
Tabella 73 Componenti - Esperimenti 17a e 17b- Standard
Picco
1
2
3
4
5
5
6
Componente
Acetato
Formiato
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Solfato
Ossalato
tR [min]
4.2
4.4
5.3
6.9
9.2
12.4
14.2
Conc. [Hg/L]
5
1
1
TP
2620
2940
3300
Area [HS/cm*s]
108
222
587
0.1
0.5
0.1
3730
3160
3010
31
163
21
Esperimento 17a - Analisi di perossido di idrogeno senza eliminazione della matrice
Cromatogramma 49
Analisi di perossido di idrogeno (30%) senza eliminazione della matrice
– 104 –
4/15/2001
Esperimento 17b - Analisi di perossido di idrogeno con eliminazione della matrice
Cromatogramma 50
Analisi di perossido di idrogeno (30%) con eliminazione della matrice
Picco
2
3
5
6
7
8
10
Componente
Acetato
Formiato
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Solfato
Ossalato
tR [min]
4.2
4.4
5.3
7.2
9.3
12.5
14.1
Conc. [Hg/L]
8.8
0.83
0.86
TP
1780
2170
2960
Area [HS/cm*s]
0.15
0.44
0.05
4560
2520
2480
47
142
10
507
Commenti
Lavare contenitori, siringhe e sistema accuratamente più volte. Usare contenitori di plastica. Indossare
occhiali protettivi! I picchi 1, 4 e 9 non sono stati quantificati.
Esperimento 17c - Analisi di perossido di idrogeno con eliminazione della matrice su una
colonna ad alta prestazione.
Tabella 75 Parametri - Esperimento 17c
Colonna
6.1006.530 Metrosep A Supp 5 (4 x 250 mm)
Eluente
1 mmol/L NaHCO3 / 3.2 mmol/L Na2CO3;
Campione
perossido di idrogeno 30%, suprapur
Metodo
exp_17c_s.mtw
Sistema
asupp5.smt
Flusso
1.0 mL/ min
Pressione
11 MPa
Tempo dell'analisi
30 min
– 105 –
4/15/2001
Colonna di
preconcentrazione
6.1006.300 Metrosep Anion
Introduzione del
campione
1 mL di campione in colonna di preconcentrazione; per l'eliminazione della
matrice lavare con 1 mL di acqua ultrapura
Soppressore
Polarità
+
Dissolvi 339 mg di carbonato di sodio (anidro) e 84 mg di bicarbonato di sodio in 1 L di acqua
ultrapura.
Introduzione del campione
Lavare il sistema accuratamente con acqua ultrapura, quindi caricare 1 mL di campione in colonna di
preconcentrazione e lavare con 1 mL di acqua ultrapura.
Cromatogramma 51 Analisi di perossido di idrogeno (30%) con eliminazione della matrice sulla
colonna Metrosep A Supp 5
Picco
3
4
6
7
8
10
13
Componente
Acetato
Formiato
Cloruro
picco di sistema
Nitrato
Solfato
Ossalato
tR [min]
6.3
6.7
8.9
13.0
16.4
23.3
27.0
Conc. [Hg/L]
6.8
0.77
0.78
TP
2850
8740
17810
Area [HS/cm*s]
219
123
380
0.15
0.35
0.04
19100
16640
12100
37
86
7.7
Commenti
I Picchi 1, 2, 5. 9, 10, 11 e 12 non sono stati quantificati.
– 106 –
4/15/2001
4.4 Esperimenti di determinazione di cationi
4.4.1 Esperimento 18- Metalli alcalini e alcalino terrosi nell' acqua potabile
Oltre ai gas disciolti O2, N2 e CO2, l'acqua naturale contiene anche sali che percolano principalmente
dal suolo nelle acque interstiziali. Un'altro costituente dell'acqua naturale sono i composti polari
organici che provengono, per esempio, dagli strati di humus del suolo. La contaminazione da parte di
acque di scarico è un'altra fonte possibile di sali e composti organici. I sali più importanti sono i cloruri,
i solfati e bicarbonati di sodio, calcio e magnesio.
Un parametro importante per l'acqua potabile, sia per l'uso alimentare che nei processi industriali e
per il lavaggio a macchina, è la durezza dell'acqua.
La durezza totale dell'acqua è intesa essere la somma delle concentrazioni molari (mmol/ L) degli ioni
calcio e magnesio. La parte della durezza che può essere rimossa per ebollizione è nota come
durezza carbonatica (o durezza temporanea). La durezza residua è dovuta al solfato e cloruro, i cui
sali di Ca e Mg non possono essere precipitati per ebollizione.
Con i saponi classici - sali di sodio degli acidi grassi - il calcio ed il magnesio formano composti
insolubili . Questi sali sono entrambi inefficaci nel lavaggio e si depositano anche sui tessuti come un
"patina grigia". I moderni agenti detergenti contengono alchil-solfati che non formano composti
insolubili col calcio ed il magnesio. Le zeoliti vengono aggiunte come scambiatori ionici per legare gli
2+
2+
ioni Ca e Mg . Questo previene efficacemente la precipitazione di CaCO3 insolubile e del carbonato
di magnesio per riscaldamento.
La normativa per l'acqua potabile, attuativa delle direttive CEE sull'acqua potabile (80/ 778/ EEC),
impone i valori seguenti per i cationi:
+
0.5
150
12
50
400
NH4
+
Na
+
K
2+
Mg
2+
Ca
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
Un aumento dell'assunzione di ioni sodio da parte dell'organismo umano è causa fra l'altro di un
+
aumento della pressione sanguigna. Il fabbisogno quotidiano di Na è di 1 g ed è di gran lunga
superato nella dieta moderna (3 - 7 g).
In tutte le analisi descritte di seguito i campioni devono essere acidificati per aggiunta di acido nitrico
(pH 2.5 - 3.5), questa garantisce la riproducibilità dei risultati per i cationi divalenti.
Se il contenuto di sodio nel campione è sostanzialmente più alto che nella soluzione standard
proposta, la concentrazione del sodio in quest'ultima dovrebbe venire adattata.
•
Analisi dell'alimento "Numero 1"
•
Controllo dell'etichettatura delle bottiglie di acqua minerale
•
Perchè è necessario acidificare i campioni?
Colonna
6.1010.210 Metrosep C2 (4 x 100 mm)
Eluente
5 mmol/ L acido tartarico/ 0.75 mmol/ L acido dipicolinico;
Campione
- acqua potabile, acidificata a pH= 2.5- 3.5 (+ circa 100 YL di HNO3 2
mol/ L per 100 mL campione)
- acqua minerale, acidificata a pH= 2.5- 3.5 (+ circa 100 YL di HNO3 2
[mol]/ L per 100 mL campione)
Metodo
exp_18_c.mtw
Sistema
cation.smt
Flusso
1 mL/ min
– 107 –
4/15/2001
Pressione
7 MPa
Tempo dell'analisi
12 min
Loop
10 YL
Polarità
-
riscaldamento e porta a 1 L con acqua ultrapura.
Cromatogramma 52
Soluzione standard per la determinazione di cationi in acqua potabile
– 108 –
4/15/2001
Tabella 78 Componenti - Esperimento 18 - Standard
Picco
1
2
3
4
Componente
Sodio
Potassio
Calcio
Magnesio
Cromatogramma 53
tR [min]
3.8
6.5
8.4
11.0
Conc. [mg/L]
0.5
0.2
20
5
TP
4200
3090
1960
2700
Area [HS/cm*s]
1.5
0.9
66
34
Acqua potabile di Herisau, Svizzera (diluizione 1: 10)
Tabella 79 Componenti - Esperimento 18 - Acqua di rubinetto
Picco
1
2
3
Componente
Sodio
Calcio
Magnesio
tR [min]
3.8
8.7
11.2
Conc. [mg/L]
5
85
19
– 109 –
TP
4840
2640
3520
Area [HS/cm*s]
1.4
29
13
4/15/2001
Cromatogramma 54
Acqua minerale (diluizione 1: 10)
Tabella 80 Componenti - Esperimento 18 - Acqua minerale
Picco
1
2
3
4
Componente
Sodio
Potassio
Calcio
Magnesio
tR [min]
3.7
6.4
8.3
10.9
Conc. [mg/L]
4.3
0.8
344
62
TP
4190
6350
1520
2550
Area [HS/cm*s]
1.3
0.3
113
43
Commenti
Tutte le soluzioni devono essere conservate in contenitori di plastica. Ogni contatto col vetro deve
essere evitato per una determinazione corretta del sodio. Il valore del pH dello standard e delle
soluzioni campione deve essere tra 2.5 e 3.5.
4.4.2 Esperimento 19 - Determinazione di metalli di transizione
Per separare gli ioni dei metalli di transizione vengono aggiunti alla fase mobile agenti complessanti.
Essi riducono la densità di carica e migliorano la selettività della separazione, che è relativamente
bassa per gli ioni dei metalli di transizione perchè hanno la stessa carica. Oltre all'equilibrio tra resina
scambiatrice ed analita, in presenza di agenti complessanti si instaura un'ulteriore equilibrio, vale a
dire tra ioni metallici e complessante. Questo equilibrio è influenzato dal pH della soluzione se la
dissociazione dell'agente complessante avviene per stadi o se lo ione metallico forma idrossi
complessi.
Gli acidi deboli organici sono impiegati spesso come agenti complessanti, es. acido tartarico, acido
citrico, acido ossalico, acido piridin-2,6-dicarbossilico (acido dipicolinico - vedi capitolo 4.2.6Esperimento 6 - Alterazione della selettività con l'impiego di agenti complessanti). Il numero di leganti
L che circonda lo ione metallico centrale Me, ovvero il numero di coordinazione, può variare, es. MeL,
MeL2, MeL3 e quindi la carica che ne risulta varia. A seconda della carica del metallo, dei leganti e del
loro numero, possono essere presenti complessi cationici, neutri o anionici. Questo significa che, a
seconda della loro carica, i complessi possono essere separati su scambiatori cationici o anionici.
Teoricamente è possibile lavorare con scambiatori contenenti entrambi i tipi di gruppi scambiatori,
cationici e anionici.
La separazione può essere influenzata e ottimizzata cambiando il valore del pH e gli agenti
complessanti - si possono anche aggiugere alla fase mobile due o più agenti complessanti diversi. In
parte le influenze sono contrapposte e difficili da predire. Alcune indicazioni generali vengono
comunque riportate qui di seguito:
•
la diversa stabilità (costanti di formazione del complesso) influenza la separazione.
•
l'aggiunta di un solvente organico, come l’ acetone, all'eluente influenza la separazione. Infatti gli
ioni lipofilici eluiscono più rapidamente .
•
in cromatografia di scambio cationico, l'etilendiammina si è dimostrata un buon agente eluente. In
condizioni normali è presente nella forma cationica e porta due protoni.
•
un aumento del pH comporta una riduzione del tempo di ritenzione poichè riduce la carica totale.
•
un aumento della concentrazione del legante nella fase mobile, oltre che spostare l'equilibrio di
+
+
complessazione, aumenta la concentrazione del controione H o Na ed accelera quindi la
rimozione del complesso dal sito di scambio carico negativamente, quindi l'efficienza della
separazione viene ridotta.
•
un aumento nella concentrazione del legante causa un aumento nel tempo di ritenzione perchè il
numero di coordinazione del complesso aumenta, d’altro canto il legante anionico libero favorisce
anche l'eluizione dell'anione del metallo complessato, così che i due effetti opposti sul tempo di
ritenzione hanno luogo contemporaneamente.
La rivelazione dei complessi può
(derivatizzazione di post-colonna).
essere
eseguita per
conducibilità
o fotometricamente
Per la rivelazione a conducibilità si può lavorare solo senza soppressione chimica che causerebbe
la formazione di idrossidi insolubili con la reazione di soppressione, visto che gli anioni dell'eluente
disponibili sono il carbonato o l' idrossido.
La rivelazione fotometrica richiede la derivatizzazione di post-colonna nella quale un agente
complessante cromoforo viene introdotto per spostare quello originalmente presente (es. l'acido
– 110 –
4/15/2001
tartarico, l' acido ossalico, ecc.). Il nuovo complesso formatosi è rivelabile all'UV o UV-VIS, sempre
che il massimo di assorbimento del legante libero non sia nella regione del massimo del complesso.
Come, per la maggior parte dei complessi coloranti, i massimi di assorbimento dei singoli complessi di
ogni metallo di transizione cadono in intervalli di lunghezza d'onda diverse, inoltre i limiti di rilevabilità
dei singoli metalli differiscono grandemente.
•
Influenza dell'eluente sulla selettività
•
Complessazione degli ioni dei metalli di transizione
•
Agenti complessanti per la rilevazione fotometrica
•
Fotometria
Colonna
6.1007.000 Nucleosil 5SA (4 x 125 mm)
Eluente
a) 4 mmol/ L acido tartarico, 0.5 mmol/ L acido citrico, 3 mmol/ L
etilendiammina, 5% acetone;
conducibilità circa 500 YS/ cm;
b) 3.5 mmol/ L acido ossalico, 5% acetone, pH= 4 (circa 120 YL
etilendiammina);
Campione
acqua potabile
Metodo
exp_19_c.mtw
Sistema
nucleosil.smt
Flusso
1.5 mL/ min
Pressione
13 MPa
Tempo dell'analisi
a) 12 min;
b) 13 min
Loop
100 YL
Polarità
-
Esperimento 19a - Determinazione di metalli di transizione impiegando un'eluente contenente
acido tartarico, acido citrico, etilenediammina ed acetone (eluente a)
Dissolvi 600 mg di acido tartarico e 105 mg di acido citrico in acqua ultrapura. Aggiungi 200 YL
etilenediammina e 50 mL di acetone e portare a 1 L.
– 111 –
4/15/2001
Cromatogramma 55
Soluzione standard 1 per determinare i metalli di transizione
Tabella 82 Componenti - Esperimento 19a - Standard 1
Picco
1
2
3
4
5
6
Componente
Nichel
Zinco
Cobalto
Ferro (II)
Calcio
Magnesio
Cromatogramma 56
tR [min]
3.4
4.4
5.6
8.1
9.8
10.8
Conc. [mg/L]
5
5
5
10
5
5
TP
1020
5640
4370
6150
6340
6390
Area [HS/cm*s]
40
36
34
30
29
39
Soluzione standard 2 per determinare i metalli di transizione
– 112 –
4/15/2001
Tabella 83 Componenti - Esperimento 19a - Standard 2
Picco
1
2
3
4
5
6
Componente
Piombo
Nichel
Zinco
Cobalto
Cadmio
Manganese
Cromatogramma 57
tR [min]
2.9
3.4
4.3
5.6
8.6
9.9
Conc. [mg/L]
5
5
5
5
5
10
TP
2680
930
5510
4310
6600
6270
Area [HS/cm*s]
8.6
43
37
34
15
45
Analisi di acqua potabile (diluizione 1: 10)
Tabella 84 Component i- Esperimento 19a - Acqua potabile
Picco
1
2
3
Componente
Zinco
Calcio
Magnesio
tR [min]
4.2
9.8
10.6
Conc. [mg/L]
1.2
89
19
No. di piatti
6360
5750
7460
Area [HS/cm*s]
0.9
53
15
Esperimento 19b - Determinazione di metalli di transizione impiegando un'eluente contenente
acido ossalico, etilendiammina ed acetone (eluente b)
Dissolvi 315 mg di acido ossalico in acqua ultrapura, aggiungere 50 mL di acetone e portare a 1 L con
acqua ultrapura. Aggiusta il pH a pH= 4 con etilendiammina (circa 120 YL).
– 113 –
4/15/2001
Cromatogramma 58
Soluzione standard per determinare i metalli di transizione
Picco
1
2
3
4
Componente
Ferro
Manganese
Magnesio
Calcio
Cromatogramma 59
tR [min]
2.2
4.0
7.5
12.3
Conc. [mg/L]
10
10
5
5
TP
2110
1830
3110
6000
Area [HS/cm*s]
50
110
98
45
Analisi di acqua potabile (diluizione 1: 10)
– 114 –
4/15/2001
Tabella 86 Componenti - Esperimento 19b - Acqua potabile
Picco
1
2
Componente
Magnesio
Calcio
tR [min]
7.3
12.4
Conc. [mg/L]
21
91
TP
4690
4780
Area [HS/cm*s]
41
83
Commenti
Nel caso dell'eluente a) il calcio e il manganese coeluiscono. Nel caso dell'eluente b invece, calcio e
manganese vengono separati; nichel, zinco e cobalto vengono complessati fortemente ed eluiscono
col picco dell'acqua.
4.4.3 Esperimento 20 - Contaminanti nel gel di silice - determinazione di calcio e magnesio
Il gel di silice prodotto, per esempio, per idrolisi di silicati di sodio e successiva rimozione completa
dell' acqua ha la struttura seguente:
O
Si
O
O
O
Si
O
OH
Si
O
Si
O
Si
OH
OH
Figura 36 Struttura del gel di silice
Oltre al suo uso come agente assorbente tecnico, il gel di silice è impiegato sia in gascromatografia
che in cromatografia liquida ad alta pressione.
In gascromatografia originalmente si utilizzavano solo colonne impaccate - e sporadicamente sono
ancora in uso oggi. Esse si preparano usando un carrier particolato, appunto come il gel di silice, che
viene sospeso in una fase liquida, per es. olio di silicone. Il numero di piatti teorici di tali colonne è
basso comparato con quelli delle colonne capillari che oggi sono molto più diffuse.
In cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) il gel di silice è impiegato come fase stazionaria
o materiale di trasporto sia per l'adsorbimento, che per la fase inversa (RP), la fase normale e per la
cromatografia ionica. Per alcune di queste applicazioni la superficie del gel di silice deve essere
modificata con gruppi funzionali (per es. gruppi octadecilici o gruppi a scambio ionico ).
Il gel di silice come fase stazionaria viene impiegato in alternativa o in aggiunta ad Al2O3 anche in
cromatografia di adsorbimento. La separazione cromatografica si basa sull’interazione di legame
dipolo dipolo-indotto, dipolo-dipolo, ponte a idrogeno e sul legame di tipo complesso- . La
cromatografia di adsorbimento si usa per la separazione di sostanze non-polari che è difficile
sciogliere in acqua.
In cromatografia RP i gruppi silanolici liberi del gel di silice sono resi idrofobici per mezzo di un
legame chimico con catene alchiliche più lunghe (per es. gruppi con otto o diciotto carboni):
Figura 37 Reazione del gel di silice con clorosilano (R= C8H17 a C18H37)
In questa reazione rimangono comunque dei gruppi silanolici liberi; questi possono assorbire composti
polari e causare scodamenti nei picchi. Questi gruppi silanolici residui possono essere disattivati con
trimetilcloro silano - "end-capping".
In cromatografia di fase normale i residui polari sono chimicamente vincolati ai gruppi silanolici, per
esempio.
(CH2)n C
N o
(CH2)n NH2
Una fase mobile meno polare o non polare verrà impiegata con questa fase stazionaria polare per
realizzare la separazione cromatografica. In cromatografia RP, che rappresenta circa il 75% di tutte le
applicazioni HPLC, le polarità sono invertite, una fase stazionaria non polare è impiegata con una fase
– 115 –
4/15/2001
mobile polare. Si può quindi osservare che il nome fase inversa ha solo un'origine storica legata al
fatto che questo metodo è stato sviluppato più tardi.
In cromatografia ionica viene impiegato come scambiatore cationico per l'analisi di metalli alcalini il
gel di silice funzionalizzato con gruppi solfonici.
La contaminazione del gel di silice da parte di ioni metallici è rilevante in cromatografia poichè questi
possono causare interferenze non specifiche. Per la determinazione di questi contaminanti viene
impiegato uno scambiatore cationico fortemente acido.
I cationi monovalenti eluiscono nel volume morto sicchè si osserva solo la separazione dei cationi
divalenti. Il Fe(III) deve essere ridotto a Fe(II) con acido ascorbico prima dell'analisi.
•
Controllo di qualità
•
Esperimento addizionale: arricchire l'estratto con Fe (III); eseguire la determinazione con e
senza aggiunta di acido ascorbico (vitamina C)
•
Colonne di separazione HPLC a gel di silice
Tabella 87 Parametr i- Esperimento 20
Colonna
6.1007.000 Nucleosil 5SA (4 x 125 mm)
Eluente
4 mmol/ L acido tartarico, 0.5 mmol/ L acido citrico, 3 mmol/ L
etilendiammina, 5% acetone;
Campione
gel di silice (5% soluzione)
Metodo
exp_20_c.mtw
Sistema
nucleosil.smt
Flusso
1.5 mL/ min
Pressione
13 MPa
Tempo dell'analisi
12 min
Loop
100 YL
Polarità
-
Dissolvi 600 mg di acido tartarico e 105 mg di acido citrico in acqua ultrapura. Aggiungi 200 YL di
etilendiammina e 50 mL di acetone e porta a 1 L con acqua ultrapura.
– 116 –
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Cromatogramma 60
Soluzione standard per la determinazione di cationi nel gel di silice
Picco
1
2
Componente
Calcio
Magnesio
Cromatogramma 61
tR [min]
9.6
10.5
Conc. [mg/L]
0.5
0.1
TP
6990
7260
Area [HS/cm*s]
3.1
0.7
Determinazione di cationi nel gel di silice
– 117 –
4/15/2001
Tabella 89 Componenti - Esperimento 20 - Gel di silice
Picco
Componente
Ferro
Calcio
Magnesio
1
2
tR [min]
8.1
9.7
10.6
Conc. [mg/L]
n.d.
9.4
1.4
TP
–
6850
10100
Area [HS/cm*s]
–
2.9
0.4
Esperimento 21 - Cosmetici e protezione dalla corrosione: determinazione di
etanolammine e metalli alcalini
Le seguenti tre etanolammine, i cui nomi sono amminoetanolo, iminodietanolo e nitrilotrietanolo, si
ottengono per reazione di ammoniaca con l'ossido di etilene.
4.4.4
H
H2N
CH2
CH2
CH2
CH2
OH
CH2
CH2
OH
N
HO
CH2
CH2
CH2
CH2
OH
CH2
CH2
OH
N
OH
Figura 38 Monoetanol-ammina Figura 39 Dietanolammina
Figura 40 Trietanolammina
Tutte e tre le sostanze sono impiegate per rimuovere CO2 e H2S da miscele di gas, per es. per
rimuovere l'anidride carbonica dal gas di sintesi, ma anche nel processo di sintesi dell'ammoniaca e
anche per la rimozione di solfuri di idrogeno dai gas di raffineria.
+
NR3 + H2O + CO2
T
HNR3 + HCO3
-
Per riscaldamento la CO2 viene rilasciata e l'etanolammina NR3 può essere riciclata nel processo di
assorbimento.
2NR3 + H2S
T
(HNR3)2S
L' H2S invece viene rilasciato a temperatura ancora più alta e ossidato a zolfo liquido (processo
Claus), questo viene poi convertito nelle anidridi SO2 e SO3 e quindi in acido solforico.
La monoetanolammina (di cui la massima concentrazione ammessa sul luogo di lavoro (MAK) è di 3
ppm) è impiegata nei tensioattivi come estere dell'acido grasso. La dietanolammina è impiegata nei
prodotti per la pulizia di mobili e pavimenti, lucidi da scarpe e lubrificanti.
La trietanolammina forma saponi con gli acidi grassi, per es. con l'acido stearico C18H35COOH. Questi
sono facilmente solubile in acqua e olii minerali e sono impiegati perciò come emulsionanti. Possono
essere contenuti anche in preparazioni cosmetiche (per es. la schiuma da barba).
La monoetanolammina viene impiegata come inibitore di corrosione nelle centrali elettriche perchè
mantiene un pH debolmente alcalino ed evita che si formino eccessi di ioni H+ dal processo di
corrosione.
Per la loro determinazione in cromatografia ionica le etanolammine devono venir protonate per
aggiunta di acido e quindi se ne determinano gli ammonio derivati.
•
Determinazione di cationi inorganici ed organici
•
Modifiche di selettività per aggiunta di agenti complessanti
•
Determinazione di ammine in cromatografia ionica
Colonna
6.1010.210 Metrosep C2 (4 x 100 [mm])
Eluente
a) 4 mmol/ L acido tartarico/ 0.75 mmol/ L acido dipicolinico;
conducibilità circa 600 YS/ cm;
– 118 –
4/15/2001
b) 4 mmol/ L acido tartarico/ 0.5 mmol/ L acido dipicolinico;
Campione
standard (etanolammina, [triethanolamine]+ cationi standard)
Metodo
exp_21_c.mtw
Sistema
cation.smt
Flusso
1 mL/ min
Pressione
6 MPa
Tempo dell'analisi
a) 13 min;
b) 14 min
Loop
10 YL
Polarità
-
a) Dissolvi 600 mg di acido tartarico e 125 mg di acido dipicolinico in 100 mL di acqua ultrapura sotto
riscaldamento, quindi porta a 1 L con acqua ultrapura.
b) Dissolvi 600 mg di acido tartarico e 84 mg di acido dipicolinico in 100 mL di acqua ultrapura, quindi
porta a 1 L con acqua ultrapura.
Cromatogramma 62
Soluzione standard 1- Eluente a
– 119 –
4/15/2001
Tabella 91 Componenti - Esperimento 21- Standard 1 (eluente a)
Picco
1
2
3
4
5
Componente
Sodio
Ammonio
Monoetanolammina
Potassio
Trietanolammina
Cromatogramma 63
tR [min]
3.8
4.3
4.9
6.4
9.0
Conc. [mg/L]
2
2
7
5
20
TP
4520
4340
4120
3070
2230
Area [HS/cm*s]
6.8
6.8
10.8
7.9
6.9
Soluzione standard 2- eluente a
– 120 –
4/15/2001
Tabella 92 Componenti - Esperimento 21- Standard 2 (eluente a)
Picco
1
2
3
4
5
6
Componente
Sodio
Ammonio
Monoetanolammina
Potassio
Calcio + trietanolammina
Magnesio
Cromatogramma 64
tR [min]
3.7
4.3
4.9
6.4
8.7
11.0
Conc. [mg/L]
2
2
7
5
5 + 20
5
TP
4500
4190
4380
2930
2070
2970
Area [HS/cm*s]
7.2
7.0
9.8
8.6
24
32
Soluzione standard 2- eluente b
Tabella 93 Componenti - Esperimento 21- Standard 2 (eluente b)
Picco
1
2
3
4
5
6
7
Componente
Sodio
Ammonio
Monoetanolammina
Potassio
Trietanolammina
Calcio
Magnesio
tR [min]
3.9
4.5
5.1
6.6
9.3
10.8
12.2
Conc. [mg/L]
2
2
7
5
20
5
5
TP
4700
4110
4400
2920
2400
3240
2820
Area [HS/cm*s]
7.2
7.0
9.6
8.4
7.3
16
32
Commenti
Se si lavora con l'eluente a) il calcio e la monoetanolammina coeluiscono.
Tutte soluzioni devono essere conservate in recipienti di plastica. Ogni contatto con il vetro deve
essere evitato per una determinazione corretta del sodio.
4.4.5 Esperimento 22- Metalli alcalini ed alcalino terrosi nel vino
Le sostanze minerali nel succo d'uva sono prevalentemente fosfati di calcio, magnesio e potassio. Le
concentrazioni di questi composti sono tra i 3 e i 5 g/L. Il contenuto in sali minerali, noto come
"cenere" del vino è inferiore a quello del succo perchè una parte viene assimilata per via metabolica
dai fermenti della vinificazione. Un'ulteriore riduzione nel contenuto in sali minerali è dovuto alla
separazione dei tartrati. Nel complesso, quindi, il vino contiene solo da 1.8 a 2.5 g/L di "cenere." I
costituenti cationici più importanti vengono normalmente espressi come contenuto di ossidi, e sono:
K2O (circa 40%), MgO (circa 6%), CaO (circa 4%) e Na2O (circa 2%).
(vedi capitolo 4.3.5 - Esperimento 12 - Acidi organici nel vino)
– 121 –
4/15/2001
•
Analisi degli alimenti
•
Analisi di processo - controllo della precipitazione del tartrato
Tabella 94 Parametri- Esperimento 22
Colonna
6.1010.210 Metrosep C2 (4 x 100 mm)
Eluente
4 mmol/ L acido tartarico/ 0.75 mmol/ L acido dipicolinico;
Campione
Vino bianco (Fechy, Svizzera), vino rosso (Pinot Noir, Svizzera),
Metodo
exp_22_c.mtw
Sistema
cation.smt
Flusso
1 mL/ min
Pressione
6 MPa
Tempo dell'analisi
20 min
Loop
10 YL
Polarità
-
riscaldamento, quindi porta a 1 L con acqua ultrapura.
Filtra e diluisci il campione di vino (1:10).
Cromatogramma 65
Soluzione standard per la determinazione dei cationi nel vino
Picco
Componente
tR [min]
Conc. [mg/L]
– 122 –
TP
Area [HS/cm*s]
4/15/2001
1
2
3
4
Sodio
Potassio
Calcio
Magnesio
3.7
5.9
8.6
10.8
1
100
5
10
4360
1480
2950
2150
3.5
180
16
66
Commenti
Tutte soluzioni devono essere conservate in recipienti di plastica. Per una determinazione corretta del
sodio il contatto col vetro deve essere evitato. Il pH dello standard e delle soluzioni campione deve
essere tra 2.5 e 3.5.
Cromatogramma 66
Determinazione dei cationi nel vino bianco (diluizione 1: 10)
Tabella 96 Componenti - Esperimento 22- Vino Bianco
Peak
1
5
6
8
Component
Sodio
Potassio
Calcio
Magnesio
tR [min]
3.7
6.0
8.6
11.0
Conc. [mg/L]
24
590
72
59
TP
4220
1860
2920
2880
Area [HS/cm*s]
8.4
106
23
39
Commenti
I picchi 2, 3, 4 e 7 non sono stati quantificati.
– 123 –
4/15/2001
Cromatogramma 67
Determinazione di cationi nel vino rosso (diluizione 1: 10)
Tabella 97 Componenti - Esperimento 22- Vino Rosso
Picco
1
6
8
10
Componente
Sodio
Potassio
Calcio
Magnesio
tR [min]
3.7
5.8
8.6
10.8
Conc. [mg/L]
10
1380
50
80
TP
2000
1300
3030
2520
Area [HS/cm*s]
3.6
248
16
53
Commenti
I picchi 2, 3, 4, 5, 7 e 9 non sono stati quantificati.
– 124 –
4/15/2001
5 Riferimenti bibliografici
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– 125 –
4/15/2001

asti 31 ottobre/IC applicata

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