Micotossine e Vacche da latte - Società Italiana di Buiatria

Micotossine &
Vacche da latte
ISTITUTO DI SCIENZE
DEGLI ALIMENTI E DELLA NUTRIZIONE
@
FACOLTÀ DI AGRARIA
@
UNIVERSITÀ CATTOLICA DEL SACRO CUORE
PIACENZA
Sommario
Breve introduzione a problema Micotossine
Micotossine comuni
AFLA
ZEA
Tricoteceni (DON; T-2 & HT-2; DAS)
Fumo
OTA
Effetto sinergico delle micotossine
Effetto dei bassi dosaggi
Micotossine nascoste
Micotossine dei Foraggi
Micotossine
Metaboliti secondari prodotte da funghi filamentosi
Tossici per gli organismi superiori
«Micotossicosi»
micotossine
intossicazione
Più frequente effetti Indiretti:
Immunodepressione: causa od effetto?
causata
da
Micotossine e ruminanti
«the dose makes the poison»
Esposizione costante a micotossine, ma raramente
dosi alte
Difficoltà nell’ «imputare» effetto alle micotossine
Difficoltà nel «isolare» effetto dovuto a micotossine
Difficoltà nel «quantificare $» danni dovuti alla
presenza di micotossine negli alimenti
Principali Funghi micotossicogeni
Genere
Specie
Micotossine
Aspergillus
A. flavus
A. parasiticus
Aflatoxin B1, B2
Aflatoxin B1, B2, G1, G2
A. ochraceus
Ochratoxin
A. nigri
Ochratoxin
P. verrucosum
Ochratoxin
P. expansum
Patulin
F. culmorum
F. graminearum
Tricothecenes, Zearalenone
Tricothecenes, Zearalenone
F. verticillioides
F. proliferatum
Fumonisin B1, B2, B3
Fumonisin B1
C. purpurea
Alcaloids (ergoline, ergotammine)
Penicillium
Fusarium
Claviceps
Funghi visti da vicino
Penicillium spp.
Fusarium spp.
Micotossine: situazione mondiale
AllAboutFeed, 2011 2:17-20
Micotossine: presenza negli alimenti
Origine
DON
ZEA
FB1+FB2
T-2 + HT-2
OTA
Ue company
46%
90%
1%
0%
18%
Italia
62%
40%
73%
11%
15%
Totale
(12000 campioni)
79%
55%
20%
4%
15%
Dati FEFAC, 2008
Micotossine: Dove, come, quando?
Micotossine e Ruminanti
Diete per ruminanti
Concentrati
Sottoprodotti
Foraggi
Esposizione “ampia” gamma di micotossine
Rumine: difesa attiva
Micotossine e Ruminanti
Microflora complessa:
• Batteri 1011/ml
• Protozoi 106/ml
• Lieviti 104/ml
Metabolismo ruminale
delle principali micotossine
Mycotoxin
Estimates of
Derivatives
Degradation
AFB1
DON
ZEA
0-30 %
0-50 %
0-90 %
T-2 Toxin
0-70 %
OTA
FUMO
50-100 %
0-35 %
Aflatoxicol
DOM1
α- and β- Zearalenol
Acetyl T-2, HT-2 acetyl
HT-2
Dihydroxyioscounmarin
Quali sono i loro effetti sugli animali?
1.
Rifiuto dell’alimento
2. Immunodepressione
,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,
1.
Maggiore suscettibilità alle malattie
2. Riduzione delle performance produttive e
riproduttive
3. Aumento della mortalità
Tossicità delle Micotossine
Aflatossine: da chi sono prodotte?
Genere Aspergillus spp. (Funghi filamentosi)
Cresce in zone tropicali e sub-tropicali
Fungo di stoccaggio
ma…Può infettare le piante in campo, durante il
trasporto e lo stoccaggio degli alimenti
Aspergillo: condizioni di crescita
Fattori che favoriscono lo sviluppo
Temperatura
Specie Italiane
Umidità
Aw
CO2
O2
37°C
anche 25-30°C
15-18%
>85%
<20%
>10% (<1% No crescita)
Principali specie
A. flavus e A.parasiticus
Anche A. nomius, A. bombycis, e A. tamari
Aflatossina: condizioni di produzione
Metabolismo secondario e relazioni con ambiente
esterno
Presenza del fungo
Fattori che favoriscono la produzione – non certe!!!
Temperatura
Specie Italiane
Umidità granelle
Aw
25-30°C
23-25°C
13-18°C
>85%
Principali Aflatossine
Aflatossine “Madri” Idrofobiche
AFB1, AFB2, AFG1, AFG2
O
O
O
O
O
O
OCH3
O
O
O
OCH3
AFB2
AFB1
O
O
O
O
O
O
O
OCH3
O
AFG1
O
O
O
AFG2
O
O
OCH3
Principali alimenti contaminati
Alto rischio di contaminazione (dal campo)
MAIS e sottoprodotti
COTONE e sottoprodotti
Arachidi
25%
36%
41%
Prodotti vegetali suscettibili (condizioni di stoccaggio)
Soia e sottoprodotti
Cereali (orzo, frumento, triticale, riso)
Principali alimenti contaminati
Matrice
N° campioni
Mais
Mais germe
Mais semola glutinata
Mais glutine
Mais tutoli
Cotone semi
Cotone F.E.
Girasole F.E.
Girasole bucce
Colza F.E.
Lino
Cocco
Soia F.E.
Distiller
Arachide
Sorgo
Cacao
Palma
Citrus pulp
129
7
16
7
2
20
9
59
1
11
4
3
5
3
1
1
1
1
1
Media ± D.S.
(µ
µg/kg)
1.63±3.9
6.93±11.31
10.08±18.2
2.25±3.9
< 0.1
19.87±71.08
19.59±6.08
0.72±0.57
0.01±0.03
3.52
20.42
0.74
0.13
-
Mediana
(µ
µg/kg)
0.13
< 0.1
3.92
1.06
< 0.1
0.14
20.63
0.68
0.00
0.12
17.30
0.10
<0.1
-
Range
(µ
µg/kg)
<0.1 - 35.16
0.69 - 32.42
<0.1 - 58.73
<0.1 - 10.93
< 0.1
<0.1 - 320.30
9.36 - 28.15
<0.1 - 2.03
<0.1
0.1
<0.1 – 3.22
15.02 – 28.95
<0.1 – 2.67
<0.1 – 0.29
0.31
<0.1
0.1
0.9
<0.1
Dati forniti dal prof. Pietri
La realtà Italiana
Principale coltura: MAIS da granella
Temperatura
Specie Italiane
Umidità
CO2
O2
37°C
anche 25-30°C
15-18%
<20%
>10% (<1% No crescita)
Rischio di contaminazione
Silomais
Pastone integrale
Pastone di granella
Granella
---+++
Raccolta del Mais
Raccogliere ad umidità superiore del 18%
Preferibilmente
20-28%
Rapida essicazione delle Granelle (attenzione a
trasporto!!!)
Evitare rottura delle granelle (Piralide, rotture
meccaniche)
La realtà Italiana: “il caso del 2003”
Indice di aridità (Battilani et al., 2007)
< -100
-100 - 0
0 - 50
50 - 100
100 - 200
200 - 300
300 - 400
400 - 500
500 - 700
> 700
< -100
-100 - 0
0 - 50
50 - 100
100 - 200
200 - 300
300 - 400
400 - 500
500 - 700
> 700
< -100
-100 - 0
0 - 50
50 - 100
100 - 200
200 - 300
300 - 400
400 - 500
500 - 700
> 700
< 100
-100 - 0
0 - 50
50 - 100
100 - 200
200 - 300
300 - 400
400 - 500
500 - 700
> 700
Aflatossicosi
Varia con dose, tempo di esposizione, specie, età, stato
sessuale, nutrizionale, etc.
Principali organi bersaglio (Fegato e Reni)
Segni clinici:
anoressia
↓ peso corporeo
↓ produttività (uova o latte)
emoraggie, embrio-tossicità
↓ performance riproduttive
↑ suscettibilità malattie
Aflatossicosi
Epatotossica
Epatocarginogenica
Neurotossica
Nefrotossica
Emotossica
Enterotossica
0steotossica
Immunosoppressiva
Aflatossicosi
Foto riprodotta da presentazione di D.E. Diaz
Effetto delle AFLATOSSINE sulle vacche
Il rumine è un detossificatore?
Effetti sugli animali dipendono:
Dose somministrata
Durata dell’esposizione
Fattori di stress
Ingestione di altre micotossine (Simbiosi, eff. Additivo,
Antagonismo)
Aflatossicosi in Vacche
AFB1 nei mangimi 700 ppb
(35 volte il limite di legge)
Anoressia
Riduzione performance produttive
Insorgenza malattie
AFB1 nei mangimi 100-300 ppb
(5-15 volte limite di legge)
Aumento dimensioni del fegato (dismetabolie ???)
Aflatossicosi nelle vacche
Prova di Campo (USA, 1979)
Contaminazione della dieta
120 ppb
Effetti misurati
Dopo sospensione, aumento del latte del 25%
Aflatossicosi nelle Vacche
Prova di campo (USA, 1979)
120 vacche in mungitura
Contaminazione unifeed 20 ppb
Effetti misurati
Riduzione ingestione di alimenti
Riduzione produzione di latte
Aflatossicosi
Lavori datati
Livelli alti
Risposta dose-effetto non lineare
Non investigata presenza di altre micotossine
Si ha una risposta chiara? NO!
Metabolismo dell’Aflatossina
Ingestione, contatto e inalazione
Assorbimento dell’AFB1: comparsa ematica (6h)
ppt
600
Vitamina A
Retinolo-Palmitato
Inizio transito dal rumine
400
200
0
0
60
AFB1
120
180
240
AFM1
300
minuti dal
trattamento
360
Assorbimento dell’AFB1: comparsa ematica (30’)
AFB1 e AFM1 (ng/L)
240
AFB1
AFM1
200
160
120
80
40
0
0
5
10
15
20
25
30 minuti
Legislazione mondiale
International Agency for Research of Cancer
classifica le AFLATOSSINE
(AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 e AFM1)
“sicuri cancerogeni per l’uomo” (gruppo 1)
Legislazione Europea
DIRETTIVA 2003/100/CE
Legislazione Europea
REGOLAMENTO (CE) N. 1881/2006
Escrezione dell’Aflatossina
L’AFB1 viene idrolizzata e/o coniugata
Meccanismo di escrezione
Feci: 55-80%
Urine: 10-20%
Carni: <1%
Latte: 1-3%
Escrezione dell’AFB1
55-80 %
Escrezione AFs
10-20 %
Bile e Feci
Urine
Latte
(Wong and Hsieh, 1980; Coulombe and
Sharma,1985)
(Eaton et al., 2004; Yannikouris and Juoany, 2002)
Animali in lattazione
49-57 %
AFB1glutatione
(CAST, 2003)
4-15 %
40-50 % less 10 %
AFB1AFM1 AFP1
(Groppman, 1988)
glucuronide
(Holenski et al., 1987)
16 %
AFM1
AFB1-N7Guanina Carry Over 1-3 %
Carry over del AFM1
Unica dose
A FM 1 (µ g /m lL )
0,02
0,015
0,01
0,005
h
0
0
24
48
72
96
Carry over dell’AFM1
Ingestione continuata
Rapido aumento, ma anche rapida riduzione (4-6 munte)
80,0
Fine ingestione
Inizio ingestione
70,0
Milk AFM1 (ng/L)
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Days (n°)
Masoero et al., 2007
Carry Over dell’AFM1
Carry Over: quota di AFB1 escreta nel latte come
metabolita AFM1
Varia fra 1-3% (min 0,1% e max 6%)
Dipende da
Produzione di latte e giorni di lattazione
Specie (Lattifere, ovi-caprini)
Cellule somatiche per permeabilità membrana ????
Carry Over e Produzione di latte
ppt
120
C.O.
3,2-5,1% (4,1%);
prod. 44 kg latte
80
40
C.O. 0,66-1,6% ( 1,2%)
prod. 18.5 kg latte
day
0
1
4
7
Vacche ad Alta Produzione
10
13
16
Vacche a Bassa Produzione
19
Effetto delle SCC sul Carry over
Animali
•Animali 34 pluripare
Divisi per Livello produttivo: LY (< 30 L/vacca/d) & HY (> 30 L/vacca/d)
Cellule Somatiche: LSCC (< 350’000 n°/ml) & HSCC (> 350’000 n°/L)
30 L/vacca/d < > 30 L/vacca/d
Lg SCC (n°/ml)
350000 n°/ml < > 350000 n°/ml
1
2,7
Latte (L/vacca/giorno)
Effetto delle SCC sul Carry Over
Andamento della concentrazione dell’AFM1 (ng/L) nelle vacche analizzate nel disegno
sperimentale (■) HYHSCC, (□) HYLSCC, (▲) LYHSCC, (∆) LYLSCC
80.0
Inizio dell’ingestione di AFB1
Fine dell’ingestione dell’AFB1
70.0
Milk AFM1 (ng/L)
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Days
10
11
12
13
14
15
17
18
Carry over nelle pecore
Battaccone et al., 2005
Prevedere AFM1 nel Latte
AFM1 (ppt) = 1.19 x AFB1 (µg/vacca/d) + 1.9
AFM1 (ppt) = 0.787 x AFB1 (µg/vacca/d) + 10.95
AFM1 (ng/kg)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
20
40
60
AFB1 intake (mg/cow/d) 1
80
Prevedera AFB1 nel latte
L. Giovati, PhD tesi
Prevedere CO nel latte
CO % = 0.0013 x latte prodotto (kg/vacca/d) – 0.0026
CO % = 0.077 x latte Prodotto (kg/vacca/d) – 0.33
0,06
Carry over rate
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0
10
20
30
Milk (kg/cow/d)
40
50
Facciamo degli Esempi
Dieta per vacche da latte
Silomais
Medica
Fieno di prato
Mais
Soia
Cotone
Nucleo
22 kg
4 kg
2 kg
5 kg
3 kg
1 kg
2 kg
Totale AFB1 ingerita = 62 µg
AFM1 latte = 75 ppt (Oltre il limite)
AFB1
10 ppb
<1 pbb
2 ppb
4 ppb
Facciamo degli esempi
Ingestione AFB1 Max
40 µg di AFB1
Cont. UNIFEED Max
2 ppb di AFB1
In termini di alimenti:
Max 2 kg di Mais contaminato a 20 ppb (limite di legge)
Max 5 kg di Mais a 8 ppb di aflatossina
Max 8 kg di Mangime contaminato a 5 ppb (limite di legge)
Metodi di Detossificazione
Controllo della Contaminazione da AFB1
Prevenzione in campo
(Huwing et al., 2001):
•Scelta varietale
•Condizioni agronomiche
•Lavorazioni
•etc.
Metodi di Decontaminazione
Metodi di Detossificazione
“le proprietà tossiche delle
micotossine sono rimosse”
“le micotossine sono rimosse
o neutralizzate”
Prerequisiti (CAST, 2003; Diaz and Smith, 2005)
• Effettive nel ridurre, distruggere e inattivare le micotossine
• Non residuare negli alimenti sostanze tossiche,
cancerogene o mutagene e prodotti derivati
• Non alterare il valore nutritivo degli alimenti e
l’accettabilità
• Non alterare le proprietà “tecnologiche”
• Essere economicamente e tecnologicamente conveniente
• Distruggere spore funginee per evitare contaminazioni
tardive
Metodi di Decontaminazione/Detossificazione
Metodi fisici
Pulitura delle granelle
Separazione per densità
Combinazione (-70-90% di AFB1)
Inattivazione termica
Irradiazione
Estrazione con Solventi
Pulitura delle Granelle
Impossibile eliminare completamente
Dati forniti da Mirco Casagrandi
Funghi tossigeni nei FORAGGI
Funghi «di campo»
Fusarium
Cladosporium
Claviceps
Stachybotrys
Funghi «di stoccaggio»
Sbyssochlamis
Monascus
Foraggi vs. Concentrati
DON
AFB1
FUMO
ZEA
Granelle (51%) Foraggi (27%)
Granelle (22%) Foraggi (13%)
Granelle (45%) Foraggi (27%)
Granelle (45%) Foraggi (34%)
Quando gli alimenti sono contaminati da più micotossine il
DON è co-presente nel 65% dei campioni
Micotossine e Insilati di Mais
Borreani et al., (2003, IA 49-55)
20 aziende in provincia di Cuneo
Annate agrarie 2000-2001 (pioggie abbondanti) & 2001-2002
(relativamente asciutto)
Totale campioni
96 campioni di trinciato alla raccolta
73 trincee e cumuli
Caratteristiche trinciati
DM insilati 25,5-41,4%
pH 3,4-3,9
Micotossine degli Insilati di Mais
Micotossine dei foraggi
New (or old?) Problem?
Strom et al., 2008
Micotossine dei foraggi
New (or old?) Problem?
Strom et al., 2008
Micotossine dei foraggi
New (or old?) Problem?
Strom et al., 2008
Micotossine da Alternaria spp.
Fungo di campo
Mais?, triticale, frumento, orzo, avena
Micotossine:
Ac. Tenauzonico
AAL-toxin, Alternariolo, Alternariolo metiletere, Altenuene
Effetto sugli Animali
???
Cancerogene e fetotossiche
In Cina associate con tumore all’esofago
Micotossine di P. roqueforti
Tossicità su animali – DATI INCERTI
Acido Micofenolico
Attività antimicrobica, Forte immunodepressione (Bentley, 2000)
Roquefortina C
Attività antimicrobica
In manze ha causato Inappetenza, paralisi e chetosi (Häggblom, 1990)
PR Tossina
Attività antimicrobica
Paralisi, aborti e ritenzioni di placenta (Boysen et al., 2000)
Micotossine negli Insilati
Attività ISAN
Campionati 80 foraggi insilati prelevati in 50 Aziende
Acido Micofenolico
n° positivi
39 (49%)
range
0-48 ppm
Olanda (max)
45 ppm (17%)
PR tossina
nd
-
Roquefortina C
29 (36%)
0-32 ppm
25 ppm (23%)
DON
24 (30%)
0-600 ppb
969 ppb (81%)
ZEA
nd
-
203 ppb (46%)
Micotossine dei foraggi
Esperimento ISAN con inoculo ruminale
«Effetto della presenza di micotossine prodotte da
Penicillium roqueforti su fermentescibilità della razione»
Trattamenti (Central Composite Design)
Acido Micofenolico
PR tossina
Roquefortina C
(5 livelli)
(5 livelli)
(5 livelli)
Micotossine da P. roqueforti
Effetto della loro presenza
Response variables
Gas production parameters
Vf (ml/g OM)
k (h-1)
Lag (h)
T½ (h)
Volatile fatty acids
Acetic acid (A, % mol)
Propionic acid (P, % mol)
Butyric acid (B, % mol)
BCFA (% mol)
Total (mmol/l)
A/P ratio
(A+B)/P ratio
MSItot
PR
MYCO
ROQUE
Control syringes
Treated syringed
Reduction (%)
412±18
0.059±0.005
0.06±0.02
12.6±1.6
382±22
0.056±0.009
0.16±0.25
12.6±3.2
-7%
64.2±1.5
18.2±0.6
12.6±1.4
3.4±0.5
96.2±17.0
66.9±4.3
17.1±1.9
11.9±1.9
2.7±1.0
80.9±14.5
3.5±0.2
4.2±0.2
4.0±0.8
4.7±0.8
nd
nd
nd
0
50.2±37.0
48.1±73.3
-16%
Micotossine dei foraggi
Inibizione nella produzione di Gas
Vf (ml/g OM) = 413 – 1,11*Myco (ug) – 0,98*Roque (ug)
Vf model
mVf
413.84
393.00
372.16
30
20
351.33
30
10
20
Mycod
10
0
0
Roqued
Micotossine dei foraggi
Inibizione nella produzione di VFA
VFA (mmol/L) = 98-0.51*Myco (ug) -0.012*Roque2 (ug)
VFA model
mVFA
99.30
90.44
81.59
30
20
72.73
30
10
20
Mycod
10
0 0
Roqued
Micotossine dei foraggi
Confronto con Estratti «naturali»
400
Predicted Vf (ml/g OM)
375
350
325
300
275
250
250
275
300
325
350
Observed Vf (ml/g OM)
375
400
Micotossine da Aspergillus fumigatus
Contamina foraggi, sprtt Insilati
Gliotossina
Attività antimicrobica, immunosoppressiva, genotossica
Campionati 80 foraggi insilati
Ritrovata in 2 casi (ISAN)
Concentrazioni < 1 ppm
Micotossine da Aspergillus fumigatus
Effetto della presenza di Gliotossina su produzione
di Gas e VFA
Gas production (ml)
70
9
8
60
7
VFA production (mmol/L)
80
6
50
5
4
40
30
3
20
2
10
1
0
0
0
2
4
6
8
Gas production (ml)
VFA production (mmol/L)
10
Gliotossina incubata
Morgavi et al., 2004
Micotossine nascoste
Cosa sono?
Micotossine che si coniugano a zuccheri, proteine e grassi
Non vengono quantificate dai metodi analitici «convenzionali»
Vengono rilasciate dai processi digestivi del tratto GI
Anche trattamenti termici (fioccatura, pellettatura, estrusione)
sono in grado di liberarle
Quando libere, esplicano le loro caratteristiche di tossicità
Micotossine nascoste
Tricoteceni
Si stima che negli alimenti, il 30% (fino a 76%) del DON è in forma coniugata (D3G, DON 3
glucoside)
Zearalenone
Si stima che negli alimenti, il 27% di ZEA è in forma coniugata (Z14G, ZON 14 glucoside)
FUMO
Dopo idrolisi, la quantificazione di FUMO è aumentata di 2.6 volte (legame debole)
Questione aperta: «la coniugazione riduce o meno la biodisponibilità della
molecola per gli organismi superiori?»
Z14G è scomposto durante digestione, rilasciando ZEA
D3G non viene rilasciato dopo idrolisi acida (stomaco). Cmq, batteri lattici intestinali sono
in grado di deconiugare il composto
Nessuna informazione su masked FUMO
Berthiller et al., 2012