Classificazione dei fenotipi RhD ed RhD

Classificazione dei fenotipi RhDvariant ed RhDweak
Adelina Ornella Perrone, Ilda Ghiglione, Monica Sasso, Clemente Mazzei
Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale-ASL 1, Imperiese
(Responsabile: Dott.Clemente Mazzei)
It is difficult to discriminate serologically between
RhDweak and RhDvariant. In this work we used two different
available tests for typing partial Rhesus D. Since March
2001 we analysed eighteen samples (coming from
women in a fertile age or from transfusing patients)
showing doubtful classification of the RhD system.
According to the results, it was possible to classify
seventeen weak D (fourteen CcDuee, two CcDuee, one
ccDuee). A not typing and uncertain classifiable sample
with the different serological methods has been
analysed with molecular biological methods and has
been classified as weak D Type 11, a rare type to
transfuse preferably with RhD negative blood.
Parole chiave:RhDvariant, RhDweak, tipizzazione eritrocitaria
Key words: RhDvariant, RhDweak, erythrocyte typing
Introduzione
L'antigene RhD è una proteina di 417 amminoacidi,
situata sulla membrana dei globuli rossi1 (Figura 1). È un
mosaico composto da numerosi determinanti antigenici o
epitopi, intendendo per "epitopo" una porzione di antigene
in grado di reagire con una singola popolazione anticorpale
specifica. L'antigene RhD è codificato dal gene RHD, che
insieme al gene RHCE (responsabile della produzione degli
antigeni CcEe nelle diverse combinazioni alleliche) è situato
sul braccio corto del cromosoma 1, regione 34-36, ed è
formato da dieci esoni2 (Figura 2).
Circa il 18% della popolazione europea non ha l'antigene
RhD, spesso, ma non sempre, a causa della delezione del
gene RHD 3,4 .
Ricevuto: 28 giugno 2002 - Accettato: 29 luglio 2002
Corrispondenza
Dott.ssa Ornella Perrone
Via A. Doria 3
18017 San Lorenzo al Mare (IM)
384
Nella popolazione africana i fenotipi RhD-negativi sono
anch'essi la conseguenza di fenomeni di delezione a carico
del gene RHD, o, meno frequentemente, di mutazioni che lo
rendono inattivo.
Tali eventi possono essere osservati, per esempio, in
presenza dello pseudogene "RHD?" o dell'allele Cdes che
determina un ibrido RHD-CE-D 5.
Circa l'1% degli Europei possiede alleli RHD con struttura
anomala, che codificano per una reattività RhD ridotta,
mentre negli Africani la frequenza degli alleli anomali è molto
più alta.
Di norma, gli alleli anomali codificano per antigeni RhD
parziali (detti anche Dvariant o Dmosaic) ed RhD deboli (oggi
indicati come Dweak e, un tempo, come Du). Ricordiamo che
i fenotipi RhD parziali sono caratterizzati dalla mancanza di
alcuni epitopi mentre gli RhD deboli da una ridotta
espressione quantitativa dell'antigene RhD. I portatori di
alcuni RhD parziali e di rari RhD deboli si possono
immunizzare in seguito a trasfusione con globuli rossi RhDpositivi6-8 o, se donne, dopo il parto di neonati RhD-positivi.
Relativamente alle basi molecolari dei principali antigeni
Rh esiste un ampia variabilità 9,10.
Tra i parametri da tenere in considerazione per valutare
il rischio di immunizzazione post- trasfusionale ricordiamo
la densità antigenica e l'indice di similarità Rhesus 11.
La densità antigenica esprime il numero di siti antigenici
per cellula rilevabili sulla membrana dei globuli rossi con
tecniche di citometria a flusso, utilizzando un ampio spettro
di antisieri anti-D. Può variare da circa 30.000 siti/cellula
negli RhD normali a meno di 100 antigeni in alcuni RhDweak12.
L'indice di similarità Rhesus misura la differenza
qualitativa di ogni campione rispetto a fenotipi RhD normali.
Può variare da un valore prossimo a 1 nelle emazie RhD
normali ad un valore pari a 0 in quelle RhD parziali, che
mancano di uno o più epitopi.
Tuttavia, con le correzioni statistiche dovute alla
LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 47 - num. 3 maggio-giugno 2002 (384-388)
Classificazione dei fenotipi RhDvariant ed RhDweak
Figura 1 - L’antigene RhD è una proteina formata da 417 aa. I terminali amminico e carbossilico sono inseriti nello
scheletro eritrocitario, 12 domini attraversano la membrana eritrocitaria a livello del doppio strato
lipidico,regolarmente spaziati e collegati tra loro da occhielli (loops). Sei occhielli sporgono verso lo strato
extracellulare della membrana detto “glicocalice” e sei occhielli sporgono verso l’interno (da Wagner et al.11,
modificata)
Figura 2 - Rappresentazione schematica del gene RHD che, analogamente al gene RHCE, è formato da 10 esoni
variabilità dei saggi analitici, ci si deve aspettare nei
campioni RhD normali un valore di indice di similarità Rhesus
intorno a 0,845. L'indice di similarità Rhesus è sovrapponibile
a quello dei campioni RhD normali nei fenotipi Dweak a basso
rischio di immunizzazione come nei tipi 1, 2, 3 che sono i più
comuni: non risultano, infatti, segnalazioni che soggetti
appartenenti a questi tipi abbiano sviluppato anticorpi antiD in seguito a trasfusione di sangue RhD-positivo.
Viceversa, i Dweak di tipo 4.2.1, 4.2.2, per i quali è stata
descritta o ipotizzata la possibilità di immunizzazione con la
trasfusione di sangue RhD-positivo11, hanno indici di
similarità Rhesus al di sotto di 0,4.
Durante la tipizzazione sierologica routinaria dei gruppi
sanguigni capita di individuare campioni che possiedono
una debole reattività RhD, che può essere attribuita alla
ridotta espressione quantitativa dell'antigene RhD oppure
alla mancanza di qualche epitopo. Se si tratta di donatori di
sangue, è imperativo considerarli RhD positivi ed impiegarli
di conseguenza anche quando presentano solo una debole
reazione con sieri anti-D nel test con antiglobulina, perché
possono indurre immunizzazione nei riceventi Rh negativi13.
Viceversa, se si tratta di soggetti da trasfondere o di
donne in età fertile, non è facile stimare la probabilità di una
loro immunizzazione, e, infatti, sono stati descritti casi di
immunizzazione con la produzione di anticorpi anti-D in
soggetti RhDvariant ed anche in RhDweak11.
È auspicabile che si collabori ad effettuare uno studio
accurato relativo alla frequenza nella popolazione dei
soggetti RhD deboli e delle varianti qualitative dell'antigene
RhD, congiuntamente alla descrizione degli eventi osservati
385
AO Perrone et al.
Tabella I: patterns di reattività presentati dai campioni con
fattore RhD di incerta classificazione
Tabella III: patterns di reattività previsti con i campioni
classificabili con D-Screen
Anti-D
Campioni
da approfondire
Det. diretta Rh(D) su vetrino,
con sieri anti-D mono
e policlonali, lettura dopo due minuti
Reazione da ++ a -
Det. diretta Rh(D) in gel -test,
con sieri anti-D mono e policlonali
Reazione da ++ a -
Ricerca Du in gel-test
DII
DIII
DIVa
DIVb
DVa
DVI
DVII
DFR
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+
+/+
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Reazione da +++ a +
Test di Coombs diretto ed indiretto negativi
Tabella II: patterns di reattività previsti con i campioni classificabili con ID-Partial RhD Typing
Anti-D
1
2
3
4
5
6
DII
DIII
DIVa
DIVb
DV
DVI
DVII
DFR
DBT
R0Har
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+/-
di immunizzazione, magari tramite l'istituzione di un Registro.
Un aiuto da affiancare allo screening sierologico di
routine può essere fornito da alcuni sieri disponibili in
commercio che consentono di approfondire la tipizzazione
dell'antigene RhD.
Materiali e metodi
Da marzo 2001 ad oggi, su circa 16.000 determinazioni
di gruppo sanguigno, abbiamo individuato 18 campioni,
provenienti da donne in età fertile o da pazienti da
trasfondere, che presentavano pattern di reattività riassunti
nella tabella I.
La determinazione diretta Rh(D) su vetrino, con 4 diversi
sieri del commercio (2 policlonali umani, 1 triclonale, 1
monoclonale) presentava una reazione debolmente positiva
(1+/2+) o negativa dopo 2 minuti di lettura; la
determinazione diretta Rh(D) in gel-test, con 2 diverse
schedine monoclonali ed una policlonale , forniva una
reazione debolmente positiva (1+/2+) o negativa.
La ricerca del Du in gel-test risultava positiva con
reattività compresa tra 3+ e 1+.
Tutti i campioni esaminati presentavano i test di
Coombs diretto ed indiretto negativi.
Per giungere ad una più corretta classificazione,
abbiamo utilizzato prodotti per la differenziazione degli RhD parziali disponibili in commercio e precisamente il Kit
386
"ID-Partial RhD-Typing della Ditta DiaMed italiana Srl,
(Vedano al Lambro - MI), e il Kit D-Screen dei Laboratori
Diagast- EuraSante (Loos, Cedex - France).
Il Kit ID-Partial RhD Typing Set (DiaMed ) è formato da
6 sieri anti-D monoclonali. Esso consente di differenziare
le categorie II-IV-V-VI-VII-DFR, DBT, RoHar (Tabella II).
Il Kit D-SCREEN (Ditta Diagast) è formato da 9 diversi
sieri monospecifici, di classe IgG ed IgM, diretti verso
differenti epitopi dell'antigene D.
A seconda dei patterns di reattività osservabili,
possono essere distinte le varianti: II-III-IVa-IVb-Va-VI-VIIDFR.(Tabella III)
Confrontando la reattività del campione in esame con
una griglia di valori attesi, si può arrivare a classificare
antigeni RhD parziali, o considerarli RhD deboli, oppure
prevedere ulteriori accertamenti.
Risultati
Tra i 18 campioni analizzati, 17 sono risultati positivi
con reazioni da 4+ a 3+ con tutti i sieri di ID-Partial RhDTyping Set. La ricerca con D-Screen era positiva con valori
da 4+ a3+ contro sieri di classe IgG, con valori compresi tra
2+ e negativi contro sieri di classe IgM .
In base ai risultati ottenuti è stato possibile classificare17
campioni come Dweak, precisamente:14 fenotipi CcDuee, 2
fenotipi CCDuee, 1 fenotipo ccDuee. (Tabella IV). Un
Classificazione dei fenotipi RhDvariant ed RhDweak
Tabella IV: risultati ottenuti con la classificazione
sierologica e l'ausilio dei kit per la tipizzazione
dei D parziali
Tabella V: risultati ottenuti con l'ausilio della biologia
molecolare sul campione non classificabile in
sierologia
17 campioni
1 campione
reazioni da ++++ a +++ con tutti i sieri ID-Partial RhD - Typing-DiaMed
reazione + con un siero D-SCREEN
reazioni da ++++ a +++ con sieri IgG D-SCREEN- Diagast
negativo con ID-Partial
reazioni da ++ a - con sieri IgM D-SCREEN- Diagast
analizzato con tecniche di biologia molecolare per la ricerca degli
esoni del gene RhD
campioni non appartenenti alle varianti previste dalla tipizzazione
D parziale
classificati come RhD deboli e precisamente:
14 fenotipi CcDuee
2 fenotipi CCDuee
1 fenotipo ccDuee
campione, che presentava debole reattività (1 +) con un
antisiero D-Screen mentre risultava negativo nella
tipizzazione con ID-Partial RhD–Typing, è stato inviato,
tramite la Ditta DiaMed italiana, dapprima presso il CTS
della Croce Rossa di Berna (Svizzera) e successivamente al
Dipartimento di Medicina Trasfusionale dell'Università di
Ulm, in Germania, dove le indagini relative sono state
approfondite e completate con studi in biologia molecolare
(Tabella V).
La ricerca su tale campione degli esoni del gene RHD
con tecnica PCR-SSP è risultata positiva dimostrando la
presenza di tutti gli esoni.
Ricordiamo che il termine SSP sta per Sequence Specific
Primer ed è un tipo particolare di tecnica PCR, che non
prevede uno step aggiuntivo di digestione o di ibridazione
dopo l'amplificazione, bensì l'esecuzione in parallelo di
diverse amplificazioni, seguite da rivelazione in elettroforesi
su gel di agarosio.
Una ulteriore indagine eseguita mediante metodica PCR,
ha consentito di individuare nel soggetto la presenza
dell'allele RHD M2951, che presenta una sostituzione
semiconservativa, causa una densità antigenica molto
bassa ed è tipico degli RhD deboli di tipo 11.
Pertanto, tale campione veniva classificato come
"RhDweak di tipo 11" presso il Dipartimento di Medicina
Trasfusionale dell'Università di Ulm, in Germania. Si tratta
di un Dweak descritto in letteratura11 come tipo raro con circa
183 siti antigenici/cellula e indice di similarità Rhesus pari a
0,53, da trasfondere preferibilmente con sangue RhD
negativo.
Conclusioni
La tipizzazione RhD parziale con antisieri monoclonali
di una Ditta nei casi certi, di due Ditte nei casi dubbi,
permette una migliore definizione dell'antigene RhD.
confermata la presenza di tutti gli esoni del gene RhD
individuato l’allele RhD M2951
classificato come “RhDweak di tipo 11 presso il Dipartimento di
Medicina Trasfusionale dell’Università di Ulm
Quando tutti i sieri monospecifici reagiscono con una
buona intensità, si può presumere di avere in esame un
antigene RhD debole e stimare un basso rischio di
immunizzazione.
Nei casi in cui la tipizzazione segnala una variante, o
lascia perplessità sull'interpretazione del risultato, si
preferisce refertare il fattore Rh come "probabile variante;
da trasfondere preferibilmente con sangue RhD negativo",
riservandosi di procedere con ulteriori approfondimenti.
In conclusione, questo schema operativo ci permette
di:
- acquisire sempre maggiori informazioni per tipizzare il
sistema Rh,
- individuare eventuali varianti o RhD deboli di tipo raro,
- stabilirne la frequenza nella popolazione,
- applicare studi di popolazione, confrontandosi con le
tabelle statistiche già elaborate e contribuendo ad
elaborarne di nuove,
- affrontare con maggior sicurezza la scelta della strategia
trasfusionale o di immunoprofilassi più appropriata,
caso per caso.
Riassunto
Dal punto di vista sierologico spesso è difficile
discriminare tra RhDweak ed RhDvariant,. Nel presente lavoro,
abbiamo utilizzato due diverse serie di sieri per la
tipizzazione dei fenotipi RhD parziali.
Da marzo 2001 ad oggi abbiamo analizzato 18
campioni, provenienti da donne in età fertile o da pazienti
da trasfondere, che presentavano incerta classificazione
del fattore RhD.
In base ai risultati ottenuti è stato possibile classificare
17 weak D e precisamente: 14 fenotipi CcDuee, 2 fenotipi
CCDuee, 1 fenotipo ccDuee.
Un campione non tipizzabile e di classificazione
387
AO Perrone et al.
dubbia con le diverse tecniche sierologiche è stato
analizzato con tecniche di biologia molecolare ed è stato
classificato come Dweak di tipo 11, ovvero un tipo raro da
trasfondere preferibilmente con sangue RhD-negativo.
5) Singleton BK, Green CA, Avent ND et al.: The presence of an
RHD pseudogene containing a 37 base pair duplication and
a nonsense mutation in Africans with the RhD-negative blood
group phenotype. Blood, 95, 12, 2000.
Bibliografia
7) Wagner FF, Gassner C, Muller TH et al.: Molecular basis of
weak D phenotypes. Blood, 93, 385, 1999.
1) Avent ND, Ridgwell K, Tanner MJA, Anstee DJ: cDNA cloning
of a 30 kDa erythrocyte membrane protein associated with
Rh (Rhesus) blood group-antigen expression. Biochem J
271, 821, 1990.
8) Flegel WA, Wagner FF: Rhesus Immunisierungsregister (RIR)
[The Rhesus Immunization Surveillance]. Available at: http:/
/www.uni-ulm.de/~w flegel /RH/RIR/
2) MacGeoch C, Mitchell CJ, Carritt B et al . : Assignment of
the chromosomal locus of the human 30 kDa Rh (Rhesus)
blood group antigen-related protein (Rh30) to
chromosome region 1p36.13-p34. Cytogenet Cell Genet,
59, 261, 1992.
3) Colin Y, Cherif-Zahar B, Le Van Kim C et al.: Genetic basis of
the RhD-positive and RhD-negative blood group
polymorphism as determined by Southern analysis. Blood,
78, 2747, 1991.
4) Wagner FF, Flegel WA: RHD gene deletion occurred in the
Rhesus box. Blood, 95, 3662, 2000.
388
6) Domen R, Hoeltge G : Alloanti-D antibody formation following
transfusion in patients with the weak D (D u )
phenotype(abstract). Blood, 90,130b,1997.
9) Cartron JP, Rouillac C, Le Van Kim C et al.: Tentative model
for the mapping of D epitopes on the Rh D polypeptide. Trans
Clin Biol, 6, 497, 1996.
10) Reali G, Perrone O: Nuove acquisizioni sul sistema Rh mediate
dalla biologia molecolare. La Trasf del Sangue, 45, 60, 2000.
11) Wagner FF, Frohmajer A, Ladewig B et al.: Weak D alleles
express distinct phenotypes. Blood, 95, 2699, 2000.
12) Jones JW, Lloyd-Evans P, Kumpel BM: Quantitation of the D
antigen sites on weak D and D variant red cells by flow
cytometry. Vox Sang, 71, 176, 1996.
13) Flegel WA, Khull SR, Wagner FF: Primary anti-D immunization
by weak D type 2 RBCs. Transfusion, 40, 428, 2000.