Modello sperimentale per la decontaminazione

Dottorato in Scienze Veterinarie
Ciclo XXIX
Dottorando: Enrico Volpe
Tutor: Dr. Sara Ciulli
Modello sperimentale per la decontaminazione microbica di Tapes philippinarum
Obiettivo
Studiare gli effetti di un trattamento degerminante effettuato con l’ausilio di un prodotto biocida commerciale in termini di attività battericida e
virucida, utilizzando come target la popolazione batterica (Vibrio spp.) e virale (NoV, HAV, Betanodavirus) naturalmente associata ai molluschi
bivalvi.
Materiali e metodi. È stato allestito un impianto composto da 4 vasche ciascuna contenente 50 litri di acqua marina
prelevata dal Mar Adriatico e termostata a 15±0,3°C. Nel periodo aprile-dicembre 2014 l’impianto allestito è stato
utilizzato per condurre 5 prove sperimentali di decontaminazione di vongole (Tapes philippinarum) sottoponendole ad
un trattamento degerminante con un biocida commerciale ad attività ossidante. Ogni lotto di Tapes philippinarum è
stato acclimatato per 3 giorni all’interno dell’impianto prima della prova. All’arrivo le vongole sono state campionate per
effettuare uno screening di verifica per la presenza di virus (HAV, NoV, Betanodavirus) naturalmente associati alle
vongole. La ricerca dei virus è stata effettuata tramite RT-nested/PCR e confermata tramite real time PCR.
Successivamente il lotto è stato diviso in 4 vasche, 2 di esse fungevano da controllo e 2 erano sottoposte al trattamento
degerminante protratto per 24 ore. Nelle prove effettuate nel periodo aprile-dicembre è stata testata la concentrazione
1000ppm del germicida. Campionamenti di vongole ed acqua sono stati esegui 1, 3 e 24 ore nel corso del trattamento
sia nelle vasche di controllo che in quelle trattate. Nelle ultime prove, una volta individuata la concentrazione ed i tempi
ottimali per il trattamento, sono stati effettuati anche ulteriori campionamenti per valutare gli effetti del trattamento
tramite un approccio multidisciplinare biochimico-istologico-endocrinologico.
Risultati e Discussione
Il trattamento degerminante a 1000 ppm per tre ore si è rilevato quello con maggiore efficacia per quanto riguarda l’abbattimento della carica
batterica riferibile a Vibrio spp. naturalmente associata all’acqua marina.
Lo screening virologico tramite RT-nested/PCR ha permesso di evidenziare la presenza di Norovirus (NoV) in 3 dei lotti analizzati (1 NoV
genogruppo I e 2 NoV Genogruppo II) e Betanodavirus in due. La positività ai virus evidenziati è stata confermata in real time PCR che ha
evidenziato cariche virali molto basse naturalmente associate ai molluschi. In 3 casi di contaminazione su 5 non è stato possibile riscontrare la
presenza del genoma virale nei campionamenti successivi né nei soggetti sottoposti a trattamento né in quelli di controllo. In un lotto positivo per
NoV genogruppo II è stata riscontrata la presenza del genoma virale nelle vongole trattate dopo 3 ore, ma non nei soggetti di controllo, mentre
per un lotto positivo a Betanodavirus è stato possibile evidenziare la presenza del genoma virale fino a 24 ore post trattamento. In questo ultimo
caso la carica virale non è risultata influenzata dal trattamento subito dalle vongole. Le indagini biochimico-istologico-endocrinologico effettuate
dai colleghi del DIMEVET non hanno evidenziato significative differenze fra i soggetti sottoposti a trattamento ed i soggetti di controllo.
Decontaminazione di Tapes philippinarum sottoposte a contaminazione sperimentale da
Betanodavirus
Obiettivi
1. Creare un protocollo di contaminazione sperimentale da Betanodavirus di Tapes philippinarum.
2. Valutare la capacità decontaminante di un trattamento, con un prodotto biocida commerciale, delle vongole contaminate sperimentalmente.
Materiali e metodi: Per le prove sperimentali sono state utilizzate vongole precedentemente analizzate e
risultate negative per la ricerca di virus contaminanti. Le prove di bioaccumulo sono state condotte
immergendo le vongole in acqua marina contaminata con una soluzione virale di Betanodavirus a titolo
noto (titolo finale 103,5-105 TCID50/ml). Dopo 24 ore di immersione i soggetti contaminati sono stati
spostati in vasche con acqua marina pulita per ulteriori 24 ore. Dopo aver verificato l’avvenuta
contaminazione delle vongole, esse sono state utilizzate per la verifica del trattamento degerminante
dividendole in due lotti, uno dei quali è stato trattato con 500-1000 ppm di prodotto disinfettante, mentre
l’altro è stato mantenuto in acqua di mare pulita. Il trattamento con prodotto biocida ha avuto una durata
pari a 24 ore. Sono stati campionati soggetti prima del trattamento (T0) e dopo 1, 3 e 24 ore di
trattamento sia dalla vasca dei trattati che in quella di controllo. Tutti i campioni sono stati analizzati con
metodica RT-nested/PCR per la ricerca del Betanodavirus. Al fine di stabilire la carica virale presente nelle
vongole è stata usata la metodica semiquantitativa analizzando diluizioni scalari fino al punto finale.
Risultati e Discussione
Le prove di bioaccumulo hanno mostrato un livello crescente di contaminazione delle
vongole durante le 24 ore di immersione, mentre la depurazione in sola acqua marina non
ha permesso di rimuovere la contaminazione virale (Figura 1). La carica virale ottenuta è,
però, risultata molto variabile nei vari soggetti analizzati. Il trattamento degerminante a 500
ppm non ha mostrato la capacità di ridurre la contaminazione (Figura 2). Nel trattamento a
1000 ppm è stata calcolata sia la percentuale di soggetti contaminati (Figura 3) che la carica
virale media ad essi associata (Figura 4). La percentuale di soggetti contaminati è risultata
variabile ai tempi di trattamento analizzati, e quindi non è stato possibile stabilire se il
trattamento abbia avuto efficacia nel ridurre il numero delle vongole contaminate. La carica
virale, invece, è risultata lievemente inferiore e molto più omogenea nei soggetti trattati
rispetto ai controlli.
Pubblicazioni:
Volpe E., Serratore P., Prosperi S., Ciulli S. 2014. Interazione di Betanodavirus con vongola verace (Tapes philippinarum). Abstract book. XX Convegno Nazionale Società Italiana
Patologia Ittica. Certosa di Calci (PI), 18-19 settembre 2014, 37.
Volpe E., Volpatti D., Galeotti M., Ciulli S. 2014. Monitoraggio dell'espressione citochinica in corso di vaccinazione polivalente della spigola (Dicentrarchus labrax, L. 1758)
contro Photobacterium damselae subsp. piscicida e Listonella anguillarum. Ittiopatologia, 11: 25-41.
Mosca F., Ciulli S., Volpatti D., Romano N., Volpe E., Bulfon C., Massimini M., Caccia E., Galeotti M., Tiscar G. P. Defensive response of European sea bass (Dicentrarchus labrax)
against Listonella anguillarum or Photobacterium damselae subsp.piscicida experimental infection. Veterinary Immunology and Immunopathology, 162: 83-95.
Passalacqua P. L., Volpe E., Zavatta E., Bignami, G., Serratore P., Ciulli S. 2014. Dati preliminari sulla sanitizzazione di un impianto di depurazione per molluschi bivalvi. Abstract
book. III Convegno Nazionale Società Italiana di Ricerca Applicata alla Molluschicoltura. Marano Lagunare (UD), 7 novembre 2014, 21-22.
Ciulli S., Volpe E., de Aguiar Saldanha Pinheiro A. C., Moscato M., Prosperi S. 2014. Distribuzione di Lymphocystivirus in tessuti target e non target di orate (Sparus aurata)
naturalmente infette. Abstract book. V Workshop Nazionale di Virologia Veterinaria. Teramo, 26-27 giugno 2014, 30.
Volpe E., Serratore P., Prosperi S., Ciulli S. 2014. Indagine su Betanodavirus in molluschi bivalvi. Abstract book. V Workshop Nazionale di Virologia Veterinaria. Teramo, 26-27
giugno 2014, 91.
≥103,5-105 TCID50/ml
Betanodavirus,
RGNNV, ceppo
It/351/Sb
24h
Disinfezione acqua
24h
H2O pulita
Bioaccumulo
M
3h
6h
Depurazione
24h
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
48h
72h
C+ C-