coloranti - Estrazione solido liquido

ALIMENTARI
AROMI
-
ADDITIVI
-
SEMILAVORATI
Poste Italiane spa • Sped. in A.P. - D.L.353/2003 (Conv. in L. 27/02/2004 no 46) art. 1, comma 1, DCB TO - N.4/2004
Luglio/Agosto 2004
anno 3 - numero 15
CHIRIOTTI
EDITORI
10064 PINEROLO - Tel. 0121 393127 - Fax 0121 794480 - E-mail: [email protected]
ISSN 1594 - 0543
INGREDIENTI
COLORANTI
SUMMARY
Since ancient times, colours have been given
particular meaning: black rapresents the pain,
red the strength or the war, white the happiness
or the noble ideals. The colours applications are
various: as means for identification, for decorative
and ornamental use, to improve the look of any
alimentary or pharmaceutical products, for dying
clothes and dresses.The colours can be extracted
from mineral substances, from animals, from
vegetables: for long time leaves and flowers have
been the principal source for dyes. In this work
a rapid and economic method for extraction is
described: Naviglio Extractor. In particular, blue
from Isatis tinctoria and yellow from Crocus sativus
have been extracted and examined.
SOMMARIO
Fin dall’antichità ai colori era legata una
particolare simbologia: il nero rappresentava il
dolore, il rosso la forza o la guerra, il bianco la
felicità o nobili ideali. L’uso dei colori è molto
vario: esso serve come mezzo di identificazione,
per scopi decorativi, ornamentali, per migliorare
l’aspetto di alcuni prodotti sia in campo
alimentare che farmaceutico, per colorare i
diversi tessuti e capi di abbigliamento. I colori
avevano origini diverse perché potevano essere
estratti da sostanze minerali, da animali, ma
soprattutto da vegetali: foglie e fiori hanno per
lungo tempo costituito la fonte principale delle
materie coloranti. Il nostro studio è stato rivolto
alla ricerca di un metodo estrattivo rapido e poco
costoso; a tal fine è stato utilizzato il Naviglio
estrattore e sono stati esaminati i coloranti
provenienti da due specie diverse: un colore blu
ottenuto dall’Isatis tinctoria ed un colore giallo dal
Crocus sativus.
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L. FERRARA - D. MONTESANO
Dipartimento di Chimica Farmaceutica e Tossicologica - Facoltà di Farmacia
Università di Napoli Federico II - Via D. Montesano 49 - 80131 Napoli - Italia
D. NAVIGLIO
Dipartimento di Scienze degli Alimenti - Facoltà di Agraria - Università di Napoli Federico II
Via Università 100 - 80065 Portici (Na) - Italia
Estrazione
e attività biologica
di indaco e zafferano
Extraction and biological activity
of Isatis tinctoria and Crocus sativus
Parole chiave: coloranti naturali, Isatis tinctoria, Crocus sativus
Key words: natural dyes, Isatis tinctoria, Crocus sativus
INTRODUZIONE
Fino alla fine del 19° secolo il colore per
i tessuti veniva ottenuto da prodotti naturali per la maggior parte di origine vegetale, piante, radici, licheni, ma anche
da insetti e molluschi.
Dalle centinaia di anni in cui sono stati
usati coloranti naturali, solo una decina di questi hanno ancora un qualche
uso pratico, a causa della instabilità del
colore e l’elevato costo di estrazione.
Fu Perkin, un allievo di Hofmann, che
con la scoperta della Malveina nel 1856
diede origine alla “rivoluzione dei coloranti”, aprendo la via per la produzione
sintetica. Tuttavia negli ultimi decenni
due nuovi problemi hanno condizionato la crescita dell’industria chimica
e coloristica in particolare: l’esponenziale crescita del costo dell’energia ed i
vincoli tossicologici e ambientali. Come
risultato, il numero dei tipi di coloranti
prodotti ha subito un drastico ridimensionamento negli anni recenti e la strategia dei produttori è stata indirizzata
Ingredienti Alimentari - III (2004) agosto
verso l’utilizzo di tecnologie a maggior
risparmio energetico e con minore inquinamento. Si tende quindi a migliorare la resa e la purezza dei coloranti
noti piuttosto che sintetizzare nuovi
coloranti.
In campo alimentare e farmaceutico i
coloranti svolgono un’azione particolare perché, conferendo colore ad un
alimento, incrementano l’interesse per
il prodotto e ne aumentano la vendita;
una pillola o una capsula colorata rendono l’assunzione meno sgradevole.
PARTE SPERIMENTALE
In questo lavoro viene riportata una
metodica estrattiva semplice ed esauriente per due coloranti naturali, Indaco
e Zafferano e l’identificazione analitica
dei componenti principali Indigotina e
Croceina. L’Indigofera tinctoria era la
pianta anticamente usata per l’estrazione dell’indaco, ma in seguito alla
produzione industriale dell’indaco la
COLORANTI
Fig. 1 - Isatis tinctoria L. - Guado.
sua coltivazione è stata quasi del tutto
abbandonata. Attualmente l’estrazione
del blu d’indaco si effettua dall’Isatis
tinctoria o Guado (fig. 1), pianta molto
comune in Europa e in Italia coltivata
estesamente in Umbria, appartenente
alla famiglia delle Crucifere. In medicina popolare è stata impiegata nella cura delle anemie iposideremiche,
nelle gravi debilitazioni fisiche con dimagrimento e come stimolante della
crescita; per uso esterno veniva usata
su varie dermatosi nonché per la cura
e la cicatrizzazione di piaghe e ferite.
Recenti studi hanno evidenziato attività farmacologiche degli estratti di Isatis tinctoria quali attività inibitoria sulle
COX in particolare sulla COX-2 (1), attività insetticida, fungicida (2) attività nei
confronti di particolari dermatofiti (3).
L’estrazione è stata eseguita mediante il
“Naviglio Estrattore” secondo la metodica precedentemente illustrata (4). Le
varie fasi dell’estrazione sono riportate
nello schema I. Nelle fig. 2 e 3 sono
riportate le analisi HPLC ed EI-MS per
l’identificazione del principio attivo.
Crocus sativus (fig. 4) è una pianta erbacea, perenne i cui fiori sono molto
preziosi perché dagli stimmi (fig. 5) si
ricava lo zafferano. Da una superficie
terriera di 15.000 m2 coltivata a zafferano si ottiene una produzione di 13 kg
di prodotto finito,il cui costo è molto
elevato perché tutte le operazioni culturali vengono eseguite rigorosamente
a mano, dalla messa a dimora dei bulbi,
alla raccolta dei fiori alla separazione degli stimmi dal fiore, al confezionamento.
Le operazioni più delicate sono:
1) la sfioratura, cioè la separazione dal
fiore degli stimmi, filamenti rossi che una
volta essiccati costituiscono lo zafferano. È necessaria particolare attenzione
durante questa fase, perché gli stimmi
sono di colore rosso solo nella parte che
fuoriesce dal calice, mentre la restante
parte è di colore bianco e la sua presenza nel prodotto finito ne diminuisce la
purezza ed il pregio.
2) L’altra operazione è la tostatura
o essiccazione durante la quale i filamenti sono portati alla temperatura
di 50°-55°C per un periodo di tempo
determinato di volta in volta a seconda
dell’umidità presente nel prodotto iniziale. Solo l’esperienza permette di valutare il giusto punto di essiccamento
per garantire la miglior resa e la migliore conservabilità. Diverse sono le adulterazioni dello zafferano, sia con fiori
provenienti dal Carthamus tinctorius o
dall’Arnica montana che con fibre colorate in giallo mediante safranina o
nitrofenoli (5) per cui è essenziale una
standardizzazione e quantizzazione del
maggior componente, la crocetina.
Schema I - Estrazione e purificazione.
Fig. 2 - Spettrometria di massa.
Sorgente: Electron Impact - Temperatura della sorgente: 190°C
Direct: 75 eV
Indigo m/z = 262
Ingredienti Alimentari - III (2004) agosto
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COLORANTI
Fig. 4 - Crocus sativus.
in concentrazione del 15%. L’intenso
colore è dovuto alla presenza di carotenoidi, in particolare esteri della crocetina, ma sono presenti anche α- e
β-carotene. Lo zafferano noto presso
i popoli orientali per le sue proprietà
afrodisiache, veniva utilizzato sotto
forma di infuso e di decotto per curare patologie quali asma, artrite, tosse,
acne, malattie della pelle, infertilità.
Esso mostra attività antiossidante (6,
7), antibatterica ed antivirale oltre che
diuretica, ipoglicemizzante ed ipocolesterolemizzante. A dosi elevate agisce
sul SNC come narcotico, è nefrotossico provoca allergie ed in alcuni casi
è perfino letale (8). L’estrazione dello
zafferano con il Naviglio Estrattore è
riportato nello schema II. In fig. 6 e 7
sono riportate le analisi HPLC ed EI-MS
per l’identificazione della crocetina.
Fig. 3 - Analisi HPLC indaco.
Colonna IB-Sil NH2 Sistema eluente: Esano/
MeCN 99:1 - λ = 220 nm
Inject: 10 µL del campione solubilizzato in
CH2Cl2 - RT Indigo = 2,04
MATERIALI E METODI
L’interesse verso questa pianta risale
al XIX secolo durante il quale molti ricercatori tra cui Vogel, Meyer, si
interessarono all’estrazione del colore
giallo e ne stabilirono la natura glicosidica. Lo zucchero è un componente
naturale dello zafferano ed è presente
- Naviglio Estrattore, Estrattore rapido
solido-liquido.
- HPLC Sunicom-Oy (Lab-Service) con
detector UV/VIS Model 500 a lunghezza
d’onda variabile corredato con Degasser ERCTT.
- Spettrometro di massa a impatto di
elettrone (EI-MS) Api 2000 Applied
Biosystem.
- Colonna IB-sil NH2 5 µm e Ultracarb
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Ingredienti Alimentari - III (2004) agosto
C18 5 µm ODS(20) (Phenomenex, USA)
250 x 4,6 mm.
- Solventi usati: Esano, Acetonitrile,
Alcool Metilico, Acido Trifluoroacetico
(TFA), Cloroformio, Etile acetato puri
per HPLC (Sigma).
Nelle fig. 1 e 2 sono riportati i risultati
analitici relativi al campione di Isatis
tinctoria. Il residuo proveniente dal
processo estrattivo è stato solubilizzato in diclorometano e 10 µL sono
stati iniettati in HPLC utilizzando una
colonna IB-Sil NH con sistema eluen2
te: Esano/MeCN 99:1 per 20’ con un
Fig. 5 - Zafferano.
flusso di 1,5 mL/min rivelando alla λ
= 220 nm.
Il RT dell’indigo è 2,04 in accordo con i
dati della letteratura (9).
Nelle fig. 6 e 7 sono riportate le analisi eseguite sul campione di zafferano
Schema II - Estrazione zafferano.
COLORANTI
Fig. 6 - HPLC Crocus sativus.
Colonna Ultracarb C18 Phenomenex Sistema eluente a gradiente CH3OH: H2O/TFA0,1%
(Da 30:70° a 50:50 in 3’; a 70:30 in 20’; a 30:70 in 30’) Flusso 1 mL/min - λ = 440 nm
ottenuto dopo estrazione. Il cromatogramma ottenuto iniettando 10 µL di
campione solubilizzato in metanolo in
HPLC utilizzando una colonna Ultracarb
C18 (Phenomenex) con sistema eluente a
gradiente CH3OH: H2O/TFA 0,1% (da 30:
70° a 50:50 in 3’; a 70:30 in 20’; a 30:70
in 30’), flusso 1 mL/min, λ = 440 nm, ha
evidenziato 4 picchi principali che sono
stati sottoposti ad ulteriore indagine. Il
picco con un RT 14,42 è stato identificato come dimetilcrocetina. La crocina è
l’estere di-genziobiosilico dell’acido dicarbossilico crocetina. Questa è un caro-
tenoide con sette doppi legami e quattro
gruppi metilici nella catena laterale (fig.
8) ed è responsabile del caratteristico colore arancione dello zafferano.
evidenziato spesso gli effetti nocivi
per la nostra salute. Se pur lentamente si sta promuovendo un ritorno all’impiego di sostanze naturali, anche
se dal punto di vista economico non
risulta vantaggioso. Inoltre, la scoperta di interessanti attività farmacologiche ha dato nuovo impulso alla ricerca delle sostanze coloranti, anche se
ha riproposto alcune problematiche
legate all’estrazione quantitativa dei
componenti principali ed alla loro
successiva determinazione. Il metodo di estrazione impiegato permette
di ottenere numerosi vantaggi, legati
soprattutto alla buona riproducibilità
dei risultati grazie alla possibilità di eseguire una standardizzazione della metodica estrattiva. Inoltre, confrontata
con altre metodiche, sia a freddo che a
caldo, permette una estrazione esaustiva in tempi molto più ridotti mostrando caratteristiche migliori dell’estratto
ottenuto. I principi attivi non vengono
degradati, e non si riscontrano perdite di molecole volatili in conseguenza
della tecnica estrattiva in recipiente
perfettamente chiuso. In conclusione
volendo ipotizzare un’applicazione industriale di tale metodica, essa risulterebbe particolarmente vantaggiosa
permettendo di eseguire un’analisi in
tempi brevi, con notevole abbattimento dei costi di produzione.
BIBLIOGRAFIA
Il controllo sempre più attento sugli
additivi utilizzati negli alimenti ed in
particolare sui coloranti artificiali ha
1) Danz H., Stoyanova S., Wippich P., Battstrom
A., Hamburger M. Planta Med. 67, 2001, p.
411-16.
2) Seifert K., Unger W. Insecticidal and fungicidal
compounds from Isatis tinctoria. Z. Naturforsch. 49, 2000 p. 44-48.
3) Honda G., Tosiriruk V., Tabata M. Isolation
and antidermatophytic tryptanthrin from
indigo plant: Polygonum tinctorium and
Isatis tinctoria. Planta Med. 38, 1980, p.
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4) Ferrara L., Montesano D., Naviglio D. Metodo
rapido di estrazione per i coloranti naturali.
Piante medicinali, vol. n. 3, 2002, p. 142144.
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RISULTATI
E DISCUSSIONE
COLORANTI
Fig. 7 - EIMS Crocus sativus.
Sorgente: Electron Impact Temperatura della sorgente: 190°C Direct: 75 eV – Dimetilcrocetina - m/z = 358
Fig. 8.
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Ingredienti Alimentari - III (2004) agosto
5) Alonso G.L., Salinas MR., Garijo J. Method to
determine the authenticity of aroma of saffron
(Crocus sativus L.). J. Food Prot. 1998 61, p.
1525-8.
6) Verma S.K., Bordia A. Antioxidant property of
Saffron in man. Indian J. Med. Sci. 1998, 52,
p. 205-7
7) Martinez Tome M., Jimenez A.M., Ruggieri
S., Frega N., Strabbioli R., Murcia M.A. Antioxidant properties of Mediterranean spices
compared with common food additives. J.
Food Prot., 2001, 64, p. 1412-9.
8) Feo F., Martinez J., Martinez A., Galindo P.A.,
Cruz A., Garcia R., Guerra F., Palacios R. Occupational allergy in saffron workers. Allergy
76, 1997, 52, p. 633-41.
9) Hasan A., Watermsan P., Iftikhar N. The use of
new chromatographic techniques for the isolation and purification of phenolic acids from
Indigofera heterantha. J. of Chromatography,
1989, 466, p. 399-402.