Indagine sulla infertilita` maschile nel territorio del
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Indagine sulla infertilita` maschile nel territorio del
UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI CATANIA FACOLTA' DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE "M. La Greca" SIMONA MALACRIA INDAGINE SULLA INFERTILITA’ MASCHILE NEL TERRITORIO DEL RAGUSANO DETERMINATA DALL’IMPIEGO DI FITOFARMACI IN AGRICOLTURA Tesi di laurea in Biologia dello Sviluppo Relatrice: CHIAR.MA PROF.SSA RENATA VISCUSO Correlatore: DOTT. GIOVANNI BRACCHITTA ANNO ACCADEMICO 2004-05 UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI CATANIA FACOLTA' DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE "M. La Greca" INDAGINE SULLA INFERTILITA’ MASCHILE NEL TERRITORIO DEL RAGUSANO DETERMINATA DALL’IMPIEGO DI FITOFARMACI IN AGRICOLTURA Si ringrazia il Centro Aster di Diagnosi e Cura della Sterilità presso la Clinica del Mediterraneo di Ragusa nelle persone del Dott. Giovanni Bracchitta e del Dott. Nunzio Minniti per l’ospitalità dimostrata e le informazioni ricevute Relatrice: CHIAR.MA PROF.SSA RENATA VISCUSO Correlatore: DOTT. GIOVANNI BRACCHITTA ANNO ACCADEMICO 2004-05 Indice Premessa …………...………………………………………. Pag. 1 Introduzione ……….………………………………………. Pag. 2 Apparato genitale femminile ……………………….. Pag. 2 Apparato genitale maschile ……………………….... Pag. 3 Ciclo vitale della cellula ………………………….… Pag. 8 La riproduzione sessuata …………………………… Pag. 11 - Ovogenesi ……………………………….……... Pag. 13 - Spermatogenesi …………………………….…. Pag. 16 - Anomalie della spermatogenesi e sterilità ……. Pag. 25 L’agricoltura nella provincia di Ragusa …………….. Pag. 28 - Intossicazioni acute da fitosanitari ……………. Pag. 31 - Intossicazioni croniche da fitosanitari ………… Pag. 35 Materiali e Metodi ………………………………………… Pag. 36 Esame del liquido seminale ………………………… Pag. 36 Tecniche di procreazione medicalmente assistita .….. Pag. 45 - Inseminazione intrauterina ………………….…. Pag. 46 - Fertilizzazione in vitro …………………………. Pag. 48 - ICSI ……………………………………….……. Pag. 49 Crioconservazione dei gameti maschili …………….. Pag. 62 - Indicazioni cliniche ……………………….……. Pag. 63 - Tecnica di congelamento ……………………….. Pag. 63 - Tecnica di scongelamento ……………….……... Pag. 66 Risultati e Discussione …………………………….………. Pag. 68 Fertilità nei serricoltori …………………….……….. Pag. 68 - Confronto dati sull’infertilità …………...……….. Pag. 70 - Gruppo di controllo ………………….…………. Pag. 71 Motilità post congelamento …………….…………... Pag. 72 Conclusione ………………………………………………… Pag. 77 Allegati ……………………………………………….…….. Pag. I Decreto 21 febbraio 2005 …………………….…….. Pag. I Legge 19 febbraio 2004, n. 40 ……………….……... Pag. IX Pazienti recatisi al centro nell’anno 2004/2005 …….. Pag. XX Gruppo di controllo ………………………………… Pag. XXV Liquido seminale sottoposto a congelamento ………. Pag.XXVI Premessa Il lavoro descritto nella presente tesi è scaturito dalla constatazione che una consistente percentuale di lavoratori serricoli, di sesso maschile, con alterazione dei parametri standard del liquido seminale, si sono recati al Centro Aster di Diagnosi e Cura della Sterilità presso la Clinica del Mediterraneo in Ragusa. Prese in considerazione le analisi del liquido seminale effettuati presso il Centro nell’anno 2004/2005, abbiamo appurato che esiste una riduzione della fertilità nella suddetta categoria. A questo punto siamo andati alla ricerca di dati sull’estensione, nella provincia di Ragusa, delle coltivazioni agricole ed in particolare serricole, al fine di rilevare le tipologie e i quantitativi di prodotti chimici adoperati; ciò per verificare se tali prodotti potessero avere influenza sulla fertilità degli operatori agricoli che ne fanno un uso diretto. Abbiamo, inoltre, congelato il liquido seminale di pazienti patologici e normali, per riscontrare eventuali differenze di motilità degli spermatozoi dopo la fase di scongelamento. Tali informazioni danno importanti indicazioni sulla più adatta tecnica di procreazione medicalmente assistita per questa categoria di pazienti che, oltre ad avere alterazioni del liquido seminale, necessitano del congelamento di quest’ultimo. Introduzione APPARATO GENITALE FEMMINILE L’apparato genitale femminile è un complesso di organi, che serve da una parte alla formazione dei gameti femminili, le uova, e dall’altra a permettere la copula, la fecondazione dell’uovo, lo sviluppo del prodotto della fecondazione e la sua espulsione nell’atto del parto. Figura 1- Apparato genitale della donna L’apparato genitale femminile consta di due componenti: • Un organo pari, l’ovaio detto anche gonade femminile, deputato sia alla funzione gametogenetica (produzione di cellule uovo) sia a quella endocrina (produzione di ormoni); • Vie genitali, rappresentate da un lungo condotto che dalle vicinanze dell’ovaio raggiunge la superficie esterna e in cui si possono riconoscere tre diversi tratti: le trombe o tube del Falloppio od ovidutti (organi pari), l’utero e la vagina (organi impari). Quest’ultima si apre in superficie a livello di una complessa formazione cui si dà il nome di organi genitali esterni o vulva. Ovaio, tube, utero e vagina costituiscono per contro, gli organi genitali interni. APPARATO GENITALE MASCHILE L’apparato genitale maschile consta delle seguenti strutture fondamentali: le borse scrotali; i testicoli con i relativi epididimi; le vie spermatiche, per mezzo delle quali gli spermatozoi raggiungono l’organo copulatore; le formazioni annesse alle gonadi e alle vie spermatiche, e l’organo della copulazione vale a dire il pene. Figura 2- Sezione longitudinale del bacino maschile I testicoli o didimi rappresentano le gonadi maschili in cui ha luogo la formazione degli spermatozoi, cioè delle cellule sessuali maschili. I testicoli in numero di due, di forma ovoidale, sono situati al di sotto del pene, accolti in un sacco cutaneo, la borsa scrotale, che mantiene tale organi ad una temperatura più bassa di quella presente all’interno della cavità addominale. Il testicolo è diviso in numerosi setti testicolari, i quali si approfondano nell’organo con direzione radiale. Figura 3- Costituzione del testicolo e dell'epididimo I setti suddividono il parenchima testicolare in circa 250-290 lobuli, di grandezza diversa fra loro e di forma conica o piramidale. Ogni lobulo testicolare è costituito da uno o più (fino a 4) condottini, tubuli seminiferi, chiamati anche tubuli contorti perché avvolti su loro stessi. I tubuli seminiferi sono circondati da tessuto connettivo in cui sono presenti le cellule interstiziali di Leydig che sotto l’azione dell’LH sintetizzano, partendo dal colesterolo, ormoni androgeni (testosterone), i quali hanno come compito principale quello di promuovere la spermatogenesi, vasi sanguigni, vasi linfatici (assai scarsi nell’uomo) e fibre nervose. I tubuli contorti di una loggia testicolare convergono tutti verso un solo tubulo, breve e rettilineo, che prende il nome di tubulo retto. I tubuli retti che fuoriescono dalle logge testicolari si aprono in un sistema di canalicoli tra loro anastomizzati a formare la rete testis. La parete dei tubuli seminiferi è costituita dall’epitelio germinativo e dalla lamina propria. Quest’ultima è separata dall’epitelio mediante una lamina basale. L’epitelio germinativo è costituito da cellule seminali e da cellule di sostegno e poggia sulla lamina basale. Le cellule seminali sono situate fra le cellule di sostegno e, nel soggetto postpubere, si trovano in differenti stati maturativi a partire dalle cellule più periferiche e immature, gli spermatogoni, che sono in contatto con la lamina basale, per giungere, attraverso gli spermatociti di I ordine e gli spermatociti di II ordine, agli spermatidi, che occupano una posizione più centrale nel tubulo. Questi ultimi si differenziano nei veri gameti maschili: gli spermatozoi. Le cellule di sostegno o del Sertoli sono elementi allungati e si estendono dalla lamina basale dei tubuli seminiferi fino al loro lume, occupando perciò tutto lo spessore dell’epitelio germinativo. Figura 4- Sezione trasversale di un tubulo seminifero Dalla rete testis originano 8-12 condottini efferenti che emergono dal margine posterosuperiore del testicolo per costituire la testa dell’epididimo. L’epididimo è un organo allungato, contenuto insieme al testicolo nella borsa scrotale. Presenta un’estremità superiore ingrossata (testa), una parte intermedia cilindroide (corpo), e una estremità inferiore assottigliata (coda). La coda si spinge fino al polo inferiore del testicolo, in corrispondenza del quale si incurva indietro e in alto per continuare nel condotto deferente. Vie spermatiche - Il condotto deferente origina dalla coda dell’epididimo e termina alla base della prostata. Quindi il condotto deferente prima di raggiungere l’uretra, riceve il condotto della vescichetta seminale e diventa condotto eiaculatore. Le vescichette seminali sono due piccole estroflessioni che producono un liquido che ha la funzione di diluire lo sperma. I condotti eiaculatori avvolti in una guaina fibrosa, costituiscono la porzione terminale delle vie spermatiche. La prostata è un voluminoso organo costituito da due lobi laterali. È attraversata oltre che dall’uretra, anche dai dotti eiaculatori che vi penetrano in corrispondenza della base. Le ghiandole bulbo-uretrali di Cowper sono due piccoli corpiccioli, piuttosto duri, posti simmetricamente a lato della linea mediana dell’uretra. Il loro secreto è vischioso, opalino, a reazione alcalina. Il pene è costituito da una parte cilindroide, il corpo, e da una parte conoide, il glande. La struttura principale di entrambi è di tipo vascolare, ovvero è una rete di vasi ampiamente comunicanti tra loro in cui il volume di sangue e la rigidità della guaina di rivestimento sono le condizioni fondamentali per la costituzione dell'erezione. Il corpo presenta due cilindri laterali, i corpi cavernosi, avvolti da una guaina di tessuto fibroso poco elastico, la tonaca albuginea, e un cilindro mediano ventrale, il corpo spongioso, in cui trova posto l'uretra. I corpi cavernosi sono gli elementi erettili, l'uretra è il canale per l'emissione dell'urina, pertanto connesso alla vescica, e dello sperma, pertanto connesso ai dotti eiaculatori che raccolgono lo sperma dalla prostata, dalle vescicole seminali e dai testicoli. Figura 5- Sezione longitudinale e trasversale delle strutture riproduttive nel maschio Il glande costituisce la parte terminale del pene, utile per la sua forma a favorire la penetrazione. La cute, con caratteri di elevata elasticità, riveste tutto il corpo e al terzo distale (quasi al glande) si ripiega formando il prepuzio che ricopre più o meno completamente il glande e al cui vertice è connesso ventralmente dal frenulo o filetto. CICLO VITALE DELLA CELLULA La maggior parte delle cellule presenta una vita limitata nel tempo, al termine della quale si divide in due cellule figlie che hanno le stesse caratteristiche di quella iniziale. Il periodo che intercorre tra una divisione e la successiva, costituisce il ciclo vitale della cellula, costituito da una regolare successione delle fasi G1, S, G2, M. Figura 6- Ciclo vitale di una cellula eucariotica Come fase centrale del ciclo vitale si usa stabilire quella nella quale la cellula duplica il proprio DNA nucleare: questa fase è detta fase S o di sintesi. Prima della fase S la cellula neoprodotta ha attraversato un lungo periodo in cui ha accresciuto il citoplasma e raddoppiato il proprio volume: questo periodo si chiama fase G1 (G sta per "gap" o intervallo prima della fase S). La fase G1 è contraddistinta da attivi fenomeni trascrizionali a livello del DNA e da sintesi proteiche nel citoplasma. Dopo la fase G2 la cellula è pronta per dividersi; entra nella fase M (mitosi). La mitosi o divisione indiretta o cariocinesi si attua attraverso quattro fasi: profase, metafase, anafase, telofase. Figura 7- Mitosi in una cellula animale Nel mondo animale le cellule che entrano in divisione mitotica sono quelle somatiche, generalmente diploidi (2n): ciascuna di esse produce due cellule figlie con 2n cromatidi (o cromosomi figli). Il processo è altamente conservativo. LA RIPRODUZIONE SESSUATA Nella maggior parte degli animali e anche nell'uomo la riproduzione sessuata presuppone il differenziamento di una popolazione di cellule, detta linea germinale, i cui elementi sono destinati a trasmettere ai discendenti le caratteristiche dell'individuo diventando gameti. I gameti maschili sono gli spermatozoi, quelli femminili sono le ovocellule. I gameti dei due sessi, sono morfologicamente e funzionalmente diversi, tuttavia essi hanno in comune una caratteristica fondamentale, quella di essere aploidi, cioè di contenere, un numero di cromosomi ridotto a metà (numero aploide n). Ciò fa sì che, quando al momento della fecondazione il gamete maschile e quello femminile si fondono, si ricostituisca nello zigote il numero diploide (2n) di cromosomi, tipico di tutte le cellule somatiche della specie. Il processo durante il quale le cellule germinali riducono a metà il loro corredo cromosomico è detto meiosi. La divisione meiotica consta di due successive divisioni nucleari precedute da una sola duplicazione del materiale genetico (una sola fase S). Per questo, la quantità di DNA risulta dimezzata nei gameti maturi. Le due divisioni della meiosi si chiamano prima e seconda divisione meiotica. Ognuna si può suddividere in stadi corrispondenti a quelli tipici della mitosi: profase, metafase, anafase e telofase. Figura 8- Stadi della meiosi di una cellula animale Nella gametogenesi maschile i quattro nuclei vengono contenuti in quattro cellule distinte che si differenziano in spermatozoi. Nella gametogenesi femminile invece uno solo dei nuclei diventa il nucleo dell'ovocito, gli altri vengono espulsi insieme con una piccola quantità di citoplasma in due o tre piccole cellule abortive che sono dette globuli polari e che restano addossate all'ovocito. Ciò ha il significato di non suddividere il citoplasma del1'ovocito, la cui organizzazione è di fondamentale importanza per il successivo sviluppo dello zigote. Le cellule progenitrici delle cellule germinali (linea germinale) si segregano molto precocemente da quelle dalle quali deriveranno le cellule somatiche (linea somatica). Una volta giunte nel territorio della gonade le cellule germinali, dopo un periodo di quiescenza più o meno lungo, iniziano il loro differenziamento in senso maschile o femminile. I gameti dopo che hanno iniziato il loro differenziamento sessuale, nella donna e nell’uomo, vanno incontro a processi ben diversi, che si chiamano, rispettivamente, ovogenesi e spermatogenesi. OVOGENESI Dalla 9a settimana di sviluppo embrionale poche centinaia di cellule germinali primordiali abbandonano il sacco vitellino e si accrescono rapidamente per mitosi durante la loro migrazione verso le creste genitali e, continuano a proliferare, durante la colonizzazione delle gonadi, dove iniziano a differenziarsi in ovogoni. Dalla 12a – 13a settimana, gli ovogoni proliferanti si localizzano nella corticale profonda dell'ovaio, iniziando il loro differenziamento in ovociti. Immediatamente dopo la loro differenziazione gli ovociti primari replicano il loro DNA, entrano nella profase della prima divisione meiotica, aumentano di dimensione e si arrestano allo stadio di diplotene, fase nella quale possono restare anche per 40-50 anni. Figura 9- Ovogenesi Gli ovogoni e gli ovociti sono circondati da uno strato di cellule appiattite, derivate dalle cellule somatiche del blastema ovarico. Queste cellule, proliferando attivamente e intromettendosi tra le cellule germinali, le racchiudono, alla fine, in una rudimentale struttura prefollicolare, contenente spesso più di una cellula germinale. Queste cellule prefollicolari continuano a circondare le cellule germinali che sono tutte prossime a divenire ovociti, anche quando i ponti intercellulari sono rimossi, e avviene una frammentazione dei gruppi di cellule. Con questi eventi morfologici inizia la vera follicologenesi. Il processo della follicologenesi consiste dunque in una serie di modificazioni strutturali progressive che conducono, attraverso gli stadi di follicolo primordiale, follicolo primario, follicolo secondario preantrale, follicolo secondario antrale e follicolo di Graaf, al completo sviluppo del follicolo primordiale. Ciò avviene generalmente nei feti umani alla 18a - 20a settimane di gestazione. Al quinto mese il numero delle cellule germinali raggiunge circa i 6-7 milioni. Durante i successivi mesi di sviluppo prenatale avviene un'imponente riduzione di numero, dovuta ad un meccanismo di degenerazione o di morte per apoptosi, per cui nella donna alla nascita, nella porzione corticale di entrambe le ovaie, sono presenti circa 1.500.000 follicoli primordiali. Molti di essi vanno incontro a fenomeni di atresia che rappresentano il proseguimento dei fenomeni degenerativi iniziati, come detto precedentemente, a partire dal quinto mese di sviluppo intrauterino. Si calcola che il numero complessivo dei follicoli primordiali all’inizio della pubertà sia di 30.000-40.000. SPERMATOGENESI La spermatogenesi è un processo di proliferazione e differenziazione di cellule staminali in spermatozoi. Osservando la sezione di un tubulo seminifero, si nota che le cellule della linea seminale sono raggruppate in associazioni cellulari. Le generazioni più giovani si trovano più in basso, vicino alla membrana basale, mentre quelle più differenziate sono situate più in alto, in vicinanza del lume del tubulo. La spermatogenesi nell’uomo inizia nel periodo della pubertà e si protrae fino a un'età molto avanzata. Il processo spermatogenetico nell’uomo, dallo spermatogonio allo spermatozoo maturo, richiede circa 72 giorni. La spermatogenesi si divide in tre fasi sequenziali: proliferazione degli spermatogoni, meiosi e spermiogenesi. Fase proliferativa Gli spermatogoni differenziatisi dai gonociti sono indicati con nomi diversi: gonociti di 2° tipo, prespermatogoni, spermatogoni primitivi, spermatogoni di tipo A. Gli spermatogoni primitivi rimangono inattivi per tutto il periodo fetale e anche dopo la nascita, fino all'epoca della pubertà, che nel maschio si verifica fra i 13 e i 16 anni. In tale periodo gli spermatogoni entrano nella prima fase della spermatogenesi, fase proliferativa, in cui gli spermatogoni primari, che rappresentano le cellule staminali, si dividono ripetutamente per mitosi, consentendo sia di mantenere un pool di cellule staminali, sia di avere un rifornimento continuo di spermatogoni che, a seguito di successive divisioni, sempre mitotiche, si avviano verso il primo passo del processo spermatogenetico. Gli spermatogoni secondari che derivano dalle ultime divisioni mitotiche (spermatogoni maturi) perdono la capacità di dividersi e si trasformeranno in spermatociti di 1 ° ordine. Dalle mitosi degli spermatogoni primari derivano sempre spermatogoni liberi, mentre dalle divisioni mitotiche degli spermatogoni secondari derivano spermatogoni che restano uniti tra loro da ponti citoplasmatici, per divisioni incomplete: ciò accade perché alla divisione nucleare non segue quella citoplasmatica. Tale condizione permane fino allo stadio di spermatidio ed è chiamata sincizio. Fra tutte le cellule germinali, gli spermatogoni risentono maggiormente dell'influenza di fattori nocivi, come le radiazioni ionizzanti, le malattie infettive, l'alcoolismo, un'alimentazione inadeguata, sostante tossiche presenti nell’ambiente ecc. Gli spermatogoni vengono classificati in tre tipi: tipo A scuro, tipo A chiaro e tipo B. Lo spermatogonio A di tipo scuro viene considerato cellula staminale primitiva: da esso hanno origine gruppi di cellule staminali che si rinnovano continuamente, perché la spermatogenesi possa continuare indefinitamente, senza che si esaurisca il rifornimento di spermatogoni. Lo spermatogonio A di tipo chiaro è alquanto più differenziato rispetto al tipo A scuro e dà origine al tipo B. Gli spermatogoni di tipo B presentano nucleo sferico e molto più piccolo rispetto ai precedenti tipi: esso contiene grosse zolle di cromatina in vicinanza della membrana nucleare e inoltre un evidente nucleolo situato al centro. Il citoplasma è scarsamente colorabile e contiene un numero maggiore di organuli rispetto agli spermatogoni di tipo A. Figura 10- Spermatogenesi Fase meiotica Gli spermatociti di 1 ° ordine o primari sono da principio molto simili agli spermatogoni di tipo B dai quali derivano. Situati in un primo tempo in prossimità della membrana basale dell'epitelio seminifero vengono poi spinti verso l'alto dalle divisioni degli spermatogoni. Lo spermatocito di 1 ° ordine è ancora una cellula con corredo cromosomico diploide. Man mano esso si accresce e, al termine della fase di accrescimento, subisce la prima divisione meiotica (divisione riduzionale), originando così due spermatociti di 2° ordine, aventi ciascuno un numero aploide di cromosomi e uniti da ponti citoplasmatici A sua volta, i due spermatociti di 2° ordine entrano rapidamente in divisione (seconda divisione meiotica o divisione equazionale) dando origine a quattro spermatidi. Gli spermatociti di 2° ordine o secondari appaiono meno voluminosi di quelli primari. Poiché tale stadio ha una durata molto breve (circa 8 ore), gli spermatociti secondari sono raramente osservabili nelle sezioni dei tubuli seminiferi. Gli spermatidi che si sono appena formati dalla divisione dello spermatocita secondario appaiono più piccoli di quest'ultimo e presentano una struttura abbastanza semplice, in parte simile agli spermatociti. Spermiogenesi La spermiogenesi o spermioistogenesi consiste in una lunga serie di cambiamenti morfologici che trasformano lo spermatidio in spermatozoo. I fatti più salienti del processo che porta alla differenziazione dello spermatozoo sono sostanzialmente la modificazioni del nucleo e la comparsa di organuli altamente specializzati che consentono il trasferimento dello spermatozoo e la fecondazione. Il processo di spermiogenesi viene generalmente distinto in quattro fasi: fase del Golgi, fase del cappuccio, fase dell'acrosoma e fase di maturazione. La fase del Golgi è caratterizzata dalla comparsa, nel complesso del Golgi, di granuli di natura polisaccaridica. Tali granuli sono chiamati granuli preacrosomiali e ciascuno di essi è contenuto in una vescicola. Man mano essi si fondono tra loro per coalescenza, dando origine a un unico grosso granulo, il granulo acrosomiale, che si colloca nella porzione anteriore del nucleo, addossato alla membrana nucleare. Durante la fase del cappuccio la vescicola acrosomiale si accresce notevolmente e si sviluppa un cappuccio che, sempre adagiato sulla membrana nucleare, copre i due terzi anteriori del nucleo. Nella fase dell'acrosoma il nucleo dello spermatidio si porta in vicinanza della membrana cellulare, si allunga e si appiattisce, mentre la cromatina si condensa in grossi granuli che, per coalescenza, originano una massa densa e omogenea in cui sono presenti aree chiare di forma e grandezza variabile chiamate vacuoli nucleari. Nella fase di maturazione si forma il segmento di connessione tra il flagello e il nucleo e una guaina fibrosa costituita da 9 grosse fibre disposte longitudinalmente lungo il flagello. Quindi i mitocondri si dispongono a spirale intorno alla porzione prossimale del flagello. Successivamente quasi tutto il citoplasma dello spermatidio viene eliminato sotto forma di corpo residuo e fagocitato dalle cellule del Sertoli che, per mezzo dei loro lisosomi, lo digeriranno completamente. Inoltre si dissolvono anche i ponti citoplasmatici tra gli spermatidi, mentre una piccola porzione di citoplasma contenente gocce lipidiche segue lo spermatozoo liberato nel lume dei tubuli, per abbandonarlo in un momento successivo. Completamento della maturazione dello spermatozoo I cambiamenti maturativi iniziano nelle vie genitali maschili e si completano in quelle femminili. Dopo il distacco dalle cellule nutrici del Sertoli, gli spermatozoi immessi nel lume dei tubuli seminiferi, non hanno né la proprietà di muoversi né quella di fecondare e sono contenuti nel liquido secreto dagli elementi sertoliani. Sempre immersi in questo primo contingente di liquido seminale essi vengono poi spinti nei tubuli retti. I tubuli retti sono rivestiti da cellule che, con la loro funzione secretoria, incrementano il quantitativo di liquido che circonda gli spermatozoi, con l'aggiunta di nuovi componenti molecolari e di potassio, necessari perché possa iniziare il processo di maturazione. I tubuli retti confluiscono nella rete testis. Questo sistema lacunare rappresenta una stazione di raccolta, di sosta e di smistamento degli spermatozoi verso i condotti efferenti che li trasportano poi nel canale dell'epididimo. Per l'attività secretiva delle cellule epiteliali dell'epididimo gli spermatozoi completano la loro maturazione, oltre a raggiungere un alto grado di motilità, ottiene anche la capacità di fecondare a causa della particolare composizione chimica di tale ambiente. Emissione degli spermatozoi Gli spermatozoi contenuti nel liquido seminale secreto dall'epididimo imboccano successivamente il canale deferente. Alla estremità terminale del deferente è annesso un diverticolo laterale, la vescichetta seminale. Deferente e vescichetta seminale si continuano con il dotto eiaculatore. Quest'ultimo, dopo avere attraversato il parenchima della prostata, sbocca nell'uretra prostatica. Il meccanismo mediante il quale gli spermatozoi contenuti nel liquido seminale vengono immessi nelle vie genitali femminili è detto eiaculazione. Tra una eiaculazione e l'altra il liquido seminale sosta nella vescichetta seminale. Infine il liquido seminale si arricchisce, al momento della eiaculazione, del secreto elaborato da due ghiandole annesse all'apparato genitale maschile: la prostata e le ghiandole bulbouretrali. La prima produce un liquido di aspetto lattescente, mentre le seconde secernono un liquido chiaro e filante (simile a muco) che riversano nel canale uretrale e che ha il compito di esercitare un'azione lubrificante durante la copulazione. I due condotti eiaculatori terminano aprendosi nell'uretra prostatica. Nel suo ultimo tratto l'uretra percorre il pene per tutta la sua estensione, aprendosi all'estremità del glande. Al momento dell'accoppiamento lo sperma viene depositato nella vagina della femmina. Dopo che il seme è stato depositato nella vagina, in questa sede si forma un coagulo gelatinoso, prodotto dagli enzimi prostatici e favorito dall'ambiente acido della vagina stessa. Tale coagulo, tuttavia, viene diluito nello spazio di un'ora appena, da un altro enzima prodotto dalla stessa prostata sotto forma di proenzima e da alcune ghiandole delle vie genitali femminili. Spesso, con il coagulo, si ha la perdita di un certo numero di spermatozoi nella vagina. Capacitazione dello spermatozoo Gli spermatozoi depositati in vagina vanno incontro all’ultima tappa della maturazione: la capacitazione. La capacitazione viene definita come il processo mediante il quale lo spermatozoo acquisisce la capacità fecondante. Esso durante questo periodo coincidente in vivo con l’attraversamento del muco cervicale, subisce cambiamenti biochimici e ultrastrutturali che sono un preludio alla reazione acrosomiale, la quale permette allo spermatozoo il legame con la zona pellucida dell’oocita. Reazione acrosomiale Una volta terminata la capacitazione, gli spermatozoi sono pronti per la reazione acrosomiale, che rappresenta un processo di esocitosi con fusioni localizzate tra la membrana acrosomiale esterna e la membrana plasmatica dello spermatozoo con formazione di vescicole. Il primo spermatozoo che raggiunge l’ovulo trova rapidamente i recettori leganti lo spermatozoo presenti sulla membrana e fonde la sua membrana con quella dell’ovocita. La zona fusa della membrana si apre e il nucleo dello spermatozoo penetra nel citoplasma dell’ovulo. Figura 11- La fecondazione Un altro processo innescato dalla fusione ovulo spermatozoo è la reazione corticale. Questa reazione chimica è finalizzata ad impedire la polispermia, cioè la fecondazione da parte di più di uno spermatozoo. Strutture definite granuli corticali, legati al versante interno della membrana dell’ovulo, rilasciano il loro contenuto all’esterno della membrana dell’ovocita. Queste sostanze chimiche modificano la membrana e la zona pellucida circostante in modo da impedire la penetrazione o il legame di altri spermatozoi. Quando l’ovulo è stato fecondato e diventa uno zigote, inizia la divisione mitotica, mentre si avvicina lentamente all’utero, dove si impianta per tutto il periodo della gestazione. ANOMALIE DELLLA SPERMATOGENESI E STERILITA’ I difetti della maturazione dei gameti quindi della spermatogenesi sono le cause più frequenti d’infertilità maschile. Concentrazione, vitalità, morfologia e motilità degli spermatozoi sono i parametri più specifici che ci consentono di classificare i seguenti quadri clinici: • Normospermia; • Azoospermia: completa assenza di spermatozoi nel liquido seminale; • Oligozoospermia: riduzione del numero di spermatozoi (<20mil/ml); • Teratozoospermia: alterazione di forma degli spermatozoi (>30%); • Astenozoospermia: alterazione della motilità degli spermatozoi (<50% a+b); • Oligoastenoteratozoospermia: associazione dei quadri sopra descritti. L’uomo è forse l’unico tra i mammiferi che presenti un elevato grado di eterogeneità tra i suoi gameti, quindi lievi anomalie si presentano anche in un uomo fertile. Secondo una prima definizione la sterilità, almeno nella donna, andrebbe distinta dall’infertilità, intesa come incapacità di condurre la gravidanza fino all’epoca di vitalità fetale. Nell’uomo, invece, essendo il concetto di aborto ovviamente estraneo alla patologia della riproduzione, i due termini sono largamente utilizzati come sinonimi. Secondo un’altra definizione, una coppia è considerata infertile quando non è stata in grado di concepire e di procreare un bambino dopo un anno o più di rapporti sessuali non protetti, mentre è sterile la coppia nella quale uno o entrambi i coniugi sono affetti da una condizione fisica permanente che non rende possibile la procreazione. Secondo questa interpretazione il termine “sterilità” si riferisce, quindi, ad una condizione più grave e comunque assoluta di “infertilità” riguardante la coppia e non il singolo membro di essa. Ai fini della presente trattazione i due termini, infertilità e sterilità, saranno usati come sinonimi. Tutte le coppie che non ottengono gravidanza nei termini sopra definiti costituiscono la popolazione delle coppie infertili. I dati relativi all’incidenza ed alle principali cause di sterilità sono simili a livello mondiale. Non esiste alcuno standard di riferimento nella misurazione dell’infertilità. In Italia si calcola oggi che ogni anno 60000-80000 nuove coppie si trovino a dover affrontare problematiche di infertilità, il che rappresenta il 20-25% delle 300000 nuove unioni. Nella nostra società motivazioni molteplici di ordine sociale, economico e culturale portano molte donne a rinviare oltre la terza decade di vita la ricerca di un concepimento. Dagli ultimi dati relativi alla natalità in Europa, infatti, emerge che l’età media in cui la donna italiana partorisce il primo figlio è 30 anni, dato aumentato rispetto al precedente rilievo del 1990 dove risultava essere di 29 anni. E’ interessante rilevare come da uno studio eseguito presso il Laboratorio del Centro di Andrologia di Pisa, confrontando i valori medi riscontrati negli esami odierni con quelli eseguiti venti anni orsono, sia stato rilevato un marcato decremento sia a carico della concentrazione sia della motilità e della morfologia spermatica. Non è, però, solamente il trascorrere degli anni che comporta la riduzione della capacità riproduttiva, che stiamo osservando, ma è anche l’influenza combinata di molti fattori esterni, presenti nel mondo che ci circonda. L’aumento dell’infertilità maschile è imputabile, infatti, a tutto un insieme di cause, prima tra tutte quella ambientale, intendendo per ambientali sia quei fattori legati all’inquinamento dell’ambiente in cui viviamo oggigiorno, sia alle mutate abitudini di vita, alle quali la società odierna ci costringe. In particolare si è studiata e si continua a studiare l’esposizione a sostanze tossiche sia prima della nascita, nel ventre materno, sia dopo la nascita. Sotto accusa sono sostanze molto diverse come fitofarmaci agricoli, policlorobifenili, certi detergenti e altre ancora. Infine, è innegabile che stiamo assistendo ad una recrudescenza di molte forme di patologia dell’apparato riproduttivo maschile, in primo luogo di quelle flogistiche-infettive legate alle mutate abitudini sessuali di oggi. In Italia ogni anno 500000 coppie chiedono un consulto per infertilità e il fenomeno sembra inoltre in aumento. L’AGRICOLTURA NELLA PROVINCIA DI RAGUSA Il comparto ortoflorovivaistico rappresenta la voce più importante per lo sviluppo economico e sociale della provincia di Ragusa, una provincia di soli 12 comuni accomunati da una spiccata vocazione per le produzioni legate al settore agricolo che sempre più spesso si evolvono in veri e propri distretti di eccellenza, tanto è vero che la provincia di Ragusa rappresenta l’area territoriale d’Italia con la più alta concentrazione di serre. Per fare qualche considerazione sulla dimensione, in termini economici e occupazionali, del comparto agricolo della provincia di Ragusa possiamo notare che in termini percentuali mentre la popolazione della provincia di Ragusa costituisce solo il 6% dell’intera popolazione siciliana (303.000 Ab.), di contro la sua produzione agricola lorda vendibile rappresenta più del 20% di quella regionale, con 10186 aziende agricole che occupano 18.000 lavoratori agricoli e 12000 lavoratori serricoli. La coltivazione in serra è stata introdotta in Sicilia intorno agli anni ’50. Già da allora le colture protette si sono localizzate soprattutto lungo il litorale mediterraneo ed in particolare in provincia di Ragusa dove negli ultimi anni hanno raggiunto un alto grado di innovazione tecnologica. In provincia di Ragusa sono presenti il 56% degli impianti terricoli siciliani, mentre il 20% si trovano nel siracusano, il 12% in provincia di Caltanissetta e l’8% in provincia di Trapani. PROVINCIA DI RAGUSA Estensione territoriale Kmq 1.614 Popolazione generale Ab. 303.000 Superficie coltivata a serre Ha 8.000 Popolazione lavorativa agricola stimata N° 18.000 Popolazione lavorativa in sericoltura N° 12.000 Aziende agricole N° 10.186 Consumo medio di antiparassitari t. 6000/anno Per tali coltivazioni nel ragusano c’è un elevato consumo di antiparassitari pari a 6000 t/anno. PRODOTTI FITOSANITARI DI MAGGIORE USO AGRICOLO NEL RAGUSANO Nome Principio attivo commerciale Utilizzo Classificazione Rubrum Acidi naftilenici Fitoregolatore Nocivo Giberellina Acido giberellinico Fitoregolatore Nocivo Galben Benalaxil Fungicida Non classificato Furacon Benfuracarb Insetticida Non classificato Applaud Buprofezin Regolatore di crescita Irritante Aldicarb Carbaryl Insetticida Tossico Bavistin Carbendazim Fungicida Tossico/nocivo Benzim Carbendazim Antibotritici Tossico Mocap Chloprophos Nematocida/insetticida Tossico/nocivo Dursban Chlorpyrifos Insetticida Tossico Geodinfos Chlorpyrifos Insetticida Tossico Lorsban Chlorpyrifos Insetticida Tossico Dormex Cianammide Fitoregolatore Nocivo Curzate Cymoxanil Anticrittogamico Nocivo Vitene Cymoxanil Fungicida Tossico Vitex Cymoxanil Fungicida Tossico Euparen Dichlofluamid Fungicida Irritante Telone Dichloropropene Fumigante Tossico Sclerosan Diclogan Fungicida Irritante Dinocol PB Dinocap Antioidico Irritante Fenocap 25 Dinocap Antioidico Irritante Rumitane PB Dinocap Antioidico Irritante Seccatutto Paraquat dicloruro Diserbante Nocivo Thiodan Endosulfan Insetticida Tossico Nemacur Fenamiphos Nematocida Nocivo Glifosan Glyphosate Erbicida Non classificato Fungicida Nocivo Agrocillina Idrossichinolina solfato Confidor Imidacloprid Insetticida Nocivo Match Lufenuron Insetticida Irritante Ridomil Metalaxil-rameici Fungicida Nocivo Fumigante Nocivo Fumigante Nocivo Fumarate Vapam Metam-sodium anidro Metam-sodium anidro Carakol Methaldehyde Molluschicida Non classificato Tamifun Methamidophos Insetticida/caricida Tossico Mesurol Methiocarb Acaricida/insetticida Tossico Metham Methomyl Insetticida Molto tossico Agrolene Methomyl Insetticida Molto tossico Lannate Methomyl Insetticida Molto tossico Systane Miclobutanil Antioidico Irritante Vydate Oxamil Insetticida/nematocida Tossico Topas Penconazolo Fungicida Nocivo Cereweed Pendimethalin Erbicida Nocivo Fungicida Irritante Fitocarb Propamocarb hidroclorito Acarion Propargite Acaricida Tossico Bayfidan Triadimenol Fungicida Nocivo Tiovit Zolfo Fungicida Poco tossico I principi attivi in grassetto sono quelli più frequentemente associati alle intossicazioni acute e croniche da prodotti fitosanitari di uso agricolo INTOSSICAZIONI ACUTE DA FITOSANITARI Dal momento che, nell’area del ragusano oltre l’elevato consumo di antiparassitari, c’è una considerevole manovalanza a basso livello culturale rappresentata dai lavoratori extracomunitari che ormai rappresenta il 30% della manodopera attiva e la tipologia prevalente delle aziende è di piccola dimensione e a conduzione familiare, l’area è stata scelta come territorio ideale per portare avanti un progetto pilota per la rilevazioni delle intossicazioni acute da antiparassitari al fine di programmare delle iniziative di prevenzione e di tutela mirate. Il principale problema emerso in tale iniziativa è stato ed è tuttora il flusso informativo sui singoli eventi. Di fatto, esiste una procedura di segnalazione dei casi, in ottemperanza alla legge 638/1975, all’ufficiale sanitario e da questi al medico provinciale e successivamente al ministero della salute. In realtà tale obbligo, in passato, è stato largamente disatteso. Nell’ambito dei piani triennali di controllo delle vendite, del consumo e dell’uso di fitofarmaci, nel corso del 2004, la Regione Siciliana ha avviato un piano di rilevazione dei casi di intossicazione acuta da antiparassitari statuito dalla Circolare Assessoriale n° 1142 del 23/06/04 e che vede la collaborazione dei P.S., delle Direzioni Sanitarie Ospedaliere, dei SIAN e dei CAV e che assegna agli SPreSAL (Servizio Prevenzione e Sicurezza Ambienti di Lavoro) un ruolo centrale nella monitorizzazione dei casi. Questo meccanismo risulta essere in fase di rodaggio, per cui a tutt’oggi, il dato nazionale complessivo del fenomeno risulta approssimativo ed è basato sui calcoli delle segnalazioni e delle ricerche di consulenza che pervengono ai centri antiveleni e sulle sporadiche segnalazioni spontanee ai servizi dei dipartimenti di prevenzione delle ASL. Direttamente legata alla difficoltà delle segnalazioni spontanee è sicuramente la nazionalità dei lavoratori. NAZIONALITA’ DEI LAVORATORI 2001 2002 2003 2004 Italiani 88% 76% 88% 90% Extracomunitari 12% 24% 12% 10% Nella larga maggioranza dei casi si tratta di lavoratori dipendenti. I casi che interessano lavoratori extracomunitari sono sottostimati: si ritiene, infatti, che il numero dei soggetti extracomunitari coinvolti in eventi acuti sia molto maggiore, in quanto i lavoratori clandestini o comunque non in regola con il permesso di soggiorno non si reca al Pronto Soccorso e comunque non denuncia la vera causa del malore. Al fine di riuscire ad intercettare anche questi casi è stata avviata alla fine del 2004 una collaborazione con Medici Senza Frontiera che, grazie alla presenza sul territorio con due ambulatori a Vittoria e S. Croce Camerina, sono in grado di rilevare gli eventi che normalmente sfuggono all’osservazione del Sistema Sanitario Nazionale. Un altro parametro importante per la valutazione dei rischi è la fascia di età dei lavoratori. FASCE DI ETA’ 2001 2002 2003 2004 Minori 1 2 0 3 18 – 30 anni 21 17 15 5 31 – 40 anni 21 16 24 16 41 – 50 anni 5 10 12 5 51 – 60 anni 11 3 3 7 > 60 anni 4 1 3 5 Si conferma la fascia di età (18 – 40 anni) come quella a maggior rischio di infortuni, quella maggiormente rappresentata nella forza lavoro del settore; da segnalare i sei casi relativi a minori dovuti ad iniziative personali non sufficientemente vigilati da adulti. Il fenomeno colpisce quasi esclusivamente la popolazione maschile. 25 20 15 2001 2002 2003 2004 10 5 0 Minori 18-30 31-40 41-50 51-60 > 60 Figura 12- Intossicazioni da fitosanitari 01/04 - Fasce di età Nel seguente grafico guardiamo alle sostanze che hanno maggiormente causato intossicazioni. 35 30 25 2001 2002 2003 2004 20 15 10 Cianammide Dichloropropene Methomyl Imidacloprid Cymoxanil Fenamiphos Endosulfan 0 Chlorpyrifos 5 Figura 13- Intossicazione da fitosanitari 01/04 - Principi Attivi Il methomyl si conferma, come il presidio sanitario più frequentemente coinvolto nelle intossicazioni da fitosanitari; sicuramente è uno dei fitosanitari più utilizzato nei trattamenti, sia da solo che in associazione con altri prodotti. INTOSSICAZIONI CRONICHE DA FITOSANITARI Per intossicazioni croniche intendiamo tutte quelle intossicazioni che hanno effetti a lungo termine. Gli apparati maggiormente colpiti sono il sistema polmonare, il sistema nervoso centrale e periferico e anche il sistema oggetto del nostro studio vale a dire l’apparato genitale maschile. Gli studi precedentemente riportati sull’età dei lavoratori più colpiti, sul sesso di questi e sui principi attivi più frequentemente associati alle intossicazioni da prodotti fitosanitari di uso agricolo possono essere riproposti a riguardo delle intossicazioni croniche. In più dall’indagine statistica effettuata all’interno del Centro si evince con chiarezza che la categoria di pazienti con patologiche alterazioni dei parametri del liquido seminale sono proprio i lavoratori serricoli. Materiali E Metodi ESAME DEL LIQUIDO SEMINALE L’esame del liquido seminale, o spermiogramma, è il caposaldo dell’attività del laboratorio di andrologia, poiché rappresenta il punto di partenza dello studio della capacità fecondante di un uomo. RACCOLTA E CONSEGNA DEL CAMPIONE Il campione deve essere raccolto dopo un periodo di astinenza sessuale di non meno di 48 ore e non più di 7 giorni. Sul modulo di accompagnamento di ogni analisi dovranno essere registrati il nome del paziente, il periodo di astinenza, il giorno e l’ora della raccolta, e l’intervallo intercorso tra la raccolta e l’analisi. Preferibilmente, il campione andrà raccolto in un’apposita stanza nei pressi del laboratorio. Altrimenti, dovrà essere consegnato al laboratorio entro 1 ora dalla raccolta. Il campione dovrà essere ottenuto per masturbazione e raccolto in un contenitore etichettato con il nome del paziente, con la data e l’ora della raccolta. ESAME MACROSCOPICO INIZIALE Liquefazione Un campione normale subisce il processo di liquefazione in un tempo variabile dai 10 ai 60 minuti a temperatura ambiente. In alcuni casi, la liquefazione completa non avviene entro 60 minuti e questo fatto dovrà essere registrato. Campioni normali di liquido seminale possono contenere corpi gelatinosi che non si liquefanno, ma non sembrano avere nessun rilevanza clinica. Aspetto L’aspetto del campione viene valutato immediatamente dopo la liquefazione o dopo un’ora dall’eiaculazione, secondo la sua opacità/trasparenza. Il colore fisiologico del seme è avorio opalescente. Un colore giallastro può essere espressione di una rilevante presenza di globuli bianchi. Un colore rosato o rosso intenso è invece, indicativo della presenza di sangue. Volume Il volume dell’eiaculato viene considerato normale se è superiore ai 2ml e inferiore a 5 ml Viscosità La viscosità del campione liquefatto potrà essere valutata aspirando delicatamente il liquido seminale in una pipetta da 5 ml dall’imboccatura ampia, e lasciatolo gocciolare per gravità, osservando la lunghezza del filamento ottenuto: un campione normale lascia la pipetta come piccole gocce distinte. In caso di anormale viscosità la goccia formerà un filamento superiore ai 2 cm pH Una goccia di liquido seminale deve essere uniformemente stesa su un’apposita cartina indicatrice. Dopo 30 secondi, il colore della zona bagnata diventa uniforme e deve essere confrontato con la scala delle colorazioni per leggere il valore di pH. Il pH seminale, anche se patologico, non è comunque, come valore limite, superiore a 8,0 o inferiore a 7.2. ESAME MICROSCOPICO INIZIALE Determinazione della concentrazione di spermatozoi Con l’ausilio di una micropipetta vengono posti 10 µl di liquido seminale sul portaoggetti della camera di Makler, preriscaldata e coperti con uno speciale vetrino coprioggetti dotato di ghiera metallica, che consente di creare un monostrato di 10 µm di spessore. Messa a fuoco la griglia, si procede alla conta degli spermatozoi. Valutazione della motilità E’ consigliabile un semplice sistema di classificazione, che permetta la valutazione delle motilità degli spermatozoi. E’ necessario osservare e registrare almeno 5 campi in modo sistematico per classificare 200 spermatozoi. La motilità di ogni spermatozoo è definita: “a” motilità progressiva rapida, “b” motilità progressiva lenta o irregolare, “c” motilità non progressiva, “d” immobili. Vitalità degli spermatozoi La vitalità degli spermatozoi è definita dalla percentuale di cellule vive, determinata dall’esclusione del colorante o dal test di swelling (rigonfiamento) ipoosmotico. Essa dovrebbe essere valutata quando la percentuale degli spermatozoi immobili supera il 50%. VALUTAZIONE DELLA MORFOLOGIA SPERMATICA Per valutare la morfologia dobbiamo effettuare una colorazione; miscelando 70microlitri di liquido seminale, 70microlitri di terreno e 10microlitri di colorante Gimsa, quindi si depone una piccola goccia del preparato colorato su di un vetrino e utilizzando un obiettivo in campo chiaro 100x ad immersione di olio si valuta la morfologia esaminando almeno 100 spermatozoi. Morfologia dello spermatozoo normale Lo spermatozoo umano, normale e maturo, osservato al microscopio ottico, appare costituito da una porzione apicale, detta “testa”, di forma ovalare appiattita, le cui dimensioni standard sono descritte nella seguente tabella. Dimensione standard della testa nemaspermatica normale (criteri del WHO, 1987, 1992, 1999) WHO 1987 WHO 1992 WHO 1999 Lunghezza da 3,0 a 5,0 µ Larghezza da 2,0 a 3,0 µ Rapporto Larghezza/Lunghezza da 0,5 a 0,7 Lunghezza da 4,0 a 5,5 µ Larghezza da 2,5 a 3,5 µ Rapporto Larghezza/Lunghezza da 1,50 a 1,75 Lunghezza da 4,0 a 5,0 µ Larghezza da 2,5 a 3,5 µ Rapporto Larghezza/Lunghezza da 1,50 a 1,75 La testa è per gran parte occupata dal nucleo contenente DNA (con assetto cromosomico aploide). Nella parte anteriore si trova il complesso acrosomiale o “acrosoma”, una struttura a forma di cappuccio. La coda spermatica è inserita in maniera simmetrica in una lieve depressione alla base della testa. Morfologia degli spermatozoi anomali Anomalie della testa Le anomalie più frequenti sono: - Testa larga (macrocefalia); - Testa piccola (microcefalia); - Testa amorfa; - Testa a punta detta a sigaro; - Testa piriforme; - Testa vacuolata; - Testa a palla; - Testa doppia o multipla; - Assenza della testa (acefalia); - Difetti dell’acrosoma. Figura 14- Disegni schematici delle anomalie della testa Anomalia del collo: Le anomalie più frequenti sono: - Collo angolato; - Tratto sottile (assenza della guaina mitocondriale); - Tratto spesso e irregolare; - Inserzione asimmetrica della coda. Figura 15- Disegni schematici delle anomalie del collo Il segmento di connessione si presenta a volte particolarmente assottigliato oppure la testa risulta ripiegata ad angolo retto sul flagello. Ne consegue movimento anomalo non direzionale dello spermatozoo. Tale anomalia non è descritta in realtà come isolata, ma si associa ad altre alterazioni strutturali dello spermatozoo ed è presente generalmente in eiaculati oligoastenoteratozoospermici. Un’anomalia generalizzata ed isolata del segmento di connessione è la separazione della testa dalla coda. Tale difetto ha una base genetica essendo presente in più componenti della stessa famiglia. Anomalie della coda: Le anomalie più frequenti sono: - Coda assente; - Coda mozza; - Coda rigonfia - Coda arrotolata; - Coda angolata; - Coda doppia o multipla. Figura 16- Disegni schematici delle anomalie della coda Residuo citoplasmatico: E’ presente negli spermatozoi immaturi, la sua grandezza è circa metà della testa di uno spermatozoo. Figura 17- Disegno schematico di spermatozoo con residuo citoplasmatico L’esame a fresco o su striscio colorato del liquido seminale permette di evidenziare, la componente cellulare non nemaspermatica, rappresentata dai seguenti elementi figurati: • Elementi della linea spermatogenetica. Possono essere presenti spermatidi; spermatociti primari e secondari e spermatogoni; gli spermatidi e gli spermatociti primari sono gli elementi più frequentemente rappresentati; • Globuli bianchi, costituiti prevalentemente da granulociti, linfociti e macrofagi; • Emazie; • Cellule di sfaldamento derivanti dalle ghiandole accessorie, dai dotti e canali dell’apparato genitourinario; • Cristalli di spermina e corpuscoli prostatici. Un’importanza particolare assume, nella diagnostica differenziale delle azoospermie, la ricerca delle cellule germinali; infatti, la presenza di tali cellule nell’eiaculato permette di escludere un’ostruzione bilaterale delle vie genitali e indirizza la diagnosi verso la presenza di un blocco maturativi a livello dell’epitelio seminifero. Altre anomalie Oltre alle anomalie della forma, nel corso della spermatogenesi si possono osservare anche delle aberrazioni cromosomiche. Il caso più frequente è quello che si verifica nel corso della prima divisione meiotica, quando i cromosomi omologhi devono separarsi, raggiungere i poli opposti della cellula e ripartirsi ognuno in ciascuna delle due cellule figlie. Se i cromosomi omologhi non riescono a separarsi (fenomeno noto con il termine di non disgiunzione), le due cellule figlie conterranno una 24 cromosomi e l'altra 22. All'atto della fecondazione si possono così avere cellule con 47 (24 + 23) o con 45 (22 + 23) cromosomi. Le aberrazioni dei cromosomi sessuali sono molto più frequenti di quelle degli autosomi. La più frequente alterazione è quella del cariotipo 47 (XXY) seguita dall'assetto XYY Queste anomalie, in particolare quella del cromosoma Y, conducono all'azoospermia. Altra aberrazione riguarda la formazione dei bivalenti nel corso della meiosi, quando il mancato appaiamento dei cromosomi sessuali e degli autosomi provoca l'arresto della spermatogenesi. Studi compiuti sull'uomo e sul topo hanno accertato che in molti casi le aberrazioni degli autosomi provocano arresto della spermatogenesi. Al pari di tutti i processi differenziativi, la spermatogenesi avviene sotto il diretto controllo dell'espressione genica. Infatti, nel genoma sono presenti alcuni geni i quali sono deputati alla regolazione della spermatogenesi. La presenza di geni mutanti omozigoti nei tratti di genoma implicati nella regolazione della spermatogenesi è causa di imperfezioni di sviluppo. TECNICHE DI PROCREAZIONE MEDICALMENTE ASSISTITA (PMA) Secondo l’Articolo 4, Legge 40/2004 il ricorso alle tecniche di procreazione medicalmente assistita è consentito solo quando sia accertata l'impossibilità di rimuovere altrimenti le cause impeditive della procreazione ed è comunque circoscritto ai casi di sterilità o di infertilità inspiegate o accertata documentate da atto medico. Le tecniche di procreazione medicalmente assistita devono essere applicate in base ai seguenti principi: 1. Gradualità, al fine di evitare il ricorso ad interventi aventi un grado di invasività tecnico e psicologico più gravoso per i destinatari, ispirandosi al principio della minore invasività; 2. Consenso informato, da realizzare ai sensi dell'articolo 6 3. Inoltre è vietato il ricorso a tecniche di procreazione medicalmente assistita di tipo eterologo. Per tecniche di procreazione medicalmente assistita si intendono tutti quei procedimenti che comportano il trattamento di ovociti umani, di spermatozoi o embrioni nell’ambito di un progetto finalizzato a realizzare una gravidanza. Questi procedimenti includono: l’inseminazione omologa, la fecondazione in vitro ed il trasferimento embrionale, il trasferimento intratubarico dei gameti, il trasferimento intratubarico degli zigoti, il trasferimento intratubarico degli embrioni, la crioconservazione dei gameti. Delle suddette tecniche noi ci occuperemo soltanto di: 1. Inseminazione intrauterina (IUI); 2. Fertilizzazione in vitro ed embriotransfer (IVF-ET/ICSI); 3. Crioconservazione dei gameti maschili. INSEMINAZIONE INTRAUTERINA (IUI) Indicazioni • Oligoastenospermia; • Fallimento eiaculatorio; • Fattore femminile; • Endometriosi. Materiale utilizzato • Vasetti da urinocoltura; • Guanti monouso sterili senza talco; • Micropipette sterili; Camera di Makler; • Provette tappo bianco a 2 posizioni da 5 ml; • Ham’s F10 con rosso fenolo, senza glutamina, per lavaggio spermatozoi; • Provette Falcon da 15 ml sterili (tappo blu); • Centrifuga; • Pasteur in vetro sottile; • Tettarelle in gomma (sterilizzate); • Siringhe da 1ml; • Catetere per inseminazione Gynetics IUI 4220. Tecnica Il campione seminale viene prodotto dal paziente all’interno del centro in un locale apposito, il contenitore viene fornito al paziente con su scritto nome, cognome e data di nascita suo e della partner e viene portato da un’infermiera in laboratorio. Il campione viene lasciato liquefare per 30-60 minuti su piastra riscaldata o stufa a 36°C. Avvenuta la fluidificazione se ne prelevano 10 µl con una micropipetta sterile e si effettua la conta degli spermatozoi mobili in camera di Makler, in base al risultato di questa prima conta l’embriologo decide il tipo di trattamento da effettuare al campione: Swim-up da pellet Swim-up da strato. Tecnica dello Swim-up da strato: Un’aliquota di terreno di coltura (0,3-0,5 ml) viene stratificato sopra il liquido seminale (circa 1 ml) in una provetta Falcon a fondo conico, sterile, da 15 ml; si pone la provetta in incubatore, o sul termoblock per 45’. Si controlla la concentrazione degli spermatozoi mobili alla sommità del terreno stratificato e si trasferisce un’aliquota di questo terreno (0,5-0,6 ml), contenente gli spermatozoi selezionati, in una provetta tappo bianco da 5 ml, poi si procede al caricamento del catetere. Tecnica dello Swim-up da pellet: Un’aliquota di medium Ham’s F10, o altro terreno di lavaggio, (1-2-3 ml) viene stratificato sopra il liquido seminale (circa 1 ml) in una provetta Falcon a fondo conico, sterile, da 15 ml. Si miscelano le due frazioni con agitazione delicata (o pipetman), si centrifuga a 1500 RPM per 10’, si elimina il surnatante con una pasteur in vetro sterile, si stratificano 300 µl di terreno di coltura e si pone in incubatore, o sul termoblock per 45’. Si controlla la concentrazione degli spermatozoi mobili alla sommità del terreno stratificato e si trasferisce un’aliquota di questo terreno (0,5-0,6 ml), contenente gli spermatozoi selezionati, in una provetta tappo bianco da 5 ml, poi si procede al caricamento del catetere. Si collega il catetere da inseminazione ad una siringa da 1ml, si aspira dalla punta del catetere un’aliquota del terreno contenente gli spermatozoi selezionati (circa 0,5 ml), quindi si porta il catetere al ginecologo che provvede all’inseminazione. Tale trattamento non comporta l’esecuzione di anestesia; è completamente indolore; si esegue nel periodo fecondo. È il meno costoso e ripetibile; se ne eseguono circa due ogni ciclo e statisticamente dà una percentuale di successo del 15/20%. La maggiore percentuale di gravidanze avviene in media al 3°/4° ciclo, ma non si continua per più di sei cicli. Condizioni necessarie sono: presenza di ovulazione, tube libere e funzionanti, spermatozoi nella normalità o modicamente ipomobili. FERTILIZZAZIONE IN VITRO (IVF) Indicazioni • Patologia tubarica; • Endometriosi; • Infertilità inspiegata; • Fattore maschile; • Fallimenti di 3-6 cicli di IUI. Oggi la FIVET è indicata in molta situazioni: che vanno dalla sterilità tubarica alla subfertilità maschile. È una metodica che dà buone possibilità di successo ma non è priva di limiti; inoltre è complessa, costosa e comporta scelte di tipo etico. ICSI Indicazioni Sperma eiaculato • Oligozoospermia; • Astenozoospermia; • Teratozoospermia; • Ripetuti fallimenti della fertilizzazione FIVET; • Disordini eiaculatori. Sperma epididimario • Assenza congenita bilaterale dei deferenti; • Ostruzione di entrambi i dotti eiaculatori; Materiale utilizzato • Fiasche sterili da 50 ml; • Fiasche da 500 ml; • Provette tappo bianco a 2 posizioni da 15 ml; • Provette tappo bianco a 2 posizioni da 5 ml; • Piastre Petri medie nunc cod. 153066 (dischi di coltura); • Piastre nunc a 4 pozzetti; • Piastre Petri grandi Falcon cod. 3004 (Pick-up); • Pipette Pasteur di vetro; • Forbici ; • Pinzette; • Tettarelle in gomma (sterilizzate); • Puntali da 100 e da 1000 µl; • Vetrini coprioggetto grandi (TESE); • Garze e telini; • Guanti in lattice senza talco; • Aghi di aspirazione ovocitaria Wallace o altra marca; • Guanti monouso sterili senza talco; • Provette Falcon da 15 ml sterili (tappo blu); • Vasetti da urinocoltura; • Piastre Petri piccole Falcon cod. 1006 (dischi ICSI); • Aghi per micromanipolazione COOK, Eppendorf o Humagen: ICSI e Holding; • Catetere per embryo transfer COOK – Wallace. Soluzioni e Terreni di coltura Utilizzati • H2O Bidistillata (Carlo Erba); • Olio Minerale Sterile (Medicult): Olio di copertura per colture cellulari per evitare un’eccessiva evaporazione del terreno di coltura e per creare un filtro protettivo sulla coltura stessa agendo anche come riserva di CO2. Deve essere equilibrato in incubatore O.N. a 37 °C e 5% CO2; • Hearle con rosso fenolo: terreno di coltura di gameti utilizzabile per primo lavaggio ovociti dopo pick-up; • IVF (Medicult) con rosso fenolo: Terreno di coltura di gameti ed embrioni, contiene bicarbonato viene equilibrato a 37°C e 5% CO2 prima dell’utilizzo; • Ham’s F10 con rosso fenolo, senza glutamina, per flushing ovocitario e per lavaggio spermatozoi; • Sperm Prep (Medicult) con rosso fenolo: Terreno di coltura di gameti, contiene bicarbonato e HEPES per migliorare la stabilità fuori dall’incubatore dove viene equilibrato a 37°C e 5% CO2 prima dell’utilizzo; • PVP, 7% - ready to use solution; • Hyaluronidase 80 U/ml in HTF w/hepes; • PVP (Medicult) con rosso fenolo (Medium PVP 10 %): Soluzione ad alta viscosità per immobilizzare gli spermatozoi da prelevare per procedura ICSI Preparazione laboratorio Prima dell’inizio di un ciclo di fecondazione assistita il laboratorio viene accuratamente disinfettato e monitorato per accertarsi del corretto funzionamento delle apparecchiature. Tecnica L’ICSI è una tecnica che comporta la microiniezione di un singolo spermatozoo in un ovocita maturo allo scopo di ottenerne la fertilizzazione. Perché ciò avvenga la donna si deve sottoporre ad una stimolazione della crescita follicolare con dei farmaci (gonadotropine). È una tecnica che permette di avere una gravidanza a quelle coppie dove il partner maschile è affetto da grave infertilità. DAY –2 Si preparano 50 ml di olio minerale sterile + 5 ml di terreno di coltura (IVF, Hearle o altro) per paziente in una o più fiasche, e si mettono in incubatore senza tappo per far sedimentare il terreno di risciacquo e far equilibrare l’olio (non mettere i tappi nell’incubatore). DAY –1 Alla sera si prepara per ogni paziente una provetta da 15 ml con terreno Ham’s F 10 per il pick-up ovocitario e delle provette vuote in funzione del numero di follicoli e si mettono sotto cappa a temperatura ambiente. Si mettono in incubatore delle provette contenenti terreno di coltura (IVF o Fert) e alcune contenenti Sperm Prep (o altro terreno con Hepes), in base al numero di pazienti da trattare, come riserve di terreno. Si preparano 5 Piastre (Nunc 153066) per paziente, si scrive il nome della paziente al centro della piastra, sul fondo esterno, con una penna vetrografica e si riempiono con 4,2 ml di olio minerale. Si dispongono le piastre in incubatore in file frontali all’apertura e senza coperchio. Si prepara, per ogni paziente, una piastra nunc a 4 pozzetti, (o più, in base al n° di follicoli da aspirare) di raccolta ovocitaria, con all’interno 500 µl di terreno di coltura (FERT), ricoperto da olio minerale, per pozzetto, e la si pone in incubatore. Si posizionano le piastre per il Pick-up (Falcon 3004), in confezione, sul termoblock già dalla sera prima. Si preparano Pasteur in vetro sterili in numero di 20 circa per paziente. Si sterilizzano: forbici, pinzette, tettarelle, puntali da 100 e da 1000 µl, vetrini coprioggetto grandi (TESE), garze e telini. DAY 0 Prima dell’inizio dei pick-up si mettono a temperatura ambiente il PVP e la Hyaluronidase. Aspirazione dei follicoli Figura 18- Prelievo ovocitario L’aspirazione dei follicoli è eseguita per mezzo di un ago (Wallace o equivalente) a singolo lume ecoguidato. All’ago è applicata una pressione negativa (-80 / -100 millibar) regolata da una pompa di aspirazione (pompa di Kraft). Gli ovociti recuperati sono raccolti nelle provette tappo bianco sterili da 15 ml, o alternativamente in fiasche sterili da 50 ml, e trasferiti in laboratorio. I tubi contenenti gli ovociti vengono svuotati in piastre Falcon (cod. 3004) grandi poste su piano riscaldato all’interno della cappa sterile a flusso laminare orizzontale e il liquido viene controllato allo stereomicroscopio per la ricerca degli ovociti. Si controlla allo stereomicroscopio il fondo della provetta prima di buttarla. A questo punto gli ovociti vengono trasferiti nella piastra nunc a 4 pozzetti contenenti ognuno 500 µl di terreno di coltura ricoperto d’olio, in numero di 2/3 per ogni pozzetto, in incubatore e ivi mantenuti per circa 1 ora. Cognome moglie – Cognome marito 1 3 2 4 Figura 19- Piastra nunc a quattro pozzetti Affinchè la procedura ICSI possa aver luogo, gli ovociti devono essere privati del cumulo ooforo e della corona radiata. Si preparano piastre nunc 35 x 10 con microgocce di 50 µl, preparando 4 microgocce di terreno di coltura (FERT) e una goccia di terreno + hyaluronidase (40 UI/ml finale), o solo hyaluronidase (80 UI/ml finale) da segnare con un cerchio sotto la piastra mediante la matita vetrografica. 50 µl di FERT + 50 µl di hyaluronidase 50 µl di FERT 1 2 6 6 2 paziente 3 1 5 3 5 4 Figura 20- Piastra I (percorso ovociti) riposo) 4 Figura 21- Piastra II (disco di Le piastre vengono rimesse in incubatore (down) per 15’, si preparano intanto delle Pasteur assottigliate e si dispongono sotto cappa in ordine di diametro decrescente. Si utilizza prima la piastra I che viene uscita dall’incubatore insieme alla nunc a 4 pozzetti, contenente gli ovociti, che vengono prelevati dal pozzetto e messi in una goccia di FERT (1) e poi passati in hyaluronidase (2), spipettati dolcemente fino all’eliminazione del cumulo (utilizzando Pasteur normale), e poi passati tutti assieme nelle gocce di lavaggio (3-4-5-6) mediante pipette assottigliate per allontanare il più possibile ogni traccia di enzima dagli ovociti. Spipettamento con pasteur assottigliate, si ottiene la rimozione delle cellule follicolari, e gli ovociti vengono lasciati nella goccia di lavaggio (6). A fine trattamento si aspira la goccia di Hyaluronidase. La procedura deve essere effettuata velocemente per non esporre gli ovociti alla soluzione di Hyaluronidase per più di 30 secondi. Dopo l’eliminazione del cumulo ooforo gli ovociti vengono trasferiti nella piastra II, uno per goccia, classificati all’invertoscopio, e rimessi in incubatore. Alternativamente la decoronizzazione può essere effettuata in piastre nunc a 4 pozzetti, contenenti nel pozzetto n°1 500 µl di hyaluronidase (80 UI/ml finale), contrassegnato con un puntino nero, e nei pozzetti n° 2-4 500 µl di terreno di coltura con hepes (HTF w/hepes). La piastra viene riscaldata sul termoblock a +37 °C, non in incubatore, e il procedimento di decoronizzazione è uguale. Hyaluronidasi 80UI/ml finale HTF con hepes Cognome moglie – Cognome marito 1 4 2 3 Figura 22- Piastra nunc (1-4: percorso degli ovociti) Preparazione del campione seminale Il campione seminale viene prodotto, subito dopo la constatazione del recupero di almeno un ovocita. Il campione verrà trattato come già visto per l’inseminazione intrauterina. Fertilizzazione FIVET: Le piastre nunc a 4 pozzetti contenenti gli ovociti vengono prelevate dopo circa 4 ore di incubazione e ad ogni pozzetto contenente gli ovociti (max 3 per pozzetto) viene aggiunta una quantità di seme trattato tale da contenere 40.000 – 50.000 spermatozoi per ovocita. Le piastre vengono quindi rimesse in incubatore. ICSI: Dopo la pulizia degli ovociti si preparano piastre Falcon 1006 (con indicato sul fondo il cognome della paziente) con 3 gocce da 10 µl di terreno di coltura (Fert), e, sopra, due gocce con un volume <10 µl di PVP, si ricopre di olio minerale. Si aggiungono 2 µl di seme trattato in una goccia di PVP, si mette la piastra in incubatore per 30’ a 37°C e 5% CO2. PVP (Medium PVP 10 %) + Spermatozoi PVP Fert Nome Paziente 1 2 3 Figura 23- Piastra Falcon per ICSI Si utilizza il PVP perchè grazie alla sua alta viscosità riduce la mobilità degli spermatozoi e ne permette una facile cattura e una agevole immobilizzazione. Si trasferiscono gli ovociti nelle microgocce di terreno con una Pasteur assottigliata rispettando la numerazione iniziale. Si procede alla microiniezione. Al momento della ICSI si pone la piastra sull’invertoscopio e si fa equilibrare la pressione della micropipetta Injecting immergendola nella goccia contenente PVP ma non spermatozoi. Si immobilizza uno spermatozoo toccando la coda con la micropipetta, e lo si aspira con la testa rivolta verso l’estremità aperta della micropipetta. Si sposta la piastra per inquadrare nel campo visivo la goccia con l’ovocita, lasciando la micropipetta Injecting abbassata; si abbassa la micropipetta Holding e si blocca l’ovocita aspirandolo leggermente, si sta attenti ad orientarlo con il globulo polare a ore 6 (zona disorganizzata dell’ovocita). Si perfora l’ovocita con la micropipetta Injecting, si aspira un po’ di citoplasma, al fine di capire se si è perforata la zona pellucida. Dopo si espelle lo spermatozoo all’interno del citoplasma, questa procedura permette anche di attivare l’ovocita per l’afflusso di ioni Ca++ dal terreno di coltura al citoplasma. Si blocca subito il flusso dalla micropipetta Injecting e la si estrae lentamente dall’ovocita. Dopo ogni microiniezione si sollevano leggermente le micropipette e si riposiziona il campo nella goccia con gli spermatozoi e si procede con una nuova iniezione. A fine procedura si pongono gli ovociti microiniettati nelle goccie di una terza piastra Nunc 35 x 10 con FERT, rispettando la numerazione iniziale e si mette la piastra in incubatore. 1 2 3 Figura 24- Piastra nunc III A fine giornata si prepara una nuova piastra di coltura, per paziente, con gocce di terreno (cleavage) per il cambio di terreno da effettuarsi a day +1 dopo il controllo dell’avvenuta fertilizzazione e si pone in incubatore. DAY 1 Il controllo dell’avvenuta fertilizzazione degli ovociti, mediante osservazione dei 2 pronuclei all’invertoscopio, viene effettuato 15-19 ore dopo l’inseminazione in caso di procedura IVF classica, in caso di procedura ICSI il controllo può essere effettuato 12-18 ore dopo l’iniezione intracitoplasmatica in quanto i pronuclei appaiono prima. Gli ovociti fertilizzati, provenienti da FIVET o ICSI, vengono classificati e trasferiti in una nuova piastra di coltura (nunc 153066) con gocce di terreno (cleavage), rispettando l’eventuale numerazione. DAY2 La seconda osservazione viene effettuata 40 - 48 ore dall’inseminazione. In questa fase si fa una valutazione embrionale e una classificazione. Gli embrioni vengono valutati per il numero totale e la regolarità dei blastomeri, presenza di frammentazione, presenza di granulazioni nel citoplasma dei blastomeri e soprattutto per il rispetto dei tempi di divisione; gli embrioni dopo osservazione possono essere riposti in incubatore, oppure trasferiti in terreno fresco. DAY 3 La terza osservazione viene effettuata 66 - 74 ore dall’inseminazione. Si controlla la divisione degli embrioni al mattino mediante osservazione allo stereomicroscopio su piano riscaldato. Figura 25- Embrione a quattro cellule Si procede al transfer embrionale. Si prepara una siringa da insulina, si riempie di terreno di caricamento (cleavage) e si tiene sul termoblock riscaldato in una provetta sterile da 15 ml. Si porta il catetere in sala operatoria dove si lascia al ginecologo la guida affinché sia inserita nel canale cervicale e si ritorna in laboratorio con il catetere e l’astuccio. Si taglia l’astuccio di 2-3 cm per far uscire la punta del catetere, lo si connette alla siringa da 1 ml e lo si sciacqua con il terreno di coltura dell’embrione da trasferire lasciando circa 20 µl di terreno nella siringa. Gli embrioni vengono trasferiti con una Pasteur nella goccia centrale della piastra di coltura. Si aspirano all’interno del catetere in sequenza, gli embrioni entro una quantità di terreno pari a 20 µl, una bolla d'ari paria 10 µl e, nella punta del catetere, una quantità di terreno pari a 5-10 µl, si ripone il catetere così preparato nella confezione sterile e si porta in sala per il transfer. Il ginecologo inserisce il catetere nella guida e, finito il posizionamento, l’embriologo o il ginecologo, aziona lo stantuffo della siringa. Si attende circa 1 minuto e, successivamente, il ginecologo estrae delicatamente il catetere dalla guida e lo consegna all’embriologo che lo riporta in laboratorio. Qui, sotto cappa, si poggia la punta del catetere su una piastra sterile con una goccia di terreno fresco e si controlla la presenza di embrioni sulla punta del catetere. In caso di esito negativo si comunica al ginecologo di estrarre la guida altrimenti si ripete l’operazione. CRIOCONSERVAZIONE DEI GAMETI MASCHILI Gli spermatozoi sono organismi mobili unicellulari: è nota dai primi anni del XX secolo la loro proprietà di sopravvivere al congelamento, riacquistando in buona parte con lo scongelamento, la loro capacità di movimento e fertilizzante. Una banca per il congelamento dei gameti maschili è costituita da un contenitore criogenico per i gameti (contenitore n° 1) e da un contenitore di stoccaggio per l’azoto liquido (contenitore n° 2), come riserva per i rabbocchi periodici. Per ogni contenitore criogenico, contenente gameti, è presente un registro contenente la suddivisione interna dello stesso, e il contenuto in paillettes, con i riferimenti ai pazienti proprietari del materiale crioconservato. Al termine del congelamento viene rilasciata, da parte del Centro, al paziente, una relazione conclusiva del trattamento dove viene riportato il numero di paillettes congelati. Tutti i contenitori criogenici vengono ispezionati con frequenza quindicinale al fine di accertarne il livello di azoto liquido all’interno ed eventalmente effettuarne il rabbocco; le operazioni di pulizia dei contenitori criogenici vengono effettuate con cadenza annuale. INDICAZIONI CLINICHE Le indicazioni cliniche per cui un paziente si rivolge ad un centro per la crioconservazione del liquido seminale sono molteplici: 1. Crioconservazione per inseminazione artificiale omologa in alcune forme di ipofertilità maschile in cui il trattamento farmacologico o chirurgico determinano un peggioramento transitorio o definitivo. 2. Crioconservazione per inseminazione artificiale eterologa (nei paesi dov'è consentito); 3. Crioconservazione per inseminazione artificiale omologa in pazienti (anche con parametri normali) che presentano difficoltà alla raccolta nei tempi stabiliti, mettendo così a rischio l’intera procedura; 4. Crioconservazione del seme per pazienti che devono sottoporsi a terapie antineoplastiche o comunque a terapie spermiotossiche; 5. Crioconservazione del seme in pazienti che si sottopongono a vasectomia. TECNICA DI CONGELAMENTO Terreno di crioconservazione Freezing Medium Test Yolk Buffer (TYB) with Glycerol (IRVINE Scientific): 12 % v/v Glycerol; 20 % egg yolk; 1.000 units/ml Penicillin G; 1.000 µg/ml Streptomycin Sulfate; Il glicerolo ha la funzione di proteggere la cellula dai danni dovuti alla formazione di cristalli di ghiaccio intracitoplasmatici. Il tuorlo d’uovo, contiene fosfolipidi, che proteggono la membrana dello spermatozoo, e lipoproteine che hanno un’azione protettiva durante lo shock termico che avviene nella prima fase del congelamento. Materiale utilizzato Paillettes per liquido seminale (0,25-0,5 ml); Pipetman; Pipette monouso sterili; Puntali sterili; Siringa da 1 ml; LN2; Tecnica Al paziente viene illustrato il consenso informato, nel quale è specificato che i campioni di sperma sono di esclusiva proprietà del paziente e che, in caso di morte, verranno distrutti. Il paziente viene istruito sulle corrette modalità per la raccolta del campione seminale, che deve essere fatta "in loco". Subito dopo la raccolta il liquido seminale viene posto a 37° e dopo la liquefazione vengono valutati i parametri fondamentali: volume dell’eiaculato, spermatozoi. numero, motilità e morfologia degli Si preparano delle paillettes per liquido seminale con su scritto, cognome, nome, codice del paziente, n° scheda di congelamento e il numero relativo di paillette, si determina la posizione in cui si dovranno conservare in banca e si mette ad equilibrare a temperatura ambiente il terreno di congelamento Si diluisce a temperatura ambiente un ugual volume di liquido seminale e terreno con crioprotettore (TYB + Glicerolo) (Rapporto 1:1) aggiungendolo goccia a goccia e miscelando bene, utilizzando il Pipetman. Si riempiono le paillettes collegandole ad una siringa per mezzo di un puntale sterile e si chiude l’estremità aperta con la plastilina; dal momento in cui si inizia la diluizione del liquido seminale con il crioprotettore, al momento in cui le paillettes verranno poste a contatto con i vapori di azoto liquido, non devono passare più di 10 minuti, per evitare l’azione tossica del crioprotettore. Le paillettes sono dei tubicini in plastica della lunghezza di circa 10 cm e del diametro di circa 2-3 mm che possono contenere circa 0.25 ml di liquido. In media, sono sufficienti 2 o 3 campioni di liquido seminale per ottenere la conservazione di circa 50-60 paillettes per paziente. Si ripongono le paillettes in un cestello forato, poste orizzontalmente in modo ordinato, e si inserisce il cestello in un contenitore di LN2 a circa 8 cm dal livello di LN2. Si mantiene il cestello in quella posizione per 10 minuti, dove, dopo una prima fase in cui la temperatura cala velocemente e il campione passa dallo stato liquido a quello solido, la temperatura cala progressivamente fino ad equilibrarsi con quella dei vapori di azoto (-150°). Successivamente si procede con l’immersione delle paillettes direttamente nell’azoto liquido e solo successivamente si trasferiscono in banca nella posizione determinata. Tutti i contenitori e le provette utilizzati portano scritti sul lato il nome, il cognome e il codice del paziente proprietario dei gameti. Il giorno dopo si procede ad uno "scongelamento di prova" per registrare il numero di spermatozoi e la motilità residua. Al paziente viene consegnata una relazione con il numero totale di paillettes congelate e con la descrizione del campione seminale prima e dopo lo scongelamento. TECNICA DI SCONGELAMENTO La procedura di scongelamento del liquido seminale crioconservato è rapida. Materiale utilizzato Pipetman Pipette monouso sterili Forbici sterilizzate Tubi Falcon da 15 ml monouso sterili La tecnica di scongelamento, è un punto altrettanto importante perché deve consentire alle cellule di recuperare le normali attività biologiche limitando quanto più possibile rapide differenze di temperatura. Infatti, al fine di evitare bruschi sbalzi termici è necessario estrarre lentamente le paillettes dall’azoto liquido e consentire il raggiungimento dell’equilibrio termico tra materiale cellulare e ambiente esterno, si mantengono a temperatura ambiente per 10 minuti e poi a 37 °C per altri 10 minuti; si tagliano le due estremità delle paillettes e si fa fuoriuscire il liquido per gravità in un tubo Falcon da 15 ml preriscaldato sul termoblock a +37°C. Il liquido seminale così scongelato viene trattato prima dell’utilizzo (vedi trattamento del liquido seminale). Uno studio portato avanti da ricercatori polacchi e belgi suggerisce di utilizzare la tecnica della "crioconservazione" per 'selezionare' gli spermatozoi migliori, quelli più vitali, per garantirsi maggiore successo in caso di fecondazione con la tecnica dell'ICSI (iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi) e, ciò che più fa meditare, è la loro ulteriore conclusione che - nella fecondazione assistita - gli spermatozoi congelati hanno lo stesso potenziale riproduttivo di quelli freschi. Gli studiosi hanno analizzato oltre duecento pazienti con liquido seminale a ridotta fertilità. Il tasso di gravidanze per il ciclo di trattamenti avviati è stata di quasi il 30% dopo l'ICSI con spermatozoi freschi e quasi del 39% con spermatozoi congelati. Nei cicli successivi il tasso è stato del 23% per quelli freschi e il 35% per quelli congelati. Gli autori dello studio, sostengono che, la crioconservazione, negli uomini con una 'cattiva' qualità del liquido seminale, non influisce negativamente sul successo della fecondazione e gravidanze dopo l'ICSI. Risultati e Discussione FERTILITA’ NEI SERRICOLTORI Nel corso dell’anno 2004/2005, si sono rivolti al Centro di Diagnosi e Cura della sterilità 133 pazienti di cui, 40 appartenenti alla classe lavorativa “serricoltori” e 93 distribuiti nelle altre classi lavorative non soggetti ad inquinamento da fitofarmaci. Professioni Impiegati 20 15,0% Professionisti 13 9,8% Serricoltori 40 30,1% Operai 39 29,3% Commercianti 14 10,5% Altro 7 5,3% Totale pazienti 133 DISTRIBUZIONE PROFESSIONI 11% 5% 15% 10% 29% 30% Impiegati Professionisti Serricoltori Operai Commercianti Altro Dei 40 pazienti serricoltori 32 esami sono risultati patologici (80%) e 8 (20%) rientravano nei canoni standard della normalità. Dei 93 pazienti appartenenti ad altre classi lavorative 60 esami sono patologici (64.5%) e 33 esami sono normali (35.5%). Normali Patologici Altro 1 1% 6 6% Commerciante 7 8% 7 8% Impiegato 7 8% 13 14% Operaio 14 15% 25 27% Professionista 4 4% 9 10% Serricoltore 8 20% 32 80% DISTRIBUZIONE TRA PATOLOGICI E NORMALI ALL'INTERNO DELLE CATEGORIE LAVORATIVE 40 35 30 25 25 32 20 15 10 5 0 Patologici Normali 13 7 14 6 1 7 7 9 4 8 tro iante egato eraio nista ltore Al pi rc Op essio rrico Im me m of Se Pr Co Dati i risultati ottenuti, la nostra ipotesi è che i lavoratori appartenenti alla classe dei serricoltori hanno disturbi della spermatogenesi maggiori rispetto alle altre classi lavorative. Nonostante i dati ottenuti abbiano dato una corretta distribuzione Gaussiana e risultano dei dati con un’alta influenza, applicato il test del χ2 P > 0.10, ξ=0.05 quindi P > ξ la nostra probabilità di errore è del 10% per cui l’indagine non ha una significatività statistica per via del limitato numero di casi. CONFRONTO DATI SULL’INFERTILITÀ Dati standard pubblicati qualche anno fa da Collins e Spira, ci dicono che le cause d’infertilità sono attribuibili per circa il 50% alla donna e per il 25% circa all’uomo. CAUSA DI STERILITA’ SPIRA COLLINS Frequenza Frequenza Fattore Femminile 57 % 54 % Difetto ovulatorio 29 % 27 % Fattore tubarico 16 % 22 % Endometriosi 7% 5% Fattore Cervicale 2% / Fattore Uterino 3% / Fattore Maschile 21 % 25 % Sterilità inspiegata 4% 17 % Fattore Masch-Femm. 18 % / Altri 4% / Dai dati in nostro possesso relativi, ad individui di sesso maschile residenti nella provincia di Ragusa, possiamo dire che l’infertilità in tale zona è invece spostata verso il maschio. Infatti, dei 133 pazienti maschi analizzati, il 69% sono patologici. Patologici 92 69% Normali 41 31% Totale Pazienti 133 DISTRIBUZIONE TRA PAZIENTI PATOLOGICI E NORMALI 31% Patologici Normali 69% GRUPPO DI CONTROLLO Abbiamo inoltre preso in considerazione un gruppo di controllo formato da coppie che hanno concepito un figlio nell’ultimo anno. Fatto l’esame del liquido seminale abbiamo costatato che questi pazienti hanno valori che rientrano nella normalità ad esclusione di 3 pazienti che hanno un’anomalia ma solo in uno dei tre parametri (numerico, cinetico e morfologico) e i loro valori sono molto vicini alla normalità. Anche in questo gruppo ci sono 3 serricoltori, ma guardando le caratteristiche di tali pazienti vediamo che sono individui molto giovani e molto probabilmente lavorano nel settore da poco tempo. MOTILITA’ POST CONGELAMENTO Viste le richieste sempre più in aumento di pazienti, con un liquido seminale di partenza già patologico, ma con necessità di congelamento di questo, abbiamo condotto delle sperimentazione per vedere la resistenza degli spermatozoi alle tecniche di congelamento. Esaminato il liquido seminale di 51 pazienti di età compresa tra i 20 e i 64 anni abbiamo rilevato che 24 pazienti sono patologici e 27 normali. Allo scongelamento si osserva una differenza di sopravvivenza tra gli spermatozoi mobili di tipo (a+b) e gli spermatozoi mobili di tipo (c) indipendentemente dalla qualità del liquido seminale. Più precisamente diciamo che gli spermatozoi (a+b) resistono meglio degli spermatozoi (c) perché evidentemente presentano caratteristiche chimico-fisiche che consentono allo spermatozoo di resistere alle drastiche condizioni cui sono sottoposti con il congelamento. CONFRONTO TRA SOPRAVVIVENZA DEI MOBILI (a+b) E DEI MOBILI ( c) 23% Media soprav (a+b) 34% Media soprav ( c) Abbiamo poi separato i liquidi seminali patologici dai normali confrontando la rispettiva sopravvivenza dei mobili (a+b) al congelamento. Guardando ai dati pubblicati in European Journal of Obstetrics Gynecology, and Reproductive Biology in seguito ad una sperimentazione eseguita nel 2000, in cui sono stati congelati, con tecniche diverse, i liquidi seminali di 63 pazienti ottenendo i seguenti risultati di motilità post congelamento: 49+/-15.7, 43+/-15.2 e 52+/16.8%, abbiamo fissato intorno al 40% il parametro di buona motilità post congelamento. I nostri risultati ci dicono che il numero di spermatozoi mobili (a+b) con motilità superiore al 40%, nei pazienti normali è del 63% nei pazienti con liquido seminale patologico la percentuale scende al 25%. Pazienti Patologici 24 47% Pazienti normali 27 53% 51 Liquidi seminali Patologici Liquidi seminali Normali 6 Patologici con motilità post congelamento>40% 25% 18 Patologici con motilità post congelamento<40% 75% 17 Normali con motilità post congelamento>40% 63% 10 Normali con motilità post congelamento<40% 37% DIFFERENZA DI SOPRAVVIVENZA TRA PAZIENTI PATOLOGICI E NORMALI 100% 80% 60% 40% 20% Normali con motilità post congelamento<40% Normali con motilità post congelamento>40% Patologici con motilità post congelamento<40% Patologici con motilità post congelamento>40% 37% 75% 63% 25% 0% Liquidi seminali Patologici Liquidi seminali Normali Ricordiamo che tra i pazienti patologici in questo database di 51 pazienti il 30% sono lavoratori serricoli. Professioni Impiegati 6 25,0% Professionisti 2 8,3% Serricoltori 7 29,2% Operai 6 25,0% Commercianti 2 8,3% Altro 1 4,2% Totale pazienti Patologici 24 DISTRIBUZIONE PROFESSIONI TRA PAZIENTI PATOLOGICI 8% 4% Impiegati 25% Professionisti Serricoltori 25% Operai 8% Commercianti 30% Altro Tra i pazienti con liquidi seminali nella norma la categoria incide solo per il 15% quindi esattamente la metà, mentre per le altre categorie di lavoratori le percentuali tra patologici e normali oscillano di pochi punti percentuali. Professioni Impiegati 7 25,9% Professionisti 3 11,1% Serricoltori 4 14,8% Operai 8 29,6% Commercianti 2 7,4% Altro 3 11,1% Totale Pazienti Normali 27 DISTRIBUZIONE PROFESSIONI TRA PAZIENTI NORMALI 7% 11% 26% 11% 30% 15% Impiegati Professionisti Serricoltori Operai Commercianti Altro Per questo motivo possiamo concludere dicendo che i serricoltori, nella provincia di Ragusa sono una delle categorie lavorative più a rischio di infertilità; molto probabilmente a causa dei prodotti tossici con cui vengono costantemente a contatto. Tutte le informazioni raccolte a completamento di tale studio, sono importanti per dare ai pazienti patologici e non (che si rivolgono al centro con una richiesta di congelamento del liquido seminale) indicazioni precise sulla tecnica di fecondazione medicalmente assistita più adatta alle condizioni generali del liquido seminale. Pertanto anche se ci troviamo dinanzi ad un paziente con liquido seminale patologico che allo scongelamento presenta una ridotta percentuale di spermatozoi mobili (a+b), possiamo ricorrere alla tecnica ICSI che richiede esclusivamente uno spermatozoo. Conclusione I dati ottenuti ci danno modo di pensare che le motivazioni per cui abbiamo cominciato questo tipo di sperimentazione cioè il sospetto di una consistente incidenza dell’infertilità nei serricoltori della provincia di Ragusa sia confermato, nonostante a causa del basso numero di pazienti non risulti statisticamente significativo. Nonostante ciò possiamo sicuramente richiamare l’attenzione sul fatto che l’inquinamento ambientale causato da fitosanitari di uso agricolo sia un fenomeno da monitorare e tenere sempre sotto controllo. A tale proposito dobbiamo dire che il lavoro svolto nella provincia dal SPreSAL (Servizio Prevenzione e Sicurezza Ambienti di Lavoro) sia lodevole in quanto rilevata una grande carenza di formazione sui rischi specifici causato dai fitosanitari ed in particolare su: • Danni a breve e lungo termine alla salute; • Corretto utilizzo degli indumenti di protezione (tute o guanti resistenti ad agenti chimici); • Corrette tecniche di utilizzo dei fitosanitari; • Presidi sanitari di emergenza a cui rivolgersi in caso di malessere da esposizione a fitosanitari; • Incapacità, per scarsa formazione o professionalità, dei rivenditori di fitosanitari ad essere un valido supporto all’attività degli agricoltori. Il SpreSAL si è impegnato in collaborazione con l’I.P.A., alla organizzazione dei corsi di aggiornamento previsti prima dal D.P.R. 290/01 ed ora dal Decreto 29 luglio 2003 della Regione Siciliana fornendo docenza su argomenti medico – igienico - prevenzionali. Così come stabilito dall’art.5 del succitato decreto, l’IPA rilascia l’attestazione di partecipazione e solo dopo il superamento di un colloquio avanti una commissione esaminatrice l’autorizzazione (Patentino Fitosanitario) all’acquisto per l’uso di fitosanitari e loro coadiuvanti classificati molto tossici, tossici o nocivi. Dal 2003 ad oggi sono stati formati n° 2270 operatori e sono stati già rilasciati n° 1733 nuovi patentini e rinnovati n° 900 patentini. C’è anche da dire che il Ministero della Salute risulta attento agli effetti dei fitosanitari a dimostrazione di questo possiamo citare l’ultimo Decreto del 21 febbraio 2005 in cui si impone la sospensione, in via cautelativa, dell’autorizzazione all’immissione in commercio e all’impiego dei prodotti fitosanitari a base delle sostanze attive carbendazim e dinocap, in considerazione della classificazione di queste sostanze attive in categoria 2 di tossicità per la riproduzione (sono inserite nella categoria 2 tutte le sostanze considerate in grado di danneggiare la fertilità negli esseri umani, oppure le sostanze che provocano effetti tossici sullo sviluppo umano) recentemente attribuita e in attesa della conclusione della sua revisione comunitaria. (GU n. 60 del 14-3-2005). Riguardando la tabella dei prodotti maggiormente utilizzati nella provincia, insieme a tanti altri sono presenti anche i su citati prodotti. Bibliografia - Ashoori F., Tomita T., J. 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MINISTERO DELLA SALUTE DECRETO 21 febbraio 2005 Sospensione, in via cautelativa, dell'autorizzazione all'immissione in commercio e all'impiego dei prodotti fitosanitari a base della sostanza attiva dinocap. IL DIRETTORE GENERALE della sanita' veterinaria e degli alimenti Visto l'art. 6 della legge 30 aprile 1962, n. 283, modificato dall'art. 4 della legge 26 febbraio 1963, n. 441, concernente la disciplina igienica degli alimenti; Vista la circolare del Ministero della sanita' 3 settembre 1990, n. 20, concernente «Aspetti applicativi delle norme vigenti in materia di registrazione dei presidi sanitari»; Visti i decreti con i quali i prodotti fitosanitari di cui all'allegato al presente decreto sono stati autorizzati per essere immessi in commercio; Visto il decreto legislativo 30 marzo 2001, n. 165, che detta norme generali sull'ordinamento del lavoro alle dipendenze delle amministrazioni pubbliche; Visto il regolamento (CEE) n. 3600/92, recante disposizioni d'attuazione della prima fase del programma di lavoro di revisione comunitaria delle sostanze attive presenti sul territorio della comunita' europea alla data del 26 luglio 1993, tra le quali e' compresa la sostanza attiva dinocap; Visto il decreto legislativo 17 marzo 1995, n. 194, di attuazione della direttiva n. 91/414/CEE, relativo alla immissione in commercio di prodotti fitosanitari; Vista la circolare del Ministero della sanita' 10 giugno 1995, n. 17, concernente gli aspetti applicativi delle nuove norme in materia di autorizzazione di prodotti fitosanitari; Visto, in particolare, il comma 1, lettera b) dell'art. 4 della citata direttiva n. 91/414/CEE, che stabilisce che un prodotto puo' essere autorizzato solo se, tra l'altro, non produce effetti nocivi in maniera diretta o indiretta sulla salute dell'uomo o degli animali o sulle acque sotterranee; Visto il decreto legislativo 14 marzo 2003, n. 65, modificato dal decreto legislativo 28 luglio 2004, n. 260, di attuazione delle direttive n. 1999/45/CE e n. 2001/60/CE relative alla classificazione, all'imballaggio e all'etichettatura dei preparati pericolosi; Visto il decreto del Ministro della salute del 14 giugno 2002 di recepimento della direttiva n. 2001/59/CE del 6 agosto 2001, recante il ventottesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva n. 67/548/CEE del 27 giugno 1967 in materia di classificazione, imballaggio ed etichettatura delle sostanze pericolose; Visto il paragrafo 4.2 dell'allegato VI del citato decreto ministeriale 14 giugno 2002 e in particolare le definizioni secondo le quali: le «sostanze che dovrebbero essere considerate in grado di danneggiare la fertilita' negli esseri umani» oppure le «sostanze che dovrebbero essere considerate in grado di provocare effetti tossici sullo sviluppo umano» sono classificate in categoria 2 di tossicita' per la riproduzione, Vista la direttiva n. 2004/73/CE del 29 aprile 2004, che dovra' essere recepita entro il 31 ottobre 2005, recante il ventinovesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva n. 67/548/CEE del 27 giugno 1967 in materia di classificazione, imballaggio ed etichettatura delle sostanze pericolose, secondo la quale alla sostanza attiva dinocap e' attribuita la categoria 2 di tossicita' per la riproduzione; Visto l'art. 11 della direttiva n. 91/414/CEE, secondo il quale uno Stato membro puo' limitare o proibire provvisoriamente l'uso e la vendita nel proprio territorio di un prodotto fitosanitario da esso autorizzato se ha motivo valido per ritenere che tale prodotto costituisca un rischio per la salute umana o degli animali o per l'ambiente; Visto l'art. 7 del regolamento (CE) n. 178/2002 che definisce il principio di precauzione secondo il quale, in situazioni di incertezza sul piano scientifico, possono essere adottate misure provvisorie di gestione del rischio necessarie per garantire l'elevato livello di tutela della salute che la Comunita' persegue; Acquisiti i pareri espressi dall'Istituto Superiore di Sanita' in merito alla riclassificazione dei prodotti fitosanitari attualmente autorizzati in Italia in attuazione delle direttive n. 1999/45/CE e n. 2001/60/CE, di cui l'ultimo in data 3 gennaio 2005, secondo i quali i prodotti fitosanitari contenenti la sostanza attiva dinocap non possono essere commercializzati; Sentita l'impresa titolare della documentazione presentata per la revisione comunitaria della sostanza attiva dinocap, che nell'audizione del 28 aprile 2004 ha rappresentato la propria posizione alla Commissione consultiva per i prodotti fitosanitari di cui all'art. 20 del citato decreto legislativo n.194/1995; Acquisito il parere del 28 aprile 2004 della sopra citata Commissione consultiva che ha comunque proposto l'eliminazione dal commercio dei prodotti fitosanitari contenenti dinocap, in considerazione della classificazione della sostanza attiva in categoria 2 di tossicita' per la riproduzione; Sentita l'associazione di categoria Agrofarma che nell'audizione del 16 settembre 2004 ha illustrato alla sopra citata Commissione consultiva la posizione delle imprese in merito alle problematiche relative alle sostanze attive di categoria 2 di cancerogenesi, mutagenesi o tossicita' per la riproduzione; Considerato quanto esposto dal Ministro della salute con la nota del 14 luglio 2004 diretta al Commissario europeo per la salute e la protezione dei consumatori al fine di definire criteri armonizzati sulla valutazione e la gestione delle problematiche legate ai prodotti fitosanitari contenenti sostanze attive che presentano preoccupazioni di tipo sanitario, anche in applicazione del principio di precauzione; Considerato quanto esposto nella nota del 12 ottobre 2004 dal Commissario europeo per la salute e la protezione dei consumatori nella quale, tra l'altro, viene indicato che gli Stati membri possono continuare ad autorizzare prodotti contenenti sostanze attive gia' presenti sul mercato europeo alla data del 26 luglio 1993 in base ai criteri generali di cui al citato art. 4 della direttiva n. 91/414/CEE, in attesa della conclusione della procedura di revisione comunitaria delle sostanze stesse; Acquisito l'ulteriore parere espresso in data 16 dicembre 2004 dall'Istituto Superiore di Sanita' che, tenuto conto delle indicazioni espresse dal Commissario europeo per la salute e la protezione dei consumatori e in applicazione del principio di precauzione, ha tra l'altro riaffermato la non ammissibilita' dei prodotti contenenti sostanze attive di categoria 1 o 2 di cancerogenesi, mutagenesi o tossicita' per la riproduzione per le quali e' ancora in corso il processo di revisione comunitaria; Considerato che non si e' ancora conclusa la revisione comunitaria della sostanza attiva dinocap ai sensi del citato regolamento (CEE) n. 3600/92; Ritenuto di dare applicazione al citato principio di precauzione attraverso l'adozione di misure provvisorie che consentano di raggiungere un elevato livello di tutela della salute; Ritenuto pertanto di dover sospendere, in via cautelativa, l'immissione in commercio e l'impiego di prodotti fitosanitari contenenti la sostanza attiva dinocap, in considerazione della classificazione tossicologica recentemente attribuita e in attesa della conclusione della sua revisione comunitaria; Decreta: 1. Le autorizzazioni all'immissione in commercio e all'impiego di tutti i prodotti fitosanitari indicati nell'allegato al presente decreto, contenenti la sostanza attiva dinocap sono sospese in considerazione della attuale classificazione in categoria 2 di tossicita' per la riproduzione di tale sostanza attiva e in attesa della conclusione della revisione comunitaria. 2. Alle imprese titolari delle autorizzazioni dei prodotti fitosanitari indicati nell'allegato al presente decreto viene concesso un periodo di novanta giorni per provvedere al ritiro delle scorte giacenti sia presso i magazzini che presso gli esercizi di vendita. 3. Le medesime imprese sono tenute ad adottare nei confronti degli utilizzatori ogni iniziativa idonea ad assicurare una corretta informazione in merito ai prodotti fitosanitari di cui trattasi. Il presente decreto sara' pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana ed entra in vigore il giorno successivo alla sua pubblicazione. Roma, 21 febbraio 2005 Il direttore generale: Marabelli DECRETO 21 febbraio 2005 Sospensione, in via cautelativa, dell'autorizzazione all'immissione in commercio e all'impiego dei prodotti fitosanitari a base della sostanza attiva carbendazim. IL DIRETTORE GENERALE della sanita' veterinaria e degli alimenti Visto l'art. 6 della legge 30 aprile 1962, n. 283, modificato dall'art. 4 della legge 26 febbraio 1963, n. 441, concernente la disciplina igienica degli alimenti; Vista la circolare del Ministero della sanita' 3 settembre 1990, n. 20, concernente «Aspetti applicativi delle norme vigenti in materia di registrazione dei presidi sanitari»; Visti i decreti con i quali i prodotti fitosanitari di cui all'allegato al presente decreto sono stati autorizzati per essere immessi in commercio; Visto il decreto legislativo 30 marzo 2001, n. 165, che detta norme generali sull'ordinamento del lavoro alle dipendenze delle amministrazioni pubbliche; Visto il regolamento (CEE) n. 3600/92, recante disposizioni d'attuazione della prima fase del programma di lavoro di revisione comunitaria delle sostanze attive presenti sul territorio della comunita' europea alla data del 26 luglio 1993, tra le quali e' compresa la sostanza attiva carbendazim; Visto il decreto legislativo 17 marzo 1995, n. 194, di attuazione della direttiva n. 91/414/CEE, relativo alla immissione in commercio di prodotti fitosanitari; Vista la circolare del Ministero della sanita' 10 giugno 1995, n. 17, concernente gli aspetti applicativi delle nuove norme in materia di autorizzazione di prodotti fitosanitari; Visto, in particolare, il comma 1, lettera b) dell'art. 4 della citata direttiva n. 91/414/CEE, che stabilisce che un prodotto puo' essere autorizzato solo se, tra l'altro, non produce effetti nocivi in maniera diretta o indiretta sulla salute dell'uomo o degli animali o sulle acque sotterranee; Visto il decreto legislativo 14 marzo 2003, n. 65, modificato dal decreto legislativo 28 luglio 2004, n. 260, di attuazione delle direttive n. 1999/45/CE e n. 2001/60/CE relative alla classificazione, all'imballaggio e all'etichettatura dei preparati pericolosi; Visto il decreto del Ministro della salute del 14 giugno 2002 di recepimento della direttiva n. 2001/59/CE del 6 agosto 2001, recante il ventottesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva n. 67/548/CEE del 27 giugno 1967 in materia di classificazione, imballaggio ed etichettatura delle sostanze pericolose; Visto il paragrafo 4.2 dell'allegato VI del citato decreto ministeriale 14 giugno 2002 e in particolare le definizioni secondo le quali: le «sostanze che dovrebbero essere considerate in grado di danneggiare la fertilita' negli esseri umani» oppure le «sostanze che dovrebbero essere considerate in grado di provocare effetti tossici sullo sviluppo umano» sono classificate in categoria 2 di tossicita' per la riproduzione, Vista la direttiva n. 2004/73/CE del 29 aprile 2004, che dovra' essere recepita entro il 31 ottobre 2005, recante il ventinovesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva n. 67/548/CEE del 27 giugno 1967 in materia di classificazione, imballaggio ed etichettatura delle sostanze pericolose, secondo la quale alla sostanza attiva carbendazim e' attribuita la categoria 2 di tossicita' per la riproduzione; Visto l'art. 11 della direttiva n. 91/414/CEE, secondo il quale uno Stato membro puo' limitare o proibire provvisoriamente l'uso e la vendita nel proprio territorio di un prodotto fitosanitario da esso autorizzato se ha motivo valido per ritenere che tale prodotto costituisca un rischio per la salute umana o degli animali o per l'ambiente; Visto l'art. 7 del regolamento (CE) n. 178/2002 che definisce il principio di precauzione secondo il quale, in situazioni di incertezza sul piano scientifico, possono essere adottate misure provvisorie di gestione del rischio necessarie per garantire l'elevato livello di tutela della salute che la Comunita' persegue; Acquisiti i pareri espressi dall'Istituto Superiore di Sanita' in merito alla riclassificazione dei prodotti fitosanitari attualmente autorizzati in Italia in attuazione delle direttive n. 1999/45/CE e n. 2001/60/CE, di cui l'ultimo in data 3 gennaio 2005, secondo i quali i prodotti fitosanitari contenenti la sostanza attiva carbendazim non possono essere commercializzati; Sentita l'impresa titolare della documentazione presentata per la revisione comunitaria della sostanza attiva carbendazim, che nell'audizione del 28 aprile 2004 ha rappresentato la propria posizione alla Commissione consultiva per i prodotti fitosanitari di cui all'art. 20 del citato decreto legislativo n.194/1995; Acquisito il parere del 28 aprile 2004 della sopra citata Commissione consultiva che ha comunque proposto l'eliminazione dal commercio dei prodotti fitosanitari contenenti carbendazim, in considerazione della classificazione della sostanza attiva in categoria 2 di tossicita' per la riproduzione; Sentita l'associazione di categoria Agrofarma che nell'audizione del 16 settembre 2004 ha illustrato alla sopra citata Commissione consultiva la posizione delle imprese in merito alle problematiche relative alle sostanze attive di categoria 2 di cancerogenesi, mutagenesi o tossicita' per la riproduzione; Considerato quanto esposto dal Ministro della salute con la nota del 14 luglio 2004 diretta al Commissario europeo per la salute e la protezione dei consumatori al fine di definire criteri armonizzati sulla valutazione e la gestione delle problematiche legate ai prodotti fitosanitari contenenti sostanze attive che presentano preoccupazioni di tipo sanitario, anche in applicazione del principio di precauzione; Considerato quanto esposto nella nota del 12 ottobre 2004 dal Commissario europeo per la salute e la protezione dei consumatori nella quale, tra l'altro, viene indicato che gli Stati membri possono continuare ad autorizzare prodotti contenenti sostanze attive gia' presenti sul mercato europeo alla data del 26 luglio 1993 in base ai criteri generali di cui al citato art. 4 della direttiva n. 91/414/CEE, in attesa della conclusione della procedura di revisione comunitaria delle sostanze stesse; Acquisito l'ulteriore parere espresso in data 16 dicembre 2004 dall'Istituto Superiore di Sanita' che, tenuto conto delle indicazioni espresse dal Commissario europeo per la salute e la protezione dei consumatori e in applicazione del principio di precauzione, ha tra l'altro riaffermato la non ammissibilita' dei prodotti contenenti sostanze attive di categoria 1 o 2 di cancerogenesi, mutagenesi o tossicita' per la riproduzione per le quali e' ancora in corso il processo di revisione comunitaria; Considerato che non si e' ancora conclusa la revisione comunitaria della sostanza attiva carbendazim ai sensi del citato regolamento (CEE) n. 3600/92; Ritenuto di dare applicazione al citato principio di precauzione attraverso l'adozione di misure provvisorie che consentano di raggiungere un elevato livello di tutela della salute; Ritenuto pertanto di dover sospendere, in via cautelativa, l'immissione in commercio e l'impiego di prodotti fitosanitari contenenti la sostanza attiva carbendazim, in considerazione della classificazione tossicologica recentemente attribuita e in attesa della conclusione della sua revisione comunitaria; Decreta: 1. Le autorizzazioni all'immissione in commercio e all'impiego di tutti i prodotti fitosanitari indicati nell'allegato al presente decreto, contenenti la sostanza attiva carbendazim sono sospese in considerazione della attuale classificazione in categoria 2 di tossicita' per la riproduzione di tale sostanza attiva e in attesa della conclusione della revisione comunitaria. 2. Alle imprese titolari delle autorizzazioni dei prodotti fitosanitari indicati nell'allegato al presente decreto viene concesso un periodo di novanta giorni per provvedere al ritiro delle scorte giacenti sia presso i magazzini che presso gli esercizi di vendita. 3. Le medesime imprese sono tenute ad adottare nei confronti degli utilizzatori ogni iniziativa idonea ad assicurare una corretta informazione in merito ai prodotti fitosanitari di cui trattasi. Il presente decreto sara' pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana ed entra in vigore il giorno successivo alla sua pubblicazione. Roma, 21 febbraio 2005 Il direttore generale: Marabelli Legge 19 febbraio 2004, n. 40 "Norme in materia di procreazione medicalmente assistita" pubblicata nella Gazzetta Ufficiale n. 45 del 24 febbraio 2004 CAPO I PRINCÌPI GENERALI ART. 1. (Finalità). 1. Al fine di favorire la soluzione dei problemi riproduttivi derivanti dalla sterilità o dalla infertilità umana è consentito il ricorso alla procreazione medicalmente assistita, alle condizioni e secondo le modalità previste dalla presente legge, che assicura i diritti di tutti i soggetti coinvolti, compreso il concepito. 2. Il ricorso alla procreazione medicalmente assistita è consentito qualora non vi siano altri metodi terapeutici efficaci per rimuovere le cause di sterilità o infertilità. ART. 2. (Interventi contro la sterilità e la infertilità). 1. Il Ministro della salute, sentito il Ministro dell'istruzione, dell'università e della ricerca, può promuovere ricerche sulle cause patologiche, psicologiche, ambientali e sociali dei fenomeni della sterilità e della infertilità e favorire gli interventi necessari per rimuoverle nonché per ridurne l'incidenza, può incentivare gli studi e le ricerche sulle tecniche di crioconservazione dei gameti e può altresí promuovere campagne di informazione e di prevenzione dei fenomeni della sterilità e della infertilità. 2. Per le finalità di cui al comma 1 è autorizzata la spesa massima di 2 milioni di euro a decorrere dal 2004. 3. All'onere derivante dall'attuazione del comma 2 si provvede mediante corrispondente riduzione dello stanziamento iscritto, ai fini del bilancio triennale 2004-2006, nell'ambito dell'unità previsionale di base di parte corrente "Fondo speciale" dello stato di previsione del Ministero dell'economia e delle finanze per l'anno 2004, allo scopo parzialmente utilizzando l'accantonamento relativo al Ministero della salute. Il Ministro dell'economia e delle finanze è autorizzato ad apportare, con propri decreti, le occorrenti variazioni di bilancio. ART. 3. (Modifica alla legge 29 luglio 1975, n. 405). 1. Al primo comma dell'articolo 1 della legge 29 luglio 1975, n. 405, sono aggiunte, in fine, le seguenti lettere: "d-bis) l'informazione e l'assistenza riguardo ai problemi della sterilità e della infertilità umana, nonché alle tecniche di procreazione medicalmente assistita; d-ter) l'informazione sulle procedure per l'adozione e l'affidamento familiare". Dall'attuazione del presente articolo non devono derivare nuovi o maggiori oneri a carico della finanza pubblica. CAPO II ACCESSO ALLE TECNICHE ART. 4. (Accesso alle tecniche). 1. Il ricorso alle tecniche di procreazione medicalmente assistita è consentito solo quando sia accertata l'impossibilità di rimuovere altrimenti le cause impeditive della procreazione ed è comunque circoscritto ai casi di sterilità o di infertilità inspiegate documentate da atto medico nonché ai casi di sterilità o di infertilità da causa accertata e certificata da atto medico. 2. Le tecniche di procreazione medicalmente assistita sono applicate in base ai seguenti princípi: a) gradualità, al fine di evitare il ricorso ad interventi aventi un grado di invasività tecnico e psicologico più gravoso per i destinatari, ispirandosi al principio della minore invasività; b) consenso informato, da realizzare ai sensi dell'articolo 6. 3. È vietato il ricorso a tecniche di procreazione medicalmente assistita di tipo eterologo. ART. 5. (Requisiti soggettivi). 1. Fermo restando quanto stabilito dall'articolo 4, comma 1, possono accedere alle tecniche di procreazione medicalmente assistita coppie di maggiorenni di sesso diverso, coniugate o conviventi, in età potenzialmente fertile, entrambi viventi. 1. 2. 3. 4. 5. ART. 6. (Consenso informato). Per le finalità indicate dal comma 3, prima del ricorso ed in ogni fase di applicazione delle tecniche di procreazione medicalmente assistita il medico informa in maniera dettagliata i soggetti di cui all'articolo 5 sui metodi, sui problemi bioetici e sui possibili effetti collaterali sanitari e psicologici conseguenti all'applicazione delle tecniche stesse, sulle probabilità di successo e sui rischi dalle stesse derivanti, nonché sulle relative conseguenze giuridiche per la donna, per l'uomo e per il nascituro. Alla coppia deve essere prospettata la possibilità di ricorrere a procedure di adozione o di affidamento ai sensi della legge 4 maggio 1983, n. 184, e successive modificazioni, come alternativa alla procreazione medicalmente assistita. Le informazioni di cui al presente comma e quelle concernenti il grado di invasività delle tecniche nei confronti della donna e dell'uomo devono essere fornite per ciascuna delle tecniche applicate e in modo tale da garantire il formarsi di una volontà consapevole e consapevolmente espressa. Alla coppia devono essere prospettati con chiarezza i costi economici dell'intera procedura qualora si tratti di strutture private autorizzate. La volontà di entrambi i soggetti di accedere alle tecniche di procreazione medicalmente assistita è espressa per iscritto congiuntamente al medico responsabile della struttura, secondo modalità definite con decreto dei Ministri della giustizia e della salute, adottato ai sensi dell'articolo 17, comma 3, della legge 23 agosto 1988, n. 400, entro tre mesi dalla data di entrata in vigore della presente legge. Tra la manifestazione della volontà e l'applicazione della tecnica deve intercorrere un termine non inferiore a sette giorni. La volontà può essere revocata da ciascuno dei soggetti indicati dal presente comma fino al momento della fecondazione dell'ovulo. Fatti salvi i requisiti previsti dalla presente legge, il medico responsabile della struttura può decidere di non procedere alla procreazione medicalmente assistita, esclusivamente per motivi di ordine medico-sanitario. In tale caso deve fornire alla coppia motivazione scritta di tale decisione. Ai richiedenti, al momento di accedere alle tecniche di procreazione medicalmente assistita, devono essere esplicitate con chiarezza e mediante sottoscrizione le conseguenze giuridiche di cui all'articolo 8 e all'articolo 9 della presente legge. ART. 7. (Linee guida). 1. Il Ministro della salute, avvalendosi dell'Istituto superiore di sanità, e previo parere del Consiglio superiore di sanità, definisce, con proprio decreto, da emanare entro tre mesi dalla data di entrata in vigore della presente legge, linee guida contenenti l'indicazione delle procedure e delle tecniche di procreazione medicalmente assistita. 2. Le linee guida di cui al comma 1 sono vincolanti per tutte le strutture autorizzate. 3. Le linee guida sono aggiornate periodicamente, almeno ogni tre anni, in rapporto all'evoluzione tecnico-scientifica, con le medesime procedure di cui al comma 1. CAPO III DISPOSIZIONI CONCERNENTI LA TUTELA DEL NASCITURO ART. 8. (Stato giuridico del nato). 1. I nati a seguito dell'applicazione delle tecniche di procreazione medicalmente assistita hanno lo stato di figli legittimi o di figli riconosciuti della coppia che ha espresso la volontà di ricorrere alle tecniche medesime ai sensi dell'articolo 6. ART. 9. (Divieto del disconoscimento della paternità e dell'anonimato della madre). 1. Qualora si ricorra a tecniche di procreazione medicalmente assistita di tipo eterologo in violazione del divieto di cui all'articolo 4, comma 3, il coniuge o il convivente il cui consenso è ricavabile da atti concludenti non può esercitare l'azione di disconoscimento della paternità nei casi previsti dall'articolo 235, primo comma, numeri 1) e 2), del codice civile, né l'impugnazione di cui all'articolo 263 dello stesso codice. 2. La madre del nato a seguito dell'applicazione di tecniche di procreazione medicalmente assistita non può dichiarare la volontà di non essere nominata, ai sensi dell'articolo 30, comma 1, del regolamento di cui al decreto del Presidente della Repubblica 3 novembre 2000, n. 396. 3. In caso di applicazione di tecniche di tipo eterologo in violazione del divieto di cui all'articolo 4, comma 3, il donatore di gameti non acquisisce alcuna relazione giuridica parentale con il nato e non può far valere nei suoi confronti alcun diritto né essere titolare di obblighi. CAPO IV REGOLAMENTAZIONE DELLE STRUTTURE AUTORIZZATE ALL'APPLICAZIONE DELLE TECNICHE DI PROCREAZIONE MEDICALMENTE ASSISTITA ART. 10. (Strutture autorizzate). 1. Gli interventi di procreazione medicalmente assistita sono realizzati nelle strutture pubbliche e private autorizzate dalle regioni e iscritte al registro di cui all'articolo 11. 2. Le regioni e le province autonome di Trento e di Bolzano definiscono con proprio atto, entro tre mesi dalla data di entrata in vigore della presente legge: a) i requisiti tecnico-scientifici e organizzativi delle strutture; b) le caratteristiche del personale delle strutture; c) i criteri per la determinazione della durata delle autorizzazioni e dei casi di revoca delle stesse; d) i criteri per lo svolgimento dei controlli sul rispetto delle disposizioni della presente legge e sul permanere dei requisiti tecnico-scientifici e organizzativi delle strutture. ART. 11. (Registro). 1. È istituito, con decreto del Ministro della salute, presso l'Istituto superiore di sanità, il registro nazionale delle strutture autorizzate all'applicazione delle tecniche di procreazione medicalmente assistita, degli embrioni formati e dei nati a seguito dell'applicazione delle tecniche medesime. 2. L'iscrizione al registro di cui al comma 1 è obbligatoria. 3. L'Istituto superiore di sanità raccoglie e diffonde, in collaborazione con gli osservatori epidemiologici regionali, le informazioni necessarie al fine di consentire la trasparenza e la pubblicità delle tecniche di procreazione medicalmente assistita adottate e dei risultati conseguiti. 4. L'Istituto superiore di sanità raccoglie le istanze, le informazioni, i suggerimenti, le proposte delle società scientifiche e degli utenti riguardanti la procreazione medicalmente assistita. 5. Le strutture di cui al presente articolo sono tenute a fornire agli osservatori epidemiologici regionali e all'Istituto superiore di sanità i dati necessari per le finalità indicate dall'articolo 15 nonché ogni altra informazione necessaria allo svolgimento delle funzioni di controllo e di ispezione da parte delle autorità competenti. 6. All'onere derivante dall'attuazione del presente articolo, determinato nella misura massima di 154.937 euro a decorrere dall'anno 2004, si provvede mediante corrispondente riduzione dello stanziamento iscritto, ai fini del bilancio triennale 2004-2006, nell'ambito dell'unità previsionale di base di parte corrente "Fondo speciale" dello stato di previsione del Ministero dell'economia e delle finanze per l'anno 2004, allo scopo parzialmente utilizzando l'accantonamento relativo al Ministero della salute. Il Ministro dell'economia e delle finanze è autorizzato ad apportare, con propri decreti, le occorrenti variazioni di bilancio. CAPO V DIVIETI E SANZIONI ART. 12. (Divieti generali e sanzioni). 1. Chiunque a qualsiasi titolo utilizza a fini procreativi gameti di soggetti estranei alla coppia richiedente, in violazione di quanto previsto dall'articolo 4, comma 3, è punito con la sanzione amministrativa pecuniaria da 300.000 a 600.000 euro. 2. Chiunque a qualsiasi titolo, in violazione dell'articolo 5, applica tecniche di procreazione medicalmente assistita a coppie i cui componenti non siano entrambi viventi o uno dei cui componenti sia minorenne ovvero che siano composte da soggetti dello stesso sesso o non coniugati o non conviventi è punito con la sanzione amministrativa pecuniaria da 200.000 a 400.000 euro. 3. Per l'accertamento dei requisiti di cui al comma 2 il medico si avvale di una dichiarazione sottoscritta dai soggetti richiedenti. In caso di dichiarazioni mendaci si applica l'articolo 76, commi 1 e 2, del testo unico delle disposizioni legislative e regolamentari in materia di documentazione amministrativa, di cui al decreto del Presidente della Repubblica 28 dicembre 2000, n. 445. 4. Chiunque applica tecniche di procreazione medicalmente assistita senza avere raccolto il consenso secondo le modalità di cui all'articolo 6 è punito con la sanzione amministrativa pecuniaria da 5.000 a 50.000 euro. 5. Chiunque a qualsiasi titolo applica tecniche di procreazione medicalmente assistita in strutture diverse da quelle di cui all'articolo 10 è punito con la sanzione amministrativa pecuniaria da 100.000 a 300.000 euro. 6. Chiunque, in qualsiasi forma, realizza, organizza o pubblicizza la commercializzazione di gameti o di embrioni o la surrogazione di maternità è punito con la reclusione da tre mesi a due anni e con la multa da 600.000 a un milione di euro. 7. Chiunque realizza un processo volto ad ottenere un essere umano discendente da un'unica cellula di partenza, eventualmente identico, quanto al patrimonio genetico nucleare, ad un altro essere umano in vita o morto, è punito con la reclusione da dieci a venti anni e con la multa da 600.000 a un milione di euro. Il medico è punito, altresí, con l'interdizione perpetua dall'esercizio della professione. 8. Non sono punibili l'uomo o la donna ai quali sono applicate le tecniche nei casi di cui ai commi 1, 2, 4 e 5. 9. È disposta la sospensione da uno a tre anni dall'esercizio professionale nei confronti dell'esercente una professione sanitaria condannato per uno degli illeciti di cui al presente articolo, salvo quanto previsto dal comma 7. 10.L'autorizzazione concessa ai sensi dell'articolo 10 alla struttura al cui interno è eseguita una delle pratiche vietate ai sensi del presente articolo è sospesa per un anno. Nell'ipotesi di più violazioni dei divieti di cui al presente articolo o di recidiva l'autorizzazione può essere revocata. CAPO VI MISURE DI TUTELA DELL'EMBRIONE ART. 13. (Sperimentazione sugli embrioni umani). 1. È vietata qualsiasi sperimentazione su ciascun embrione umano. 2. La ricerca clinica e sperimentale su ciascun embrione umano è consentita a condizione che si perseguano finalità esclusivamente terapeutiche e diagnostiche ad essa collegate volte alla tutela della 3. a) b) c) d) 4. 5. salute e allo sviluppo dell'embrione stesso, e qualora non siano disponibili metodologie alternative. Sono, comunque, vietati: la produzione di embrioni umani a fini di ricerca o di sperimentazione o comunque a fini diversi da quello previsto dalla presente legge; ogni forma di selezione a scopo eugenetico degli embrioni e dei gameti ovvero interventi che, attraverso tecniche di selezione, di manipolazione o comunque tramite procedimenti artificiali, siano diretti ad alterare il patrimonio genetico dell'embrione o del gamete ovvero a predeterminarne caratteristiche genetiche, ad eccezione degli interventi aventi finalità diagnostiche e terapeutiche, di cui al comma 2 del presente articolo; interventi di clonazione mediante trasferimento di nucleo o di scissione precoce dell'embrione o di ectogenesi sia a fini procreativi sia di ricerca; la fecondazione di un gamete umano con un gamete di specie diversa e la produzione di ibridi o di chimere. La violazione dei divieti di cui al comma 1 è punita con la reclusione da due a sei anni e con la multa da 50.000 a 150.000 euro. In caso di violazione di uno dei divieti di cui al comma 3 la pena è aumentata. Le circostanze attenuanti concorrenti con le circostanze aggravanti previste dal comma 3 non possono essere ritenute equivalenti o prevalenti rispetto a queste. È disposta la sospensione da uno a tre anni dall'esercizio professionale nei confronti dell'esercente una professione sanitaria condannato per uno degli illeciti di cui al presente articolo. ART. 14. (Limiti all'applicazione delle tecniche sugli embrioni). 1. È vietata la crioconservazione e la soppressione di embrioni, fermo restando quanto previsto dalla legge 22 maggio 1978, n. 194. 2. Le tecniche di produzione degli embrioni, tenuto conto dell'evoluzione tecnico-scientifica e di quanto previsto dall'articolo 7, comma 3, non devono creare un numero di embrioni superiore a quello strettamente necessario ad un unico e contemporaneo impianto, comunque non superiore a tre. 3. Qualora il trasferimento nell'utero degli embrioni non risulti possibile per grave e documentata causa di forza maggiore relativa 4. 5. 6. 7. 8. 9. allo stato di salute della donna non prevedibile al momento della fecondazione è consentita la crioconservazione degli embrioni stessi fino alla data del trasferimento, da realizzare non appena possibile. Ai fini della presente legge sulla procreazione medicalmente assistita è vietata la riduzione embrionaria di gravidanze plurime, salvo nei casi previsti dalla legge 22 maggio 1978, n. 194. I soggetti di cui all'articolo 5 sono informati sul numero e, su loro richiesta, sullo stato di salute degli embrioni prodotti e da trasferire nell'utero. La violazione di uno dei divieti e degli obblighi di cui ai commi precedenti è punita con la reclusione fino a tre anni e con la multa da 50.000 a 150.000 euro. È disposta la sospensione fino ad un anno dall'esercizio professionale nei confronti dell'esercente una professione sanitaria condannato per uno dei reati di cui al presente articolo. È consentita la crioconservazione dei gameti maschile e femminile, previo consenso informato e scritto. La violazione delle disposizioni di cui al comma 8 è punita con la sanzione amministrativa pecuniaria da 5.000 a 50.000 euro. CAPO VII DISPOSIZIONI FINALI E TRANSITORIE ART. 15. (Relazione al Parlamento). 1. L'Istituto superiore di sanità predispone, entro il 28 febbraio di ciascun anno, una relazione annuale per il Ministro della salute in base ai dati raccolti ai sensi dell'articolo 11, comma 5, sull'attività delle strutture autorizzate, con particolare riferimento alla valutazione epidemiologica delle tecniche e degli interventi effettuati. 2. Il Ministro della salute, sulla base dei dati indicati al comma 1, presenta entro il 30 giugno di ogni anno una relazione al Parlamento sull'attuazione della presente legge. ART. 16. (Obiezione di coscienza). 1. Il personale sanitario ed esercente le attività sanitarie ausiliarie non è tenuto a prendere parte alle procedure per l'applicazione delle tecniche di procreazione medicalmente assistita disciplinate dalla presente legge quando sollevi obiezione di coscienza con preventiva dichiarazione. La dichiarazione dell'obiettore deve essere comunicata entro tre mesi dalla data di entrata in vigore della presente legge al direttore dell'azienda unità sanitaria locale o dell'azienda ospedaliera, nel caso di personale dipendente, al direttore sanitario, nel caso di personale dipendente da strutture private autorizzate o accreditate. 2. L'obiezione può essere sempre revocata o venire proposta anche al di fuori dei termini di cui al comma 1, ma in tale caso la dichiarazione produce effetto dopo un mese dalla sua presentazione agli organismi di cui al comma 1. 3. L'obiezione di coscienza esonera il personale sanitario ed esercente le attività sanitarie ausiliarie dal compimento delle procedure e delle attività specificatamente e necessariamente dirette a determinare l'intervento di procreazione medicalmente assistita e non dall'assistenza antecedente e conseguente l'intervento. ART. 17. (Disposizioni transitorie). 1. Le strutture e i centri iscritti nell'elenco predisposto presso l'Istituto superiore di sanità ai sensi dell'ordinanza del Ministro della sanità del 5 marzo 1997, pubblicata nella Gazzetta Ufficiale n. 55 del 7 marzo 1997, sono autorizzati ad applicare le tecniche di procreazione medicalmente assistita, nel rispetto delle disposizioni della presente legge, fino al nono mese successivo alla data di entrata in vigore della presente legge. 2. Entro trenta giorni dalla data di entrata in vigore della presente legge, le strutture e i centri di cui al comma 1 trasmettono al Ministero della salute un elenco contenente l'indicazione numerica degli embrioni prodotti a seguito dell'applicazione di tecniche di procreazione medicalmente assistita nel periodo precedente la data di entrata in vigore della presente legge, nonché, nel rispetto delle vigenti disposizioni sulla tutela della riservatezza dei dati personali, l'indicazione nominativa di coloro che hanno fatto ricorso alle tecniche medesime a seguito delle quali sono stati formati gli embrioni. La violazione della disposizione del presente comma è punita con la sanzione amministrativa pecuniaria da 25.000 a 50.000 euro. 3. Entro tre mesi dalla data di entrata in vigore della presente legge il Ministro della salute, avvalendosi dell'Istituto superiore di sanità, definisce, con proprio decreto, le modalità e i termini di conservazione degli embrioni di cui al comma 2. ART. 18. (Fondo per le tecniche di procreazione medicalmente assistita). 1. Al fine di favorire l'accesso alle tecniche di procreazione medicalmente assistita da parte dei soggetti di cui all'articolo 5, presso il Ministero della salute è istituito il Fondo per le tecniche di procreazione medicalmente assistita. Il Fondo è ripartito tra le regioni e le province autonome di Trento e di Bolzano sulla base di criteri determinati con decreto del Ministro della salute, da emanare entro sessanta giorni dalla data di entrata in vigore della presente legge, sentita la Conferenza permanente per i rapporti tra lo Stato, le regioni e le province autonome di Trento e di Bolzano. 2. Per la dotazione del Fondo di cui al comma 1 è autorizzata la spesa di 6,8 milioni di euro a decorrere dall'anno 2004. 3. All'onere derivante dall'attuazione del presente articolo si provvede mediante corrispondente riduzione dello stanziamento iscritto, ai fini del bilancio triennale 2004-2006, nell'ambito dell'unità previsionale di base di parte corrente "Fondo speciale" dello stato di previsione del Ministero dell'economia e delle finanze per l'anno 2004, allo scopo parzialmente utilizzando l'accantonamento relativo al Ministero medesimo. Il Ministro dell'economia e delle finanze è autorizzato ad apportare, con propri decreti, le occorrenti variazioni di bilancio. CARATTERISTICHE PAZIENTI RECATISI AL CENTRO NELL'ANNO 2004/2005 Pazienti 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Professione Serricoltore Serricoltore Serricoltore Operaio Professionista Altro Impiegato Operaio Serricoltore Serricoltore Impiegato Operaio Professionista Serricoltore Altro Serricoltore Serricoltore Serricoltore Serricoltore Commerciante Operaio Professionista Impiegato Professionista Professionista Serricoltore Impiegato Operaio Diagnosi Pato Pato Pato Pato Pato Pato Normo Pato Pato Normo Pato Normo Pato Pato Pato Pato Pato Normo Pato Pato Normo Pato Pato Normo Pato Pato Pato Pato Età 41 37 42 27 32 33 45 45 41 27 34 30 32 33 27 35 33 25 31 35 27 36 39 31 37 34 33 32 N° Spz Tot. 12 16 2 7 13 32 57 0 4 54 31 38 22 1 22 33 4 22 6 2 22 24 15 29 22 33 0 22 Mobili A 3 9 0 4 2 12 13 0 0 20 4 12 9 0 18 10 1 10 2 1 10 7 4 20 4 4 0 9 Morfologia N 35 12 31 9 26 15 35 0 29 37 24 35 36 13 15 15 7 36 12 30 34 27 43 31 28 32 0 34 Numerica Cinetica Morfologica 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 2 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 2 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 2 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 Impiegato Operaio Operaio Operaio Professionista Impiegato Operaio Commerciante Operaio Operaio Operaio Serricoltore Serricoltore Professionista Serricoltore Serricoltore Professionista Impiegato Impiegato Operaio Impiegato Operaio Operaio Operaio Professionista Serricoltore Impiegato Commerciante Operaio Serricoltore Pato Normo Pato Normo Normo Normo Pato Pato Pato Pato Normo Pato Normo Pato Pato Pato Pato Normo Normo Pato Normo Pato Pato Pato Normo Pato Pato Pato Pato Pato 32 30 32 42 42 28 34 29 42 31 33 43 32 39 43 31 36 53 17 36 37 25 53 38 35 32 28 33 30 30 18 42 13 49 42 54 20 0 4 9 33 3 52 22 7 15 6 48 53 28 38 12 2 22 27 10 8 8 9 14 4 17 6 11 15 16 3 0 0 2 11 2 14 2 2 8 3 16 22 17 15 9 1 6 13 1 4 2 1 3 40 35 36 32 31 36 35 0 18 15 32 34 35 31 15 12 34 31 40 25 38 15 12 32 35 20 36 30 25 27 1 0 1 0 0 0 0 2 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 2 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 Serricoltore Altro Professionista Serricoltore Serricoltore Commerciante Operaio Serricoltore Operaio Operaio Serricoltore Impiegato Operaio Serricoltore Impiegato Operaio Commerciante Serricoltore Altro Commerciante Operaio Professionista Serricoltore Operaio Operaio Commerciante Impiegato Commerciante Operaio Serricoltore Pato Pato Normo Pato Normo Pato Pato Pato Normo Pato Pato Normo Normo Pato Pato Pato Pato Normo Normo Pato Pato Pato Pato Pato Pato Normo Pato Normo Normo Pato 27 32 36 37 32 41 30 42 39 29 35 36 27 30 35 37 33 41 35 45 27 31 29 33 31 25 37 27 29 34 10 37 51 0 41 0 7 0 35 34 17 53 49 0 40 7 22 28 38 0 12 3 39 18 0 35 44 56 47 11 3 16 21 0 15 0 2 0 10 5 7 19 18 0 2 3 7 20 20 0 1 1 10 1 0 19 5 15 10 3 8 10 37 0 34 0 31 0 36 39 5 38 36 0 31 36 30 35 33 0 30 11 19 32 0 34 34 36 38 5 1 0 0 2 0 2 1 2 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 2 0 2 1 2 0 1 1 0 0 2 1 1 1 0 0 2 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 Operaio Impiegato Operaio Impiegato Operaio Altro Impiegato Serricoltore Operaio Operaio Operaio Operaio Serricoltore Impiegato Commerciante Impiegato Serricoltore Commerciante Operaio Serricoltore Serricoltore Operaio Impiegato Professionista Impiegato Commerciante Serricoltore Serricoltore Operaio Altro Normo Pato Normo Pato Normo Pato Pato Pato Pato Pato Normo Normo Normo Pato Normo Pato Pato Pato Pato Pato Normo Pato Normo Pato Pato Normo Pato Pato Pato Pato 49 33 20 32 46 22 38 28 40 39 34 32 29 34 40 47 28 37 38 41 31 31 31 35 40 39 32 32 30 28 58 7 33 26 59 19 22 16 22 51 43 59 22 1 45 3 6 0 2 27 43 6 51 27 8 36 14 0 34 22 15 2 12 6 22 4 2 7 4 12 12 24 12 1 15 1 2 0 1 11 19 2 21 5 3 12 3 0 0 5 31 22 35 30 38 5 41 10 35 19 32 35 40 10 37 31 18 0 32 26 34 17 33 30 34 35 5 0 8 8 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 2 1 0 0 1 0 0 1 0 1 2 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 2 1 0 0 1 0 1 1 0 1 2 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 Operaio Serricoltore Serricoltore Serricoltore Commerciante Operaio Serricoltore Professionista Serricoltore Commerciante Commerciante Serricoltore Serricoltore Operaio Altro Pato Pato Pato Pato Normo Pato Pato Pato Pato Normo Normo Normo Pato Normo Pato Asimmetria età Asimmetria Numerica Asimmetria Cinetica Asimmetria Morfologica Conteggio di Condizione Condizione Normo Pato Totale complessivo 42 34 29 31 32 30 27 36 32 28 32 39 21 32 25 29 6 17 29 39 35 22 33 11 53 38 47 19 58 31 9 1 6 7 10 9 13 6 8 17 10 18 2 21 11 32 10 40 9 35 10 30 25 20 32 34 33 25 37 8 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0,46 0,34 0,62 -0,72 Professione Altro Commerciante 1 7 6 7 7 14 Normo Pato Totale Impiegato 7 13 20 Altre Profess Serricoltore 33 8 60 32 93 40 Operaio Professionista Serricoltore Totale complessivo 14 4 8 41 25 9 32 92 39 13 40 133 GRUPPO DI CONTROLLO Pazienti 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Professione Impiegato Serricoltore Operaio Altro Commerciante Operaio Professionista Impiegato Serricoltore Operaio Professionista Impiegato Impiegato Impiegato Altro Serricoltore Operaio Operaio Commerciante Impiegato Impiegato Commerciante Professionista Operaio Tabella Pivot Conteggio di Condizione Condizione Normo Pato Totale complessivo Diagnosi Età Normo 35 Normo 23 Normo 30 Normo 35 Normo 25 Normo 31 Normo 40 Pato 30 Pato 27 Normo 45 Pato 36 Pato 42 Normo 29 Normo 24 Normo 32 Normo 25 Normo 30 Normo 37 Normo 27 Normo 37 Normo 31 Pato 33 Normo 35 Normo 40 N° Spz Tot. 60 45 65 30 90 115 25 31 35 100 18 150 54 110 26 120 43 90 30 105 70 19 85 135 Mobili A 20 15 30 11 38 40 11 16 12 27 11 50 15 30 11 40 15 20 16 30 27 10 18 24 Morfologia N 34 33 34 35 35 34 33 27 28 34 35 28 36 34 37 32 35 40 33 32 39 35 34 36 Numerica Cinetica Morfologica 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Professione Altro Commerciante Impiegato Operaio Professionista Serricoltore Totale complessivo 2 0 2 1 5 2 6 0 2 1 2 1 19 5 2 3 7 6 3 3 24 % Patologici 20,83 % Normo 79,17 PAZIENTE ETA' DIAGNOSI PROFESSIONE MOT(a+b) A FRESCO MOT(a+b) DOPO SCONG MOT( c ) A FRESCO MOT( c ) DOPO SCONG SOPRAV (a+b) SOPRAV (c) 1 7 9 14 17 12 30 38 24 64 36 A O/A A/T A/T O/A/T A/T Impiegato Serricoltore Operaio Altro Impiegato Serricoltore 10,0% 4,9% 11,1% 3,2% 6,5% 20,3% 5,2% 2,9% 4,3% 0,0% 0,0% 3,1% 47,5% 54,7% 43,7% 15,6% 38,7% 7,2% 8,1% 7,2% 15,9% 0,0% 0,0% 1,4% 52,0% 58,7% 39,0% 0,0% 0,0% 15,1% 17,1% 13,2% 36,5% 0,0% 0,0% 18,8% 19 21 5 24 37 41 22 48 44 2 50 46 31 11 40 23 25 47 40 34 41 48 44 32 A O/A A/T A/T O/A/T A/T A O/A/T A A/T O/A/T A/T O/A O/A O/A/T O/A/T A/T O/A Commerciante Operaio Serricoltore Impiegato Serricoltore Impiegato Professionista Operaio Serricoltore Impiegato Serricoltore Impiegato Operaio Operaio Serricoltore Professionista Operaio Commerciante 13,7% 13,9% 32,0% 3,9% 22,2% 16,4% 14,0% 13,3% 4,3% 11,7% 11,4% 15,5% 45,5% 35,0% 0,0% 16,4% 13,4% 17,0% 7,0% 9,1% 4,2% 1,0% 0,0% 3,7% 2,7% 5,3% 1,4% 2,8% 3,3% 2,4% 13,0% 20,1% 0,0% 7,3% 4,0% 2,5% 20,3% 37,0% 54,0% 50,4% 40,7% 53,6% 54,0% 52,0% 50,8% 21,5% 37,1% 21,1% 18,2% 50,0% 7,7% 24,6% 44,6% 34,1% 4,7% 22,7% 6,3% 3,1% 0,0% 6,0% 8,1% 6,7% 5,7% 2,5% 7,7% 2,9% 0,0% 19,1% 0,0% 8,1% 11,1% 6,3% 51,1% 65,5% 13,0% 26,1% 0,0% 22,4% 19,2% 40,0% 32,7% 23,9% 29,0% 15,6% 28,7% 57,5% 0% 44,3% 29,9% 14,7% 23,0% 61,4% 11,6% 6,1% 0,0% 11,3% 14,9% 12,8% 11,1% 11,7% 20,8% 13,8% 0,0% 38,3% 0,0% 32,8% 25,0% 18,3% N N Serricoltore Impiegato 57,6% 50,2% 26,5% 22,0% 20,1% 15,2% 7,2% 6,4% 46,0% 43,8% 35,5% 42,5% 20 49 36 43 34 40 37 29 40 56 33 43 37 25 33 34 36 29 4 27 16 38 30 42 10 32 36 39 3 34 45 35 8 43 33 15 28 6 51 18 26 13 30 30 47 36 37 30 30 32 39 27 32 25 57 42 29 32 35 30 39 27 27 31 20 25 35 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N Professionista Operaio Impiegato Operaio Altro Commerciante Impiegato Impiegato Professionista Impiegato Operaio Serricoltore Operaio Operaio Impiegato Altro Serricoltore Operaio Commerciante Operaio Serricoltore Professionista Impiegato Operaio Altro 51,1% 53,4% 47,1% 54,1% 82,4% 80,0% 50,8% 54,9% 88,6% 33,5% 65,1% 80,6% 44,6% 70,3% 41,8% 36,8% 49,1% 59,6% 37,3% 60,8% 45,9% 71,1% 37,9% 71,2% 59,4% 30,2% 20,4% 17,1% 25,2% 43,1% 42,1% 10,7% 23,5% 38,4% 13,3% 17,7% 18,0% 23,2% 32,3% 10,7% 0,0% 19,9% 27,6% 8,5% 33,6% 2,2% 33,4% 17,2% 40,5% 28,7% 34,0% 31,4% 33,3% 29,2% 11,0% 14,0% 15,9% 31,3% 5,1% 41,6% 21,7% 14,8% 23,2% 21,1% 21,7% 8,1% 21,4% 12,8% 13,6% 29,1% 17,6% 10,0% 27,0% 20,1% 9,8% 15,1% 10,0% 8,6% 11,1% 4,0% 4,8% 1,7% 10,9% 1,3% 11,9% 4,3% 1,9% 9,3% 7,8% 7,2% 0,0% 8,5% 3,2% 2,0% 12,0% 0,9% 2,5% 7,9% 6,4% 1,5% 59,2% 38,2% 36,4% 46,6% 52,2% 52,7% 21,0% 42,8% 43,4% 39,8% 27,2% 22,4% 52,0% 46,0% 25,5% 0,0% 40,5% 46,4% 22,9% 55,2% 4,8% 47,0% 45,4% 56,9% 48,4% 44,4% 32,0% 25,7% 38,2% 36,8% 34,4% 10,5% 34,9% 24,8% 28,6% 19,6% 12,7% 40,1% 37,1% 33,2% 0,0% 39,8% 25,1% 14,7% 41,2% 5,0% 25,1% 29,3% 32,0% 15,7% 1 2 3 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Mob. Progressivi (a+b) 4,0 1,9 13 3,1 100,0 22,2 Mob. non Progressivi (c) 19,0 3,0 24 2,8 18,3 2,3 Immobili (d) 17,0 32,0 74,5 105,2 5,7 98,6 40,0 36,9 112 111 124,0 123,1 5,2% 11,7% 2,8% 80,6% 18,0% 8,1% 21,5% 2,5% 14,8% Spermatozooi Totali Motilità% (a+b) 10,0% Motilità% (c) 47,5% 4 5 1,9% 6 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento (a+b) 35 13,2 16,0 2,0 10,2 0,5 Mob. non Progressivi (c) 20,6 6,5 27,0 3,0 3,9 0,2 Immobili (d) 10 45 7,0 43,0 8,1 22,0 66 65 Mob. Progressivi Spermatozooi Totali 50,0 48,0 22,2 22,7 Motilità% (a+b) 53,4% 20,4% 32,0% 4,2% 45,9% 2,2% Motilità% (c) 31,4% 10,0% 54,0% 6,3% 17,6% 7 8 0,9% 9 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Mob. Progressivi (a+b) 1,2 0,6 10,0 0,0 14,0 5,5 Mob. non Progressivi (c) 13,3 1,5 2,2 0,0 55,0 20,2 Immobili (d) 9,8 18,6 15,0 27,0 57,0 101,2 24,3 20,7 27,2 27,0 126,0 126,9 Spermatozooi Totali Motilità% (a+b) 4,9% 2,9% 36,8% 0,0% 11,1% 4,3% Motilità% (c) 54,7% 7,2% 8,1% 0,0% 43,7% 15,9% 10 Mob. Progressivi Mob. non Progressivi Immobili 11 12 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento (a+b) 20 8,6 70 40 5,6 0,9 (c) 11,4 4 100 38 2,0 0,4 (d) 5 24 30 120,6 20,0 28,0 36 37 Spermatozooi Totali 200 199 27,6 29,3 Motilità% (a+b) 54,9% 23,5% 35,0% 20,1% 20,3% 3,1% Motilità% (c) 31,3% 10,9% 50,0% 19,1% 7,2% 13 Mob. Progressivi Mob. non Progressivi Immobili (a+b) (c) (d) Spermatozooi Totali 14 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento 15,8 7,5 2,7 0,0 19,0 4,3 2,6 0,4 13,0 0,0 6,9 1,0 8,2 18,2 67,5 80,0 25,0 45,0 26,6 26,1 83,2 80,0 50,9 50,3 28,7% 3,2% 0,0% 37,3% 8,5% 1,5% 15,6% 0,0% 13,6% Motilità% (a+b) 59,4% Motilità% (c) 9,8% 16 Mob. Progressivi Mob. non Progressivi Immobili (a+b) (c) (d) Spermatozooi Totali 1,4% 15 17 2,0% 18 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento 20,0 9,5 1,0 0,0 27 12 10,8 4,2 6,0 0,0 19,2 5,5 6,2 24,0 8,5 15,0 25 52,2 37,0 37,7 15,5 15,0 71 70 Motilità% (a+b) 54,1% 25,2% 6,5% 0,0% 37,9% 17,2% Motilità% (c) 29,2% 11,1% 38,7% 0,0% 27,0% 7,9% 19 20 21 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Mob. Progressivi (a+b) 15,5 7,5 40 18,5 1,5 1,0 Mob. non Progressivi (c) 23,0 5,0 14 5 4,0 2,5 Immobili (d) 75,0 95,0 15,5 46,4 5,3 7,5 113,5 107,5 70 70 10,8 11,0 Spermatozooi Totali Motilità% (a+b) 13,7% 7,0% 57,6% 26,5% 13,9% 9,1% Motilità% (c) 20,3% 4,7% 20,1% 7,2% 37,0% 22,7% Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento 22 23 24 Mob. Progressivi (a+b) 8 1,5 4 1,8 3,8 1,0 Mob. non Progressivi (c) 30,8 4,5 6 2 48,5 3,0 Immobili (d) 18,2 49,8 14,4 21 44,0 93,0 57 56 24 25 96,3 97,0 Spermatozooi Totali Motilità% (a+b) 14,0% 2,7% 16,4% 7,3% 3,9% 1,0% Motilità% (c) 54,0% 8,1% 24,6% 8,1% 50,4% 3,1% 25 26 27 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Mob. Progressivi (a+b) 15,0 4,5 160,0 90,0 12,0 4,2 Mob. non Progressivi (c) 50,0 12,5 45,2 14,3 8,5 2,1 Immobili (d) 47,0 95,2 19,6 118,0 5,0 18,2 Spermatozooi Totali 112,0 112,2 224,8 222,3 25,5 24,5 Motilità% (a+b) 13,4% 4,0% 71,2% 40,5% 47,1% 17,1% Motilità% (c) 44,6% 11,1% 20,1% 6,4% 33,3% 8,6% 28 Mob. Progressivi Mob. non Progressivi Immobili 29 Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento (a+b) 180 86,2 120,0 70,0 80,0 42,0 (c) 86,2 30,8 80,0 35,0 14,0 4,8 (d) 30 139,8 35,0 126,5 6,0 52,9 296 257 235,0 231,5 100,0 99,7 33,6% 51,1% 30,2% 80,0% 42,1% 12,0% 34,0% 15,1% 14,0% Spermatozooi Totali Motilità% (a+b) 60,8% Motilità% (c) 29,1% 31 Mob. Progressivi Mob. non Progressivi Immobili 32 4,8% 33 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento (a+b) 1 0,3 35,0 15,3 26,0 12,0 (c) 0,4 0 2,0 0,5 5,6 1,4 (d) 0,8 2 2,5 24,0 12,0 30,0 2 2 39,5 39,8 43,6 43,4 13,0% 88,6% 38,4% 59,6% 27,6% 0,0% 5,1% 1,3% 12,8% Spermatozooi Totali Motilità% (a+b) 45,5% Motilità% (c) 18,2% 34 Mob. Progressivi Mob. non Progressivi Immobili 30 Lettura a fresco (a+b) (c) (d) Spermatozooi Totali 35 3,2% 36 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento 50,0 26,2 25,0 6,2 7,0 2,8 26,0 10,5 13,0 4,2 8,7 2,5 36,1 76,3 21,8 47,8 5,2 15,7 112,1 113,0 59,8 58,2 20,9 21,0 Motilità% (a+b) 44,6% 23,2% 41,8% 10,7% 33,5% 13,3% Motilità% (c) 23,2% 9,3% 21,7% 7,2% 41,6% 11,9% 37 Mob. Progressivi Mob. non Progressivi Immobili (a+b) (c) (d) Spermatozooi Totali 38 39 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento 0,6 0,0 154 80 55 15 1,1 0,0 20,5 7,5 18,3 3,6 1,0 2,0 12,3 98,3 11,2 66 2,7 2,0 187 186 85 85 Motilità% (a+b) 22,2% 0,0% 82,4% 43,1% 65,1% 17,7% Motilità% (c) 40,7% 0,0% 11,0% 4,0% 21,7% 4,3% 40 Mob. Progressivi Mob. non Progressivi Immobili (a+b) (c) (d) Spermatozooi Totali 41 42 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento 0 0 11,0 2,5 16,0 3,2 0,5 0 35,9 4,1 5,0 0,5 6 6,5 20,1 61,4 10,5 26,3 7 7 67,0 68,0 31,5 30,0 Motilità% (a+b) 0,0% 0,0% 16,4% 3,7% 50,8% 10,7% Motilità% (c) 7,7% 0,0% 53,6% 6,0% 15,9% 43 Mob. Progressivi Mob. non Progressivi Immobili 44 1,7% 45 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento (a+b) 60 24 4 1,3 120 54,6 (c) 26,2 10,3 47 5,2 36 13,2 (d) 36 86,3 41,5 85,4 14,6 101 122 121 93 92 171 169 Spermatozooi Totali Motilità% (a+b) 49,1% 19,9% 4,3% 1,4% 70,3% 32,3% Motilità% (c) 21,4% 8,5% 50,8% 5,7% 21,1% 7,8% 46 Mob. Progressivi Mob. non Progressivi Immobili (a+b) (c) (d) Spermatozooi Totali 47 48 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento 22 3,4 1,5 0,2 2 0,8 30 4,1 3,0 0,5 7,8 1 90 133 4,3 7,3 5,2 13,2 142 141 8,8 8,0 15 15 Motilità% (a+b) 15,5% 2,4% 17,0% 2,5% 13,3% 5,3% Motilità% (c) 21,1% 2,9% 34,1% 6,3% 52,0% 49 Mob. Progressivi Mob. non Progressivi Immobili (a+b) (c) (d) Spermatozooi Totali 50 6,7% 51 Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento Lettura a fresco Lettura dopo scongelamento 58,0 24,6 2 0,6 30,0 13,4 17,5 7,2 6,5 1,4 4,2 1,0 40,0 80,0 9 16,1 8,0 25,7 115,5 111,8 18 18 42,2 40,1 Motilità% (a+b) 50,2% 22,0% 11,4% 3,3% 71,1% 33,4% Motilità% (c) 15,2% 6,4% 37,1% 7,7% 10,0% 2,5%