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ALMA MATER STUDIORUM – UNIVERSITÀ DI BOLOGNA
Scuola di Farmacia, Biotecnologie e Scienze Motorie
Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie
Tesi di Laurea in Microbiologia
STUDIO DELL’ATTIVITA’ ANTIMICROBICA DI OLII ESSENZIALI
DI MONARDA FISTULOSA E MONARDA DIDYMA VERSO
CANDIDA SP.
E VALUTAZIONE DI UNA POTENZIALE ATTIVITA’ INIBENTE DI
TEA TREE OIL VERSO LA VIRULENZA DI CANDIDA ALBICANS
Candidato:
Relatore:
Jia Wang
Dott.ssa Paola Mattarelli
Matricola n°:
Correlatori:
0000450921
Dott.ssa Maria Grazia Bellardi
Dott. Lorenzo Nissen
Dott.ssa Monica Modesto
Sessione III
Anno Accademico 2012-2013
1
Obiettivi
La Monarda è una lamiacea perenne originaria dell’America del Nord. Studi
recenti hanno dimostrato una potente attività antimicrobica in vitro del suo olio
essenziale verso microrganismi patogeni. Nel presente studio sono stati ottenuti
per distillazione sotto flusso di vapore gli olii essenziali di Monarda fistulosa e M.
didyma coltivate sia presso l'Istituto Ghini-Scarabelli di Imola, sia il Giardino
delle Erbe di Casola Valsenio (Ravenna).
I microrganismi presi in considerazione sono stati Candida albicans, C.
pseudointermedia, C. stellata, tropicalis e C. utilis. Le candide sono lieviti
opportunisti in condizioni normali mentre possono determinare infezioni in
soggetti immunodepressi. La possibilità di utilizzare come antimicrobici
sostanze naturali come gli olii essenziali offre grandi vantaggi soprattutto nel
ridurre l'uso di antibiotici e quindi nel contenere il fenomeno dell'antibiotico
resistenza.
Scopo della presente tesi era dapprima di analizzare gli olii di M. fistulosa e M.
didyma, unitamente all'olio di Tea Tree (TTO) come riferimento, per la loro
attività antimicrobica verso candide. Successivamente è stata valutata
l'interessante possibilità degli olii essenziali di diminuire la virulenza di Candida
albicans. C. albicans è stata ricoltivata in presenza di TTO a concentrazioni
subinibenti ed è stata valutata l'espressione genica di alcuni geni di virulenza
mediante qPCR real time.
2
INDICE
1. Introduzione
....................................................................................................... 5
1.1 Candida sp.
.......................................................................................................6
1.2 TTO (Tea Tree Oil) .............................................................................................. 8
1.3 Gli olii essenziali di Monarda ............................................................................. 8
- Monarda fistulosa .............................................................................................9
- Monarda didyma .............................................................................................. 9
2. Metodi e materiali ............................................................................................. 10
2.1 Coltivazione delle piante di Monarda ............................................................. 10
2.2 Distillazione di Monarda per ottenimento dell’olio essenziale .................... 11
2.3 Microrganismi utilizzati ......................................................................................11
2.4 Condizioni di coltura di Candida sp.................................................................. 12
2.5 Saggio dell’attività antimicrobica secondo MIC (Minimum Inhibitory
Concentration) .......................................................................................................... 12
2.6 Determinazione attività battericida degli o. e. MBC (Minimal
bactericidal concentration) .................................................................................... 14
2.7 Estrazione RNA batterico .................................................................................14
2.8 Quantificazione RNA batterico.......................................................................... 15
2.9 Retrotrascrizione RNA ...................................................................................... 15
2.10 Reazione quantitativa real-time PCR ...........................................................16
2.11 Costruzione curva standard per la normalizzazione controllo................... 16
2.12 Espressione genica del fattore di virulenza ................................................ 17
3. Risultati ed analisi dei dati .............................................................................19
3.1. Resa della distillazione dell’olio di Monarda ................................................ 19
3.2 Saggio di attività antimicrobica dell’olio di Monarda e TTO verso
Candida sp.................................................................................................................. 20
3
3.3 Valutazione di una potenziale attività inibente di Tea Tree Oil
verso la virulenza di Candida albicans................................................................... 26
3.4 L’analisi dei regolatori trascrizionali EFG1 e Lup1 .......................................27
4. Conclusioni ...................................................................................................... 29
5. Bibliografia ......................................................................................................... 30
6. Ringraziamenti ................................................................................................... 32
4
I. Introduzione
L’olio essenziale (o. e.) è una miscela molto complessa di sostanze volatili aromatiche,
che vengono prodotte naturalmente dalle piante. L’o. e., chiamato anche essenza, è
considerato come lo “spirito” della pianta; è un estratto fitochimico selettivo, nel
senso che particolari componenti fitochimici vengono selettivamente ricavati dalla
pianta. A dispetto del nome si tratta di sostanze non oleose, non grasse, e non hanno
nulla in comune con gli oli vegetali. Sono particolarmente concentrati in parti diverse
della pianta: nei fiori, nella resina, nella corteccia, nelle radici, nella buccia dei frutti,
nelle foglie, nei frutti, nel legno.
Risultano essere poco solubili nelle soluzioni acquose, mentre si sciolgono facilmente
nelle soluzioni alcoliche e negli oli vegetali. Stimolano intensamente l’olfatto, poiché
si volatilizzano a temperatura ambiente.
Ogni tipo di olio essenziale presenta delle caratteristiche proprie incluse le proprietà
fisiche e chimiche. A seconda delle loro proprietà, i vari o. e, vengono utilizzati in
diversi campi, quelli dei profumi, dei prodotti di bellezza, delle cure medicinali, etc.
L’impiego degli olii essenziali fa parte della medicina “alternativa”, come la fitoterapia.
Questi approcci terapeutici storicamente sono stati usati nei Paesi orientali come
Cina India e Giappone, per curare e per il benessere del corpo e dello spirito, perché
gli o. e. hanno proprietà antisettiche e rilassanti. Inoltre in Cina gli olii sono utilizzati
frequentemente anche per curare punture di insetti, tagli e le ferite, bruciature ed
infezioni. Queste applicazioni hanno dimostrato che gli olii essenziali potrebbero
avere anche proprietà antitossiniche, antiparassitiche ed antimicrobiche.
Gli studi degli ultimi venti anni sull’olio essenziale di TTO (Tea Tree Oil) hanno
confermato che la sua attività inibisce la crescita di diversi tipi di microrganismi
inclusi batteri e funghi, anche se con attività diversa a seconda del microrganismo
(Hammer KA, Carson, CF, Riley TV, 2002; C. F. Carson, K. A. Hammer, and T. V. Riley;
19/01/2006; CMR).
Molti aspetti possono essere affrontati approcciandosi allo studio degli o. e. come lo
studio di nuovi o. e., del loro spettro d’attività antimicrobica e del dosaggio
necessario per esplicare attività antimicrobica, delle possibili attività inibenti
l’espressione di tossine e della diminuzione della virulenza dei patogeni.
Scopo della presente ricerca è lo studio dell’attività antimicrobica degli o. e. di
Monarda fistulosa e M. didyma paragonato allo studio dell’attività dell’o. e. di TTO
verso ceppi di Candida sp.
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1.1 Candida sp.
Fig. 1.1 Candida albicans
(dal sito www.nejm.org)
Candida è un genere di lieviti che comprende più di venti specie: la più comune è
Candida albicans (Fig. 1.1) che provoca infezioni, dette candidosi, nell'uomo e negli
animali in vari habitat del corpo come pelle, unghie, apparato respiratorio, apparato
urogenitale, apparato digestivo, etc.
Candida sp. comprende microrganismi aerobici, che crescono normalmente a 30°C:
mentre a 30°C non sono virulenti, se crescono invece a 37 °C esprimono virulenza. Il
passaggio dalla forma avirulenta a quella virulenta è regolato dall’espressione di certi
geni presenti nel genoma. Grazie alle nuove tecniche di analisi molecolare sono stati
individuati alcuni geni di virulenza in Candida come Tpk2 EFG1 e Tup1 (Alida Schaekel,
Prashant R Desai, e Joachim F Ernst, 2013).
Di seguito la descrizione di alcune specie di Candida:
- Candida tropicalis: Candida tropicalis è una delle principali cause della setticemia e
candidosi disseminata, soprattutto nei pazienti con linfoma, leucemia e diabete. È il
secondo agente patogeno più frequente medico, accanto a C. albicans, e si trova
anche come parte della normale flora mucocutanee umana. Isolati di C. tropicalis
sono stati anche trovati in casi di candidosi disseminata. Isolamenti ambientali sono
state fatti dalle feci, dai gamberi, dal kefir e dal suolo (Kreger-Van Rij, N.J.W. (ed)
1984).
- Candida utilis: Candida utilis è stato l’organismo studiato per la realizzazione di
gasolio (miscela di benzina ed alcool) e conversione di contaminazione organica
(fuoriuscite, ecc). Tuttavia, questo uso è risultato impraticabile. Attualmente, il
processo utilizzato per la coltivazione di Candida in questo modo fornisce
principalmente l'industria alimentare con sostanze non petrolifere come i substrati
(E.J. Woltering, 1994).
- Candida pseudointermedia: Candida pseudointermedia è una specie isolata dal
Kamaboko, che è un pasta tradizionale prodotta in Giappone (Nakase T, 1976).
- Candida stellata: Candida stellata è un membro delle uve e ha una fermentazione
naturale. Si trova tipicamente in numero elevato più vicino all'inizio della
fermentazione e quando la fermentazione procede. Tuttavia C. stellata presenta
molto più tardi il processo di fermentazione di altri lieviti selvatici o nativi che hanno
6
dimostrato di fermentare completamente nel vino. C. stellata può apparire come un
“bianco formaggio” simile a una feccia sulle superfici del vino, ma il loro effetto è solo
uno degli aspetti esteriori in quanto non sembra creare notevoli problemi sensoriali o
di stabilità (Yarrow e Meyer, 1978).
-Candida albicans: Candida albicans (talvolta indicato come Monilia) è un fungo che è
normalmente presente sulla pelle e nelle mucose della vagina, della bocca o del retto.
Il fungo può anche viaggiare attraverso il flusso sanguigno e influenzare la gola,
l'intestino e le valvole cardiache. C. albicans diventa un agente infettivo quando si
verifica qualche cambiamento nell'ambiente, cosa che le permette di crescere fuori
controllo. La maggior parte delle volte, le infezioni da Candida della bocca, pelle, o
vagina si verificano per nessun motivo apparente (Ryan KJ, 2004).
Per infezione intendiamo genericamente la penetrazione e la moltiplicazione di
microrganismi, inclusi virus (entità), batteri, funghi e vermi, nell’organismo. È la
premessa per lo sviluppo di una malattia asintomatica o sintomatica (latenza) con
vari gradi di intensità. L’infezione fungina è considerata fra le più importanti cause
per le malattie dell’uomo: oltre 1 milione di persone sono infettate dai funghi ogni
anno (Hsu, 2011; Di Santo, 2010).
Le infezioni fungine del genere Candida sono causate per lo più dalle specie C.
albicans e C. tropicalis. Studi recenti hanno messo in evidenza anche C. dubliniensis
come causa di infezioni in soggetti, inducendo immunodepressione. In alcuni casi, è
possibile riscontrare la presenza di organismi fungini nel circolo sanguigno.
Studi epidemiologici hanno rivelato che il genere Candida è il più diffuso fungo
patogeno dell’organismo umano. La Candida si presenta spesso nelle affezioni
vaginali e uretrali, nel cavo orale (mughetto), sulla pelle: è un microrganismo
commensale del tratto intestinale, dove colonizza dalla nascita e permane durante la
vita dell’individuo. Il fungo è in grado di penetrare elettivamente la mucosa e la pelle
e, siccome tutte le mucose dell’organismo sono collegate fra di loro dalla rete MALT
(Mucosal Associated Lymphoid Tissue), può interagire strettamente con il sistema
immunitario. In circostanze di abbassamento delle difese immunitarie, le candide
possono determinare numerose patologie, come patologie digestive, dermatiti,
sindrome premestruale, malattie autoimmuni, diabete, impotenza, depressione,
insonnia e anche il cancro. Inoltre, a causa della vastissima sintomatologia associata,
la diagnosi dell’infezione da Candida spesso è molto difficile (Luca Fortuna, 2008).
7
1.2 TTO ( Tea Tree Oil)
Fig. 1.2 Alberi di Tea Tree Oil
(dal sito www.nailsmag.com)
L’o. e. di TTO deriva dall’albero del tè, Melaleuca alternifolia, che fa parte della famiglia
delle Myrtaceae (Fig. 1.2). I fitocomponenti caratterizzanti di TTO sono monoterpeni e
alcoli-monoterpenici. Il TTO è uno straordinario o. e. con efficacissime proprietà
antisettiche. L’essenza viene prodotta per distillazione dalle foglie dell’albero. La
Melaleuca è una pianta origina dell’Australia: si tratta di un piccolo albero con foglie
aghiformi e fiori di colore giallo o giallo rossastro. Il suo olio essenziale di solito è
incolore o giallino. Questa pianta è conosciuta anche dalle popolazioni aborigene che la
utilizzavano per la fabbricazione di piccole canoe o di utensili, perché la sua corteccia è
resistente all’acqua. Le foglie pungenti di tea tree venivano messe a macerare in acqua
per preparare un rimedio contro tosse, mal di testa, ferite e lesioni della pelle ( Fortuna,
2008).
Il TTO è uno dei migliori antivirali, antibatterici, antimicotici e antiparassitari noti. Il
suo punto di forza è rappresentato dalla capacità di contrastare in modo eccellente i
microbi e di essere al contempo abbastanza delicato con le strutture organiche. Si
tratta di uno degli olii essenziali più studiati ed i primi studi risalgono alla fine
dell’Ottocento: Belaiche ne parlò nel 1895 come rimedio contro la Candida (Fortuna
2008). L’o. e. di TTO è ancora a tutt’oggi ampiamente studiato e, grazie al suo ampio
spettro di azione, è emersa la sua utilità nel trattamento delle infezioni di vari
microorganismi come Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus spp.,
Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, etc. Essendo un o.ve. ad elevata attività
e presente comunemente sul mercato può facilmente essere usato come riferimento
per lo studio di altri o. e. (Carson et al., 2006).
1.3 Monarda sp.
La monarda (Monarda spp.) è una pianta erbacea di origine nordamericana che
annovera dodici specie. È originaria del Nord America e gli indiani Oswego la
utilizzavano per trattare raffreddori e disturbi bronchiali. Ancora oggi, negli Stati Uniti,
viene usata come bevanda rinfrescante. Nel 1773, in seguito al Boston TEA Party, la
8
Monarda fu introdotta anche tra i coloni del Nord America, dove divenne molto
popolare come sostituta del tè indiano (Mcvicar, 1986).
Le foglie di Monarda hanno un sapore intenso, i fiori hanno invece gusto più dolce e
delicato. Nella medicina popolare sono usati decotti di foglie per inalazioni allo scopo
di trattare le affezioni bronchiali. L’o. e. è usato in aromaterapia per trattare la
depressione e combattere le infezioni e in profumeria viene impiegato come
fragranza naturale.
Di seguito sono descritte in particolare due specie M. fistulosa e M. didyma.
Monarda fistulosa
Fig. 1.3-1 Monarda
fistulosa (Giardino
delle Erbe di Casola
Valsenio) (Ravenna)
M. fistulosa (Fig. 1.3-1) è originaria delle zone
collinari aride e delle foreste nordamericane. Cresce su un suolo sassoso. M. fistulosa
è una bella pianta, da bordura, è una perenne ispida con foglie lanceolate,
grigio-verdi, che si restringono gradualmente all’apice. Dall’estate all’autunno,
compaiono verticilli con fiori lilla-rosa con brattee sfumate di rosa. La sua altezza è
circa 1.2 mt, mentre la larghezza è di 45 cm (Bown, 1999).
Fig. 1.3-2 M. didyma: fioritura (Giardino
delle Erbe da Casola Valsenio)
Monarda didyma
M. didyma (Fig. 1.3-2), diffusa nei boschi umidi e ricchi, è una specie perenne
aromatica con fusto eretto quadrangolare e foglie ovate o dentate. In estate e in
autunno compaiono verticilli terminali rosso vivo con brattee di colore
verde-rossastro. La sua altezza è di circa 40 cm - 1.2 mt, mentre la larghezza è 30-60
cm (Bown, 1999).
9
II. Materiali e metodi
2.1 Coltivazione della piante di Monarda
Sono state coltivate le due specie M. fistulosa e M. didyma al fine di ottenere i
rispettivi o. e. Entrambe le specie sono state inizialmente seminate in serra per
controllare e velocizzare il processo di crescita ricreando le condizioni ottimali per lo
sviluppo (controllo di temperatura, umidità e luminosità, etc.), per aumentare la
percentuale di germinabilità e per evitare la contaminazioni da virus e funghi.
Successivamente, sono state trapiantate singolarmente in vasetti: parte di esse sono
poi state messe a dimora nei campetti sperimentali, nei quali hanno un ciclo
vegetativo di almeno 2 anni (nel 1° anno generalmente non si ha fioritura, nel 2°
anno le piante vanno in fioritura). Parte delle piantine sono state coltivate a Imola
(Bologna) e parte a Casola Valsenio in modo da effettuare correlazioni fra diversi
ambienti di coltivazione delle piante, in quanto l’habitat può influire sulla resa in olio
e sulla sua composizione. Di seguito viene descritta l’impostazione e la distribuzione
delle diverse coltivazioni.
Presso l’ITA (Istituto Ghini-Scarabelli di Imola) sono stati allestiti 4 campetti:
-
Monarda fistulosa con concime (compost: vedi composizione indicata nel sacco)
-
Monarda fistulosa senza concime
-
Monarda didyma con concime
-
Monarda didyma senza concime
Presso il “Giardino delle Erbe” di Casola Valsenio (Ravenna), non sono stati allestiti
campetti con concime, quindi i campetti allestiti sono stati due:
- Monarda fistulosa senza concime
- Monarda didyma senza concime
A fine ottobre le piante di M. fistulosa e M. didyma sono state raccolte, poste in
sacchetti etichettati e pesati; il materiale (costituito da soli fusti e foglie,
opportunamente selezionato al fine di evitare la presenza di malattie infettive) è
stato quindi sottoposto a distillazione il giorno seguente la raccolta.
2.2 Distillazione di Monarda per ottenimento dell’olio essenziale
Dopo di avere raccolto le piante da tutti i sei campetti in sei sacchetti etichettati
diversi, pesiamo ogni sacco e lo segniamo. Per la distillazione di monarda serve tutta
la pianta vegetale integra, cioè non è necessario lavorare la pianta (spezzettandola o
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tagliandola) e le quantità (acqua e piante) variano a seconda dalla portata del
serbatoio.
La distillazione in corrente di vapore utilizza l’acqua bollente per far uscire l’olio dalle
piante. Il vapore dell’acqua che si produce passa attraverso le piante che inizieranno
a rilasciare l’olio essenziale. Il vapore sviluppato entra nei tubi del condensatore del
distillatore che sono raffreddati dall’acqua che passa all'esterno. In questo modo il
vapore ricco di olio essenziale torna allo stato liquido. La miscela di acqua e olio, per
autoseparazione, si dispone con l'olio sopra e la cosiddetta acqua cobata (acqua con
tracce di olio) sotto, all’interno del separatore (Fig. 2.2). Quest’ultima viene eliminata,
mentre l’olio essenziale viene trasferito in contenitori di vetro scuro perché deve
essere al riparo dalla luce. Ogni contenitore viene etichettato con nome dell'olio,
data e contenuto in ml. La raccolta dell'olio va fatta con molta cura per evitare di
raccogliere anche acqua cobata. Quando la quantità di olio distillato è minima è facile
prelevare, anche per errore, una quantità di acqua.
Fig. 2.2 Olio essenziale di
Monarda fistulosa raccolto
nell’ultima fase di distillazione
svolta presso il Giardino dell’Erbe
di Casola Valsenio.
La distillazione degli olii essenziali è un processo fondamentale, che va fatto con cura
per garantire la qualità del prodotto finale.
2.3 Microrganismi utilizzati
Le “candide” testate per lo studio dell’attività antimicrobica sono Candida tropicalis
CBS 94, Candida utilis CBS 621, Candida pseudointermedia CBS 6918, Candida stellata
CBS 943. Inoltre, abbiamo considerato anche Candida albicans come un modello per
valutare l’attività inibente della virulenza di “candida”.
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2.4 Condizioni di coltura di Candida sp.
Terreno utilizzato per la crescita di Candida sp. per prove di attività antimicrobiche:
SABOURAUD per un litro di acqua purificata
5,0 g di Digerito pancreatico di caseina
5,0 g di Digerito peptico di tessuto animale
40,0 g di Glucosio
15,0 g di Agar (aggiunto per solidificare il terreno in piastre petri e becchi di clarino)
I ceppi sono stati conservati in becchi di clarino contenente Sabouraud agarizzato (2%
di agar) in frigo a 4 °C. Quando necessario, periodicamente, si è provveduto a
prelevare le colonie, mediante ansa sterile ed inocularle in beuta contenente
Sabouraud per poi lasciarle crescere in agitazione a 30° C overnight.
Il terreno utilizzato per la crescita di Candida sp. per prove di espressione genica è
Yeast-Phytone-Glucose (YPG) +0.5% Tween, che ottiene:
20,0 g/L di Glucosio
10,0 g/L di Peptone 212367
5,0 g/L di estratto di lievito
0,5% (0,5ml/100ml) di Tween
2.5 Saggio dell’attività antimicrobica secondo MIC (Minimum Inhibitory
Concentration)
L'analisi della MIC, cioè la più bassa concentrazione d'olio essenziale che inibisce la
crescita del batterio, è stata allestita in micropiastre da 96 pozzetti.
MIC: metodo 1
Sono state saggiate le diluizioni di olio essenziale in substrato 10-1, 10-2, 10-3,10-4 e
10-5. I pozzetti sono caricati con 160μl di substrato, 20μl di diluizione dell'olio e 20μl
di inoculo per ogni diluizione dell'olio e allestiti per ogni diluizione i rispettivi bianchi
non inoculati. È stato utilizzato un controllo negativo con solo il microrganismo
inoculato (180μl di substrato e 20μl di inoculo) e un bianco con solo substrato (200μl
di substrato). Ogni analisi è stata effettuata in triplicato e la piastra incubata a 30 °C
in aerobiosi. La lettura della crescita microbica veniva condotta a 24 e 48 ore
mediante spettrofotometro a 620nm.
12
MIC: metodo 2, secondo le linee guida "Clinical and Laboratory
Standards Institute" CLSI (2012)
Le diluzioni degli o. e. saggiati sono state eseguite seguendo CLSI (2012) utilizzando il
Tween 80 come tensioattivo per emulsionare le diluizioni dell'olio.
Una “soluzione madre” di Tween 80 al 10% viene utilizzata per preparare il “Diluente
1” (Tween 80 allo 0,02%, 200ul della soluzione madre + 100 ml H2O) e il “Diluente 2”
(Tween 80 allo 0,012%, 120ul della soluzione madre + 100ml H2O)
Gli o.e. sono stati diluiti seguendo lo schema sottostante:
A. Le diluzioni degli olii essenziali si preparano nel modo seguente:
① 160 μl olio + 240 μl Dil A = 40%
⑤ 100 μl ④+ 100 μl Dil B = 2.5%
② 100 μl ① + 100 μl Dil B = 20%
⑥ 50 μl ④ + 150 μl Dil B = 1.25%
③ 50 μl ① + 150 μl Dil B = 10%
⑦ 50 μl ④ + 350 μl Dil B = 0.6%
④ 50 μl ①+ 350 μl Dil B = 5%
⑧ 100 μl ⑦ + 100 μl Dil B = 0.3%
⑨ 50 μl ⑦+ 150 μl Dil B = 0.15%
⑩ 50 μl ⑦ + 350 μl Dil B = 0.0078%
Esempio di allestimento di una piastra da 96 pozzetti per la determinazione MIC.
La piastra da 96 pozzetti ( Tabella 2.5)
Ogni pozzetto contiene 50 µl di diluzione dell’olio (4% 2% 1% 0.5% 0.25% 0.l25%
0.06% 0.03% 0.0150% e 0.0078%) come riportato nello schema e 50 µl di inoculo.
Il controllo positivo rappresenta la massima crescita batterica ed è costituto da 50 µl
di inoculo e 50 µl di Sabouraud; il bianco è rappresentato da 100 µl di solo terreno.
Le piastre sono state incubate a 30 °C, e le letture sono state registrate lo stesso
giorno dell’allestimento, dopo 24 ore e dopo 48 ore mediante spettrofotometro a
620 nm.
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B. Preparazione dell’inoculo
10 mL di coltura di C. albicans sono stati centrifugati a 6000 rpm per 10 minuti. Il
pellet è stato risospeso mediante l’uso del vortex, in 10 ml di Sabouraud fresco.
200 µl della sospensione sono stati addizionati a 10 mL di terreno fresco; la lettura
spettrofotometrica a 600 nm deve essere un valore di densità ottica compreso tra
0,08 e 0,13 (CLSI, 2012).
2.6 Determinazione attività battericida degli o. e. MBC (Minimal
bactericidal concentration)
La MBC permette di individuare la concentrazione di olio ad attività battericida. La
MBC viene condotta mediante il saggio delle microgocce. Dopo 24 ore di incubazione
nella piastra vengono individuati i pozzetti dove non si ha più crescita microbica. Dieci
microlitri vengono prelevati dai pozzetti dove non si osserva più la crescita microbica
e dai due pozzetti vicini, con concentrazione di olio più elevata, vengono piastrate in
piastre petri contenenti Sabouroud agarizzato. Le piastre sono divise in quattro
sezioni, in ognuna delle quali sono depositate tre microgocce di 10 microlitri, ognuna
derivante da un pozzetto (Fig. 2.6).
Fig. 2.6 Piatra agarizzata del saggio delle Microgocce
Dopo l’incubazione per 24 ore a 30 °C viene individuata la concentrazione di olio che
non permette la crescita: questa concentrazione corrisponde alla MBC.
2.7 Estrazione RNA batterico
L'estrazione dell’RNA batterico è stata effettuata seguendo il kit Promega SV Total
RNA Isolation System (Promega, Madison, Wi, USA) usando il solo format di
centrifugazione (spin) a 16.000 rpm.
Per prima cosa si è isolato l'RNA attraverso diversi passaggi di centrifugazione nei
quali si sono aggiunti di volta in volta:
-
100μl di TE conting lysozyme (che provoca la rottura della parete cellulare)
75μl di RNA Lysis Buffer (RLA)
350μl di RNA Dilution Buffer
14
L'RNA è stato poi purificato, sempre mediante cicli di centrifugazione (spin),
aggiungendo però 200 μl di etanolo 95% per l’eliminazione del lisato.
Si è poi proceduto con la preparazione della DNase incubation mix che richiede una
combinazione di 40μl di Yellow Core Buffer, 5μl di MnCl2 0.09M e 5μl di DNase
lenzyme; si sono inseriti 50μl di questa preparazione direttamente sulle membrane
nello Spin Basket ed incubato per 15 minuti a 20-25 °C.
Terminato il periodo di attesa, sono stati aggiunti allo Spin Basket 200μl di DNase
Stop Solution e 600μl di RNA Wash Solution; dopo la centrifugazione a 12,000-14,000
x g di un minuto, si sono aggiunti altri 250μl di Wash Solution.
Si è proseguito trasferendo lo Spin Basket dal Collection Tube all'Elution Tube, nella
cui membrana si sono aggiunti 100μl di Nuclease-Free Water. Infine, è stata eseguita
un'ultima centrifugazione al termine della quale si è rimosso lo Sipn Basket e
conservato l'Elution Tube, che conteneva l'RNA purificato, a -80°C.
2.8 Quantificazione RNA batterico
Per determinare la purezza e la resa dell’RNA precedentemente è stato utilizzato lo
spettrofotometro a 260nm (ThermoFisher Scientific, Bremen, Germany): solo l’RNA
totale, isolato dai campioni che mostravano un rapporto di purezza λ260/λ280
compreso fra 1.8 e 2, è stato utilizzato per le successive analisi. Per la quantificazione
dell'RNA è stata usata la formula
Ci·Vi = Cf·Vf
Dove
Ci rappresenta la concentrazione iniziale letta allo spettrofotometro
Vi è l’incognita
Cf rappresenta la concentrazione finale, pari a 2
Vf è il volume finale, pari a 50 μl
Per la lettura si sono aliquotati 4μl di ogni campione in una cuvette con 996 μl
d'acqua, utilizzando i valori di Ci, già calcolati in base alla diluizione.
2.9 Retrotrascrizione RNA
La retrotrascrizione dell’RNA a cDNA (DNA complementare) è caratterizzata da due
fasi di reazione: (I) l’aggiunta di oligonucleotidi (sequenze ripetute che servono da
innesco per la polimerasi inversa) allo stampo di RNA e (II) la retro-trascrizione a
15
cDNA. Il cDNA è materiale genetico che ci permette di leggere il trascritto, perché
stabile da analizzare e tale da conservare al contrario le informazioni dello "stampo"
in RNA. Per la retrotrascrizione l’RNA è stato retro-trascritto a cDNA usando l’enzima
della trascrittasi inversa del virus “Moloney murine leukemia” (M-MLV RT RNase H
minus) (Promega, Madison, Wi, USA). In seguito, 1μg di RNA totale è stato incubato
con 0.5 μg/ml di primer Oligo(dT)15 (Promega) a 70°C per 5 min e raffreddato con
ghiaccio. In una seconda fase, una master mix è stata aggiunta ai campioni,
contenente 10 mM dNTPs, 200 unità di enzima M-MLV RT, buffer RT 5X (Promega),
RNAse inibitor 20 μ/μl e acqua nuclease free fino ad un volume finale di 25 μl. Per la
reazione della trascrizione inversa, la miscela è stata quindi incubata a 40°C per 60
min, 70°C per 5 min e poi raffreddata a 4°C con un termociclatore (Biometra GmbH,
Goettingen, Germany). I prodotti ottenuti sono stati quindi conservati a -20°C fino
alle successive analisi di espressione genica con Real-Time PCR quantitativa.
2.10 Reazione quantitativa real-time PCR
L’espressione genica della Tpka fattore di virulenza target, del regolatore negativo
trascrizionale Tup1, del regolatore positivo trascrizionale Efg1 e del controllo
endogeno ACT1 e GADPH, è stata analizzata usando un apparecchio Real Time PCR
StepOne (Applied Biosystems, Foster City, Ca, USA), con chimica SYBR Green I
(Applied Biosystems). Le sequenze oligonucleotidiche dei primers dei vari geni sono
state disegnate con il software Primers Express 3.0 (Applied Biosystem) oppure
ottenute dalla letteratura scientifica (Tabella 3). Prima di procedere alle reazioni di
quantificazione, le specificità di ogni paia di primer sono state valutate con il software
di analisi delle curve di melt dell’apparecchio Real-Time StepOne (Applied
Biosystems). Per la quantificazione genica sono stati impiegati tre diversi protocolli di
reazione a seconda della temperatura di melt del prodotto di amplificazione e a
seconda della sua dimensione. In generale, il protocollo consiste in un periodo di 10
minuti a 50°C e 2 minuti a 95°C; in seguito un periodo di 15 secondi a 95°C e 19 30
secondi a 58-62°C viene ripetuto per 36-40 volte.
2.11 Costruzione curva standard per la normalizzazione controllo
Per la normalizzazione del controllo endogeno sarà costruita una curva standard in
funzione dei cicli soglia di amplificazione e del numero di copie geniche del controllo
endogeno ACT1 e GADPH. Da diluizioni seriali 1:10 di una coltura pura di C. albicans
ad assorbanza ottica di OD600 = 1 sono stati estratti i relativi contenuti di RNA. L’RNA
è stato estratto con kit commerciale Sv Total RNA Wizard (Promega) ed è stato poi
singolarmente retro trascritto a cDNA e amplificato con apparato PCR (Biometra,
Goettingen, De) con la coppia di primers RT1-TPK2 e RT2-TPK2 (Tabella 3). La master
16
mix per la reazione di PCR comprendeva MgCl2 12,5 μM, Buffer Ecotaq 5x (Fermentas,
De), 32 μM di entrambi i primers, 0,5 μ/μg di Ecotaq (Fermentas, De) e 20 μM di
dNTPs. La reazione è stata amplificata secondo il seguente programma PCR: 95°C per
5 min seguiti da 26 cicli di 95°C per 1 min, 56°C per 1 min, 72°C per 1 min e 30 sec ed
infine un ciclo di 72°C per 8 min. I prodotti ottenuti sono stati fatti correre su gel di
agarosio all’1,5% in elettroforesi con tampone TBE 1X a voltaggio costante (120 V)
per 1,5 ore. In seguito il gel è stato colorato con Bromuro di Etidio (50 μg/L) per 20
minuti e lavato in acqua deionizzata. Dopo aver posto il gel su un trans illuminatore a
UV ed aver individuato la banda dell’amplicone di TPKa, si è proceduto al taglio della
banda con scalpellino. Le bande in questo modo ottenute sono state purificate con
kit commerciale NucleoSpin PCR (Macherey-Naegel) e quindi usate per
l’amplificazione in real-time PCR.
2.12 Espressione genica del fattore di virulenza
Il cDNA ottenuto è stato impiegato nelle reazioni di Real Time PCR (Applied
Biosystems) per l’analisi del trascritto del fattore di virulenza, utilizzando i primers
descritti in Tabella 3: il prodotto trascritto è stato analizzato con StepOne real-time
RT-PCR e chimica SYBR Green I (Life Science). I primers che non mostravano prodotti
con picchi non-specifici sono stati selezionati per l’analisi dell’espressione genica. Il
calcolo dei valori di espressione per ogni gene è stato ottenuto con il metodo 2-ΔCt,
calibrato verso l’espressione di ACT1 e GADPH endogeni, controllo che risulta essere
costantemente espresso in ogni condizione. Il ciclo soglia di amplificazione (“cycle
threshold”) viene abbreviato come Ct e il calcolo del ΔCt viene effettuato come segue:
Ct (+RT) - Ct (-RT) = cCt (CT corretto). ΔCt = cCt (gene d’interesse) - cCt (gene
endogeno di controllo). Per l’analisi dell’espressione genica in Real Time PCR si è
preparata una piastra da 48 pozzetti divisa in 2: nella prima metà si è usata una
mastermix con un gene endogeno house keeping (HK) e nella seconda con il fattore
di virulenza TPK2.
17
Tabella 2.12 Elenco dei geni utilizzati e relativi primers.
Tpk2p media la formazione ifale in brodo liquido e permette l’invasione in agar
Act 1 è il gene endogeno che codifica per l’actina
GADPH è un altro gene endogeno che codifica per la gliceraldeide 3 fosfato deidrogenasi
Tpk2p media la formazione ifale in brodo liquido e permette l’invasione in agar. E’ il fattore di virulenza
che vogliamo saggiare
EFG1 è il regolatore trascrizionale positivo della via metabolica che porta alla formazione della PKA che
media la formazione ifale.
Tup1 è il regolatore trascrizionale negative che blocca la trascrizione della via metabolica che porta
alla PKA.
Si può quindi ipotizzare che il Tea Tree Oil riesca a ridurre l’espressione genica di tPKA
e quella di EFG1, aumentanto, al contrario, l’espressione di Tup1.
18
III. Risultati e analisi
3.1. Resa della distillazione dell’olio di Monarda
I rapporti fra la quantità di pianta distillata e o. e., cioè le rese, ottenute dalle
coltivazioni allestite presso l’Istituto Ghini-Scarabelli (Imola) e Il Giardino delle Erbe
(Casola Valsenio) sono descritti nella Tabella 3.1-1.
Tabella 3.1-1 Descrizione delle tipologie di coltivazioni di Monarda, quantità di pianta
raccolta e distillata, e rese in o. e.
Monarda
Ghini-Scarabelli
M.fistulosa
Quantità
distillata
Resa
Resa in olio per
Kg di pianta
% di resa in
olio essenziale
11,7 kg
43 ml
3,68 ml
0,368%
6,9 kg
18 ml
2,61 ml
0,261%
9,78 kg
22 ml
2,25 ml
0,225%
8,12 kg
17 ml
2,09 ml
0,209%
Quantità
distillata
Resa
Resa in olio per
Kg di pianta
% di resa in
senza concime
M.didyma
senza concime
M.fistulosa
con concime
M.didyma
con concime
Monarda
Casola Valsenio
olio essenziale
senza concime
M. fistulosa
3.58 kg
10.5 ml
2.93 ml
0.293%
M. didyma
6.14 kg
10 ml
1.63 ml
0.163%
In particolare, per M. fistulosa la maggiore resa si è avuta nei lotti “senza concime” e
coltivati a Imola (0,368 %) rispetto a Casola Valsenio (0,293 %). La minor resa si è
avuta nei lotti “con concime” presso l’ITA Ghini-Scarabelli di Imola (0,225 %).
Per quanto riguarda M. didyma: la maggiore resa si è avuta sempre nei lotti “senza
concime” e coltivati ad Imola (0,261 %), una resa minore nei lotti “con concime”
sempre presso l’ITA Ghini-Scarabelli di Imola (0,209 %), mentre la resa minore si è
avuta a Casola Valsenio (0,163 %).
19
Tabella 3.1-2 Confronto fra le rese in o. e. di Monarda fra i diversi tipi di coltivazione.
Monarda sp.
Monarda Ghini-Scarabelli
Con Concime
M. fistulosa
M. didyma
Monarda Ghini-Scarabelli
Senza Concime
M. fistulosa
M. didyma
Monarda Casola Valsenio
Senza Concime
M. fistulosa
M. didyma
Resa in olio per Kg di
pianta
% di resa in
olio essenziale
2,25 ml
2,09 ml
0,225%
0,209%
3,68 ml
2,61 ml
0,368 %
0,261 %
2,93 ml
1,63 ml
0,293 %
0,163 %
La maggiore resa di olio calcolata per Kg di pianta distillata si è avuta per M. fistulosa
rispetto a M. didyma in tutte le tipologie di coltivazione.
Riassumendo, la resa migliore è stata ottenuta sia per M. fistulosa sia per M. didyma
nei lotti “senza concime” presso l’ITA Ghini-Scarabelli di Imola.
3.2 Saggio di attività antimicrobica dell’olio di Monarda e TTO verso
Candida sp.
Nel presente lavoro sono stati saggiati gli o. e. di Monarda: M. fistulosa e M. didyma
ottenuti da coltivazioni presso l’ITA Ghini-Scarabelli allestite nel 2012. Lo scopo della
ricerca è stato quello di verificare se questi due olii essenziali di Monarda possiedano
attività antimicrobica verso le seguenti specie di candida: Candida tropicalis, Candida
utilis, Candida pseudointermedia e Candida stellata. Come riferimento di o. e. ad
elevata attività antimicrobica verso le candide è stato saggiato il Tea Tree Oil (TTO).
La MIC è stata ottenuta seguendo il protocollo MIC (metodo 1) e MIC (metodo 2,
CSLI).
MIC (metodo 1)
Sono state utilizzate C. tropicalis e C. utilis. Le Figs. 3.2-1, 3.2-2, 3.2-3 mostrano che
sia l'olio essenziale di M. fistulosa, sia quello di M. didyma, sia quello di TTO hanno la
MIC alla concentrazione -1 (1: 10). Il TTO sembrerebbe meno efficace degli altri olii.
Questo dato però potrebbe essere dovuto alla scarsa emulsione delle diluizioni
dell'olio, soprattutto TTO, poiché in questa metodica le diluizioni vengono allestite
senza agenti tensioattivi che hanno capacità performanti nell'emulsione degli olii con
acqua.
20
Figura 3.2-1. MIC di TTO verso Candida tropicalis e Candida utilis. C+, controllo.
Figura 3.2-2. MIC di M. fistulosa verso Candida tropicalis e Candida utilis, C+,
controllo.
Figura 3.2-3. MIC di M. didyma verso Candida tropicalis e Candida utilis, C+, controllo.
21
MIC (metodo 2, CLSI)
Attività antimicrobica di Monarda fistulosa e M. didyma verso C. tropicalis e C. utilis
In questa MIC sono stati testati gli olii essenziali di M. fistulosa e M. didyma su due
candide: C. tropicalis e C. utilis.
La tabella 3.2.1 mostra la lettura dell’assorbanza al T0 (Tempo 0) e T24 (dopo 24 ore
di incubazione).
Tabella 3.2.1 Letture di densità ottica (DO) della piastra da 96 pozzetti della prova del
6/11/2013: M. fistulosa e M. didyma verso C. tropicalis e C. utilis a T0 e T24.
T0
T24
*C+:controllo negativo; B: bianco
Confrontando le letture delle due piastre si osserva che a T24 i valori delle colonne di
bianco (B) sono quasi uguali, questo vuole dire che la piastra ha mantenuto la
condizione di sterilità; il bianco viene utilizzato anche come "rumore", cioè come
fondo da sottrarre a tutti gli altri valori ottenuti. Nella colonna a sinistra del bianco si
trova il controllo negativo dove le letture dovrebbero avere ed hanno il valore più
alto non essendoci l'agente inibente (o. e.).
Nelle colonne successive sempre verso sinistra sono presenti concentrazioni crescenti
di o. e. dallo 0.0078 al 4%. I valori di DO infatti sono decrescenti fino alla
concentrazione 4%.
22
La MIC di M. fistulosa è 0.06% sia per C. tropicalis, sia per C. utilis. La MIC di M.
didyma è 0.125% sia per C. tropicalis, sia per C. utilis. M. fistulosa sembra quindi
essere più attiva.
I risultati del test MBC sono descritti in tabella 3.2.2.
Tabella 3.2.2 Valori di MBC di C. tropicalis e C. utilis in presenza di M. didyma e M.
fitulosa.
Concentrazioni
0.06%
0.03%
0.015%
MBC
M. fistulosa
C. tropicalis
No crescita
crescita
Crescita
0.06%
C. utilis
No crescita
crescita
Crescita
0.06%
Concentrazioni
0.125%
0.06%
0.03%
MBC
M. didyma
C. tropicalis
No crescita
crescita
Crescita
0.125%
C. utilis
No crescita
crescita
Crescita
0.125%
Nelle Figure 3.2-4 e 3.2-5 sono mostrati esempi di piastre ottenute con inoculo di
micro gocce per il test MBC.
Fig. 3.2-4 Microgocce di Candida
utilis sulla piastra agarizzata (foto
scattata nel laboratorio di
microbiologia del DipSA )
Fig. 3.2-5 Microgocce Candida tropicalis
sulla piastra arganizzata (foto scattata
nel laboratorio di microbiologia del
DipSA )
23
Attività antimicrobica di Monarda fistulosa e M. didyma verso C. pseudointermedia
e C. stellata
Con questa MIC sono stati testati gli olii essenziali di M. fistulosa e M. didyma verso C.
pseudointermedia e C. stellata.
La tabella 3.2.3 mostra la lettura dell’assorbanza della micropiastra a T0 e T24.
Tabella 3.2.3 Letture di DO della prova del 21/11/2013: M. fistulosa e M. didyma
verso C. pseudointermedia e C. stellata a T0 e T24.
La MIC sia di M. fistulosa sia di M. didyma è 1%, sia per C. pseudointermedia e sia per
C. stellata.
I risultati del test MIC sono descritti in Tabella 3.2.4:
Concentrazioni M. fistulosa
1%
C. pseudo
intermedia
C. stellata
0.25%
MBC
No crescita
Crescita
Crescita
1%
No crescita
Crescita
M. didyma
Crescita
1%
0.%%
0.25%
MBC
Crescita
Crescita
Crescita
Crescita
1%
1%
Concentrazioni
1%
C. pseudointermedia
C. stellata
0.50%
No crescita
No crescita
24
Grafici derivanti dall’elaborazione dei dati descritti nelle Tabelle 3.2.1 e 3.2.3 che
riassumono i valori medi e la SD della crescita microbica: (Fig. 3.2-6 e Fig. 3.2-7)
Fig. 3.2-6: M. fistulosa e M. didyma verso C. tropicalis, C. utilis, C. pseudointermedia e
C. stellata.
1) Attività antimicrobica dell’o.e. di M. fistulosa verso Candida sp.
2) Attività antimicrobica dell’o.e. di M. didyma verso Candida sp.
25
Attività antimicrobica di TTO verso C. tropicalis, C. utilis, C. pseudointermedia e C.
stellata.
Tabella 3.2-7 TTO verso C. tropicalis, C. utilis, C. pseudointermedia e C. stellata.
Il TTO mostra un'elevata attività antimicrobica verso tutte le candide saggiate (Fig.
3.2-7): la MIC è 0.5% verso C. tropicalis, C. pseudointermedia e C. stellata, mentre è
0.25% verso C. utilis. È possibile pertanto osservare un comportamento antimicrobico
analogo verso tutte le “candide”.
Utilizzando il TTO come riferimento di elevata attività antimicrobica, possiamo
osservare che anche gli olii essenziali di M. fistulosa e M. didyma possono essere
considerati ad elevata attività antimicrobica ma con una differenziazione di attività
verso le diverse specie di Candida: infatti, ambedue gli olii hanno MIC dell'1% verso C.
pseudointermedia e C. stellata. mentre M. fistulosa ha una MIC di 0.06% verso C.
tropicalis e C. utilis e M. didyma ha una MIC di 0.125% sempre verso C. tropicalis e C.
utilis.
3.3 Valutazione di una potenziale attività inibente di Tea Tree Oil verso
la virulenza di Candida albicans
Tramite questa prova si può verificare se il TTO possiede una potenziale attività
inibente nei confronti della virulenza di Candida albicans mediata dall’inibizione della
regolazione dell’espressione genica del gene target Tpk2.
Il TTO è stato utilizzato come potenziale agente inibitore della virulenza di C. albicans.
E’ noto che C. albicans è virulenta se coltivata a 30 °C mentre esprime virulenza
26
quando coltivata a 37 °C. Sono pertanto state utilizzate colture di Candida cresciute a
37 °C.
La quantificazione relativa (RQ) dell’espressione del gene TPK2 è stata confrontata a
quella di due geni housekeeping endogeni Act 1 e GADPH. L’espressione del gene
target TPK2 è ridotta circa dell’80% sia dopo tre che dopo sei ore di esposizione al
TTO in tutte le quattro concentrazioni saggiate, (Fig. 3.3-1).
Il TTO sembra inibire la virulenza in Candida albicans anche alle concentrazioni più
basse testate.
Fig. 3.3-1 RQ (Quantità Relativa) del cDNA di gene target TPK2.
RQ di TPK2
TTO 2%
TTO 0.25%
TTO 0.125%
TTO0.06%
Non trattato
3 ore
0.03429245
0.07935325
0.096124525
0.118657315
1
6 ore
0.015292795
0.093945585
0.063612453
0.06761501
1
3.4 Analisi dei regolatori trascrizionali EFG1 e Lup1
Sono stati analizzati anche i geni regolatori trascrizionali che promuovono o bloccano
una cascata di reazioni che attiva l’espressione genica di gene target. Sono stati
considerati 2 regolatori con attività opposta: EFG1, il regolatore trascrizionale
positivo che favorisce l’espressione di Tpk2 (gene di virulenza); Tup1, il regolatore
trascrizionale negativo, che agisce inibisce l’espressione del gene di virulenza.
27
La RQ (relative quantification) del regolatore trascrizionale positivo EFG1 (Fig 3.4-1) è
simile a quella del TPK2, infatti esso è un fattore che favorisce la virulenza;
l’espressione genica di EFG1 risulta fortemente inibita, con valori di inibizione del
98% rispetto al controllo. Non si osservano differenze fra i tempi di esposizione di 3 e
6 ore.
Figura 3.4-1 Regolazione dell’espressione di EFG1 dopo 3 e 6 ore.
RQ di EFG1
TTO 2%
TTO 0.125%
Non trattato
3 ore
0.02973378
0.066124549
1
6 ore
0.03223928
0.060221454
1
La RQ (relative quantification) del regolatore trascrizionale negativo Tup1 (Fig 3.4-2)
nelle stesse condizioni è sovra espresso, con valori di sovra espressione crescenti
rispetto ai tempi di esposizione di 3 e 6 ore.
Fig 3.4-2 RQ (Quantità Relativa) del cDNA del regolatore trascrizionale negativo Tup1.
RQ di Tup1
TTO 2%
TTO 0.125%
Non trattato
3 ore
6.124416726
3.9369023
1
6 ore
8.117356147
5.368779023
1
28
L'espressione genica del gene di virulenza Tpka è stata valutata analizzando l'attività del TTO
sulla modulazione dell'espressione genica del gene di virulenza Tpka che induce la
formazione ifale e contribuisce alla virulenza di C. albicans. Sono state inoltre valutate le
espressioni geniche di EFG1 e di Tup1, che sono rispettivamente il regolatore trascrizionale
positivo e il regolatore trascrizionale negativo della via metabolica, che porta alla formazione
della PKA (Protein Kinase), la quale regola la crescita filamentosa.
IV. Conclusioni
Lo studio dell’attività antimicrobica dell’olio essenziale di Monarda fistulosa e M. didyma ha
mostrato che gli o. e. di Monarda hanno un effetto elevato nell’inibire la crescita di Candida
sp.
Confrontando l’attività antimicrobica di TTO, considerato fra gli olii maggiormente attivi
come antimicrobici, si osserva che gli olii di Monarda sono talvolta più attivi del TTO. Mentre
il TTO ha MIC dello 0.5% verso tutte le candide saggiate, per quanto riguarda M. fistulosa e M.
didyma si nota un effetto antimicrobico specifico per le specie di Candida saggiate. Pertanto,
i risultati ottenuti sono senza dubbio promettenti per un’eventuale applicazione degli olii
essenziali di Monarda.
L'efficacia dimostrata dal TTO nel diminuire la virulenza di C. albicans mediante lo studio di
espressione genica di un gene di virulenza e dei suoi regolatori ha dato anch’esso risultati
molto interessanti.
Le infezioni fungine sono malattie molto diffuse attualmente. Ogni anno milioni di persone
soffrono di infezioni causate da diverse candide, soprattutto le donne. I nostri studi hanno
quindi portato a individuare due approcci dell’utilizzo degli olii essenziali, sia come
antimicrobici sia come fattori di diminuzione della virulenza.
Questi studi potranno essere di interesse medico e farmaceutico anche se saranno
necessari ulteriori ricerche per individuare la dose di olio attiva e la sua tossicità in vivo al fine
di una eventuale applicazione in campo animale o umano
29
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http://enologyaccess.org/EA2/index.php/
http://www.mycology.adelaide.edu.au/Fungal_Descriptions/Yeasts/Candida
31
VI. Ringraziamenti
Innanzitutto vorrei ringraziare la Prof.ssa Paola Mattarelli che è stata sempre disponibile
durante e dopo il periodo del mio tirocinio. La sua professionalità ha rappresentato un ottimo
modello per lo studio nel mio futuro. Ricorderò sempre la sua gentilezza e gli suoi aiuti a me.
Dovrò ringraziare anche tutto il nostro gruppo di laboratorio, soprattutto per la Dott.ssa
Monica Modesto, la Dott.ssa Cecilia Santini e il Dott. Lorenzo Nissen. Inoltre ringrazio
particolarmente la Prof.ssa Maria Grazia Bellardi. Tutti voi mi avete insegnato molto in diversi
modi, e mi sono anche divertita tanto dal nostro “ Team Work”. Il lavoro che abbiamo fatto
insieme si considera veramente positivo.
Poi vorrei dare i miei ringraziamenti a due persone importanti per me, che sono i miei
conquillini: la Dott.ssa Marialida Di Iorio e il Dott. Giafranco Giorgi. Durante gli anni che
abitavamo insieme, mi hanno aiutato e insegnato, proprio come i miei famigliari in Italia. Siete
voi che mi hanno aperto la conoscenza per Italia.
Ringrazio tanto a tutti gli miei amici italiani, soprattutto i miei compagni di corso. Devo dire
che il corso di biotecnologie non è facile per me. Siete voi che mi tenete sempre in compagnia
durante i laboratori, le lezioni e soprattutto la preparazione degli esami. Non dimenticherò
mai i momenti belli che abbiamo passato insieme.
Vorrei ringraziare anche i miei amici cinesi che ho conosciuto in Italia, in particolarmente con
la mia madrelingua: 很荣幸能在意大利这片美丽的国土上认识你们，我打从心底珍惜这份难得的缘分。
感谢你们在我低谷的时候不计回报的支持我, 帮助我。我想把我人生中这一幸福的时刻与你们一同分享，并
希望大家一起加油，都能找到自己的幸福天地。
Alla fine darò il mio ringraziamento più importante a mia madre che mi ha sempre
incorraggiato e creduto. Grazie al suo supporto dalla Cina, sono riuscita a stare qui. Senza di
lei, non avrò questo momento bello e felice, 谢谢您！(xiè xiè)
32