LABORATORIO 2 (19 novembre 2009) - MUSE

Michela A. Denti – Corso di aggiornamento “genetica, biologia e salute” – Museo Tridentino di Scienze Naturali
Protocollo Crime Scene Investigation
Precauzioni da adottare in laboratorio:
- non mangiare o bere
- indossare sempre i guanti quando si maneggiano i tubini, i gel, le micropipette
- nel dubbio, chiedere!
Primo giorno: PCR
L’amplificazione per PCR consiste nella replicazione del DNA in provetta. La porzione di DNA
che si vuole copiare è chiamata sequenza bersaglio (“target”). Il campione di DNA reperito
sulla scena del crimine ed i campioni del DNA dei sospetti contengono la sequenza bersaglio.
La PCR si basa su tre principii di biologia molecolare.
1. Denaturazione – separazione del DNA stampo a doppio filamento in DNA a singolo
filamento.
2. Appaiamento – ibdridazione delle sequenze dei primers, complementari al DNA a singolo
filamento.
3. Estensione – sintesi del filamento di DNA da parte della DNA polimerasi.
Denaturazione. Prima che possa iniziare la sintesi di nuovo DNA, lo stampo di DNA a
doppio filamento deve essere svolto e separato in singoli filamenti.
Nelle cellule questo processo è operato da una famigli di enzimi (elicasi). Nella PCR, è
utilizzato il calore per separare (o denaturare) lo stampo di DNA a doppio filamento.
Appaiamento. Prima che una regione bersaglio di DNA possa essere amplificata, è
necessario determinare delle corte sequenze di DNA a monte (all’estremità 5’) e a valle
(all’estremità 3’) delle regioni di interesse. Queste zone sono poi utilizzate per creare corti
frammenti di DNA, chiamati “primers” (=”inneschi”) o “oligonucleotidi”, che sono
complementari alle regioni a monte e a valle delle regioni bersaglio. I primers servono da
inneschi per la sintesi del DNA da parte della DNA polimerasi e delimitano l’inizio e la fine
della sequenza di DNA amplificata.
Nella PCR, l’ibridazione dei filamenti complementari avviene quando i primer si appaiano
(legano) alle sequenze di basi complementari sul bersaglio. L’ibridazione è il processo che
descrive il legame dell’oligonucleotide al DNA bersaglio. I due filamenti si appaiano l’uno
all’altro, formando un “ibrido”. I due primers sono disegnati e sintetizzati in laboratorio con una
specifica sequenza di nucleotidi così che si appaino alle estremità opposte e sui filamenti
opposti a delimitare la regione di DNA che si vuole amplificare. Perciò la sequenza bersaglio
è determinata dalla posizione in cui si appaiano i primers.
Esercitazione di Laboratorio: analisi di mutazioni geniche mediante PCR (12 e 19 Novembre 2009)
1
Michela A. Denti – Corso di aggiornamento “genetica, biologia e salute” – Museo Tridentino di Scienze Naturali
Estensione. I primers sono necessarii perchè la DNA polimerasi richiede una catena
polinucleotidica preesistente a cui attaccare un nucleotide alla volta. Appena la polimerasi
trova e lega il primer ed il DNA bersaglio, inizia l’aggiunta di nucleotidi e sintetizza nuove
copie del DNA a doppio filamento bersaglio, aggiungendo nucleotidi all’estremità 3’ del primer
ed estendendolo. Perciò, i primers funzionano da innesco per la DNA polimerasi.
Queste 3 fasi – denaturazione, appaiamento ed estensione, costituiscono un ciclo di PCR.
Una reazione di PCR completa prevede molte ripetizioni di cicli di PCR. In questo
esperimento, le vostre reazioni saranno sottoposte a 35 cicli.
L’enzima utilizzato nella PCR (la DNA polimerasi) deve essere termostabile perchè la PCR
prevede temperature che vanno da 52°C a 94°C. La DNA polimerasi termostabile che effettua
la reazione di polimerizzazione è stata isolata da un batterio termofilo, Thermus aquaticus
(Taq), che vive nelle sorgenti calde quali quelle che si trovano nel parco nazionale di
Yellowstone.
Due filamenti sono creati dallo stampo originale dopo ogni ciclo completo. Si tratta di una
reazione a catena in cui il numero di molecole cresce esponenzialmente. Perciò dopo 35 cicli
ci saranno 235 più copie che all’inizio. Dopo 35 cicli, il DNA di interesse è stato
sufficientemente amplificato da poter essere visualizzato usando elettroforesi su gel e
colorazione del DNA. Ciò permette al ricercatore di determinare la presenza o assenza dei
prodotti di PCR desiderati.
Perchè la PCR possa avvenire sono necessarii diversi componenti: oltre al DNA stampo, gli
oligonucleotidi primers e l’enzima (DNA polimerasi TAq), è necessario uno speciale tampone
di reazione, detto master mix. La master mix contiene tutte le componenti necessarie alla
reazione, inclusi i mattoni di costruzione del DNA (nucleotidi o dNTP), un tampone speciale
per mantenere le condizioni ottimali di pH, sali e MgCl2. I sali e gli ioni magnesio (cofattori)
sono necessarii perchè la DNA polimerasi Taq funzioni al meglio.
In questo esperimento, la master mix che riceverete sarà pronta, contenente tutti gli
ingredienti elencati, i primers e la DNA polimerasi Taq.
Riceverete campioni di DNA che sono stati raccolti da una scena del crimine e da quattro
individui sospettati di essere coinvolti nel crimine.
Il vostro compito è di amplificare la regione di un locus polimorfico dai campioni di DNA. I
prodotti di PCR saranno poi analizzati mediante elettroforesi su gel per determinare i genotipi
dei campioni al locus in questione, e collegare il DNA della scena del crimine a quello di uno
dei sospettati.
Esercitazione di Laboratorio: analisi di mutazioni geniche mediante PCR (12 e 19 Novembre 2009)
2
Michela A. Denti – Corso di aggiornamento “genetica, biologia e salute” – Museo Tridentino di Scienze Naturali
Postazioni (2-3 persone per postazione)
Materiale
Master Mix + primers (MMP, liquido blu)
DNA Crime Scene e Sospetti A - D
portaprovette per tubi da 2 ml
portaprovette per tubi da PCR
tubini da PCR (0,2 ml)
Pennarello
micropipetta da 2–20 µl
puntali per micropipetta da 2–20 µl
Quantità
1
5 (un tubo ciascuno)
1
1
5
1
1
1 confezione
1. Troverete in ciascuna postazione:
- un tubo giallo marcato MMP (Master mix e primers) contenente un liquido blu
- 5 tubi marcati CS (tubo viola), A (tubo verde), B (tubo blu), C (tubo arancione), e D (tubo
rosa).
Marcate i tubini da PCR con le scritte CS, A, B, C, e D sui lati ed i numeri seguenti sui lati e
sul tappo (in base alla postazione di lavoro):
Esempi:
postazione 7: tubi da 71 a 75
postazione 12: tubi da 121 a 125
postazione 10: tubi da 101 a 105
etc.....
tubini da PCR
11 CS
12 A
13 B
14 C
15 D
DNA
Master mix + primers
(liquido blu)
20 µl DNA Crime Scene (tubo viola)
20 µl MMP (tubo giallo)
20 µl DNA Sospetto A (tubo verde)
20 µl MMP (tubo giallo)
20 µl DNA Sospetto B (tubo blu)
20 µl MMP (tubo giallo)
20 µl DNA Sospetto C (tubo arancione) 20 µl MMP (tubo giallo)
20 µl DNA Sospetto D (tubo rosa)
20 µl MMP (tubo giallo)
2. Usando la micropipetta ed i puntali, aggiungete 20 µl di DNA ad ogni tubino da PCR, come
indicato sopra. Per esempio, per il DNA della scena del crimine (Crime Scene DNA), trasferite
20 µl del DNA Crime scene (tubo viola) nel tubino da PCR 11 marcato 'CS'. Importante:
usate ogni volta un puntale nuovo, per evitare contaminazioni tra i diversi campioni.
Esercitazione di Laboratorio: analisi di mutazioni geniche mediante PCR (12 e 19 Novembre 2009)
3
Michela A. Denti – Corso di aggiornamento “genetica, biologia e salute” – Museo Tridentino di Scienze Naturali
3. Usando la micropipetta ed i puntali, aggiungete 20 µl di Master Mix + primers ad ogni
tubino da PCR, come indicato sopra. Mescolate il contenuto dei tubini pipettando su e giù,
cercando di evitare di fare bolle. Importante: usate ogni volta un puntale nuovo, per
evitare contaminazioni tra i diversi campioni. Appena avete aggiunto la MMP ad un
tubino, chiudete il tappo del tubino stesso. Centrifugate brevemente per portare il liquido sul
fondo. La soluzione nei vostri tubini da PCR dovrebbe a questo punto essere blu.
4. Quando vi sarà detto, potete mettere i vostri tubini nel termociclatore, che è stato
programmato con il ciclo appropriato.
Esercitazione di Laboratorio: analisi di mutazioni geniche mediante PCR (12 e 19 Novembre 2009)
4
Michela A. Denti – Corso di aggiornamento “genetica, biologia e salute” – Museo Tridentino di Scienze Naturali
Secondo giorno: Elettroforesi dei prodotti di PCR
Avete completato la vostra amplificazione per PCR, ma non potete ancora dire se avete
ottenuto o meno dei prodotti di PCR. A questo scopo, dovete separare i vostri prodotti di PCR
mediante elettroforesi su gel, e visualizzarli con un colorante per DNA.
Poichè il DNA è carico negativamente, può essere separato usando una corrente elettrica.
Infatti “elettroforesi” significa “migrazione dovuta al campo elettrico”.
Nell’elettroforesi su gel di agarosio, il DNA è collocato nell’agarosio solidificato, che forma un
setaccio contenente pori di dimensione variabile, in base alla concentrazione dell’agarosio.
All’aumentare della concentrazione di agarosio la dimensione dei pori diminuisce, ritardando
maggiormante il movimento della molecola attraverso il gel. Ciò è utile soprattutto quando si
vogliono confrontare molecole di dimensioni diverse, contenute nello stesso campione.
Il movimento attraverso il gel avviene quando una corrente elettrica è applicata al gel. Poichè
il gel è immerso nel tampone di corsa, la corrente migrerà attraverso il tampone ed il gel,
portando con sè il DNA carico negativamente, verso l’anodo positivo.
Oltre ai prodotti di PCR, caricherete sul gel anche un Marker di dimensioni (DNA Allele
Ladder) che rappresenta tutti i possibili alleli del locus esaminato. Questo è un riferimento da
confrontare con i campioni di PCR, per determinarne le dimensioni relative e l’identità.
Nel disegno qui sotto i campioni (bande) che si vedono nella prima corsia (lane)
appartengono al DNA Allele Ladder. Queste sono le dimensioni standard degli alleli che si sa
ricorrere in questo locus. Ci sono 8 possibili alleli, con il più grande in alto ed il più piccolo
nella porzione inferiore del gel.
Nelle successive corsie, sono visibili i prodotti di PCR corrispondenti ai campioni di DNA CS,
A, B, C, D. Il campione della scena del crimine (CS) ha un genotipo che corrisponde agli alleli
5 e 2 sul marker di dimensioni. Diremo quindi che il genotipo per questo campione è 5-2. Per
il campione accanto, il genotipo è 7-4 e così via.
Esercitazione di Laboratorio: analisi di mutazioni geniche mediante PCR (12 e 19 Novembre 2009)
5
Michela A. Denti – Corso di aggiornamento “genetica, biologia e salute” – Museo Tridentino di Scienze Naturali
Postazioni (2-3 persone per postazione)
Materiale
Quantità
gel di agarosio
1
campioni da PCR del precedente laboratorio
5
tampone di corsa elettroforetica (1X TAE)
1
colorante di caricamento (loading dye=LD; liquido blu)
45 µl
CSI Allele Ladder (Marker di dimensioni) (liquido blu)
25 µl
Attenzione a non confondere questi ultimi due tubi: contengono composti differenti!)
micropipetta da 2–20 µl
1
puntali per micropipetta da 2–20 µl
1 confezione
camera elettroforetica
1
alimentatore per elettroforesi
1
1. Preparate il vostro apparato da elettroforesi.
2. Recuperate i vostri campioni di PCR dalla lezione precedente.
3. Usando una micropipetta ed i puntali, aggiungete 8 µl di colorante di caricamento (LD) in
ciascun campione di PCR, mescolate bene, pipettando su e giù. Importante: usate ogni
volta un puntale nuovo.
4. Usando come guida la tabella qui sotto, caricate 20 µl di Allele Ladder e 20 µl di ciascun
campione nell’ordine sotto indicato, annotando l’ordine di caricamento su un foglio.
Lane
1
2
3
4
5
6
campione
Allele Ladder
Crime Scene
Sospetto A
Sospetto B
Sospetto C
Sospetto D
volume
20 µl
20 µl
20 µl
20 µl
20 µl
20 µl
5. Fate correre il vostro gel per 30 minuti a 100 V. Non fate uscire dal gel il colorante
arancione.
Esercitazione di Laboratorio: analisi di mutazioni geniche mediante PCR (12 e 19 Novembre 2009)
6
Michela A. Denti – Corso di aggiornamento “genetica, biologia e salute” – Museo Tridentino di Scienze Naturali
6. Quando l’elettroforesi è completa, spegnete l’alimentazione e togliete il coperchio dalla
camera di alimentazione. Rimuovete il gel (attenzione: è facile che possa cadere fuori dal
vassoietto).
7. Visualizzate e fotografate le bande nel gel mediante l’apparato di documentazione dei gel.
8. Analisi dei risultati. Ora potete determinare gli alleli presenti in ogni campione ed
assegnare un genotipo (profilo di DNA). Per ogni reazione di PCR confrontate le bande
ottenute in ciascuna corsia (“lane”) con il marker di dimensioni (Allele Ladder) che avete
corso nella prima corsia.
Domande:
Lezione 1:
1. Che cosa permette di fare la PCR con il DNA?
2. Quali componenti sono necessari per eseguire una PCR?
3. Cosa c’è nella master mix e a cosa serve ciascun componente?
4. Perchè è necessario eseguire una PCR sui campioni di DNA provenienti dalla scena del
crimine?
5. Quali sono le fasi di un ciclo di PCR e cosa accade in ciascuna fase?
Lezione 2:
1. Perchè il DNA si muove attraverso un gel di agarosio?
2. Quali sono le due tecniche utilizzate per creare un profilo di DNA in questo esperimento?
Quale funzione ha ciascuna delle tecniche?
3. Che cos’è un Marker di dimensioni (Allele Ladder)? Qual è la sua funzione nel DNA
profiling?
4. Cosa è necessario per visualizzare il DNA dopo l’elettroforesi?
Esercitazione di Laboratorio: analisi di mutazioni geniche mediante PCR (12 e 19 Novembre 2009)
7