Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi

Amplificazione del DNA tramite reazione a
catena della polimerasi (POLYMERASE
CHAIN REACTION; PCR) e sue
applicazioni in ambito biomedico
Dottoressa Camerin Consuelo
Laboratorio Oncoematologia Pediatrica
La PCR (Polymerase Chain Reaction),
inventata e messa a punto da Kary
Mullis nel 1983, è un metodo attraverso
il quale una sequenza di DNA o cDNA
(RNA retrotrascritto) può essere
amplificata esponenzialmente in vitro
in modo specifico.
Per fare ciò è necessario:
● conoscere con precisione le estremità della sequenza
da amplificare per poter sintetizzare i primers;
● utilizzare un enzima che non si denaturi alle alte
temperature per poter fare cicli continui di PCR.
L'enzima che si utilizza è denominato
DNA Taq polimerasi ed è stato
estratto da un batterio, Thermus
Aquaticus, presente nei geyser del
parco nazionale di Yellowstone
La PCR sfrutta i meccanismi cellulari di
replicazione del DNA. I vari cicli di
amplificazione procedono con andamento
esponenziale e avvengono in un thermal
cycler.
Il ciclo di PCR è composto da:
•denaturazione per uno o più minuti a 94-96°C
per separare il DNA nei suoi due filamenti;
•anealing per uno o più minuti a temperatura
uguale o inferiore a 72°C per permettere
l’appaiamento dei primers al DNA;
•estensione per uno o più minuti a 72°C durante
i quali la DNA polimerasi si lega al DNA in
corrispondenza dei primers e sintetizza il
filamento corrispondente a partire da ciascun
primer.
Provette contenenti il DNA vengono riscaldate a 94-96°C per un tempo che
puo' variare da uno a pochi minuti, al fine di denaturare il DNA, cioe' di
separarne la struttura a doppia elica nei suoi due filamenti.
La temperatura viene ridotta a 50-65°C per uno o piu' minuti, per
consentire l'adesione dei due inneschi alle rispettive sequenze
complementari presenti sul DNA, a destra e a sinistra della regione che si
desidera amplificare.
La temperatura e' portata a 72°C per uno o piu' minuti, per permettere a
molecole di enzima Taq polimerasi di raggiungere le estremita' degli
inneschi e di estendere questi ultimi copiando lo stampo di DNA.
Durante il secondo ciclo si formano molecole ibride con un filamento della
lunghezza desiderata.
Nel terzo ciclo si ha la formazione delle prime molecole di DNA corrispondenti
esattamente alla zona del genoma che si vuole amplificare.
Man mano che prosegue la sintesi aumenta la percentuale di molecole di
DNA con le caratteristiche desiderate. Alla fine del quarto ciclo, otto
molecole su sedici (cioe' 50% delle molecole presenti) corrispondono
esattamente alla zona bersaglio.
Alla fine del quinto ciclo, ventidue molecole su trentadue (cioe' quasi 70% delle
molecole presenti) corrispondono esattamente alla zona bersaglio.
Il grafico mostra la curva di sintesi di molecole di DNA. In blu sono indicate le molecole
corrispondenti alla zona bersaglio, mentre in rosso sono indicate tutte le molecole
sintetizzate, comprese quelle che contengono anche altre zone del genoma. Partendo da una
sola molecola di DNA, alla fine di 30 cicli si puo' teoricamente ottenere oltre un miliardo
(esattamente 1.073.741.824) di molecole, di cui 1.073.741.764 (cioe' praticamente 100%)
corripondono alla zona che si desidera analizzare.
REAGENTI PER LA PCR
Il campione può essere:
- omogeneo (plasmide purificato), in questo caso poche molecole bastano a
garantire l'amplificazione;
- eterogeneo (mix di diverse molecole di DNA come sospensione cellulari o
materiale biologico), in questo caso devo usare molto DNA per avere un
minimo sufficiente per garantire l'amplificazione.
Di solito non si superano i 40 cicli, poichè dopo un certo numero di cicli
l'amplificazione non è più esponenziale ma raggiunge un plateau dovuto a:
- carenza di primers;
- carenza di dNTP.
NUCLEOTIDI (dNTP)
Devono essere bilanciati, perchè se uno dei precursori è in concentrazione
limitante, l'enzima incorpora qualcos'altro oppure si ferma.
MG++
Non deve essere limitante: tutto ciò che metabolizza polimeri di nucleotidi
necessita di Mg++. Se è troppo in eccesso determina inaccuratezza, aumentando
la frequenza degli appaiamenti dei primers con sequenza non omologhe.
TEMPERATURA
La Temperatura di anealing (Ta) deve essere più alta possibile. La Ta scelta
deve impedire il verificarsi di self annealing: i due primers non devono
appaiarsi fra loro, in particolare non si devono appaiare in corrispondenza del
3', perché è qui che comincia la polimerizzazione.
PRIMERS
Sono prodotti sintetizzati chimicamente e perciò devono essere puri.
1) Unicità della sequenza oligonucleotidica;
2) Presenza di una o più G o C in 3’;
3) Lunghezza intorno ai 18-30 nucleotidi;
4) Temperatura di anealing (Ta) bilanciata tra i 2 primers.
E' possibile utilizzare programmi al computer per verificare la specificità di
legame del primer con la sequenza desiderata (es. Amplify, Primers, BLAST).
In NUCLEOTIDE si inserisce il
nome del gene che si vuole cercare.
Si prende la sequenza completa del
nostro gene
Utilizzando i programmi di Primers e Amplify si fanno delle prove di PCR e
si sceglie la coppia di primers che meglio soddisfa le nostre esigenze.
Questa coppia di primers da un
buon amplificato del nostro
gene
Questa coppia non va bene,
perché si formano anche dimeri
di primers oltre al nostro
amplificato
Alla fine si verifica in BLAST la
specificità della propria sequenza.
Si cercano le eventuali omologie
con altri geni.
Il prodotto di PCR così ottenuto va valutato per la sua lunghezza e specificità
attraverso una corsa elettroforetica su gel di agarosio. La foto A mostra un
prodotto di amplificazione con PCR di lunghezza 101bp (valutata attraverso il
marcatore di peso molecolare noto), di buona quantità e specifico.
A.
Foto da: Int J Oncol. 2004 Feb;24(2):265-72, Pession A. et al.
Negative
GI -CA -N
GI -LI-N
Marker
N-myc
101 bp
La PCR appena descritta è definita “qualitativa” dato che non permette di
risalire al numero di copie di DNA o cDNA di partenza, visto che la reazione
procede con andamento esponenziale e quantità di DNA di partenza anche
molto diverse danno origine a prodotti di amplificazione simili al termine dei
30-40 cicli.
L’amplificazione del DNA tramite PCR qualitativa, è un passaggio obbligato
presente in pressoché tutte le tecniche di biologia molecolare.Le più rilevanti
riguardano la ricerca di mutazioni, il clonaggio, l’analisi di marcatori
genetici polimorfici, l’identificazione di traslocazioni con significato
prognostico; tutte queste metodiche sono ampiamente usate nel nostro
laboratorio.
La PCR viene utilizzata nel clonaggio di geni di interesse. In questo caso uno
dei due primer porta delle sequenze di riconoscimento per gli enzimi di
restrizione. Il prodotto di PCR, dopo vari trattamenti, viene incorporato in
un plasmide usato per essere amplificato in batteri. Alla fine di tutto ciò
mediante il clonaggio siamo in grado di far replicare a dei batteri delle
sequenze presenti nel DNA umano.
C.
B.
Normale corsa di un
amplificato di PCR
cDNA;
M= Marker XIV; Controlli Positivi: a)PCR su batteri
b)PCR su
1-14 = colonie clonate;
no = controllo negativo.
La PCR può anche essere il punto di partenza per la metodica del
sequenziamento automatico. In questo preciso caso si parte da una PCR che
richiede solo un primer ed una mix con nucleotidi normali e nucleotidi
fluorescenti. Quando questi ultimi vengono incorporati si interrompe la
reazione di PCR, così si formano tanti frammenti di varia lunghezza con
diversa fluorescenza. Ad ogni colore corrisponde una specifica base: in
questo modo è possibile ricostruire, nucleotide per nucleotide, la sequenza
analizzata. Questa metodica permette di vedere mutazioni puntiformi,
breakpoint, sequenze complete del proprio frammento.
breakpoint
D.
La PCR viene usata per valutare la presenza di traslocazioni, con fattore
prognostico, nel sangue di pazienti affetti da disordini mielodisplastici. Di
seguito viene riportata una tabella con indicate le traslocazioni associate alle
varie forme di LAM.
Tipo di LAM
Indifferenziata
M0
Mieloblastica
senza maturazione
M1
Mieloblastica
con maturazione
M2
Promielocitica
M3
Mielomonocitica
M4
Traslocazioni
immunofenotipo
t(9;22)(q34;q11)
CD13 , 33 , 34
t(8;21)(q22;q22)
t(3;21)(q26;q22)
CD13 , 33 , 34
t(15;17)(q22;q11-12)
t(11;17)(q23;q21)
CD13 , 33
t(1;11)(q21;q23)
t(6;11)(q27;q23)
t(9;11)(p22;q23)
t(10;11)(p12;p23)
t(11;19)(q23;p13.1)
t(11;19)(q23;p13.3)
inv(16)(p13;q22)
t(16;16)(p13;q22)
Monoblastica
M5a
11q23
(vedi M4)
Monocitica
M5b
11q23
(vedi M4)
Eritroleucemia
M6
Megacariocitica
M7
+
+
+
BRC, ABL
+
+
+
ETO, AML1
EVI1, AML1
+
+
CD13 ,
+
33
+
PML, RAR
PLZF, RAR
+
+
+
14 ,
15 ,
MLL
+
+
+
CD4 , 13 , 15 , 33 ,
+
+
MLL
64 , DR
+
+
+
+
CD4 , 13 , 15 , 33 ,
+
+
64 , DR
MLL
+
Glicoforina A
t(1;22)(p13;q13)
Geni coinvolti
+
+
CD41 , 61
Nelle foto E ed F si vedono due esempi di traslocazioni evidenziate
mediante una PCR qualitativa.
M
Kasumi
NO
M
Pz
NB4
NO
Pz
t(15;17)
289 bp
t(8;21)
260 bp
E.
Gel di paziente affetto da M2
con traslocazione t(8;21)
F.
Gel di paziente affetto da M3
con traslocazione t(15,17)
Mediante lo Spectratyping è possibile monitorare i cambiamenti che
avvengono nelle popolazioni di linfociti successivamente al riconoscimento
dell’antigene, perchè si basa sull’eterogeneità di dimensione a livello genico
della regione CRD3 del recettore per l’antigene dei linfociti T.
Utilizzando una modificazione della PCR che prevede 25 primers per le
regioni ipervariabili CDR3 della catena  e un primer costante marcato
(quindi fluorescente), è possibile valutare in dettaglio una popolazione di
linfociti T, confrontando le lunghezze dei segmenti genici relativi a queste
regioni. Gli amplificati sono analizzati con l’aiuto di un sequenziatore a
capillare che permette di rilevare la fluorescenza dei frammenti amplificati e
ne determina le diverse lunghezze.
G.
La PCR trova altre numerose applicazioni. Può venire impiegata nella
diagnosi di malattie per individuare batteri o virus patogeni come l'HIV, il
virus dell'epatite B, il mycobatterio tubercolare. Nel caso particolare della
tubercolosi mediante la PCR si possono rilevare 10 bacilli su 106 cellule
eucariotiche.
Può venire impiegata nella diagnosi prenatale delle malattie ereditarie
monogeniche come la distrofia muscolare, la fibrosi cistica, la talassemia.
La PCR viene utilizzata anche nella valutazione della diversa capacità degli
individui di metabolizzare i farmaci a partire dall'analisi dei polimorfismi
dei geni che codificano per il complesso enzimatico del citocromo p450
coinvolto nelle reazioni metaboliche.
In ambito giuridico la PCR trova utilizzo nell’amplificazione di tracce di DNA
provenienti da campioni prelevati dalla scena del crimine come capelli, sangue o
sperma. Il DNA amplificato può quindi essere analizzato e confrontato con
quello della vittima e di un sospetto, i risultati usati per incriminare o
scagionare il sospettato del crimine.
La PCR trova impiego anche negli studi di evoluzione molecolare. E' possibile
misurare l'omologia tra specie diverse confrontando le differenze esistenti fra
nucleotidi dello stesso gene.