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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA
FACOLTÀ DI AGRARIA
Corso di Laurea Specialistica di II livello in Viticoltura,
Enologia e Mercati Vitivinicoli
TESI DI LAUREA
Valutazione dell’efficacia di oli essenziali di uso erboristico
nei confronti della muffa grigia (Botrytis cinerea Pers.)
Relatore: Dott.ssa Ilaria Pertot
Correlatore: Dott.ssa Kathrin Eva Annaheim
Laureando: Denis Bassetti
ANNO ACCADEMICO 2006-2007
INDICE
1. RIASSUNTO/ABSTRACT
1
2. INTRODUZIONE
3
2.1. Le piante medicinali
3
2.2. L’erboristeria cinese
4
2.3. La fitoterapia oggi
4
2.4. Gli oli essenziali
5
2.5. Le tinture madri
8
2.6. I macerati gliceridi o gemmoderivati
8
2.7. Oli essenziali, tinture madri e macerati gliceridi (gemmoderivati) con
proprietà antimicotiche o antimicrobiche
9
2.8. Altri prodotti di derivazione naturale con proprietà antimicotiche o
antimicrobiche
15
2.9. La muffa grigia della vite
16
3. SCOPO DELLA TESI
23
4. MATERIALI E METODI
24
4.1. Estratti vegetali utilizzati
24
4.2. Valutazione dell’efficacia degli estratti vegetali sull’inibizione della
germinazione dei conidi e della crescita miceliare di B. cinerea
5. RISULTATI E DISCUSSIONE
29
37
5.1. Valutazione dell’efficacia degli estratti vegetali sull’inibizione della
germinazione dei conidi e della crescita miceliare di B. cinerea
37
6. CONCLUSIONI
49
7. BIBLIOGRAFIA
50
1. RIASSUNTO/ABSTRACT
Botrytis cinerea è l’agente causale di una delle più pericolose malattie della vite. Le
elevate perdite di produzione ed il deprezzamento qualitativo delle uve che il patogeno
può causare impongono all’agricoltore la pianificazione di un’accurata difesa. I metodi
agronomici preventivi non sempre sono sufficienti a contenere la malattia. L’utilizzo di
agrofarmaci di sintesi porta con se il rischio di residui che possono interferire nel
processo di fermentazione e lo sviluppo di popolazioni resistenti del patogeno. Inoltre in
agricoltura biologica non esistono prodotti efficaci per il contenimento della malattia.
L’obiettivo della tesi è rappresentato dall’individuazione di prodotti attivi nei confronti
di B. cinerea alternativi agli agrofarmaci di sintesi e/o impiegabili in agricoltura
biologica. È stata valutata l’efficacia di 15 prodotti di derivazione vegetale, noti in
bibliografia per l’applicazione contro le micosi umane o dal potere disinfettante. I
prodotti sono stati selezionati preliminarmente in laboratorio ed in seguito i più
promettenti fra loro sono stati valutati in vigneto in presenza di infezioni artificiali su
due diversi vitigni (Merlot e Pinot grigio) Due estratti di origine naturale (Citrus x
paradisi e Eugenia caryophyllata) sono risultati efficaci nei confronti di B. cinerea sia
in condizioni controllate in laboratorio, sia nel vigneto. Futuri approfondimenti sulla
composizione degli estratti e sul meccanismo d’azione potrebbero portare allo sviluppo
di nuovi fungicidi a basso impatto ambientale.
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Botrytis cinerea is the causal agent of one of the most dangerous grapevine disease.
High production and quality fruits losses, which are frequent inevitable consequences
due to pathogen infection, force the farmer to apply an accurate pesticide schedule.
Technical and agronomic measures are often inefficient in order to prevent and keep the
disease under control. Chemicals treatments plans are, by the time, replaced with
organic programs due to chemical molecules residues, which could trig out anomalous
fermentations a resistant pathogen populations development. Moreover, there is still not
enough knowledge about effective products against B. cinerea to be used in viticulture.
The objective of this study was to detect new alternatives and organic products against
B. cinerea to replace pesticides currently used in conventional viticulture treatment
plans. Throughout the study 15 new natural active principles have been tested
afterwards a literature review where the molecules are fairly well known for disinfection
and curative effects in human medicine. The products have been preliminary selected in
microbiology laboratory and, at the later time, the most efficient principles have been
applied in the field B. cinerea artificial infections on Merlot and Pinot Gris grapevine
varieties. In particular, two active principles (Citrus x paradise, Eugenia caryophyllata)
have shown to be effective against B. cinerea both in lab tests and in the field. Further
studies regarding action mechanism and composition of the natural extracts could lead
to a new active formulation development with low environmental and human impact.
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2. INTRODUZIONE
2.1. Le piante medicinali
Le piante medicinali da sempre hanno suscitato un notevole interesse presso tutti i
popoli. La fitoterapia è una disciplina terapeutica che cura le malattie attraverso
l’utilizzo di estratti naturali di piante o erbe (secche oppure fresche).
Le conoscenze attualmente a nostra disposizione sull’uso delle piante a scopo
terapeutico sono frutto di osservazioni ed esperienze di millenni. Già duecentomila anni
or sono, i semi di Euryale ferox erano consumati a scopo benefico dall’uomo primitivo
in Cina (Bremness, 1994). Soltanto molti secoli più tardi sono stati riconosciuti i loro
effetti medicinali citati negli antichi erbari cinesi (Lee et al., 2002). Nelle tavolette di
argilla assiro-babilonesi e nei geroglifici dell’antica civiltà egizia si ritrovano citazioni
dell’utilizzo di piante a scopo terapeutico e veri e propri trattati sull’impiego di piante
medicinali (AAVV, 2006). Nelle civiltà più antiche le conoscenze scientifiche e
mediche erano proprietà esclusiva di alcune classi sociali, come sacerdoti o stregoni.
I greci furono i primi ad introdurre lo studio della botanica nelle loro scuole,
soprattutto grazie ad Aristotele e Ippocrate. I romani, seguendo le orme dei greci ed
acquisendo informazioni delle popolazioni da loro conquistate, ampliarono le loro
conoscenze mediche e sull’uso della fitoterapia. Durante il Medioevo, nonostante sia
considerato un periodo buio e di scarsi progressi della conoscenza, nei monasteri si
continuò alacremente ad approfondire l’utilizzo della fitoterapia, che seguiva di pari
passo le conoscenze della medicina. Degno di menzione è l’erbario dei monaci di
Canterbury, datato intorno al 1100 d.c. che ha contribuito a diffondere le conoscenze di
botanica medica in quasi tutti i continenti (Bremness, 1994).
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2.2. L’erboristeria cinese
In Cina, a differenza di quanto è avvenuto in occidente, lo studio e la ricerca relativa
alle piante medicinali e aromatiche è da sempre tenuta in elevata considerazione. Il
metodo cinese contrasta fondamentalmente con quello occidentale. La fitoterapia
asiatica consiste nel calibrare ed equilibrare una combinazione di un certo numero di
piante medicinali con le esigenze del singolo individuo (Bremness, 1994).
In occidente si tende invece a ottenere un farmaco standard, adatto e valido per
il maggior numero possibile di individui. Si preferisce utilizzare molecole pure, o
combinazione semplici di molecole, escludendo per quanto è possibile le formulazioni
la cui composizione non sia facilmente caratterizzabile. Questo approccio è supportato
dalle attuali procedure di registrazione dei farmaci che ne prevedono, di fatto, la
valutazione di ciascun singolo principio attivo di cui sono costituiti. Non stupisce quindi
che molte piante medicinali cinesi vengano “riscoperte” in occidente, dove ci si è
allontanati per decenni dalla fitoterapia classica. Ad esempio la Pueraria lobata in Cina
è usata per combattere l’alcolismo. La ricerca ha recentemente confermato la presenza
in questa pianta di principi attivi in grado di eliminare il desiderio di alcol (Keung,
1997; Carai et al., 2000).
Recentemente si è evidenziato che l’utilizzo di singoli principi attivi può
causare effetti collaterali negativi rispetto all’utilizzo della pianta intera e che a volte
l’effetto dell’insieme di sostanze presenti nella pianta aumenta l’efficacia del principio
attivo principale. Da tempo gli erboristi suggeriscono di considerare la pianta nella sua
interezza e non solo i suoi singoli componenti chimici.
2.3. La fitoterapia oggi
L’utilizzo di piante e di erbe medicinali è passato da un utilizzo popolare-casalingo a
una fase in cui predomina la ricerca e la sperimentazione, grazie soprattutto alla
possibilità di isolare i principi attivi contenuti nelle piante e di produrli per via sintetica
trasformandoli in farmaci di sintesi.
Secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità, una pianta medicinale è un
organismo vegetale che contiene, in uno dei suoi organi, sostanze che possono essere
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utilizzate a fini terapeutici o che sono i precursori di emisintensi di specie
farmaceutiche. Nel linguaggio comune si sovrappone l'uso dei termini “pianta
medicinale” con “pianta officinale”, che indica più propriamente le piante utilizzate
nelle officine farmaceutiche per la produzione di specialità medicinali. Questa
definizione è però abbastanza riduttiva, e l'utilizzo in ambienti accademici del termine
pianta medicinale non fa più riferimento esclusivamente ad un utilizzo a scopo
terapeutico delle sostanze contenute nelle piante, bensì dell'utilizzo della pianta o di
estratti da lei derivati a scopo terapeutico.
L’enorme interesse da parte delle case farmaceutiche nell’individuazione di
nuovi farmaci ha però tralasciato e dimenticato molte delle esperienze del passato. Si è
recentemente osservato che molte proprietà fitoterapeutiche non sono legate al singolo
principio attivo, ma ad una serie di sostanze, conosciute e sconosciute, che in sinergia
tra loro concorrono al miglior risultato terapeutico. L’insieme di queste sostanze viene
definito fitocomplesso.
L’attuale fitoterapia si basa oltre che sul decotto e sull’infuso anche su altri
preparati, più facilmente titolabili e conservabili: gli oli essenziali, le tinture madri e i
macerati gliceridi o gemmoderivati.
2.4. Gli oli essenziali
2.4.1. Caratteristiche degli oli essenziali
Gli oli essenziali usati come terapia, rientrano in quel metodo di cura definito
aromaterapia. Questa branca della fitoterapia che utilizza gli aromi o più comunemente
le essenze è nota da moltissimi secoli. Il nome aromaterapia deriva dal francese
“aromathèrapie”, nome che le fu attribuito da R. M. Gattefossè, conosciuto oggi come il
padre della moderna aromaterapia (Del Principe e Mondo, 2005). Pare che le prime
testimonianze di utilizzo risalgano a circa 5000 anni fa. Nella valle dell’Indo sono stati
portati alla luce degli antichi distillatori in terracotta datati 4000 anni fa (AAVV, 2006).
I Veda, testi sacri della religione induista, citano l’uso di oli essenziali nelle cerimonie
liturgiche e come cura contro le malattie. In Egitto durante l’imbalsamazione delle
mummie, in cosmetica e in medicina erano largamente usati prodotti aromatici come le
resine e le essenze.
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Il termine “olio” può trarre in inganno facendo pensare che gli oli essenziali
siano delle sostanze grasse. Essi al contrario sono delle sostanze eteree che tendono ad
evaporare a contatto con l’aria (Sala et al., 2003). Sono frutto del metabolismo delle
piante e vengono prodotti in piccolissime quantità. Si diversificano in essenze vegetali e
resine. Le prime sono molto volatili e sono prodotte all’esterno della pianta sotto forma
di essudati. Le resine rimangono sulla pianta come residui collosi dopo che l’olio si è
volatilizzato. La manifestazione fisica dell’olio essenziale è il profumo. Semplicemente
schiacciando la buccia di un agrume oppure odorando un fiore o sfregando una foglia
tra le dita, percepiamo il cosiddetto “aroma”, dovuto alle molecole di olio essenziale che
si volatilizzano nell’aria e raggiungono i nostri sensori nervosi del naso.
Il ruolo delle essenze nel mondo vegetale è quello di attirare o respingere gli
insetti o gli erbivori o, in termini generici, per regolare il loro rapporto con il mondo
esterno (Sala et al., 2003).
2.4.2. Estrazione di un’essenza
Le principali tecniche d’estrazione possono essere riassunte in: spremitura a freddo ed
estrazione per corrente di vapore.
La spremitura a freddo è utilizzata, ad esempio, per ottenere oli essenziali dalla
scorza degli agrumi. Come tecnica è molto valida in quanto consente di ottenere
quantità di oli abbastanza elevate e di buona qualità. Questa tecnica comporta due grossi
limiti: è poco efficiente e quindi poco redditizia e presenta elevati rischi di
contaminazione con ciò che risulta essere presente sulla superficie del frutto, come ad
esempio i pesticidi. Questo motivo ha portato l’aromotecnica a ricercare sempre più
spesso prodotti ottenuti mediante agricoltura biologica. I più recenti oli essenziali
provengono quindi da colture biologiche certificate o da produzioni garantite e
qualificate dallo stesso produttore (Sala et al., 2003).
Il secondo metodo definito anche “distillazione in corrente di vapore”,
garantisce maggiori rese e non presenta i problemi inerenti alle contaminazioni che sono
possibili con la spremitura a freddo ed è sicuramente il sistema maggiormente utilizzato.
6
Una fonte di vapore sottostante il supporto vegetale estrae le molecole di olio. Olio e
vapore salendo verso l’alto condensano in appositi condotti refrigeranti. La scarsa
miscibilità tra olio e acqua permette la separazione. L’olio ottenuto risulta purissimo,
l’acqua ottenuta conserva un fragrante profumo caratteristico della pianta di origine e
prende il nome di idrolato (Sala et al., 2003).
2.4.3. Utilizzo e somministrazione degli oli essenziali
In ambito umano non tutti gli oli essenziali sono adatti a un uso interno e non vanno mai
assunti puri (Del Principe e Mondo, 2005). Prima di farne uso è necessario escludere il
rischio di allergia ad uno specifico prodotto. Il metodo maggiormente impiegato è
quello di assumere l’olio in forma diluita. L’acqua è sicuramente sconsigliata in quanto
non miscibile con l’olio. Le basi più utilizzate sono lo zucchero (un cucchiaino o una
zolletta), oppure il miele (un cucchiaio). Le dosi utilizzate variano da essenza ad
essenza, in genere corrispondono ad una posologia di 1-2 gocce.
Per quanto riguarda le affezioni delle vie respiratorie si ricorre alle inalazioni,
ai suffumigi e alle inalazioni a secco. Le inalazioni avvengono utilizzando apparecchi
per l’areosolterapia, utilizzando in genere 1-2 gocce diluite in un po’ d’acqua dentro
l’ampolla. Il suffumigio è un tipo d’inalazione che prevede di versare in un catino pieno
di acqua bollente un cucchiaio di bicarbonato di sodio con l’essenza desiderata e di
inalare in seguito il vapore. L’inalazione a secco, usata in caso di emergenza, consiste
nel versare alcune gocce di olio su di un fazzoletto o panno di stoffa per poi annusare
ripetutamente l’aroma.
Un ulteriore utilizzo è il bagno aromatico. In questo caso il sale è la matrice su
cui sono deposti gli oli, ad esempio si utilizzano 10 ml di sale marino con 10 gocce di
olio per un bagno.
Altre basi utilizzate per la somministrazione degli oli essenziali sono il latte, la
panna e la crusca per uso interno; l’argilla per la cura della pelle e l’aceto per i
gargarismi. Per i massaggi e le frizioni è utilizzato frequentemente come base l’olio
vegetale.
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2.5. Le tinture madri
Alcune sostanze derivate da piante non sopportano l’ebollizione, poiché vengono
denaturate dal calore perdendo di conseguenza il potere curativo (Treben, 2001).
Le tinture madri sono preparate mettendo a macerare le piante fresche in alcol
etilico per un periodo di circa tre settimane. Al termine del periodo di estrazione il
residuo vegetale viene spremuto e filtrato. Se il grado alcolico iniziale dell’alcol è di 90°
nella tintura si arriva ad un grado alcolico che varia dai 38° ai 40°. Si utilizza l’alcol in
quanto risulta essere un ottimo estrattore di buona parte dei principi attivi contenuti
nella pianta. La qualità della tintura è legata alla qualità del materiale vegetale fresco di
partenza. Il termine “tintura madre” deriva dal fatto che è la “base” per ottenere i rimedi
omeopatici attraverso le diluizioni successive.
2.6. I macerati gliceridi o gemmoderivati
La gemmoterapia è una branca della fitoterapia che utilizza parti fresche vegetali allo
stato embrionale (gemme o giovani getti). La preparazione dei gemmoderivati consiste
nel raccogliere gemme, giovani getti e radici che dopo ripulitura e triturazione vengono
messi a macerare in alcool e glicerina per circa tre settimane. Il tutto decantato e filtrato
fino all’ottenimento del macerato glicerinato (MG). La loro azione drenante di
spostamento delle tossine dell’organismo verso gli organi emuntori, quali fegato, rene e
pelle dove ne è più facile l’espulsione, rendono questi preparati molto interessanti dal
punto di vista terapeutico. La somministrazione sublinguale avviene a digiuno con un
po’ d’acqua naturale.
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2.7. Oli essenziali, tinture madri e macerati gliceridi (gemmoderivati)
con proprietà antimicotiche o antimicrobiche
Sulla base di dati bibliografici e a seguito di specifiche consulenze con esperti erboristi
è stato possibile stilare un elenco dei più noti ed utilizzati prodotti erboristici (oli
essenziali, tinture madri e gemmoderivati) che presentano attività antimicrobica o
antifungina in ambito umano. In particolare i flavonoidi, contenuti in numerose specie
vegetali sono risultati essere molto attivi nei confronti di numerosi patogeni umani
(Cushnie e Lamb, 2005).
2.7.1. Olio essenziale di calendula
Specie: Calendula officinalis L.
Famiglia: Compositae
Origine: la pianta è presente comunemente nelle regioni italiane.
Parti impiegate: fiori.
Metodo di estrazione: distillazione in corrente di vapore.
Proprietà: la calendula è antisettica e antimicotica. Per uso interno cura dolori di
stomaco, infiammazioni dei nodi linfatici e stimola il fegato, aiutando gli alcolisti a
disintossicarsi (Bremness, 1994). Risulta molto utile nella cura delle micosi del piede
(Treben, 2001). Molto interessante è la sua azione antivirale contro il virus dell’HIV
(Kalvatchev et al.1997).
2.7.2. Olio essenziale di rosmarino
Specie: Rosmarinus officinalis L.
Famiglia: Labiatae
Origine: il rosmarino è originario del bacino del Mediterraneo, cresce spontaneamente e
viene coltivato in tutta l’Europa meridionale, Africa settentrionale, in Oriente e sud
America. Il paese maggior produttore di essenza è la Spagna, seguita da Tunisia e
Marocco.
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Parti impiegate: sommità fiorite essiccate.
Metodo di estrazione: distillazione in corrente di vapore.
Proprietà: rinvigorente, antibatterico, antimicotico. Stimola il sistema nervoso centrale e
la circolazione sanguinea, allevia i dolori muscolari. È anche analgesico, antimicrobico,
antisettico, afrodisiaco (Sala et al., 2003). In ambito agrario va evidenziata la sua
spiccata attività contro la Peronospora del pomodoro (Soylu et al., 2006)
2.7.3. Olio essenziale di ginepro
Specie: Juniperus communis L.
Famiglia: Coniferae
Origine: originario dell’emisfero boreale cresce spontaneo in Europa e Asia. Il maggior
produttore è l’Italia (Appennino).
Parti impiegate: bacche.
Metodo di estrazione: distillazione in corrente di vapore delle bacche essiccate.
Proprietà: è antimicotico (Riva, 2001), efficace contro le dermatiti, funghi patogeni
dell’uomo come Aspergillus spp. e Candida spp. (Cavaleiro et al.,2006), antisettico,
disintossicante, è un rimedio per cistiti, acne, eczemi, cellulite, reumatismi e raffreddori
(Bremness, 1994).
2.7.4. Olio essenziale di chiodi di garofano
Specie: Caryophyllus aromaticus L.
Famiglia: Myrtaceae
Origine: è originario dell’Asia tropicale ed in particolare delle isole Molucche.
Attualmente le principali fonti di approvvigionamento sono il Madagascar e Zanzibar.
Parti impiegate: i boccioli floreali essiccati chiamati “chiodi”.
Metodo di estrazione: distillazione in corrente di vapore dei boccioli floreali essiccati.
Proprietà: è antisettico, antimicotico, antibatterico,afrodisiaco, nell’industria alimentare
vengono usati i chiodi di garofano come aromatizzanti. Può essere usato come
fumigante contro la termite Giapponese (Park e Shin, 2005).
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2.7.5. Olio essenziale di timo
Specie: Thymus vulgaris L.
Famiglia: Labiatae
Origine: è originario dall’area mediterranea. Oggi cresce in tutto il bacino del
Mediterraneo, con la prevalenza della Spagna.
Parti impiegate: le foglie e le sommità fiorite.
Metodo di estrazione: distillazione in corrente di vapore delle parti della pianta
essiccate.
Proprietà: antimicotico, afrodisiaco, antisettico sia intestinale, polmonare che urogenitale, cicatrizzante, diuretico, stimolante della circolazione, tonico e vermifugo,
antimicrobico. Ha dato buoni risultati in test contro 25 generi di batteri dannosi per
piante ed animali (Dorman e Deans, 2000).
2.7.6. Olio essenziale di lavanda
Specie: Lavandula latifolia L.
Famiglia: Labiatae
Origine: Di origine mediterranea cresce spontanea, il maggior produttore di essenza è la
Francia.
Parti impiegate: sommità fiorite e steli.
Metodo di estrazione: si estrae per distillazione in corrente di vapore delle parti ancora
fresche.
Proprietà: l’olio essenziale è particolarmente attivo, ha un’azione antisettica delle vie
urogenitali, è antidepressivo, vermifugo, antimicotico, cicatrizzante, deodorante. Una
specie affine (Lavandola stoechas subsp. stoechas) è risultata efficace contro alcuni
patogeni umani che possono potenzialmente contaminare gli alimenti (Escherichia coli
O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium e Staphylococcus aureus)
(Dadalioglu e Evrendilek, 2004)
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2.7.7. Olio essenziale di manuka
Specie: Leptospermum scoparium J.R. et G. Forst.
Famiglia: Myrtaceae
Origine: Nuova Zelanda.
Parti impiegate: foglie.
Metodo di estrazione: distillazione in corrente di vapore.
Proprietà:
è
antinfiammatorio,
antisettico,
rigenerante,
antibiotico,
antivirale,
antimicotico. Il suo olio viene utilizzato nell’emisfero Australe come antibatterico (LisBalchin et al.,2000).
2.7.8. Olio essenziale di cipresso
Specie: Cupressus sempervirens L.
Famiglia: Cupressaceae
Origine: bacino del mediterraneo.
Parti impiegate: le cime fresche e le foglie.
Metodo di estrazione: distillazione in corrente di vapore.
Proprietà: ha potere antireumatico, antisettico, antimicotico (Turchetti et al.,2005),
deodorante.
2.7.9. Olio essenziale di Melaleuca alternifolia o Tea tree oil
Specie: Melaleuca alternifolia Cheel.
Famiglia: Myrtaceae
Origine: Australia precisamente del Nuovo Galles, risulta essere coltivata solo in questo
continente.
Parti impiegate: le foglie.
Metodo di estrazione: distillazione in corrente di vapore delle foglie fresche.
Proprietà:
è
antinfettivo,
antinfiammatorio,
antisettico,
antivirale,
battericida,
antimicotico.
Sono riportate numerose ricerche in ambito medico che evidenziano la sua potente
attività antimicrobica (Carson et al., 2006)
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2.7.10. Tintura madre di tuia
Specie: Thuja occidentalis L.
Famiglia: Coniferae
Origine: America settentrionale.
Parti impiegate: foglie e semi.
Metodo di estrazione: macerazione in alcool per 20-21 giorni.
Proprietà: ha azione antimicotica, cicatrizzante, antipiretica, antivirale, sedativourinario. Alcuni studi attribuiscono all’estratto di questa pianta effetti di inibizione alla
metastasi del Melanoma (Sunila e Kuttan, 2006).
2.7.11. Gemmoderivato di Baptisia tintoria
Specie: Baptisia tinctoria (R. Br.) Vent.
Famiglia: Leguminosae
Origine: Pianta indigena dell’America settentrionale.
Parti impiegate: radice
Metodo di estrazione: alcool e glicerina per 3 settimane.
Proprietà: la pianta è usata dagli indiani d’America possiede attività antibiotica,
antisettica, antimicotica e stimolante del sistema immunitario. L’attività antivirale è
stata testata nei confronti dell’influenza di tipo A, ottenendo un effetto inibitorio
(Bodinet et al., 2002).
2.7.12. Gemmoderivato di ribes nero
Specie: Ribes nigrum L.
Famiglia: Grossulariaceae
Origine: Europa
Parti impiegate: gemme fresche
Metodo di estrazione: macerazione di gemme fresche in alcool e glicerina per tre
settimane.
Proprietà: è antifiammtorio, antimicotico, agisce contro orticaria e sindromi febbrili.
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2.7.13. Gemmoderivato di semi e polpa di pompelmo
Specie: Citrus x paradisi Macf.
Famiglia: Rutaceae
Origine: originario dell’Oriente, oggi viene coltivato in Cina, nelle Indie occidentali,
negli Stati Uniti, California e Florida, in Brasile ed in Israele.
Parti impiegate: semi e polpa.
Metodo di estrazione: macerazione dei semi e polpa in alcool e glicerina per tre
settimane.
Proprietà: è antimicotico, antibatterico, antisettico, antivirale, antiparassitario. Studi
eseguiti in vitro hanno evidenziato un effetto inibitore contro Candida albicans e
Salmonella enteritidis (Cvetnic et al., 2004).
2.7.14. Gemmoderivato di noce nero
Specie: Juglans nigra L.
Famiglia: Juglandaceae
Origine: America settentrionale
Parti impiegate: gemme fresche.
Metodo di estrazione: macerazione delle gemme fresche.
Proprietà: è antimicotico, antidiabetico, antimicrobico e depurativo, Recenti studi
attribuiscono a questa famiglia proprietà contro Helicobacter pilori (Nariman et al.,
2004).
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2.8. Altri prodotti di derivazione naturale con proprietà antimicotiche
o antimicrobiche
2.8.1. Estratto di resina di Apis mellifera
La propoli è una sostanza resinosa e vischiosa che le api prelevano da gemme e cortecce
di vari alberi per rivestire e proteggere l'alveare. Essa è costituita essenzialmente da una
miscela di composti di natura aromatica e fenolica arricchita da numerose sostanze
molto eterogenee tra loro (acidi grassi, terpeni, amminoacidi, vitamine, sali minerali,
ecc.) la cui distribuzione percentuale è molto variabile in funzione delle stagioni e del
tipo di vegetazione.
Parti impiegate: resina di Apis mellifera.
Metodo di estrazione: macerazione in glicerina
Proprietà: ha un’attività batteriostatica e battericida; antimicotica; antivirale;
cicatrizzante; immunostimolante; vasoprotettiva; antiossidante e antiirrancidente. La
propoli è un ottimo inibitore dei microrganismi responsabili della carie (Park et al.,
1998).
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2.9. La muffa grigia della vite
2.9.1. Agente causale
La muffa grigia, o Botrite, è una delle malattie più importanti della vite, causata da un
fungo, Botryotinia fuckeliana (De Bary) Whetzel, appartenente alla divisione Eumycota,
sottodivisione Ascomycotina, più comunemente noto con il nome dell’anamorfo,
Botrytis cinerea Pers, sottodivisione Deuteromycotina. Questo fungo estremamente
polifago (oltre alla vite attacca numerose specie vegetali), parassita facoltativo,
aerobico, può sopravvivere come saprofita utilizzando substrati organici diversi
(sostanza organica animale o vegetale in decomposizione). Tali caratteristiche fanno di
questo fungo un patogeno molto virulento e difficile da controllare. La malattia è diffusa
in tutte le zone viticole del mondo, dove può creare problemi non indifferenti, con forti
perdite quantitative e qualitative della produzione viticola, soprattutto in climi caldi e
umidi durante l’estate e l’autunno. Su vite B. cinerea colpisce soprattutto i grappoli,
dove determina i maggiori danni, ma può colpire anche gli altri organi erbacei
dell’apparato aereo (Ferrari et al., 1994). Su ogni organo colpito, se le condizioni
ambientali risultano essere favorevoli (alta umidità relativa e temperatura), si origina
una tipica muffa grigia che su vite può assumere forme diverse: la “muffa grigia” che
rovina irrimediabilmente l’uva e crea problemi nella successiva fermentazione e la
“muffa nobile” che apporta invece aromi straordinari al vino (Brambilla, 1999).
2.9.2. Ciclo biologico di B. cinerea
La fase più importante del ciclo biologico di questo fungo è rappresentata dalla forma
imperfetta (agamica) B. cinerea. La forma gamica, che è in rapporto metagenetico con
la forma conidica, cioè B. fuckeliana, compare sporadicamente in natura (Matta, 1996).
La forma sessuata può essere osservata occasionalmente in autunno sottoforma di
apoteci generalmente peduncolati (Ferrari et al., 1994).
Il fungo si conserva nell’ambiente come micelio in materiale in
decomposizione oppure come sclerozio, anche se in natura quest’ultimo è poco
frequente. Dal micelio si originano i conidi responsabili delle prime infezioni su foglie e
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grappoli. Gli sclerozi costituiscono supporto per la differenziazione, previa
spermatizzazione, degli apoteci con conseguente formazione di ascospore (Matta,
1996). Le forme di conservazione del fungo sono presenti durante tutte le fasi vegetative
della vite (Mattedi e Varner, 2000), tali forme rimangono latenti nel periodo invernale e
in fase potenzialmente patogena negli altri periodi (Ferrari et al., 1994).
Gli organi della vite colonizzati sono una continua fonte di conidi, in grado di
diffondere la malattia specialmente durante la vendemmia. In autunno abbiamo
nuovamente la differenziazione di micelio e sclerozi.
I conidi di B. cinerea sono attivi ad una temperatura che oscilla tra i 5°C e i
32°C e con una bagnatura della vegetazione di almeno 15 ore. Si quindi è formulata una
regola empirica denominata dei “due quindici” e cioè quando sussistono 15°C di
temperatura e 15 ore di bagnatura della vegetazione si stima essere nel momento
ottimale per la comparsa dell’infezione.
I conidi, responsabili della diffusione delle infezioni ad opera soprattutto del
vento, sono idrofobici al momento del rilascio, ma richiedono la presenza di acqua per
germinare (Matta, 1996). Giunti sul tessuto vegetale, dove si fissano mediante un
appressorio, producono un promicelio. Inizia a questo punto la fase di penetrazione
delle ife nei tessuti vegetali. Possiamo, in questa fase, assistere ad una penetrazione di
tipo stomatico, anche se risulta essere rara. I conidi generando un tubetto germinativo
sono in grado di perforare direttamente la cuticola producendo enzimi capaci di
dissolvere le membrane.
Il fungo può penetrare passivamente attraverso lesioni o ferite determinate da
fattori biotici, quali insetti o altre malattie fungine, oppure da fattori abiotici, come la
grandine o dalle lavorazioni meccaniche. I residui fiorali, o altre parti morte delle piante
colonizzate dal parassita non solo costituiscono sorgenti d’inoculo, ma anche una fonte
nutrizionale per avviare l’infezione (Matta, 1996).
Al termine del periodo d’incubazione, stimato essere circa 6-8 giorni,
compaiono sui frutti i primi sintomi di marciume molle, più o meno profondi dai quali
avviene l’evasione.
17
2.9.3. Sintomi
Sui grappoli è visibile la caratteristica muffa grigia (Figura 1) costituita da conidiofori e
da conidi. I grappoli sono maggiormente suscettibili dopo l’invaiatura (inizio
maturazione). Durante questa fase assistiamo a delle modificazioni di natura fisica e
chimica all’interno dell’acino, con aumento della concentrazione zuccherina e graduale
riduzione dello spessore cuticolare. Soprattutto l’accumulo degli zuccheri favorisce le
fasi di germinazione e di penetrazione degli elementi vegetativi del fungo nei tessuti
dell’acino (Ferrari et al., 1994).
Figura 1: sintomi di B. cinerea su grappolo, vitigno Merlot
I sintomi sulle foglie sono poco frequenti e di scarsa importanza. In primavera al
verificarsi di condizioni climatiche favorevoli con la presenza di frequenti
precipitazioni, temperature miti e prolungate ore di bagnatura, foglie giovani, grappolini
e germogli risultano suscettibili all’attacco da parte di questo patogeno. In regioni del
nord Italia, come il Trentino-Alto Adige, gli attacchi in questa fase fenologica
avvengono di rado e non comportano grossi danni. Sulle foglie compaiono delle necrosi
18
rossastre localizzate, soprattutto sui bordi fogliari. Le necrosi in seguito possono
espandersi fino ad interessare tutta la pagina fogliare se le condizioni rimangono
favorevoli per il patogeno. Nella maggior parte dei casi assistiamo ad un disseccamento
delle parti colpite. B. cinerea quando attacca piccioli e peduncoli determina la comparsa
di lesioni asciutte (Matta, 1996).
L’attacco a germogli e tralci risulta essere circoscritto al periodo primaverile; sui
germogli sono visibili dei marciumi molli che tendono a necrotizzare e disseccare
(Ferrari et al., 1994). Sui tralci erbacei è possibile notare degli imbrunimenti diffusi
accompagnati da necrosi. Su essi si possono trovare degli organi di conservazione del
fungo (sclerozi) visibili come corpiccioli nerastri.
2.9.4. Fattori che influenzano le infezioni di B. cinerea
Condizioni inerenti alla zona di produzione, quali clima e suolo, risultano essere fattori
determinanti per lo sviluppo di questa malattia. Zone di fondovalle umide, con
ventilazione quasi assente, sono favorevoli all’attacco di questo patogeno. Dal punto di
vista climatico B. cinerea ha bisogno di temperature ottimali comprese fra i 15°C e i
22°C, l’optimum per la germinazione dei conidi è 22°C (Fregoni, 1998). In tale
situazione i vigneti posti ad altitudini elevate, dove una maggiore ventilazione riduce il
ristagno di umidità risentono meno degli attacchi di B. cinerea.
In terreni compatti, poco drenati con ristagni idrici sono più soggetti a B.
cinerea. Inoltre i suoli argillosi favoriscono la muffa grigia in quanto l’apparato radicale
risulta essere poco profondo la pianta risente delle variazioni idriche e le bacche
risultano più soggette a fessurazioni (Fregoni, 1998).
La vigoria elevata, in terreni fertili, provoca un maggiore ombreggiamento dei
grappoli, una più deficiente aerazione che facilita i ristagni di umidità. Tutto ciò porta
alla formazione di un microclima adatto allo sviluppo del patogeno. Le carenze di calcio
e magnesio, elementi importanti per la produzione dei pectati che costituiscono le
membrane e cementano le membrane cellulari, favoriscono la penetrazione del micelio
(Fregoni, 1998).
19
Concimazioni eccessive specialmente azotate portano, come i terreni fertili, ad
un aumento della vigoria con conseguente formazione di un microclima favorevole a B.
cinerea.
L’utilizzo di varietà a grappolo compatto aumenta sensibilmente la comparsa di
B. cinerea. Molto sensibili risultano essere le varietà bianche quali Pinot grigio, Pinot
bianco, Pinot nero e Chardonnay. Per quanto riguarda le varietà nere, il Teroldego è
molto suscettibile alla Muffa grigia, mentre Cabernet e Merlot lo sono in misura minore.
La selezione di cloni grappolo “spargolo” all’interno di una stessa varietà può
aiutare a ridurre il problema. I grappoli compatti sono in grado di trattenere
maggiormente i residui fiorali al loro interno, costituendo un ottimo substrato per B.
cinerea, specialmente in annate con piogge abbondanti e prolungate nel periodo tra
fioritura ed allegagione (Mattedi eVarner, 2000). Le lesioni causate dall’attacco di
fitofagi (tignoletta e tignola) o altre malattie, come l’oidio, facilitano l’ingresso
direttamente del fungo all’interno dell’acino. Non è comunque sufficiente la sola difesa
contro insetti e malattie per eliminare un eventuale attacco da parte della muffa grigia.
I sistemi d’allevamento giocano sicuramente un ruolo fondamentale come
prevenzione nei confronti di B. cinerea. Forme a spalliera, come guyot e cordone
speronato, mantengono i grappoli più asciutti e meglio esposti alla luce. Sistemi a
tendone, o a pergola non sono sicuramente ideali per varietà sensibili a questo patogeno.
Un buon equilibrio vegeto-produttivo dei vigneti è fondamentale per ottenere una
produzione di qualità. Spesso si riscontrano situazioni in cui eccessive concimazioni
azotate, e uso poco accorto dell’irrigazione danno origine a vigneti poco equilibrati. In
tali situazioni si riscontra un aumento dell’ombreggiamento dei grappoli dovuto ad un
aumento degli strati fogliari. Come conseguenza si genera un microclima più favorevole
allo sviluppo di B. cinerea e altre crittogame, come la peronospora. Infatti, sono
riscontrabili bagnature più prolungate della vegetazione. Non si esclude una perdita di
consistenza della buccia con sensibile aumento ai marciumi (Mattedi eVarner, 2000).
Un fattore molto importante che determina la muffa grigia consiste nella sostituzione di
fungicidi tradizionali a base di rame con ditiocarbammati ed altri pesticidi (Brambilla,
1999). Il rame avendo una parziale fitotossicità deprime il vigore ed aumenta
l’elasticità, la resistenza e lo spessore delle cuticole (Fregoni, 1998). Non è da escludere
come un’eccessiva maturazione delle uve aumenta la predisposizione all’attacco di B.
cinerea.
20
2.9.5. Difesa contro B. cinerea
L’infezione da parte di questo patogeno può essere prevenuta adottando alcuni
accorgimenti di tipo agronomico, in particolare favorendo tutte le condizioni che
permettono ai grappoli di mantenersi asciutti e ricevere una buona aerazione. In
quest’ottica diventano molto importanti alcune scelte quali i sesti d’impianto,
l’orientamento dei filari e la forma di allevamento. Tutto accompagnato da una corretta
gestione agronomica del vigneto, sfogliatura, eliminazione delle “femminelle” e
cimatura sono pratiche che sfavoriscono la comparsa del patogeno.
La difesa chimica contro B. cinerea, oltre che dal prodotto impiegato, dipende
molto dalla qualità della distribuzione. In situazioni viticole in cui predominano forme
di allevamento chiuse (tendone, pergola) la bagnatura con il trattamento dei grappoli
risulta essere un punto cruciale. La professionalità dell’operatore è uno dei fattori
predominanti nella corretta applicazione dei trattamenti. La manutenzione delle
macchine irroratrici e la modalità di distribuzione devono garantire un’efficiente e
uniforme distribuzione del prodotto chimico.
I momenti critici nei quali intervenire con i trattamenti chimici sono
individuabili in: fine fioritura, chiusura grappolo, invaiatura e 21 giorni prima della
raccolta. Attualmente i prodotti comunemente impiegati in Italia appartengono alla
famiglia delle anilino-pirimidine (Scala, Switch). La strategia di difesa in Trentino è
orientata in un unico trattamento nella fase pre-chiusura grappolo per le varietà bianche,
mentre per le varietà rosse, si interviene all’invaiatura. La lunga persistenza di questi
prodotti garantisce una buona protezione.
Uno dei grossi problemi della difesa contro la muffa grigia è l’elevata capacità
del patogeno di sviluppare popolazioni resistenti. Questo è dovuto sicuramente al
meccanismo di azione estremamente specifico di alcuni fungicidi ed al numero di
trattamenti eseguiti per stagione (Gullino e Garibaldi, 1997). Un esempio è la resistenza
che si è creata da parte di B. cinerea a benzimidazoli e fenilammidi. La
commercializzazione di nuovi principi attivi come le anilino-pirimidine è accompagnata
da adeguate norme d’impiego, basate sul ricorso ad un numero limitato di trattamenti (al
massimo 1-2 per stagione). La presenza di ceppi resistenti è comunque già stata
segnalata in Francia (Leroux e Despote, 1996) ed in Svizzera (Hilber e Scuepp, 1996). I
nuovi disciplinari regionali tendono a limitare l’utilizzo di prodotti chimici per la difesa
21
antibotritica, sia per la loro elevata persistenza nell’ambiente, ma anche per eventuali
residui nei vini.
In agricoltura biologica purtroppo non esistono mezzi tecnici efficaci per
prevenire le infezioni. Trichoderma harzianum T39 (Trichodex) impiegato nella difesa
antibotritica fino a pochi anni or sono, non è attualmente commercializzato. Il
Regolamento CEE 2092/91 definisce i prodotti fitosanitari, fertilizzanti, preparati
biodinamici, macchine agricole ecocompatibili, sementi e materiale vivaistico
impiegabili in agricoltura biologica. E’ però anche noto che il minor impatto
sull’agroecosistema e l’ambiente determinato dalle tecniche biologiche è dato non dalla
semplice sostituzione di sostanze chimiche di sintesi con sostanze naturali, ma al
ripristino e alla conservazione della fertilità fisica, chimica e biologica del suolo alla
salvaguardia della biodiversità e delle varie forme di vita presenti nel suolo. Questo
approccio non è sempre sufficiente a contenere patogeni e parassiti. Uno dei problemi
riguardanti la difesa fitosanitaria è la mancanza di una vasta scelta di prodotti specifici
contro le principali malattie. Se aggiungiamo poi l’elevato costo di quelli disponibili,
associato ad un’efficacia non sempre ottimale, è logico pensare in futuro ad una perdita
d’interesse da parte degli agricoltori nell’intraprendere la coltivazione biologica.
Oltre a promuovere una corretta applicazione di tecniche agronomiche, è
necessario quindi individuare nuovi prodotti naturali a basso impatto ambientale a costi
sostenibili.
22
3. SCOPO DELLA TESI
La muffa grigia è una delle principali malattie della vite. Stagioni favorevoli allo
sviluppo della malattia con alto rischio di perdita dell’intera produzione sono frequenti.
In agricoltura biologica non esistono prodotti efficaci contro B. cinerea. In medicina
vengono utilizzati farmaci di origine naturale contro le micosi che colpiscono l’uomo.
La fitoterapia prevede l’uso di oli essenziali, tinture madri o gemmoderivati contro le
principali micosi che colpiscono l’uomo e gli animali. Non è da escludere il fatto che
prodotti con azione antisettica efficaci contro le micosi o le batteriosi sull’uomo lo siano
anche contro B. cinerea, essendo esso stesso un fungo. Lo scopo di questa tesi è
verificare se B. cinerea è sensibile ad alcuni antimicotici utilizzati nella fitoterapia e se
la muffa grigia della vite possa essere combattuta mediante essi. L’efficacia di questi
prodotti di origine naturale verrà valutata in ambiente controllato in laboratorio e
verificata in vigneto in condizioni commerciali.
23
4. MATERIALI E METODI
4.1. Estratti vegetali utilizzati
Il materiale utilizzato è stato acquistato presso un’erboristeria autorizzata (L’Achillea,
Vezzano, TN). Nella tesi sono stati utilizzati 15 prodotti (Figura 2). Nella tabella 1 sono
riportati i prodotti e le loro caratteristiche commerciali.
Figura 2: Oli essenziali, tinture madri, gemmoderivati utilizzati nelle prove
24
Tabella 1. Oli essenziali ed estratti vegetali usati in questa tesi
Nome
Azienda
Composizione e Principi
Dosi Consigliate
Quantità
Prezzo
Commerciale
Produttrice
Attivi
in ambito umano
(ml)
(€)
100
15,50
100
20,66
100
8,40
50
10,50
10
6,50
10
10,60
30
17,60
Alcune gocce
10
11,36
30
17,00
Olio di
Farmaderbe
Olio di Calendula
4 gocce circa per
Calendula
(Udine)
Officinalis pressato a freddo
ogni anno di età
Phito Logic
Vis Medicatrix
Glicerina vegetale, acqua,
12 gocce per adulti
Baptisia
Naturale (Firenze)
Baptisia tinctoria
Alfa Omega
ALFA OMEGA
Tintura al 10% di Thuja
Thuja
s.r.l
occidentalis, Alcool 40%,
1 cucchiaio da tè
Occidentalis
Copparo (FE)
acqua
per adulti
BIOGEMMO
Laboratori
Glicerina, alcoolo etilico,
50 gocce due volte
G Ribes
BIOKYMA
acqua, Ribes nigrum
al giorno
Nigrum
Anghiari (AR)
gemme fresche 1,5 %
BIOESSENZA
Laboratori
Olio essenziale 100%
10-30 gocce diluito
Olio essenziale
BIOKYMA
Rosmarinus officinalis
in acqua
Rosmarino
Anghiari (AR)
Sommità fiorite
ABOCA
Aboca azienda
Olio essenziale 100% di
5-10 gocce diluito
Ginepro
agraria
ginepro Bacche Juniperus
in acqua
Sansepolcro (AR)
communis
VITAL
VITAL BIOTIX
Acqua, glicerina vegetale,
5-12 gocce diluite
BIOTIX Dt.
Dt. Joseph Brunico
estratti fluidi (20%) di semi
in un bicchiere
Joseph gocce
(BZ)
e polpa di pompelmo
d’acqua (100ml)
T.M.G.
S.I
concentrato di
(Citrus x paradisi)
pompelmo
GSE.33%
Phito Logic
Vis Medicatrix
Olio essenziale 100% di
Chiodi di
Naturale (Firenze)
Eugenia caryophyllata
H.B. Noce nera
Nature’s answer
Noce nera mallo (Juglans
10-15 gocce in
estratto
N.Y.USA
nigra) estratto glicerina
acqua
garofano
vegetale da cocco, acqua
purificata
25
Tabella 1. Continua
Nome
Azienda
Composizione e Principi
Dosi Consigliate
Quantità
Prezzo
Commerciale
Produttrice
Attivi
in ambito umano
(ml)
(€)
Da 2-10 gocce
5
13,60
Da 2-10 gocce
10
13,62
Da 2-10 gocce
5
11,40
Da 2- 4 gocce
5
13,60
Da 10-15 gocce
30
18,00
Melaleuca alternifolia pura
10-20 gocce; poche
10
9,00
al 100%
gocce contro le
Timo bio tipo
Germania,
Olio essenziale puro al
linalolo
distribuito da La
100% di Thymus zygis
Neumond
piramide, Brescia
Lavanda spica
Germania,
Olio essenziale puro al
bio Neumond
distribuito da La
100% di Lavandula
piramide, Brescia
latifolia
Manuka
Germania,
Olio essenziale puro al
Neumond
distribuito da La
100% di Leptospermum
piramide, Brescia
scoparium
Germania,
Olio essenziale puro al
distribuito da La
100% di Cupressus
piramide, Brescia
sempervirens
Nature’s answer
Propoli (resina di Apis
N.Y. U.S.A.
mellifera), estratto glicerina
Cipresso bio
H.B. Propoli
vegetale da cocco, acqua
purificata
Ord River Tea
tree oil
Ord River, England
micosi
26
4.1.1. Preparazione del substrato di coltura
Le prove sono state svolte presso il laboratorio del Centro SafeCrop dell’Istituto agrario
di S. Michele all’Adige.
Come substrato di crescita è stato utilizzato l’agar patata destrosio, meglio noto
con il termine inglese potato dextrose agar (PDA, Oxoid) in piastre Petri di 9 cm di
diametro (piastre Petri, steril). La preparazione del substrato è molto semplice (Figura 3)
e si basa sull’utilizzo della polvere liofilizzata disponibile commercialmente.
Figura 3. Diverse fasi della preparazione del substrato di coltura (agar potato destrosio)
27
4.1.2. Preparazione dell’inoculo di B. cinerea
Nelle sperimentazioni è stato utilizzato un isolato di B. cinerea proveniente da frutti di
actinidia infetti raccolti nel 1997 a Spilimbergo (UD). L’isolato è stato cresciuto su
PDA per tre settimane a 25° C. I conidi utilizzati nelle prove sono stati rimossi dalla
superficie delle piastre (Figura 4) utilizzando 10 ml di acqua sterile contenente 0,001 %
di Tween 80 (Sigma) aggiunto allo scopo di portare uniformemente in sospensione i
conidi idrofobici.
La sospensione è stata filtrata attraverso due strati di garza sterile e la
concentrazione dei conidi presenti è stata contata mediante un vetrino conta globuli
“Thoma”. La concentrazione conidica utilizzata è stata di 4x104 conidi/ml.
Figura 4. Diverse fasi della preparazione dell’inoculo di Botrytis cinera
28
4.2. Valutazione dell’efficacia degli estratti vegetali sull’inibizione della
germinazione dei conidi e della crescita miceliare di B. cinerea
4.2.1. Identificazione degli estratti vegetali con attività inibente nei confronti di B.
cinerea
La sospensione conidica (1 ml) posta in provette Eppendorf è stata centrifugata
(centrifuga Mini Spin Plus, Eppendorf,) a 9000 giri/minuto per 20 minuti (Figura 5) ed
il surnatante è stato eliminato. Sono stati aggiunti 100 μl degli estratti vegetali elencati
in tabella 1, senza diluizione. Due provette servivano rispettivamente come controllo
positivo (conidi + 100 μl di acqua sterilizzata) e negativo (100 μl di acqua sterilizzata).
Dopo un’incubazione di 5 minuti, tenendo le provette in agitazione mediante Vortex
(Vibromix, PBI) il contenuto di ciascuna è stato trasferito in tubi Falcon da 15 ml con
l’aggiunta di 9,5 ml di acqua sterile (Figura 5).
In condizioni di sterilità, 500 μl di ciascuna sospensione sono stati trasferiti in
45 piastre Petri contenenti PDA. Sono state effettuate tre ripetizioni (piastre) per ogni
estratto vegetale. In tre addizionali piastre Petri sono stati trasferiti 500 μl di
sospensione conidica non trattata con alcun estratto vegetale (controllo positivo) e in tre
ulteriori piastre Petri, sono stati posti 500 μl di acqua (controllo negativo). Con un’ansa
ad “L” le diverse sospensioni sono state distribuite uniformemente sulla superficie di
ogni piastra. Le piastre sono state lasciate ad incubare per 48 ore a 20 C° (Figura 6). I
risultati sono stati valutati contando il numero di colonie per piastra (Unità Formanti
Colonia, UFC) e misurando il diametro (in cm) di dieci di colonie scelte a random.
I dati raccolti sono stati elaborati statisticamente utilizzando il programma
Statistica (Statsoft) mediante ANOVA e applicando il test di Fisher per la separazione
dei trattamenti.
29
Figura 5. Fasi di preparazione delle provette Eppendorf contenenti l’inoculo di Botrytis
cinera, centrifugazione ed eliminazione del surnatante. aggiunta dell’estratto vegetale o
dell’acqua sterile
30
Figura 6. Diverse fasi della preparazione delle piastre inoculate con Botrytis cinerea, e
trattamento con gli estratti vegetali
4.2.2. Valutazione in vitro dell’efficacia inibente nei confronti di B. cinerea degli
estratti vegetali
La prima prova aveva l’obiettivo di selezionare gli estratti che presentavano sia efficacia
inibitoria nei confronti della germinazione dei conidi, sia sullo sviluppo miceliare di B.
cinerea. In seguito ad essa tra i 15 estratti vegetali iniziali ne sono selezionati 8: M.
alternifolia, Citrus x paradisi, E. caryophyllata, Propoli, L. latifolia, T. zygis, T.
occidentalis, R. officinalis.
Nella seconda prova si intendeva valutare l’efficacia di concentrazioni inferiori
(diluizioni) degli oli risultati attivi e stimare la concentrazione alla quale il 50 % dei
conidi di B. cinerea presenta inibizione della germinazione (CL50). La metodologia
utilizzata è stata la medesima di cui al punto 4.2.1., mentre gli estratti sono stati diluiti
1:5, 1:10 e 1:100 (V:V) in acqua distillata sterile.
31
4.2.3. Valutazione dell’efficacia degli estratti vegetali nei confronti di B. cinerea su
acini di Pinot Grigio
L’inoculo era costituito da una sospensione conidica preparata con la medesima
metodologia delle prove in vitro. Sono stati raccolti 20 grappoli maturi di Pinot Grigio
da piante non trattate precedentemente con prodotti dall’azione antibotritica. Gli acini
sono stati separati dal raspo lasciando il pedicello per evitare che dalla ferita potessero
entrare agenti patogeni estranei. Sono stati valutati tutti gli estratti vegetali elencati in
tabella 1. Gli acini sono stati posti in piastre a pozzetti multipli (piastra 24 pozzetti,
Greiner bio-one). Per ogni estratto vegetale sono state effettuate 3 ripetizioni, con 4
acini ciascuna. Il controllo positivo è stato inoculato, mentre il controllo negativo non è
stato inoculato, ma trattato solo con acqua sterile. L’inoculazione è stata effettuata
depositando una goccia di sospensione conidica (10μl) al di sopra di una microferita
effettuata con la punta di un ago. (Figura 8).
Figura 8. Diverse fasi della preparazione degli acini in laboratorio e dell’inoculazione
32
Non appena le gocce di sospensione si sono asciugate (circa due ore) è stato
deposto su ciascuna una goccia dell’estratto vegetale da valutare (Figura 9).
La valutazione dello sviluppo della B. cinerea sugli acini è stata effettuata
visivamente, considerando per ciascun acino la percentuale di superficie colpita dal
patogeno (gravità). Si sono eseguite sei valutazioni alle seguenti date: 5/09/2006
(comparsa sintomi), 6/09/2006, 7/09/2006, 11/09/2006, 15/09/2006, 13/09/2006. Per
rendere più completa la comprensione dei dati è stata calcolata l’area sottostante la
curva di sviluppo malattia dalla comparsa dei sintomi fino alla stabilizzazione della
progressione dei sintomi (ACSM).
Figura 9. Diverse fasi della preparazione degli acini in laboratorio
33
4.2.4. Valutazione dell’efficacia in campo di un estratto vegetale con attività
inibente nei confronti di B. cinerea su grappoli di Pinot Grigio
La prova in campo è stata eseguita su Pinot grigio clone SMA 505, anno d’impianto
1996, allevato a pergola doppia trentina. Dalla valutazione dei test in vitro su substrato
ed in condizioni controllate sugli acini, l’estratto vegetale Citrus x paradisi risulta il più
efficace contro B. cinerea. Si è deciso quindi di testarlo in campo. Durante la stagione
vegetativa le piante non hanno subito alcun trattamento con fungicidi attivi nei confronti
di B. cinerea. Per la prova sono stati scelti 30 grappoli sani e sono stati trattati con
l’estratto. Grappoli simili, ma senza trattamento con l’estratto sono stati inclusi nella
prova come testimone non trattato. Il trattamento è stato eseguito il 1/08/06 spruzzando
uniformemente i grappoli (Figura 10) con uno spruzzatore manuale a pressione (10 ml/l
di estratto in acqua).
Al momento in cui i grappoli risultavano asciutti (circa un’ora) sono stati
immediatamente avvolti in sacchetti trasparenti di polietilene per alimenti per creare le
condizioni ottimali di sviluppo della muffa grigia.
Il primo rilievo è stato effettuato il 14/09/2006 data alla quale sono stati
rimossi i sacchetti. Per ogni grappolo sono stati contati il numero di acini colpiti da B.
cinerea. A tale data i grappoli non trattati manifestavano lievi sintomi di Muffa grigia. È
seguito un secondo rilievo il 18/09/2006. I dati raccolti sono stati elaborati
statisticamente utilizzando il programma Statistica (Statsoft) mediante ANOVA e
applicando il test di Fisher .
34
Figura 10. Diverse fasi della preparazione dei grappoli in campo
4.2.5 Valutazione dell’efficacia in campo di due estratti vegetali con attività
inibente nei confronti di B. cinerea su grappoli di Merlot
In una seconda prova di campo si è voluto confrontare l’efficacia dell’estratto di Citrus
x paradisi con E. caryophyllata. La metodologia applicata è stata la medesima di cui al
punto 4.2.4. I trattamenti con gli estratti sono stati eseguiti il 15/09/06. L’estratto di E.
caryophyllata risulta inibire in modo analogo lo sviluppo di B. cinerea sugli acini
trattati in laboratorio, ma perde l’efficacia sulla crescita del micelio se viene diluito.
Il 2/10/2006 corrisponde alla data del primo rilievo a cui sono stati rimossi tutti
i sacchetti (Figura 11); il 10/10/2006 è la data del secondo rilievo.
35
Figura 11. Diverse fasi della preparazione dei grappoli in campo
36
5. RISULTATI E DISCUSSIONE
5.1. Valutazione dell’efficacia degli estratti vegetali sull’inibizione della
germinazione dei conidi e della crescita miceliare di B. cinerea
5.1.1. Identificazione degli estratti vegetali con attività inibente nei confronti di B.
cinerea
La prima valutazione riguarda l’efficacia degli estratti vegetali sull’inibizione
della germinazione dei conidi di B. cinerea. Dei 15 estratti vegetali valutati, uno (J.
Nigra) non riduce la germinazione dei conidi di B. cinerea (Figura 13). Quattordici
estratti risultano invece esserne inibitori del processo di germinazione. Ben sette estratti
vegetali bloccano la germinazione e di conseguenza la comparsa di colonie in piastra (L.
latifolia, T. occidentalis, T. zygis, R. officinalis, E. caryophyllata, Citrus x paradisi,
Propoli). I rimanenti estratti vegetali, M. alternifolia, B. tinctoria, J communis, C.
officinalis, R. Nigrum, C. sempervirens, L. scoparium, anche se non risultano
significativamente diversi dai precedenti, permettono comunque una parziale
germinazione di B. cinerea.
37
160
b
140
120
b
UFC/ml
100
80
a
60
a
40
20
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
La
va
nd
Th u la
uj
a latif
oc
cid olia
Ro
e
T
sm
hy nta
a
lis
m
Eu rin
ge us us z
y
ni
a off i gis
ca ci
n
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0
Figura 13. Inibizione della germinazione dei conidi di B. cinerea determinata dal trattamento
con i diversi estratti naturali. I valori sono espressi come unità formanti colonia (UFC)/ml di
sospensione conidica (4x104 conidi/ml). Lettere diverse indicano differenze significative (Test
di Fisher, P<0.05)
Il secondo parametro considerato è la crescita del micelio di B. cinerea valutato
misurando il diametro delle colonie sviluppatesi in piastra. Sette estratti vegetali (L.
latifolia, T. occidentalis, R. Nigrum, R. officinalis, T. zygis, Citrus x paradisi, E.
caryophyllata, Propoli) inibiscono la crescita delle colonie di B. cinerea (Figura 14). Per
quanto riguarda gli estratti vegetali M. alternifolia, L. scoparium, B. tinctoria, J. nigra,
C. sempervirens, C. officinalis, essi non hanno nessun effetto inibente sullo sviluppo
delle colonie. Un estratto vegetale (J. Communis) risulta promuovere la crescita. Sempre
analizzando i dati si è visto che R. nigrum, non interferisce sulla germinazione dei
conidi, ma risulta inibente sulla loro crescita.
Tra gli estratti vegetali testati e segnalati in bibliografia come attivi nei
confronti di microrganismi patogeni umani o limitanti lo sviluppo delle infezioni
sull’uomo, la pressoché totalità di essi risulta attiva anche nei confronti del fungo
patogeno della vite B. cinerea. Quando si valuta però la riduzione del diametro di quelle
colonie frutto dei pochi conidi germinati, si nota, all’opposto, che molti di essi hanno
38
un’efficacia limitata. Questo fatto potrebbe essere legato all’azione limitata nel tempo
da parte dell’estratto (denaturazione nelle condizioni sperimentali), dall’effetto di
diluizione che si esercita nel momento in cui le sospensioni vengono poste su piastra o
ad eventuali meccanismi di detossificazione da parte del fungo che ne inattivano
l’effetto.
2,0
Diametro colonia (cm)
e
1,5
1,0
d
d
d
d
cd
bcd
0,5
bc
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0,0
Figura 14. Inibizione della crescita delle colonie di B. cinerea in piastre a seguito del
trattamento dei conidi con i diversi estratti naturali (1:1, sospensione conidica:estratto). I valori
sono espressi in diametro delle colonie (cm). Lettere diverse indicano differenze significative
(Test di Fisher, P<0.05)
39
5.1.2. Valutazione dell’efficacia in vitro degli estratti vegetali con attività inibente
nei confronti di B. cinerea
M. alternifolia, Citrus x paradisi, E. caryophyllata, Propoli, L. latifolia, T. zygis, T.
occidentalis e R. officinalis risultano gli otto estratti vegetali che hanno dato i migliori
risultati nella prima valutazione di laboratorio vedi punto 5.1.1 e che, nello specifico,
hanno inibito completamente la germinazione dei conidi.
La diluizione degli estratti vegetali nella globalità è correlata ad un calo
dell’effetto inibente sulla germinazione dei conidi di B .cinerea (Figura 15). Tra gli otto
estratti vegetali presi in considerazione solo Citrus x paradisi mantiene un effetto
inibente a tutte le diluizioni eseguite. Un secondo estratto vegetale E. caryophyllata,
statisticamente ha un effetto inibente a tutte e tre le diluizioni eseguite, ma partendo
dalla diluizione 1:10 si nota un trend dell’effetto in diminuzione. Probabilmente il suo
effetto tende ridursi, anche se la sua azione antigerminazione rimane significativa.
L’effetto inibitore di alcuni estratti vegetali (M. alternifolia, Propoli, L. latifolia, T.
zygis) si nota fino alla diluizione 1:5 e aumentando la diluizione il loro effetto inibente
tende ad affievolirsi. R. officinalis e T. occidentalis, rispetto agli altri estratti di origine
vegetale già alla diluizione 1:5 non hanno un effetto inibente sulla germinazione
conidica.
40
d
140
UFC/ml
120
100
c
80
60
40
20
a
a
a
a
a
a
b
0
140
g
120
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UFC/ml
100
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b
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140
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120
UFC/ml
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d
100
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20
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0
Figura 15 Inibizione della germinazione dei conidi di B. cinerea determinata dal
trattamento con i diversi estratti naturali diluiti (1:5, 1:10, 1:100). I valori sono espressi
come unità formanti colonia (UFC)/ml di sospensione conidica (4x104 conidi/ml). Lettere
diverse indicano differenze significative (Test di Fisher, P<0.05). Dall’alto al basso
rispettivamente le diluizioni 1:5, 1:10 e 1:100
41
Per quanto riguarda la crescita del micelio alla diluizione 1:5 sei estratti vegetali (M.
alternifolia, Citrus x paradisi, E. caryophyllata, Propoli, L. latifolia, T. zygis) inibiscono
la crescita del micelio di B. cinerea. È comunque da sottolineare che T. zygis, determina
un leggero sviluppo di micelio in piastra, anche se statisticamente non significativo
(Figura 17).
L’estratto vegetale T. occidentalis non ha nessun effetto inibente sulla crescita
del micelio. R. officinalis risulta promuovere la crescita del micelio di B. cinerea,
infatti, supera di gran lunga i valori del non trattato. Esiste comunque una correlazione
tra UFC/ml e diametro della colonia, infatti estratti vegetali che riducono la
germinazione a pochi conidi, permettono lo sviluppo di poche colonie, ma con diametri
maggiori. Invece estratti vegetali con elevate germinazioni conidiche sviluppano colonie
di B. cinerea con diametri più piccoli. Ed esempio si può confrontare, alla diluizione
1:5, le UFC/ml dopo trattamento dei conidi con R. officinalis (Figura 15) con il suo
rispettivo diametro sempre alla stessa diluizione (Figura 16). Alla diluizione 1:10 è da
rilevare che Citrus x paradisi non sviluppa nessuna colonia invece Propoli, promuove lo
sviluppo di colonie. La diluizione 1:100 conferma il Citrus x paradisi, come estratto
vegetale inibente la crescita miceliare di B. cinerea, mentre E. caryophyllata, in questo
caso risulta promuovere la crescita delle colonie di B. cinerea. Anche in questo caso
confrontando alla diluizione 1:100 le UFC/ml (unità formanti colonia per ml
dell’estratto) ed il diametro delle colonie dopo trattamento con E. caryophyllata appare,
che i pochi conidi cresciuti sulla piastra si siano sviluppati con diametri maggiori
rispetto ad estratti che consentono una germinazione maggiore di conidi.
La spiegazione può essere ricercata nella minor competizione che le poche
colonie formatesi esercitano tra loro rispetto alle piastre con maggiori densità di colonie
o alla perdita di efficacia dell’estratto vegetale per diluizione delle tossine. In questo
secondo caso quindi le sostanze ad effetto tossico vengono diluite al di sotto della soglie
di efficacia ed eventuali fattori promuoventi la crescita presenti nell’estratto continuano
ad esercitare la loro azione anche a bassa concentrazione.
42
Diametro colonie (cm)
1,2
c
1,0
0,8
b
b
0,6
0,4
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Diametro colonie (cm)
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Diametro colonie (cm)
1,2
1,0
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c
c
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0,4
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0,0
Figura 16. Inibizione della crescita delle colonie di B. cinerea in piastre a seguito del
trattamento dei conidi con i diversi estratti naturali diluiti(1:5,1:10,1:100). I valori sono espressi
in diametro delle colonie (cm). Lettere diverse indicano differenze significative (Test di Fisher,
P<0.05). Dall’alto al basso rispettivamente le diluizioni 1:5, 1:10 e 1:100
43
In Tabella 2 sono riportati i valori delle CL
50
degli otto estratti vegetali
calcolati dai risultati di questa prova. Tutti gli estratti presentano valori di Cl50
relativamente alti se si considera l’estratto in se. Va considerato che questo risultato
esprime la concentrazione dell’estratto nella sua globalità, ma molto probabilmente la/le
molecole efficaci in realtà è probabile che siano contenuti in concentrazioni molto basse
nell’estratto stesso. Citrus x paradisi, E. caryophyllata, T. zygis e Propoli hanno un
valore di CL 50 inferiore a 0,01 (ml estratto vegetale /ml acqua). I valori d’inibizione di
questi estratti sulla germinazione dei conidi di B. cinerea sono molto bassi quindi non è
stato possibile calcolare la retta di regressione nell’intervallo di concentrazioni testate.
Tabella 2. Concentrazione dei diversi estratti vegetali in cui la germinazione è inibita per 50 %
dei conidi di Botrytis cinerea (CL 50)
CL 50 (ml estratto vegetale /ml acqua)
Thuja occidentalis
0,33
Rosmarinus officinalis
0,08
Citrus x paradisi
<0,01
Eugenia caryophyllata
<0,01
Thymus zygis
<0,01
Lavandula latifolia
0,09
Propoli
<0,01
Melaleuca aAlternifolia
0,08
44
5.1.3. Valutazione dell’efficacia degli estratti vegetali nei confronti di B. cinerea su
acini di Pinot Grigio
E. caryophyllata, è l’estratto vegetale i cui acini risultano infetti in percentuale minore
(Figura 17) rispetto ai 14 estratti vegetali testati. J. nigra e T. zygis risultano anche
efficaci nei confronti di B cinerea. Un effetto leggermente inferiore, rispetto ai tre
estratti citati precedentemente, è attribuibile a L. latifolia. L’estratto vegetale che nelle
prove di laboratorio in vitro risulta essere il migliore (Citrus x paradisi), sugli acini è
risultato meno efficace nei confronti della B. cinerea, anche se la sua efficacia risulta
stabile nel tempo anche dopo più di un mese d’incubazione. Questi cinque estratti
vegetali in ordine di efficacia E. caryophyllata, J. nigra, T. zygis, L. latifolia, Citrus x
paradisi, sono risultati i più interessanti rispetto ai 15 testati.
La prova eseguita ha permesso di evidenziare il comportamento degli estratti
vegetali a contatto diretto con gli acini. Uno dei fattori da tenere in considerazione per
l’interpretazione dei risultati in questa prova è che molti dei preparati testati non
appartengono ad una singola categoria, infatti E. caryophyllata, T. zygis, L. latifolia
sono oli essenziali mentre, J. nigra e Citrus x paradisi, sono dei gemmoderivati. La loro
azione fisica nei confronti dell’acino è sicuramente diversa e non trascurabile. Gli oli
essenziali si attaccano meglio alla buccia dell’acino mentre i gemmoderivati come J.
nigra, e il macerato glicerico Citrus x paradisi essendo molto più liquidi tendono a
scivolare.
Nella globalità dell’esperimento si vede come passando da condizioni
controllate in vitro a trattamenti su una porzione della pianta (acino) l’efficacia
inibitoria degli estratti risulta inferiore. Questo effetto è stato ampiamente documentato
in bibliografia in moltissimi sistemi pianta/patogeno e con prodotti naturali di svariata
origine. Ciò è, in gran parte dei casi, legato alla minor efficacia dei prodotti naturali e
dalla loro bassa persistenza in condizioni naturali.
45
120
Non trattato
C. officinalis
100
B. tinctoria
Acini infetti (%)
T. occidentalis
80
R. nigrum
R.officinalis
60
J.communis
C. x paradisi
E. caryophyllata
40
J. Nigra
T. zygis
20
L. latifolia
L. scoparium
10
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0/
06
05
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06
30
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20
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06
15
/0
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06
C. sempervirens
10
/0
9/
06
05
/0
9/
06
0
Propoli
M. alternifolia
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b
4000
3500
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3000
b
b
b
b
b
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b
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2500
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1500
1000
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Figura 17. Curve di sviluppo di B. cinerea, con grafico relativo all’area sottostante le curve di
sviluppo della malattia, su acini trattati in laboratorio con 15 estratti vegetali (1:1, sospensione
conidica:estratto). Lettere diverse indicano differenze significative (Test di Fisher, P<0.05)
46
5.1.5 Valutazione dell’efficacia in campo di un estratto vegetale con attività
inibente nei confronti di B. cinerea su grappoli di Pinot Grigio
Com’è possibile vedere (Figura 18) la gravità ossia la percentuale di superficie del
grappolo colpita è diversa dal non trattato al trattato. Alla data del primo rilievo il non
trattato ha una gravità pari al 26% contro un 13,6% del trattato con Citrus x paradisi. Il
risultato più significativo rimane all’ultimo rilievo dove il non trattato ha gravità 90%
contro un 43,43% del trattato. Il trattamento con Citrus x paradisi abbassa la
percentuale d’attacco di circa il 50%.
Non trattato
Citrus x paradisi
100
a
Gravità su grappolo (%)
90
80
70
60
50
b
40
30
20
a
b
10
0
14/09/2006
18/09/2006
Figura 18. Inibizione sullo sviluppo di B. cinerea su grappoli di Pinot Grigio trattati con Citrus
x paradisi diluito 1:100. Lettere diverse indicano differenze significative (Test di Fisher,
P<0.05)
47
5.1.6 Valutazione dell’efficacia in campo di due estratti vegetali con attività
inibente nei confronti di B. cinerea su grappoli di Merlot
In (Figura 19) sono riportati i risultati del secondo esperimento in campo. Alla data
2/10/2006 il non trattato presenta una percentuale di attacco sui grappoli del 10,26%, i
grappoli trattati con Citrus x paradisi hanno gravità sui grappoli di 1,73 % mentre i
rimanenti 30 grappoli trattati E. caryophyllata presentano un attacco pari a 1,23%. È
molto evidente che l’effetto inibente dei due estratti vegetali usati è simile. La seconda
valutazione eseguita il 10/10/2006 conferma l’efficacia dei due estratti vegetali, infatti i
grappoli trattati con Citrus x paradisi presentano una gravità su grappolo pari al 3,56%
mentre i campioni trattati con E. caryophyllata si attestano intorno al 3,46%. Il non
trattato arriva ad una percentuale del 16,33%. L’efficacia dei due estratti risulta anche in
questo caso molto simile. Questa prova in campo conferma i risultati ottenuti in
laboratorio Citrus x paradisi e E. caryophyllata hanno un effetto inibente sia sulla
germinazione dei conidi di B. cinerea che sulla crescita delle colonie.
Non trattato
Citrus x paradisi
Eugenia caryophyllata
18
a
Gravità su grappolo (%)
16
14
12
a
10
8
6
b
4
2
b
b
b
0
02/10/2006
10/10/2006
Figura 19. Inibizione sullo sviluppo di B. cinerea su grappoli di Merlot trattati con Citrus x
paradisi diluito 1:100, Eugenia caryophyllata diluito 1:100. Lettere diverse indicano differenze
significative (Test di Fisher, P<0.05)
48
6. CONCLUSIONI
Le prove eseguite in laboratorio ed in campo evidenziano che alcuni derivati vegetali
utilizzati come disinfettanti in ambito umano presentano delle potenzialità anche come
fungicidi in agricoltura. In particolare tra i vari estratti analizzati si è potuto rilevare
l’efficacia inibente contro la B. cinerea di due estratti vegetali: Citrus x paradisi e E.
caryophyllata. L’utilizzo dei due prodotti dopo diluizione (0,01 ml estratto/ml acqua
distillata) sebbene dia risultati promettenti in termini di efficacia nei confronti di B.
cinerea, non sarebbe però economicamente accettabile per un utilizzo commerciale.
Confrontando i costi relativi ai due estratti vegetali con un prodotto chimico di sintesi, è
evidente la loro scarsa competitività commerciale: un trattamento con estratto di Citrus
x paradisi costerebbe 5860 Є/ha. Se valutiamo l’estratto vegetale E. caryophyllata, il
costo sale a 11360 Є/ha. Se si utilizza un agrofarmaco di sintesi, ad esempio un noto
prodotto appartenente alla famiglia delle anilino-pirimidine, il costo ad ettaro è di soli
80 Є. Questa ricerca rappresenta però solo il primo passo del percorso che potrebbe
portare allo sviluppo di nuovi prodotti naturali alternativi agli agrofarmaci di sintesi.
Non è da escludere che l’utilizzo dei due estratti a diluizioni ancora maggiori non dia
risultati pienamente accettabili in campo ed una corretta formulazione potrebbe
ulteriormente ridurne il dosaggio necessario. Una riduzione di costo potrebbe essere
raggiunta con una produzione su ampia scala e con purezze inferiori a quelle richieste
per un farmaco. Un’altra via percorribile potrebbe essere quella dell’identificazione del
principio attivo e della sintesi di molecole analoghe, in modo simile a quanto è avvenuto
recentemente nello sviluppo di noti agrofarmaci, quali le strobilurine.
49
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