ProgettoGECO - Carcinoma ovarico

Titolo del progetto
Caratterizzazione genetica del carcinoma ovarico: implicazioni per la terapia e la
prevenzione (GECO)
Background e razionale scientifico
Il carcinoma ovarico (CO) rappresenta nei paesi occidentali la principale causa di morte tra le
neoplasie ginecologiche.
Si tratta, infatti, di una neoplasia non molto frequente ma altamente letale: in Emilia Romagna,
l’incidenza è di circa 17 casi ogni 100000 abitanti e la mortalità si attesta intorno a 15 casi x
100000, con un rapporto mortalità/incidenza molto elevato (0.83) (fonte: “I tumori in Emilia
Romagna-2”, Regione Emilia Romagna, contributo 67). L’elevata mortalità è principalmente da
ricollegarsi al fatto che, a causa della sintomatologia aspecifica e tardiva, il 75-80% delle
pazienti giunge alla diagnosi ad uno stadio avanzato di malattia (III-IV), caratterizzato da una
sopravvivenza a 5 anni inferiore al 25%.
Purtroppo, però, la relativa rarità del CO e, soprattutto, la scarsa accuratezza delle opzioni
disponibili per la diagnosi precoce non rendono percorribile la strada di uno screening di
popolazione per questa patologia. Tuttavia, si calcola che il 9-15% dei CO insorga in donne
portatrici di una mutazione ereditaria dei geni BRCA1 o BRCA2 predisponente alla malattia
(Zhang et al, 2011; Cancer Genome Atlas Research Network, 2011; Alsop et al, 2012).
L’identificazione di questi casi “ereditari” e l’estensione della valutazione del rischio alle loro
familiari permette di individuare una popolazione di donne ad alto rischio che può beneficiare di
misure di prevenzione e diagnosi precoce. Si stima, infatti, che il rischio di sviluppare un CO
entro i 70 anni ammonti al 39-49% per le donne con mutazione BRCA1 e all'11-18% per le
donne con mutazione BRCA2 (Antoniou et al, 2003, Chen and Parmigiani, 2007). L’esecuzione
della salpingo-ooforectomia profilattica nelle donne con mutazione BRCA si è dimostrata in
grado di ridurre il rischio di CO dell'80-90% e quello di carcinoma mammario del 50% circa
(quando effettuata prima dell’età della menopausa fisiologica), determinando una riduzione della
mortalità pari al 77% (Finch et al, 2006; Finch et al, 2014). Allo stato attuale, tuttavia, l'analisi
dei geni BRCA e' considerata appropriata, e quindi eseguita, solo nelle pazienti con CO che
presentino una storia familiare suggestiva per presenza di altri casi di CO e/o di casi di
carcinoma mammario. Ciò fa sì che sfuggano all'identificazione quelle donne con CO che pur non
presentando familiarità significativa siano portatrici di una mutazione BRCA e che sono stimate
rappresentare il 7% di tutti i casi (Zhang et al, 2011, Alsop et al, 2012). L'estensione del test a
tutti i casi di CO permetterebbe quindi di rendere più capillare l'identificazione delle donne a
rischio genetico.
Altro aspetto su cui agire, ai fini dell'incremento della sopravvivenza, e' indiscutibilmente la
terapia. Negli ultimi 15 anni, nessun farmaco o regime terapeutico si e' dimostrato superiore alla
chemioterapia standard a base di platini e taxani. Nuove speranze sono perciò riposte nella
possibilità di “personalizzare” la terapia sulla base delle caratteristiche molecolari del tumore,
come già avviene per vari tipi di neoplasie. A questo fine appare interessante notare come nel
3% di CO sierosi siano riportate mutazioni acquisite dei geni BRCA, e come in un altro 11% vi
sia una riduzione dell'espressione di BRCA1 (Cancer Genome Atlas Research Network, 2011);
aggiungendo a questi quelli con mutazioni ereditarie, si arriva a un 25% circa di CO che
presentano un deficit di BRCA. I CO con deficit BRCA, sia esso ereditario o acquisito, sono
risultati responsivi alla terapia con inibitori di PARP, che rappresenta quindi un'importante
promessa nell'ottica di una personalizzazione della terapia (Bryant et al, 2005; Audeh et al,
2010).
Questi presupposti rappresentano il razionale per proporre un'analisi sistematica dei geni BRCA a
partire dal tessuto tumorale, il che permetterebbe di identificare sia le mutazioni ereditarie che
quelle acquisite, consentendo al contempo l'identificazione di donne a rischio genetico, in cui il
CO può essere prevenuto, e di un marcatore molecolare utile ai fini prognostici e predittivi.
Altra caratteristica molecolare meritevole di ulteriori approfondimenti e' la presenza di mutazioni
del DNA mitocondriale (mtDNA). Mutazioni di questo sono state a lungo associate ai tumori
solidi di ogni genere (Brandon et al, 2006). Nella maggior parte dei casi si tratta di mutazioni
tumore-specifiche e ad oggi sono considerate eventi modificatori importanti della progressione
tumorale poiché influenzano lo stato energetico cellulare. Poiché la riprogrammazione
metabolica è uno degli hallmark emergenti della cancerogenesi (Hanahan and Weinberg, 2011),
è plausibile che il ruolo delle mutazioni nel mtDNA nel definire la prognosi della malattia sia
preminente. Inoltre, la presenza di tali mutazioni sembra conferire resistenza all’apoptosi e
favorire, in tal modo, la resistenza a farmaci chemioterapici.
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Risultati preliminari da parte del gruppo di ricerca
Le strutture coinvolte nel progetto collaborano tra loro da vari anni per l'assistenza e la ricerca
sui tumori ginecologici. Alcune di queste collaborazioni pongono le basi per il progetto qui
presentato
In primo luogo, e' attivo dalla fine del 2012 il percorso multidisciplinare dell’AOU di Bologna per
l'identificazione e la gestione delle donne a rischio ereditario di neoplasie ginecologiche,
illustrato nella flow-chart che segue, che ha consentito la presa in carico per le misure di
prevenzione e diagnosi precoce di un numero rapidamente crescente di donne ad alto rischio.
Caso di carcinoma endometriale od ovarico
Percorso regionale
rischio eredofamiliare ca
mammario
Scheda familiarità
SSD Oncologia Ginecologica (OncGin)
UO Genetica Medica (GenMed)
UO Gastroenterologia
SSD Oncologia-Addarii
no
Stop
Indicazione
alla
consulenza?
sì
Consulenza rischio
eredo-familiare ca
mammario/ovarico
Spoke Onco Addarii
Invio scheda a Genetica Medica
Pazienti inviati da
altri specialisti o
MMG
Programmazione
consulenza (GenMed)
Richiesta SSN: GenMed
Sospetta
HNPCC
Ambulatorio Tumori
Ereditari Gastrointestinali
Sospetto Ca
mammella/ovaio
ereditario
Pazienti inviati da
altri specialisti o
MMG
Ambulatorio Genetica
Medica
Donne a rischio di
ca ginecologico
Rischio tumori gastrointestinali
Consulenza
Genetica HUB
(GenMed)
Rischio carcinoma mammario
Sorveglianza endoscopica
c/o percorso tumori
ereditari gastrointestinali
Invio in ginecologia programma gestione
rischio (GenMed)
Sorveglianza c/o
percorso regionale
rischio eredo-familiare
ca mammario
Programmazione prestazioni (OncGin)
Richiesta SSN: OncGin
Sorveglianza clinicostrumentale
(Ambulatorio mensile
dedicato e scheda
clinica ad hoc)
Supporto
psicologico alla
presa di
decisione
Annessiectomia
profilattica
(BRCA+)
Inoltre, grazie alla collaborazione tra le unita' cliniche e i ricercatori dell’unità di genetica medica
e' stato possibile dimostrare come le mutazioni del mtDNA siano hit con un ruolo definito nelle
neoplasie ginecologiche, in particolare nei carcinomi endometriali (Guerra et al, 2011). Inoltre,
abbiamo di recente riportato un’associazione fra la comparsa di una mutazione patogena in uno
dei geni mitocondriali per la subunità ND4 del complesso I della catena respiratoria, e
l’insorgenza di un fenotipo quiescente ma resistente alla terapia convenzionale per il carcinoma
ovarico, ovvero carboplatino e taxolo (Guerra et al, 2012). Dati preliminari su di una casistica
limitata di CO analizzati prima della chemioterapia hanno altresì dimostrato un’elevata frequenza
di mutazioni mitocondriali somatiche (tumore-specifiche), di impatto patogenico sulla
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bioenergetica tumorale, che tende a diminuire significativamente nei campioni prelevati postchemioterapia. Tali dati suggeriscono l’esistenza di processi di selezione modificati dalla terapia,
che possono influenzare l’outcome della malattia. Questi promettenti dati preliminari necessitano
di essere confermati su un campione più ampio e trattato in maniera omogenea.
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Obiettivo del progetto
Caratterizzazione molecolare di carcinomi ovarici neodiagnosticati per la presenza di mutazioni o
epimutazioni dei geni BRCA1/2 e per la presenza di mutazioni del DNA mitocondriale, al fine di
identificare:
-
marker molecolari prognostici e predittivi di risposta alla terapia;
-
mutazioni ereditarie che permettano l’identificazione di donne a rischio genetico da
avviare a misure di prevenzione e diagnosi precoce.
Metodologia (sintetizzata nella flow-chart allegata)
1) Caratterizzazione BRCA
Saranno candidate alla caratterizzazione BRCA le donne con nuova diagnosi di CO che si
sottoporranno a biopsia o trattamento chirurgico presso la SSD Oncologia Ginecologica
dell’AOU Policlinico S.Orsola e ad evenyuale terapia medica presso la SSD Oncologia Medica
della stessa AOU nel periodo 1/11/14-31/8/15.
Criteri di esclusione: tumori borderline, tumori stromali, istotipo mucinoso (forme per cui i
dati disponibili tendono ad escludere una correlazione con i geni BRCA1/2), impossibilità di
fornire consenso informato.
In base al numero di pazienti trattate negli anni precedenti, ci si attende che nel periodo in
esame siano arruolabili per questo studio almeno 70/80 pazienti.
Prima della procedura chirurgica, le donne eleggibili saranno sottoposte a consulenza
genetica, durante la quale, dopo un’accurata anamnesi familiare e la raccolta di informazioni
su altri fattori di rischio oncologico, si informerà dettagliatamente la paziente su scopi ed
implicazioni dello studio. Verrà quindi raccolto un consenso su più livelli: la donna potrà
esprimere il consenso per il congelamento e la conservazione di un campione del tessuto
asportato durante la procedura chirurgica e per lo svolgimento delle analisi BRCA, potrà
decidere se acconsentire ad un prelievo di sangue per la verifica della natura ereditaria di
eventuali mutazioni identificate e, infine, potrà esprimere la volontà di ricevere o meno la
comunicazione di questo ultimo risultato.
Alle donne che abbiano fornito il consenso informato, verrà effettuato un prelievo di sangue
venoso e, in occasione della procedura chirurgica, un campione di tessuto tumorale (salvo le
rare situazioni in cui questo può ostacolare la diagnosi) verrà congelato fresco.
Si procederà all’estrazione del DNA dal tessuto tumorale e all’analisi di sequenza dei geni
BRCA1/2 con gli stessi metodi di analisi utilizzati per i test BRCA diagnostici effettuati presso
l’UO di Genetica Medica (Next Generation Sequencing su sequenziatore ION PGM Life
Technologies e Sequenziamento Sanger su sequenziatore automatizzato ABI Prism 3730).
Oltre alle varianti di sequenza verranno ricercati anche riarrangiamenti genici
(delezioni/duplicazioni) mediante tecnica MLPA. Per i tumori che non presentino mutazioni
dei geni BRCA verrà effettuata l’estrazione dell’RNA e verrà valutata l’espressione di BRCA1
mediante RT-PCR per evidenziare eventuali deficit di BRCA1 su base epigenetica (da
caratterizzare ulteriormente mediante analisi di metilazione del promotore).
Le mutazioni dei geni BRCA1/2 identificate nei tumori verranno verificate sul sangue delle
rispettive pazienti per individuare le mutazioni costituzionali e, quindi, ereditarie.
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Le donne con mutazioni ereditarie che abbiano espresso la volonta' di essere informate, ne
riceveranno comunicazione nell'ambito di una consulenza genetica post-test completa, in cui
verra' proposta l'estensione della valutazione alle familiari sane. Queste ultime potranno
decidere se sottoporsi alla ricerca della mutazione BRCA identificata nella famiglia, nel qual
caso potranno scoprire
a) di non avere ereditato la mutazione e di essere, quindi a rischio di popolazione, con
notevole beneficio in termini di riduzione dell'ansia)
b) di avere ereditato la mutazione e di essere, quindi, a rischio genetico (fino al 49% in
base al gene coinvolto). Queste ultime saranno prese in carico presso il percorso di gestione
delle donne a rischio genetico di CO attivo da diversi anni presso l'AOU di Bologna e
potranno optare per l'annessiectomia profilattica o per la sorveglianza intensificata
organizzata.
Le donne appartenenti a famiglie con mutazione accertata che preferiscano non conoscere il
proprio stato genetico saranno comunque prese in carico per la sorveglianza intensificata.
2) Caratterizzazione mitocondriale
Saranno candidate a tale determinazione tutte le donne arruolate nello studio GOGER01 dai
centri di Bologna e Ravenna entro il 31 agosto 2015, previo consenso informato allo studio
molecolare. Le donne inserite nello studio di caratterizzazione BRCA che vengano arruolate nel
GOGER01 saranno sottoposte ad entrambe le caratterizzazioni, permettendo un ulteriore
confronto tra stato BRCA e mutazioni mitocondriali.
Lo studio GOGER01 e' uno studio randomizzato multicentrico di fase II, finalizzato a confrontare
l'efficacia di 3 verso 6 cicli di chemioterapia neoadiuvante a base di carboplatino e paclitaxel in
donne con CO (o carcinoma tubarico o peritoneale) in stadio IIIC o IV. Tale studio e' gia' stato
approvato dal Comitato Etico dell'Azienda Ospedaliera di Bologna ed e' recentemente partito
l'arruolamento. Per le pazienti che forniscano il proprio consenso agli studi opzionali di genetica
molecolare verra' analizzato il tessuto tumorale prelevato prima e dopo la chemioterapia. Tale
tessuto potra' essere indifferentemente congelato a fresco (nel caso delle pazienti sottoposte a
caratterizzazione BRCA si utilizzera' lo stesso prelievo come campione pre-chemio), oppure
fissato in formalina ed incluso in paraffina.
Ci si attende che siano eleggibili per la caratterizzazione mitocondriale almeno 40 casi.
Il DNA totale sarà estratto dal tessuto tumorale, prelevato durante le procedure chirurgiche
prima e dopo la chemioterapia neoadiuvante. L’intero genoma mitocondriale sarà sequenziato e
confrontato con diverse sequenze di riferimento, al fine di filtrare le varianti di interesse
patogenico (Kurelac et al, 2013). Si verifichera' la somaticità delle varianti ritrovate ricercandone
la presenza in un campione di tessuto non tumorale.
Il confronto tra tessuto pre- e post-chemio permettera' di evidenziare come lo stato mutazionale
cambi con la chemioterapia. Inoltre, la presenza delle mutazioni verra' analizzata in relazione ai
dati clinici e patologici al fine di associare l’insorgenza di mutazioni nel mtDNA al decorso e ad
eventuali fenomeni di resistenza alla chemioterapia.
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La caratterizzazione genetica del mtDNA nei tessuti pre- e post-chemio sarà il risultato
principale, che permetterà l’associazione con i parametri clinici quali, tra gli altri, indice di
proliferazione (Ki67), risposta alla chemioterapia. Le differenze fra i genotipi mitocondriali pre- e
post-chemio permetteranno altresì di inferire se sia favorito, nel carcinoma ovarico, un tipo di
metabolismo prettamente glicolitico, o se sia necessario il ripristino della respirazione nella
selezione di cloni cellulari resistenti o residui, il che aiuterà a chiarire i meccanismi di risposta
alla chemioterapia.
3) Gestione dati e analisi dei risultati
I dati clinico-patologici all'esordio, le terapie effettuate e l'esito delle terapie verranno inseriti in
un unico database (in parte coincidente con quello dello studio GOGER01) con i dati emergenti
dalle analisi genetiche per permettere le opportune analisi statistiche.
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Donna con nuova diagnosi di CO c/o
Policlinico S.Orsola, Bologna
Donna con nuova diagnosi di CO c/o Osp.
S.Maria delle Croci, Ravenna
Arruolamento nello studio
GOGER01, se eleggibile
- Consulenza genetica (anamnesi familiare/personale)
- Consenso Informato (CI) per:
Raccolta tessuto e analisi molecolari
Definizione natura ereditaria di eventuali mutazioni
Comunicazione dei risultati
- Prelievo ematico
Analisi mtDNA su tessuto tumorale
alla diagnosi
Raccolta e congelamento campione di tessuto tumorale in
occasione della biopsia/intervento
Chemioterapia
neoadiuvante
Analisi geni BRCA1/2 su tessuto tumorale
Analisi mtDNA su tessuto tumorale
residuo
sì
Mutazioni
identificate?
no
Ricerca mutazioni su
sangue (se CI)
sì
Mutazione
costituzionale?
Tumore ereditario
no
sì
Espression
e alterata?
Tumore sporadico con
deficit BRCA
Consulenza genetica
post-test (se CI)
no
Tumore sporadico
senza deficit BRCA
Inserimento in data-base con dati
clinici e patologici
Analisi statistica
Ricerca mutazione nelle
familiari interessate
Donne non portatrici (rischio
di popolazione)
Verifica mutazioni mtDNA su
sangue (e/o altri tessuti sani) per
definire somaticità
Studio espressione
BRCA1/2
Donne portatrici (rischio
genetico)
Presa in carico per
prevenzione e diagnosi
precoce
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Rassicurazione
Personale coinvolto nel progetto
Daniela Turchetti
Posizione: Ricercatore Universitario-Dirigente Medico I livello
Struttura di appartenenza: Unità di Genetica Medica – DIMEC, AOU di Bologna Policlinico
S.Orsola-Malpighi
Ruolo nel Progetto: Responsabile del Progetto
Tempo dedicato: 30%
Giuseppe Gasparre
Posizione: Ricercatore Universitario
Struttura di appartenenza: Unità di Genetica Medica – DIMEC
Ruolo nel Progetto: Responsabile degli studi di caratterizzazione mitocondriale
Tempo dedicato: 20%
Claudio Zamagni
Posizione: Dirigente medico, Responsabile SSD Oncologia Medica
Struttura di appartenenza: SSD Oncologia Medica AOU di Bologna Policlinico S.OrsolaMalpighi
Ruolo nel Progetto: Responsabile della terapia medica e del progetto GOGER01
Tempo dedicato: 10%
Pierandrea De Iaco
Posizione: Dirigente medico, Responsabile SSD Oncologia Ginecologica
Struttura di appartenenza: SSD Oncologia Ginecologica AOU di Bologna Policlinico
S.Orsola-Malpighi
Ruolo nel Progetto: Responsabile delle procedure chirurgiche e dell’identificazione delle
pazienti reclutabili
Tempo dedicato: 10%
Anna Myriam Perrone
Posizione: Dirigente medico
Struttura di appartenenza: SSD Oncologia Ginecologica AOU di Bologna Policlinico
S.Orsola-Malpighi
Ruolo nel Progetto: Raccolta campioni durante le procedure chirurgiche e identificazione
delle pazienti
Tempo dedicato: 10%
Donatella Santini
Posizione: Dirigente Medico
Struttura di appartenenza: UO Anatomia Patologica AOU di Bologna Policlinico S.OrsolaMalpighi
Ruolo nel Progetto: Diagnosi istopatologica
Tempo dedicato: 10%
Claudio Ceccarelli
Posizione: Ricercatore Universitario-Dirigente Biologo
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Struttura di appartenenza: UO Anatomia Patologica AOU di Bologna Policlinico S.OrsolaMalpighi
Ruolo nel Progetto: Caratterizzazione immunoistochimica
Tempo dedicato: 10%
Da definire (Medico o infermiere genetista con contratto annuale part-time)
Struttura di afferenza: Unità di Genetica Medica
Supervisore: D. Turchetti
Ruolo nel Progetto: Reclutamento e consulenza genetica delle pazienti arruolate
Tempo dedicato: 50% (contratto da finanziarsi con il contributo)
Da definire (Biologo/biotecnologo con competenze di genetica molecolare)
Struttura di afferenza: Unità di Genetica Medica
Supervisori: D. Turchetti e G. Gasparre
Ruolo nel Progetto: Gestione e analisi molecolari dei campioni
Tempo dedicato: 100% (assegno di ricerca da finanziarsi con il contributo)
Da definire (Medico specialista in oncologia con contratto annuale a tempo pieno)
Struttura di afferenza: SSD Oncologia Medica
Supervisore: C. Zamagni
Ruolo nel Progetto: Raccolta, gestione ed analisi dei dati clinico-patologici e molecolari
delle pazienti arruolate
Tempo dedicato: 100% (contratto da finanziarsi con il contributo)
Da definire (volontario con esperienza nella comunicazione con pazienti con neoplasie
ovariche)
Struttura di afferenza: LOTO Onlus
Ruolo nel Progetto: Supporto nella diffusione delle informazioni sul CO e nella
comunicazione con le pazienti arruolate
% tempo dedicato: 20% (a titolo gratuito)
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