Report Primo Anno SP1 - Il Progetto Invecchiamento

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Aggiornamento annuale –2012
PROGETTO D’INTERESSE
“INVECCHIAMENTO:
INNOVAZIONI TECNOLOGICHE
E MOLECOLARI PER UN MIGLIORAMENTO
DELLA SALUTE DELL’ANZIANO"
Responsabile Dott.ssa Stefania Maggi
Dipartimento di Medicina, CNR
Progetto Invecchiamento
Sottoprogetto 3
SOTTOPROGETTO 1
STUDIO DEI MECCANISMI MOLECOLARI DELLA NEURODEGENERAZIONE E
DELL’INVECCHIAMENTO (RESP. TULLIO POZZAN)
WP1.1 Imaging subcellulare nelle patologie neurodegenerative e loro valore predittivo della
funzione degli organelli subcellulari
(IN – Padova)
Si segnala che, come a voi noto, i fondi sono diventati disponibili solo da poche settimane. Tuttavia
le linee di ricerca originariamente proposte sono state portate avanti e alcuni dati preliminari già
ottenuti. Per quanto riguarda la parte del progetto assegnata all’unità di Padova (riguardante
l’imaging cellulare) possiamo così brevemente riassumere i punti essenziali:
Stato di avanzamento (Attività avviate e da avviare, Risorse impegnate)
1. Sono continuati gli studi atti a comprendere le alterazioni nell’omeostasi del Ca2+ cellulare
in neuroni e astrociti in modelli di Alzheimer ereditario dovuto a mutazioni nelle
preseniline. Come noto il morbo di Alzheimer è una delle patologie più frequenti associate
all’invecchiamento e si ritiene che i modelli di Alzheimer con chiara componente genetica
possano fornire informazioni patogentiche essenziali anche per la comprensione dei
meccanismi alla base delle forme (molto più frequenti) di Alzheimer sporadico. Abbiamo
continuato l’approccio da noi proposto e utilizzato nel passato (cellule trasfettate con
preseniline (PS) mutate o derivate da topi transgenici esprimenti PS umane mutate).
Abbiamo studiato gli effetti di queste PS sull’omeostasi di Ca2+ sia in colture primarie di
neuroni che su fettine di corteccia. Parte di questi dati sono stati inclusi in un articolo
recentemente pubblicato su Ageing Cell (Kipanyula et al. 2012). Abbiamo inoltre sviluppato
nuovi sensori per lo studio del Ca2+ nel reticolo endoplasmatico e nel Golgi di cellule vive e
li stiamo applicando ai modelli di Alzheimer sopra descritti. Abbiamo inoltre sviluppato
vettori virali per alcune delle sonde per i sensori Ca2+ che infettano selettivamente i
neuroni, in vista di un loro utilizzo per lo studio di questi fenomeni in vivo.
2. Studio dei meccanismi di controllo del Ca2+ nel cuore e le sue alterazioni in processi di
miocardiopatie. Si tratta anche in questo caso di una patologia che affligge in particolare
modo la popolazione anziana. Abbiamo perciò continuato lo studio del ruolo mitocondriale
nel controllo della contrazione cardiaca e le variazioni che si possono indurre modificando
le caratteristiche del sistema di accumulo del Ca2+ in questi organelli. Alcuni di questi dati
sono stati inclusi in una recente pubblicazione del gruppo su PNAS (Dago et al. 2012).
Abbiamo iniziato alcuni studi relativi ai meccanismi di controllo dell’espressione delle
proteine fondamentali che regolano l’accumulo ed il rilascio di Ca2+ nelle cellule cardiache.
3. Abbiamo continuato lo studio degli astrociti nella modulazione dei processi che scatenano il
fenomeno epilettico con dati particolarmente rilevanti riguardanti il ruolo dell’interazione tra
astrociti e inter neuroni inibitori.
Piano di fattibilità e sostenibilità economico finanziaria
La fattibilità dei progetti è dimostrata non solo dalla lunga esperienza nel campo dei ricercatori
coinvolti, ma dai dati preliminari già pubblicati sull’argomento in riviste prestigiose in questi ultimi
mesi. Tali linee di ricerca sono ovviamente sostenute anche da altri finanziamenti ai gruppi, ma il
sostegno del progetto invecchiamento rappresenta un apporto essenziale sia per la continuità di
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Sottoprogetto 3
queste linee che per l’attivazione di altri progetti ad esse correlati da iniziare nel corso dell’anno a
venire. In particolare, pur nel brevissimo periodo che è trascorso dalla disponibilità dei fondi alla
presente relazione, è già stata impegnata una frazione molto significativa dei fondi assegnati (bandi
per un assegno di ricerca e per una borsa di studio, ordini per tre rotori per ultracentrifuga, ordini di
materiale di consumo, impegni per missioni). Ovviamente tali spese erano state previste nella fase
di programmazione del progetto e sono state immediatamente avviate le procedure di utilizzo non
appena gli uffici centrali del CNR ci hanno dato comunicazione ufficiale della disponibilità dei
fondi.
Collaborazione con Enti, Organismi di ricerca e Imprese
I progetti sopra descritti sono svolti in stretta collaborazione con gruppi di ricerca dell’Università di
Padova, con l’Istituto Veneto di Medicina Molecolare (VIMM) e con gruppi di ricerca dell’Istituto
Italiano di Tecnologia (IIT) e con i laboratori LENS di Firenze. Trattandosi di progetti di ricerca di
base i contatti con il mondo industriale sono relativamente limitati, ma interessanti possibilità
d’interazione con industrie Biotech della zona sono stati già iniziati.
Prodotti e Pubblicazioni
Ovviamente, dati i tempi trascorsi dalla disponibilità dei fondi di ricerca, i prodotti qui di seguito
elencati sono stati finanziati con finanziamenti diversi da quelli del Progetto Invecchiamento, ma
rispecchiano le linee di ricerca proposte nel progetto stesso:
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KIPANYULA MJ, CONTRERAS L., ZAMPESE E., LAZZARI C., WONG AKC,
PIZZO P., FASOLATO C., POZZAN T. Early Ca2+ dysregulation in neurons from
transgenic mouse expressing mutant presenilin 2 , 2012, Aging Cell, in the press IF.
7.148
DRAGO I., DE STEFANI D., RIZZUTO R. & POZZAN T. Mitochondrial Ca2+ uptake
contributes to buffering cytoplasmic Ca2+ peaks in cardiomyocytes. 2012 Proc. Natl.
Acad. Sci. USA in the press IF 9,432
RODRIGUEZ L., SIMEONATO E., SCIMEMI P.., ANSELMI F., CALÌ B.,
CRISPINO G., CIUBOTARU C.D., BORTOLOZZI M., RAMIREZ F.G., MAJUMDER
P., ARSLAN E., DE CAMILLI P., POZZAN T. & MAMMANO F. Reduction of
phosphatidylinositol 4,5–bisphosphate synthesis causes a graded alteration of Ca2+
signaling along the postnatal cochlea and impairment of high frequency hearing
acquisition 2012 Proc. Natl. Acad. Sci. USA in the press IF 9,432
NOWIKOVSKY K, POZZAN T, RIZZUTO R, SCORRANO L, BERNARDI P. The
Pathophysiology of LETM1. J Gen Physiol. 2012 139, 445-54.
PIZZO P., DRAGO I., FILADI R. & POZZAN T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis:
mechanism, role and tissue specificities Pflugers Arch. 2012 Jul;464(1):3-17.
LOSI G, CAMMAROTA M, CARMIGNOTO G. The role of astroglia in the epileptic
brain. Front Pharmacol. 2012;3:132. Epub 2012 Jul 12.
CARMIGNOTO G, HAYDON PG. Astrocyte calcium signaling and epilepsy. Glia.
2012 Aug;60(8):1227-33.
ZOREC R, ARAQUE A, CARMIGNOTO G, HAYDON PG, VERKHRATSKY A,
PARPURA V. Astroglial excitability and gliotransmission: an appraisal of Ca2+ as a
signalling route. ASN Neuro. 2012 Mar 22;4(2).
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Sottoprogetto 3
WP1.2 Trafficking intracellulare neuronale nella patologie da accumulo proteico
(IBP)
Nonostante il fatto che i fondi sono diventati disponibili solo recentemente, alcune delle linee di
ricerca proposte sono state iniziate e alcuni dati preliminari sono già disponibili. I principali
obiettivi della parte del progetto dell’ IBP sono due: a) la definizione dei tragitti intracellulari di
APP e delle secretasi usando le più moderne tecnologie di imaging e, b) lo studio della possibilità di
utilizzare trattamenti e farmaci sviluppati per altre malattie conformazionali (meno frequenti) per il
morbo di Alzheimer. Per ora abbiamo lavorato sulla seconda parte del progetto, cioè quella relativa
allo sviluppo di trattamenti per malattie conformazionali.
L’obiettivo specifico scelto qui è stato l’identificazione di vie di signalling capaci di controllare la
proteostasi, un processo che si può in modo semplice definire come l’insieme di funzioni cellulari
che determina i livelli e la funzionalità delle proteine. La proteostasi è composta da tre sottoprocessi
principali: il ‘folding’ di queste proteine, la degradazione, e il trasporto delle proteine al loro sito d’
azione. Come modello per lo studio della modulazione della proteostasi abbiamo usato un mutante
della proteina CFTR molto frequente nella fibrosi cistica (D-508-CFTR), per due motivi: 1) la
CFTR mutata è molto ben caratterizzata a dal punto di vista conformazionale e, 2) il difetto
conformazionale della CFTR mutata può venire corretto, seppure in parte, da un notevole numero di
farmaci e piccole molecole (correttori) che sono identificate in progetti di screening effettuati dall’
industria farmaceutica o da laboratori accademici.
Il nostro approccio si è basato su di una combinazione di studi informatici e sperimentali. Per
identificare i pathways regolatori della proteostasi, siamo partiti dall’ipotesi che i correttori
agiscano, almeno in parte, modificando tali pathways: e per identificare il meccanismo d’azione dei
correttori, abbiamo usato l’informazione esistente circa i loro effetti trascrizionali. Tale
informazione è disponibile per 12 correttori. Abbiamo poi paragonato gli effetti trascrizionali (‘gene
signature’) di questi correttori per identificare i geni la cui espressione fosse modificata dalla
totalita’ o dalla maggioranza di questi farmaci, in quanto tali geni dovrebbero essere legati all’
effetto di correzione.
Infine, abbiamo studiato questo gruppo di geni per verificare il loro ruolo nella effettiva correzione
della CFTR mutata. I dati sperimentali hanno rivelato che alcuni pathways di signalling presenti nel
gruppo di geni di cui sopra sono di fatto coinvolti nella correzione, e che farmaci attivi direttamente
su questi geni (o meglio sulle proteine da loro codificate) sono molto attivi nell’effetto di correzione
di CFTR mutata. Lo studio dell’effetto di questi farmaci sta ora venendo esteso ad altre malattie
conformazionali.
Le risorse finora impegnate rappresentano circa il 30% dell’entità totale del finanziamento.
La fattibilità dei progetti è legata all’esperienza dei proponenti per la parte propriamente
sperimentale e dei collaboratori per la parte informatica (laboratorio Di Bernardo al TIGEM).
Inoltre, le linee di ricerca proposte sono sostenute anche da altri finanziamenti, fra le quali però il
progetto invecchiamento rappresenta una componente essenziale.
Impiego e valorizzazione scientifica
I programmi di analisi dei profili di espressione genica saranno applicabili a numerosi problemi
biologici. Inoltre, l’identificazione di nuovi modulatori della proteostasi potra’ essere di interesse
non solo nello studio o nel trattamento dell’ Alzheimer ma anche di altre malattie conformazionali.
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Sottoprogetto 3
Il progetto viene svolto in collaborazione con gruppi di ricerca del Telethon Institute for Genetics
and Medicine (TIGEM). Nel mondo industriale, la Dompe’ Farmaceutici ha mostrato interesse per
lo sviluppo di modulatori della proteostasi.
A rational pharmacological approach to conformational diseases. Raman Parashuraman, Ramanath
Hegde, Fabrizio Capuani, Fabiana Ciciriello, David Thomas, Alberto Luini. Manuscript in
preparation.
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Sottoprogetto 3
WP1.3 Identificazione e caratterizzazione dei processi di metilazione coinvolti
nell’invecchiamento
(IRGB)
L’obiettivo di questo WP è studiare il ruolo dei meccanismi epigenetici quali la metilazione del
DNA e le modificazioni istoniche negli eventi clinici che si sviluppano in età avanzata, in
particolare nello scompenso cardiaco.
In quest’anno abbiamo condotto esperimenti che combinano l’immunoprecipitazione della
cromatina con il sequenziamento massivo del DNA (ChIP-seq) per identificare le regioni del
genoma regolate dalle modifiche istoniche H3K9ac, H3K27ac, H3K4me4, H3K79me2, H3K9me2,
H3K9me3, e H3K27me3 nei cardiomiociti isolati dal ventricolo sinistro di topi che hanno subito
una costrizione dell’arco aortico (TAC) per una settimana, una procedura che causa scompenso
cardiaco in vivo.
Un’analisi funzionale di queste regioni fatta con il programma GREAT (http://great.stanford.edu/)
ha evidenziato come queste modifiche istoniche cambino il loro profilo in regioni coinvolte nella
regolazione trascrizione di proteine del citoscheletro e che legano l’actina.
Il passo successivo è comprendere se queste modifiche sono effettivamente coinvolte nella
regolazione trascrizionale che sono alla base dello scompenso cardiaco, andando ad investigare se
esiste una correlazione significativa tra cambiamenti epigenetici e i cambiamenti trascrizionali, A
questo scopo abbiamo iniziato a condurre esperimenti di RNA-seq per identificare i profilo
trascrizionale dei cardiomiociti ipertrofici.
In quest’anno abbiamo anche iniziato a condurre esperimenti di Methyl-chip e di sequenziamento
con bisolfito per investigare il ruolo della metilazione delle citosine (CpG) nello scompenso
cardiaco.
Il nostro laboratorio ha tutte le competenze scientifiche e tecniche per svolgere questo progetto. Il
progetto ha una buona sostenibilità economica, crediamo, infatti, che il finanziamento programmato
sia sufficiente per condurre a buon fine lo studio proposto.
Il ruolo dei meccanismi epigenetici nelle patologie che si sviluppano in età avanzata, in particolare
lo scompenso cardiaco, è in gran parte sconosciuto. Pertanto, lo studio dei meccanismi che
controllano l'espressione genica nello SC cardiaco potrebbe generare informazioni utili per una
migliore comprensione della patogenesi di questa sindrome nell’invecchiamento e portare allo
sviluppo di nuovi strumenti diagnostici e terapeutici. Inoltre questo progetto potrebbe avere una
buona ricaduta dal punto di vista scientifico portando alla pubblicazione di articoli su riviste
scientifiche internazionali con buon impact factor.
Il progetto ha previsto collaborazioni con gruppi dell’Università di Milano, ma per ora non con
imprese.
Dato il breve tempo trascorso dall’inizio del progetto non sono ancora state effettuate pubblicazioni
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Sottoprogetto 3
WP1.4 Ruolo dei meccanismi redox e dell’accumulo patologico di proteine
(IBIM-IBPM)
Attività avviate:
1) Alterato equilibrio delle proteine del reticolo endoplasmatico (ER), processi associati a
misfolding proteico e formazioni di aggregati:
a) abbiamo avviato studi sul coinvolgimento delle proteine VAPs (VAMP-associated proteins),
implicate nell’Alzheimer come pure nella Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA), e della
proteina CLN8 implicata in patologie neurodegenerative da accumulo lipo-proteico, nella
disfunzione del sistema di controllo del folding proteico (UPR) e dell’autofagia in un
modello di degenerazione del motoneurone;
b) avendo dimostrato che il processing della proteina VAPB e particolarmente la secrezione del
suo frammento MSF si modificano nel CSF di pazienti con SLA sporadica e costituiscono
pertanto dei potenziali biomarcatori di progressione, abbiamo avviato studi su biopsie di
muscoli di pazienti SLA e linee cellulari per valutare i meccanismi di processing e rilascio
di MSP e la formazione di aggregati proteici.
2) Ruolo delle small-heat shock proteins nell fibrillogenesi in modelli di retinopatia associati all’età:
a) abbiamo avviato i modelli animali di retinopatia diabetica (RD) da streptozotocina;
b) abbiamo messo a punto un modello di stress ossidativo in vivo mediante trattamento
intraoculare con composti ferrici che percorre le tappe della degenerazione maculare senile
(AMD);
c) abbiamo avviato le indagini sulla regolazione post-trascrizionale delle cristalline (A e B) che
denatura il ruolo antifibrillogenico durante l’invecchiamento;
d) abbiamo avviato studi di caratterizzazione delle cristalline e delle molecole amiloidogeniche
nei modelli di RD e AMD-simile;
e) abbiamo avviato studi in vitro di regolazione delle cristalline da estrogeni.
3) Caratterizzazione di farmaci di nuova sintesi
a) abbiamo avviato indagini farmacologiche in vitro (espianti retinici e cellule ARPE) e in vivo
(modelli di RD e AMD) con composti di nuova sintesi: ciclo-dipeptidi con presunta attività
antiossidante e beta-sheet breakers con attività antifibrillogenica sintetizzati dall’Istituto di
Biostrutture e Bioimmagini (IBB) sez. Catania.
b) abbiamo avviato test di tossicità di composti pro- ( Metformina, H2O2) ed anti- (acido
ferulico, insulina) ossidanti in sistemi cellulari
c) messa a punto di protocolli per la preparazione di frazioni mitocondriali da cellule e tessuti
da utilizzare per indagini proteo miche
d) abbiamo avviato l’analisi dei pattern di espressione proteica a seguito di trattamenti con
composti pro- e anti- ossidanti sopra descritti
4) Basi molecolari del misfolding proteico
L’attività di ricerca è stata incentrata parallelamente sullo studio di proteine che a) presentano la
stessa struttura ma diverse sequenze amino acidiche; b) sono caratterizzate da una struttura ed una
funzione distinta, sebbene mostrino una’elevata identità di sequenza (fino all’88%). Entrambi i
sistemi proteici sono stati studiati utilizzando sinergicamente tecniche di ingegneria proteica e studi
in cinetica rapida ed ultra-rapida.
a) Stessa struttura, diversa sequenza. Il sistema modello utilizzato è rappresentato dalla
famiglia dei domini PDZ, una famiglia di piccole proteine a struttura alfa/beta di circa 100
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Sottoprogetto 3
aminoacidi che media centinaia di interazioni di tipo proteina-proteina all’interno della
cellula vivente.
Si è comparato il meccanismo di folding di sei domini PDZ diversi e si è potuto riscontrare
che, a dispetto di una bassa identità di sequenza, tutti i domini PDZ utilizzati ripiegano
mediante un meccanismo comune. Questa importante osservazione indica in maniera chiara
che il meccanismo di folding di una proteina, vale a dire la presenza/assenza di intermedi di
ripiegamento e il loro ruolo cinetico, è principalmente determinato dalla topologia della
proteina stessa, piuttosto che dalla sua composizione amino acidica.
b) Diversa struttura, sequenza quasi identica. Il recente disegno di proteine a struttura
differente ma sequenza quasi identica (88% di identità) permette, per la prima volta, di
studiare il folding delle proteine mediante un approccio complementare. In particolar modo
è in teoria possibile comprendere a quale stadio del meccanismo di folding una proteina
“sceglie” la sua struttura tridimensionale.
Si è comparato il meccanismo di folding di proteine a crescente identità di sequenza ma
diversa struttura e funzione (i.e. coppie eteromorfiche che contenevano 30%, 77% ed 88% di
identità di sequenza mantenendo sempre diversa struttura e funzione). Il lavoro
sperimentale, che si è basato sulla produzione, purificazione e caratterizzazione di oltre 130
mutanti sito-specifici, ha sorprendentemente mostrato che tutte le proteine considerate
mostravano delle caratteristiche tipiche della loro struttura nativa già nella loro forma
denaturata. Lo stato denaturato, pertanto, non rappresenta una conformazione
completamente disordinata, ma contiene nuclei incipienti di struttura residua e tali nuclei
sono sufficienti per codificare per la struttura nativa. Il lavoro è stato pubblicato sulla
prestigiosa rivista internazionale Proceedings of the National Academy of Sciences USA.
La caratteristica tendenza di alcuni domini proteici a cambiare conformazione mediante
piccole variazioni di sequenza, come esemplificato delle coppie eteromorfiche, o in seguito
a legame in vivo con specifiche molecole è stata inoltre discussa in una pubblicazione.
Una ulteriore linea di esperimenti è stata inoltre incentrata sulla caratterizzazione del ruolo
cinetico degli intermedi nel meccanismo di folding proteico e nel meccanismo di foldingindotto-da-legame per proteine intrinsecamente disordinate.
5) Ruolo del NO nella fisio-patologia mitocondriale
L’ossido nitrico (NO) è una molecola chiave coinvolta nella regolazione di numerosi processi
fisiologici ed in numerosi stati patologici dell’anziano. E’ stato chiarito che, dipendendo dallo stato
metabolico della cellula e più in particolare dal flusso elettronico a livello della catena respiratoria
mitocondriale, il NO è in grado di inibire la citocromo c ossidasi secondo due meccanismi
alternativi, presumibilmente associati ad effetti fisio-patologici distinti. Questi meccanismi di
reazione sono stati studiati in grande dettaglio prevalentemente mediante misure di cinetica rapida e
tecniche amperometriche. Sul tema è stata pubblicata una rassegna in cui sono state raccolte le
informazioni ad oggi disponibili sull’interazione tra NO e citocromo c ossidasi, dagli aspetti più
meccanicistici alle potenziali implicazioni fisio-patologiche.
6) Bioenergetica e morbo di Alzheimer
E’ stata avviata una ricerca mirata alla caratterizzazione bioenergetica di un sistema cellulare
modello per lo studio del morbo di Alzheimer. Lo studio intende chiarire quali siano gli effetti
prodotti dal precursore del frammento Aβ e dal frammento stesso sui principali parametri
bioenergetici mitocondriali, tra i quali l’attività di consumo dell’O2 nei diversi stati mitocondriali,
l’entità del potenziale elettrico della membrana mitocondriale, la capacità di sintesi di ATP a livello
della fosforilazione ossidativa e della glicolisi. Nel corso del primo anno di attività sono stati messi
a punto i protocolli sperimentali necessari a realizzare tali misure nel prosieguo del progetto.
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Sottoprogetto 3
Attività da avviare:
1) Proteine VAPs e patogenesi nella SLA e Alzheimer
a) Messa a punto di un biosensore per il frammento MSP-VAPB in collaborazione con la
STMicroelectronics S.r.l. (CT)
b) Analisi di VAPS e MSP in paziente con Alzheimer e altre forme di demenza
c) Indagini nei pazienti Alzheimer e SLA associate a marcatori delle alterazioni delle barriere
emato-encefaliche e del midollo spinale e dei processi di neovascolarizzazione
d) Caratterizzazione dei meccanismi patogenetici delle VAPs in associazione ad altre proteine
del reticolo, quale la proteina CLN8, in colture di fibroblasti e biopie di muscolo da pazienti
2) Ruolo dei meccanismi che controllano la fibrillogenesi proteica:
a) Ruolo dei metalli in relazione ai processi angiogenici nella RD e AMD
b) Messa a punto di sensori delle modificazioni delle cristalline nelle retinopatie
STMicroelectronics S.r.l. (StM, CT)
c) Regolazione delle cristalline da estrogeni: indagini sull’attività neuroprotettiva
3) Identificazione di proteine mitocondriali in sistemi redox modificati
a) indagine di proteomica classica e redox
b) indagine in vivo sugli effetti di composti proed anti- ossidanti utilizzando modelli
transgenici di Alzheimer e retinopatie
c) studi di cinetica di aggregazione in vitro del peptide beta-amiloide in presenza di agenti proed anti- ossidanti
4) Identificazione di nuovi target molecolari, di nuovi farmaci e sistemi di delivery per le retinopatie
e le patologie neurodegenerative
5) Ruolo del NO in sistemi cellulari modello per lo studio di malattie neurodegenerative
a) studio dell’effetto del NO esogeno ed endogeno sulla respirazione cellulare
b) misura dell’effetto Warburg in sistemi modello d’interesse
c) caratterizzazione delle difese anti-ossidanti
6) Effetto dell’ipossia su sistemi cellulari modello per lo studio di patologie tipiche dell’anziano.
Analisi degli effetti prodotti da condizioni di crescita ipossiche sul metabolismo cellulare e la
capacità di rispondere a stress ossi-nitrosativi in sistemi modello di interesse
7) Studio del meccanismo di folding su nuovi costrutti proteici per l’identificazione di molecole che
interferiscano con il processo di aggregazione.
Risorse umane impegnate:
n°2 Primo Ricercatore
n°4 Ricercatori
n°2 Ricercatori a tempo determinato
n°1 Tecnologo
n°1 Tecnico
Piano di fattibilità e sostenibilità economica finanziaria:
Le unità coinvolte nel progetto hanno specifiche competenze in ambito biomolecolare per portare a
termine con successo il progetto.
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Sottoprogetto 3
In particolare, l’unità IBIM-CNR di Palermo svolge da tempo attività di ricerca nell’ambito delle
biotecnologie al fine di sviluppare sistemi innovativi per la diagnosi e la terapia delle patologie
retiniche e neurodegenerative associate all’età. L’attività è condotta con approccio multidisciplinare
reso possibile dalle competenze diversificate dei partecipanti all’unità nei campi biomolecolare,
proteomico, neuropatologico e clinico, nonché dalle collaborazioni con altri Istituzioni e partner
industriali che favoriscono le azioni biotecnologiche a carattere fortemente innovativo. L’IBIM
inoltre ha una continua collaborazione con l’Istituto Zooprofilattico Siciliano (IZS) per la
sperimentazione animale.
L’unità IBPM-CNR di Roma ha competenze complementari a quelle dell’unità IBIM nell’ambito
della caratterizzazione strutturale e funzionale di proteine native e ricombinanti e della loro
dinamica. L’unità ha una notevole esperienza nel campo dello studio del folding proteico e delle
reazioni redox, mediante tecniche di cinetica rapida, così come in quello dello studio del NO e dei
suoi effetti biologici.
Entrambe le unità possiedono la strumentazione adeguata al raggiungimento degli obiettivi del
programma, tuttavia il contributo del MIUR favorirebbe un miglioramento e potenziamento della
strumentazione già esistente, in particolare per l’upgrade delle tecnologie inerenti la proteomica, il
bioimaging e la spettrofotometria tempo-risolta.
Si prevede inoltre l’assegnazione di cinque assegni di ricerca a giovani ricercatori impegnati a
tempo pieno sul presente progetto che consentiranno di raggiungere gli obiettivi prefissati.
L’unità IBIM ha i seguenti progetti approvati che affiancano gli interessi del progetto
Invecchiamento:
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Ministero del Lavoro, della Salute e delle Politiche Sociali, Ricerca Sanitaria (nota
DGRST4/P/1.0.a.b del 02/09/2008) “Identification of biological, genetic and clinical
modifiers of the rate of progression and survival in amyotrophic lateral sclerosis”.
(responsabile di UO Dott.ssa Guarneri)
HIPPOCRATES PON02_00355 Regione Sicilia – Progetto HIPPOCRATES - Sviluppo di
Micro e Nano-Tecnologie e Sistemi Avanzati per la Salute dell’uomo. Distretto Tecnologico
Sicilia Micro e Nano Sistemi, settore, NANOTECNOLOGIE, d.d. 427ric del 19-07-2012
(responsabile di UO Dott.ssa Guarneri)
Progetto “MERIT - MEdical Research in ITaly" Progetti multilaterali strategici-MIUR.
Titolo: Basi Molecolari dei Disordini Neurodegenerativi associati all’invecchiamento - A
multidisciplinary approach to evaluate the molecular basis of aging-related diseases
(Alzheimer, Parkinson, metabolic-related syndromes like diabetes) and develop new
biomarkers for diagnosis and therapy. FIRB-MIUR/ RBNE08HWLZ-005. (responsabile di
UO Dott.ssa Guarneri)
POR 4.1.1.1 POR FESR Sicilia 2007-2013 “Biotecnolgie per lo sviluppo di device
ortopedici” (responsabile di UO Dott.ssa Di Carlo)
MERIT SUD (n. 0017097, Protocollo: RBNE08NKH7_012) Nuovi "networks" molecolari
per il controllo dell'omeostasi energetica: implicazioni per il Diabete di Tipo 2 e
l'Obesità. (componente di UO Dott.ssa Di Carlo)
Finanziaria 2010 “FareBio di Qualità, Farmaci e Reti Biotecnologiche di Qualità”
(componente di UO Dott.ssa Di Carlo )
Una vasta gamma di malattie umane, tra cui il cancro, alcune patologie metaboliche e diverse
malattie neuro-degenerative, deriva dal misfolding di uno specifico peptide o proteina e/o da
condizioni di stress ossi-nitrosativo.
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Sottoprogetto 3
Diversi fattori sono potenzialmente coinvolti nei processi di misfolding; tra questi, una crescente
quantità di evidenze indica che l’accumulo di intermedi parzialmente strutturati rappresenta un
potenziale rischio per l’inizio della cascata delle reazioni di aggregazione e morte cellulare. A
dispetto della centralità del ruolo degli intermedi di folding nello studio delle patologie da
misfolding legate all’invecchiamento cellulare, le informazioni sulla struttura e sul ruolo di tali stati
meta-stabili sono ancora oggi piuttosto scarse. Il WP ambisce a caratterizzare la struttura di
intermedi di folding parzialmente strutturati, con la finalità di fornire la possibilità di disegnare
farmaci che interferiscano con i processi devastanti innescati dalla aggregazione proteica in vivo.
Lo studio degli intermedi di folding, in termini di struttura e stabilità, proprietà di aggregazione ed
interazioni con partner fisiologici, essendo al bivio tra folding produttivo e cascata di misfolding,
potrebbe aprire la strada ad una terapia per diverse patologie umane. Interessanti anche le potenziali
ricadute in ambito bio-medico che potrebbero derivare da una più approfondita conoscenza dei
meccanismi molecolari sottesi alla disregolazione dell’omeostasi redox e ai deficit bioenergetici,
che accompagnano l’insorgenza di una vasta gamma di patologie tipiche del paziente anziano. La
conoscenza di tali processi potrebbe infatti aprire la strada a nuove applicazioni in ambito
terapeutico.
Grandi limiti obiettivi nel fronteggiare le patologie neurodegenerative, incluse le forme di
retinopatia da diabete e degenerazione senile, riguardano la scarsa accuratezza diagnostica,
l’assenza di biomarcatori di diagnosi precoce e/o differenziale con la conseguente difficoltà ad
elaborare interventi terapeutici, e la terapia con farmaci più mirati in termini di efficacia,
biodistribuzione e direzionamento. Sotto il profilo tecnologico innovativo, lo sviluppo di sistemi
basati sulle micro e nano-tecnologie (biosensori, drug discovery e drug delivery) è di grande
interesse dell’attuale ricerca biomedica, garantendo un eccelente overlap con le priorità delle
industrie farmaceutiche e biomediche.
In particolare le attività prevedono:
• identificazione di biomarcatori e sviluppo di biosensori
• caratterizzazione di target e farmaci innovativi
• caratterizzazione di nuove formulazioni di nanosistemi per drug delivery
• validazione di protocolli sperimentali
I risultati ed i prototipi sviluppati saranno destinati ai settori biotecnologico e farmaceutico, parte
degli studi sono già integrati in progetti multicentrici che coinvolgono realtà industriali
STMicroelectronics S.r.l. (ST), S.I.F.I. Società Industria Farmaceutica Italiana S.p.A. (SIFI),
Ge.ME.S –Calatafimi (TP)
Verrà promossa la divulgazione scientifica attraverso organizzazione e partecipazioni a convegni,
pubblicazioni su riviste internazionali, comunicati stampa, realizzazioni editoriali.
Collaborazione con Enti, Organismi di ricerca e Imprese:
CNR
IBF-CNR sezioni di Palermo e Pisa
Ist. Chimica e Tecnologia dei Polimeri CNR,
Ist.Chimica Biomolecolare CNR,
Istituto di Scienze Neurologiche, CNR UOS di Catania
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Sottoprogetto 3
Ist. Biofisica, Ist. Biomembrane e Bioenergetica CNR,
Ist. Biologia e Patologia Molecolari, CNR
Ist. Materiali Nanostrutturati, CNR
Università
STEMBIO Università di Palermo
DBAD Università di Palermo
Dip. di Biomedicina Sperimentale e Neuroscienze Cliniche, Università degli Studi di Palermo
Centro Regionale SLA, Azienda Ospedaliera Universitaria Policlinico “P. Giaccone” di Palermo
Dipartimento di Scienze Biochimiche, Università di Roma Sapienza
Dipartimento di Biologia, Università di Roma Tre
Clinica Neurologica I, Azienda Ospedaliera-Universitaria Policlinico di Catania.
Istituto di Scienze Neurologiche, CNR UOS di Catania
IRCSS “Oasi M. S. Troina” (ME)
Dip.di Neuroscienze; Clinica e Molecolare Sezione di Farmacologia e Biochimica, Università di
Catania;
Dip. Scienze Chimiche, Università di Catania
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Regione Sicilia
Istituto di Ricerche Farmacologiche “Mario Negri”, Milano
Dip. Endocrinologia, Fisiopatologia e Biologia Appl. – Uni Studi di Milano
Dipartimento di Biologia Molecolare, Lab. Proteomica Funzionale, Università degli Studi di Siena
Uppsala University
University of Copenhagen
Department of Medicine, Division of Experimental Medicine , McGill University, Montreal,
Canada
School of Pharmacy & Life Sciences, Faculty of Health and Social Care, Robert Gordon Un,
Aberdeen, Scotland, UK
Altre istituzioni
European Research Brain Institute, Roma
Imprese
STMicroelectronics S.r.l. (ST); S.I.F.I.
Società Industria Farmaceutica Italiana S.p.A. (SIFI)
Engineering – Ingegneria Informatica S.p.A. (Engineering)
Infracom ITS.p.A. (Infracom)
Ge.ME.S –Calatafimi (TP)
Prodotti e Pubblicazioni:
Articoli
•
Di Carlo M, Gacomazza G, Picone P, Nuzzo D, Vasto S, Accardi G, Caruso C, San Biagio
PL. A close connection: Alzheimer’s disease and type 2 diabetes. (2012) Current Topics in
Biochemical Research, in corso di stampa
•
Bondì ML, Craparo EF, Picone P, Di Gesù R, Giammona G, Di Carlo M. PEGylated and
Non-PEGylated Lipid Nanoparticles Containing Esters of Flurbiprofen. Preparation,
Physical-Chemical Characterization and Cytotoxicity Studies. (2012) Journal of Biomedical
Nanotechnology 9:1-9
12
Sottoprogetto 3
•
Di Carlo M, Giacomazza G, Picone P, Nuzzo D, San Biagio PL. Are oxidative stress
mitochondrial dysfunction the key player in the neurodegenerative diseases? Free Radical
Research (2012) 46: 1327–1338.
•
Di Carlo M. Simple model systems: a challenge for Alzheimer’s disease. Immunity and
Ageing (2012) 16; 9:3-11.
•
Di Carlo M, Giacomazza D, San Biagio PL. Alzheimer’s disease: biological aspects,
therapeutic perpsectives and diagnostic tools. Journal Biophysical Condensed Matter (2012)
24: 244102-244119.
•
Giri R, Morrone A, Travaglini-Allocatelli C, Jemth P, Brunori M, Gianni S. (2012) Folding
pathways of proteins with increasing degree of sequence identities but different structure
and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 May 31. [Epub ahead of print]
•
Polticelli, F., Caprari, S., Gianni, S., Ascenzi, P. GA/GB fold switching may modulate fatty
acid transfer from human serum albumin to bacteria. IUBMB Life, in corso di stampa
•
Gianni S, Morrone A, Giri R, Brunori M. (2012) A folding-after-binding mechanism
describes the recognition between the transactivation domain of c-Myb and the KIX domain
of the CREB-binding protein. Biochem Biophys Res Commun. 2012 Sep 28. pii: S0006291X(12)01871-2. doi: 10.1016/j.bbrc.2012.09.112. [Epub ahead of print]
•
Morrone A, Giri R, Brunori M, Gianni S. (2012) Reassessing the folding of the KIX
domain: Evidence for a two-state mechanism. Protein Sci. 2012 Sep 25. doi:
10.1002/pro.2159. [Epub ahead of print]
•
Chi CN, Bach A, Strømgaard K, Gianni S, Jemth P.(2012) Ligand binding by PDZ domains.
Biofactors. 2012 Jun 7. doi: 10.1002/biof.1031. [Epub ahead of print]
•
Hultqvist G, Pedersen SW, Chi CN, Strømgaard K, Gianni S, Jemth P (2012) An expanded
view of the protein folding landscape of PDZ domains. Biochem Biophys Res Commun.
2012 May 11;421(3):550-3. Epub 2012 Apr 13.
•
Sarti P, Forte E, Giuffrè A, Mastronicola D, Magnifico MC, Arese M. (2012) The Chemical
Interplay between Nitric Oxide and Mitochondrial Cytochrome c Oxidase: Reactions,
Effectors and Pathophysiology. Int J Cell Biol. 2012 2012:571067. Epub 2012 Jul 1
Comunicazioni a congresso
•
Picone P, Nuzzo D, Caruana L, Di Carlo M. Metformin and insulin two opposite effects on
beta amyloid biogenesis and aggregation XXI Congresso Nazionale SIBPA Ferrara 17-20
settembre 2012
•
Estrogen receptors in HAECs: neuronal differentiation and stemness. Drago G, Cascio C,
Bonaccorso G, Russo D, Guarneri P. SINS Congress, Catania 2012
•
VAPB as a possible disease-modifier of ALS. Deidda I, Galizzi G, Russo D, Passantino R,
C. Cascio, Colletti T, La Bella V, Guarneri P. SINS-XIV, Catania 2012
13
Sottoprogetto 3
•
The role of autophagy in the CLN8mnd mouse model of neuronal ceroid lipofuscinosis, G
Galizzi, R Passantino, I Deidda, D Russo, G Drago, C Cascio, P Bigini, P Guarneri. SINS
Congr, Catania 2012.
•
A potential interactome map of CLN8 protein involved in the late-infantile form of neuronal
ceroid lipofuscinosis, R Passantino, G Galizzi, C Cascio, I Deidda, D Russo, P Guarneri.
SINS Congr., Catania 2012.
Brevetti
Brevetto europeo n° 1254251: “Neurosteroids as markers for Alzheimer’s disease” Inventori:
Papadopolous V; Cascio C.; R. Brown
Articoli proposti per la pubblicazione
•
Picone P, Nuzzo D, Di Carlo M. Ferulic acid: a natural antioxdant against oxidative stress
induced by oligomeric Abeta on sea urchin embryo. (2012) sottomesso per la pubblicazione
a The Biological Bullettin
•
αA-Crystallin and estrogen receptors in retinal oxidative stress and diabetic retinopathy.
Cascio C, Deidda I, Bianchi L, Russo D, Passantino R, Bini L, Guarneri P. Summitted to
IOVS.
•
Characterization of cleavage products of vesicle-associated membrane protein associated
protein B (VAPB) in the peripheral blood leukocytes and cerebralsppinal fluid of patients
with Amyotrophic Lateral Sclerosis. Deidda I, Galizzi G, Russo D, Passantino R, C. Cascio,
Colletti T, La Bella V, Guarneri P. Amyotroph. Lateral Scler., 2012, submitted
•
CLN8 and VAPs interactors: a possible function in the lipid metabolism and autophagy, G.
Galizzi, R. Passantino, C. Cascio, I. Deidda, D. Russo, P. Guarneri. Neuroscience Lett.,
submitted
•
Identifying protein partners of CLN8, an ER-resident protein involved in neuronal ceroid
lipofuscinosis Rosa Passantino, Caterina Cascio, Irene Deidda, Giacoma Galizzi, Domenica
Russo, Gianpiero Spedale, Patrizia Guarneri. BBA - MOLECULAR CELL RESEARCH,
submitted
Altri prodotti
•
Biological and genetic variables in the pathogenesis and clinical progression of amyotrophic
lateral sclerosis: identification of biomarkers. Orphanet – Il portale delle malattie rare e dei
farmaci orfani. Responsabile Patrizia Guarneri
14
Sottoprogetto 3
WP1.5 Analisi del trascrittoma nell'invecchiamento e nella malattia di Alzheimer
(IBBE)
L’obiettivo del presente WP è lo studio su larga scala del profilo trascrizionale di campioni
biologici da soggetti sani in funzione dell'età anagrafica e di pazienti affetti da morbo di Alzheimer.
Tale obiettivo sarà perseguito mediante il sequenziamento massivo del trascrittoma con piattaforme
di nuova generazione, in modo da fornire un profilo completo della dinamica dell'espressione
genica nell'invecchiamento e nell'Alzheimer. Nel corso del progetto lo studio si focalizzerà sia
sull'espressione differenziale delle diverse isoforme di splicing alternativo e che sui potenziali
eventi di editing a carico di RNA messaggeri.
Le attività svolte nella prima fase del progetto possono essere riassunte come di seguito:
1) Campionamento. Ricerca dei tessuti cerebrali normali ed Alzheimer per l’estrazione degli
acidi nucleici. In particolare, dalla Brain Bank NBB Olandese (http://www.brainbank.nl/)
sono stati selezionati 8 donatori Alzheimer e 5 donatori normali, tutti di sesso maschile e
con età compresa tra i 70 ed 80 anni (intervallo post-mortem inferiore alle 10 ore). Per tutti i
donatori sono stati richiesti dei campioni cerebrali di lobo frontale e temporale, mentre nel
caso dei donatori Alzheimer sono stati richiesti anche i campioni di ippocampo. Tutti i
tessuti sono in fase di processamento per l’estrazione e purificazione dell’RNA cellulare
totale mediante appropriati kit di biologia molecolare.
2) Ottimizzazione dei sistemi bioinformatici per lo studio su larga scala del trascrittoma e
dei fenomeni post-trascrizionali come lo splicing alternativo e l’editing dell’RNA. In
questa prima fase del progetto si sta allestendo un appropriato workflow per l’analisi di dati
RNA-Seq costituito dalla integrazione di diversi moduli in serie (Figura 1). Le sequenze in
input (in formato fastq) vengono dapprima analizzate per una verifica preliminare della
qualità del sequenziamento tramite i software FastQC ed NGS-QC Toolkit. Il secondo, in
particolare, permette il filtraggio automatico delle reads che non soddisfano delle soglie
minime di qualità, mentenendo nel dataset iniziale solo le sequenze di buona qualità. Le
reads così filtrate vengono allineate sul genoma tramite gli algoritmi GSNAP o Tophat. Sia
GSNAP che Tophat consentono di mappare le read sul genoma in tempi ragionevoli, e
consentono di individuare sia reads esoniche che reads interrotte da introni, permettendo in
questo modo l'identificazione delle giunzioni di splicing. Tali informazioni vengono
processate da Cufflinks, un algoritmo che provvede ad assemblare i trascritti “full-length”
compatibilmente con le giunzioni individuate e ad un insieme di trascritti di riferimento.
Cufflinks è anche in grado di calcolare il livello di espressione relativo dei geni e dei singoli
trascritti. Disponendo di due o più dateset è possibile calcolarne l'espressione differenziale
mediante il modulo cuffdiff. Le reads non allineate da Tophat vengono estratte ed allineate,
mediante Bowtie, su una libreria di giunzioni estratte da ASPicDB
(www.caspur.it/ASPicDB/), un database di dati di predizione di eventi di splicing alternativo
sviluppato dal nostro gruppo di ricerca. La libreria comprende giunzioni note (individuabili
in un trascritto Refseq), giunzioni nuove (individuabili nei trascritti predetto) o giunzioni
potenziali (ottenute mediante lo skipping di uno o più esoni). Le giunzioni individuate
vengono successivamente assemblate per ricostruire i trascritti completi. Le reads non
allineate sulla libreria di giunzioni vengono analizzate per ricercare potenziali siti di
poliadenilazione. Le reads con stretch terminali di A vengono estratte e successivamente al
taglio della coda di polyA vengono nuovamente allineate. Le sequenze allineate in questa
fase sono utilizzate per marcare i potenziali siti di poliadenilazione. Infine, le reads
rimanenti vengono allineate su un database fullRNA per individuare gli RNA residui (non
coding rna, piccoli rna, etc) I risultati di ogni singolo ramo della pipeline confluiscono in un
database tramite il quale i dati ottenuti possono essere visualizzati ed interrogati.
15
Sottoprogetto 3
Per lo studio dell’editing dell’RNA, sono state sviluppate due metodologie bioinformatiche,
una per esplorare i potenziali eventi di editing mediante il confronto con le posizioni note
nel database DARNED, e l’altra per identificare “de novo” i più probabili eventi di editing
per sostituzione Adenina – Inosina (A-I). Nel primo caso è stato sviluppato un apposito
servizio web, raggiungibile al sito http://t.caspur.it/ExpEdit/, in cui tutte le posizioni note
per essere soggette ad editing sono esplorate sito per sito lungo l’allineamento multiplo delle
read. Nel secondo caso, invece, è stata sviluppata una strategia computazionale che a partire
da un allineamento multiplo di read dal trascrittoma è in grado di identificare tutte le
posizioni genomiche in cui la sostituzione A-G (I è sempre letta come G dagli enzimi per il
sequenziamento) è più probabile che sia un evento di RNA editing che non un evento
casuale conforme alla distribuzione osservata delle A-G nell’intero esperimento di
sequenziamento.
Entrambe le metodologie sono state testate su esperimenti di RNA-Seq (sequenziamento
massivo del trascrittoma) umani provenienti da tessuto cerebrale o corda spinale. Parte dei
risultati ottenuti con la metodologia de novo sono stati confermati mediante sequenziamento
Sanger o sequenziamento dell’esoma.
L’obiettivo primario di questo WP è quello di decifrare i principali cambiamenti del trascrittoma nel
corso dell’invecchiamento o in seguito alla degenerazione patologica dell’Alzheimer. Lo studio
delle modificazioni post-trascrizionali come l’editing dell’RNA saranno essenziali per investigare
altre potenziali dinamiche molecolari alla base dell’invecchiamento e della malattia di Alzheimer. I
risultati saranno quindi fondamentali non solo in fase di diagnostica ma anche per identificare nuovi
marcatori che potrebbero essere utilizzati come bersaglio per farmaci di ultima generazione.
Parte delle analisi sperimentali e bioinformatiche saranno condotte anche con l’ausilio di ricercatori
affiliati al Dipartimento di Bioscienze, Biotecnologie e Scienze Farmacologiche dell’Università di
Bari e del Consorzio Applicazioni Supercalcolo per Università e Ricerca (CASPUR) di Roma.
• Picardi E, Gallo A, Galeano F, Tomaselli S, Pesole G. A Novel Computational Strategy to
Identify A-to-I RNA Editing Sites by RNA-Seq Data: De Novo Detection in Human Spinal
Cord Tissue. PLoS One. 2012;7(9):e44184.
•
Giulietti M, F. Piva, M. D’Antonio, P. D’Onorio De Meo, D. Paoletti, T. Castrignanò, A.M.
D’Erchia, E. Picardi, F. Zambelli, G. Principato, G. Pavesi, G. Pesole. SpliceAid-F: a
database of human splicing factors and their RNA binding sites. Nucleic Acids Res. (2012,
in press)
16
Sottoprogetto 3
Figura 1. Workflow per l’analisi di dati RNA-Seq
17
Sottoprogetto 3
WP.1.6 coinvolgimento dell’RNA nelle malattie neurodegenerative
(IGM)
Parte della fase iniziale è stata spesa nel reclutare i giovani ricercatori da inserire nel progetto e
nello stabilire delle collaborazioni utili per lo svolgimento dello stesso. Di fatto questa fase è stata
condizionata dal ritardo con cui è stata stabilita dal CNR la ripartizione delle voci di spesa
ammissibili.
L’Unita di Ricerca (UR) IGM-CNR ha analizzato tramite gene expression arrays e validato
sperimentalmente i cambiamenti di espressione di fattori di splicing in seguito a condizioni
stressanti. Il sistema sperimentale utilizzato fino ad oggi si basa su colture cellulari crescite a
differente densità. Ad alata densità abbiamo potuto dimostrare che si verificano una serie di
condizioni stressanti che sono associate all’insorgenza a malattia neurodegenerative quali ipossia,
deprivazione da glucosio o glutamina. Queste condizioni portano ad una generale riduzione nei
livelli di espressione di RNA binding proteins, alcune delle quali sono direttamente coinvolte nel
regolare lo splicing dei trascritti per la proteina tau alterando il rapporto tra diverse isoforme
(isoforma 3R vs 4R). Abbiamo verificato nel nostro sistema che la densità cellulare portando ad un
aumento della isoforma 3R. Ci siamo concentrati sui trascritti per il fattore di splicing SRSF1 e
abbiamo evidenziato un complesso meccanismo di regolazione di eventi di splicing alternativo che
si verificano nella regione 3’UTR del gene e che sono controllati dai livelli di glutamina. Queste
variazioni influenzano il livello di trascritto, e conseguentemente di proteina, tramite il meccanismo
del non-sense mediated RNA decay (NMD). Ci proponiamo di utilizzare dei minigeni per
identificare le sequenze sul trascritto e le proteine che controllano questi eventi di splicing
alternativo. In parallelo, abbiamo evidenziato un complesso circuito di regolazione che coinvolge
due RNA binding proteins (hnRNP A1 e hnRNP A2/B1) in grado di antagonizzare l’attività di
SRSF1 nella regolazione dello splicing. In particolare, alti livelli di proteina A1 promuovono un
evento di splicing alternativo nei trascritti della hnRNP A2/B1 inducendone la degradazione tramite
il meccanismo di NMD. Ci proponiamo di verificare se questi circuiti regolativi si verificano nelle
cellule di neuroblastoma SH-SY5Y differenziate verso la linea neuronale con Acido Retinoico in e
Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF). A questo scopo abbiamo stretto una collaborazione
con il Prof. Covoni (Università di Pavia). Le cellule differenziate sono state trattate con peptide bamiloide. Nei prossimi mesi verranno eseguite analisi tramite 2D-gel e gene expression arrays per
stabilire l’effetto del trattamento sui profili di espressione e il pattern di modificazioni posttraduzionale delle proteine coinvolte nello splicing. Nello stesso periodo, il sistema cellulare di
neuroblastoma verrà trasferito in istituto deve sarà possibile vagliare differenti condizioni di crescita
e operare esperimenti di biologia molecolare quali RNAi.
Sono stati attivati 1 assegno di ricerca e 4 borse di studio.
Un assegnista è dedicato ad identificare composti in grado di inibire attività
chinasiche (dyrk1a, fyn, pka) con un ruolo in Alzheimer. Sono già stati messi a punto saggi
biochimici per questi scopi. I composti verranno forniti grazie ad una collaborazione con il
Prof. Maurizio Botta (Facoltà di Farmacia università di Siena). Gli stessi composti verranno
testati in colture di cellule SH-SY5Y differenziate e trattate con peptide b-amiloide.
Verificheremo in 2D-gel il loro effetto su fosforilazione di specifiche RNA binding proteins.
Un borsista si occuperà di verificare tramite gel bidimensionale eventuali
modificazioni post-traduzionali (principalmente fosforilazione) che si verificano in modelli
cellulari di Alzheimer basati su cellule di neuroblastoma SH-SY5Y. Allo scopo è stato
comperato un apparecchio per 2D gel (PROTEAN i12 IEF cell BioRad). Il metodo è stato
già applicato per verificare l’effetto di agenti danneggianti sul pattern di fosforilazione di
una serie di RNA binding proteins tra cui SRSF1.
Un borsista si occuperà di verificare l’effetto di differenti condizioni di crescita sul
differenziamento e degenerazione di cellule di neuroblastoma SH-SY5Y in seguito a
18
Sottoprogetto 3
trattamento con il peptide b-amiloide e nel fornire materiale per l’analisi di gene expression
array.
Un borsista si sta occupando di studiare la regolazione di eventi di splicing
alternativo dei trascritti di SRSF1 in cellule SH-SY5Y differenziate sottoposte a differenti
tipi di stress e della correlazione con il profilo di splicing di trascritti di geni coinvolti
nell’insorgenza della malattia di Alzheimer tra cui Tau.
Infine un borsista si occupa di studiare con metodi bio-informatici una serie di geni
la cui espressione varia durante la patologia di Alzheimer. A questo proposito in
collaborazione con l’istituto di matematica del CNR a Pavia, IMATI, abbiamo sviluppato un
programma che permette di identificare tramite il vaglio di banche dati pubbliche di
espressione genica i geni che sono coregolati positivamente o negativamente rispetto ad un
gene di interesse. L’analisi stata già fatta su una serie di geni implicati nella malattia di
Alzheimer (APOE, APP, HIF1A, PSEN1, PSEN2).
Tra le attività da intraprendere, oltre a quelle citate sopra, prevediamo di modulare tramite
esperimenti di RNA interference l’espressione di specifiche RNA binding proteins e/o chinasi per
stabilire il loro ruolo negli eventi di splicing modificati nel nostro sistema sperimentale. Al fine di
poter applicare il sistema dei vettori retro virali per una maggior efficienza del sistema stiamo
allestendo una camera per colture cellulari P2. Prevediamo che i lavori saranno completati entro la
fine dell’anno.
Nel progetto sono coinvolti:
Personale strutturato
Dott. Giuseppe Biamonti – Direttore IGM
Dott.ssa Ivana Scovassi – Dirigente di ricerca IGM
Dott. Federico Focher – Dirigente di ricerca IGM
Dott.ssa Alessandra Montecucco – Primo ricercatore IGM
Dott. Fabio Cobianchi – Ricercatore IGM
Dott.ssa Silvia Bione - Ricercatore IGM
Dott.ssa Donata Orioli - Ricercatore IGM
Dott.ssa Antonella Lisa – Tecnologo IGM
I borsisti sono stati reclutati tra i giovani che sono stati ammessi (senza borsa ministeriale) al
dottorato di ricerca in “Scienze Genetiche, Biologia Molecolare e Cellulare” dell’Università di
Pavia che, grazie ad apposita convenzione siglata quest’anno, vede la partecipazione diretta del
nostro Istituto.
Come detto l’inizio del progetto è stato influenzato dal ritardo con cui è stata stabilita dal CNR la
ripartizione delle voci di spesa ammissibili. Conseguentemente abbiamo utilizzato questo periodo
come una fase organizzativa. Appena definite la ripartizione sono stati pubblicati i bandi per i
borsisti/assegnisti. Sono state anche strette collaborazioni fondamentali per lo svolgimento del
progetto stesso.
Al momento sono stati impegnati fondi per 6 mesi per le borse e l’assegno di ricerca (38.000 €),
l’intera somma dedicata alle spesi generali (20.000 €), una frazione significativa dei fondi destinati
ad acquisto di beni inventariabili/strumentazione scientifica (10.000 €) e circa 5.000 € di consumo
per un totale di 73.000 €.
19
Sottoprogetto 3
Durante questi mesi abbiamo sviluppato un programma di analisi dei profili di espressione genica
che permette di identificare gruppi di geni co-regolati in differenti condizioni. Il programma, frutto
di una collaborazione con l’Istituto di Matematica del CNR a Pavia, analizza tutte i “data set”
pubblici di espressione genica estraendo il set di geni coregolati con un gene di interesse. L’idea di
base è che questo possa fornire indicazioni utili per comprendere il tipo di processi cellulari in cui
un dato prodotto genico è coinvolto. Il programma è stato sviluppato e utilizzato per l’analisi di geni
coinvolti nella malattia di Alzheimer. Nei prossimi mesi verrà sviluppata una maschera di
interfaccia per renderlo disponibile gratuitamente agli utilizzatori direttamente collegandosi al sito
internet dell’Istituto (www.igm.cnr.it)
Prof. Marco Racchi. UniPharmLab-Pavia è un laboratorio di ricerca afferente al Dipartimento di
Scienze del Farmaco - Sez. Farmacologia dell'Università di Pavia. La collaborazione permetterà di
sviluppare modelli cellulari di neurodegenerazione e di accedere ad un’ampia collezione di
campioni biologici ottenuti da pazienti.
Prof. Maurizio Botta. Facoltà di Farmacia. Università di Siena. La collaborazione è tesa a
sviluppare molecole contro specifiche protein-chinasi coinvolte in malattie neurodegenerative e
note per modificare specifiche RNA binding proteins.
Prof. Gianni Sacchi. IMATI – CNR . Sviluppo di metodi di analisi bio-informatici
CorrelaGenes: a new tool for the interpretation of the human transcriptome Paolo Cremaschi, Sergio
Rovida, Lucia Sacchi, Antonella Lisa, Alessandra Montecucco, Giuseppe Biamonti, Silvia Bione,
and Gianni Sacchi (2012) EMBnet journal
20
Sottoprogetto 3
WP1.7 Inibizione dell’attività lisosomiale nell’invecchiamento e conseguenze sulla
neurodegenerazione
(ITB)
L’invecchiamento è il principale fattore di rischio per le malattie neurodegenerative quali il morbo
di Alzheimer e di Parkinson.
Nei nostri laboratori stiamo da tempo studiando la struttura e la funzione di organelli che si
accumulano nei neuroni e nella glia durante l’invecchiamento del cervello umano. Questi organelli
sono di tipo lisosomiale e sono di due classi: un tipo di organello contiene un pigmento chiamato
neuromelanina, mentre un secondo tipo contiene le lipofuscine. Entrambi gli organelli sono ricchi
di lipidi e proteine allo stato nativo e probabilmente anche modificato, e sono il risultato di un
meccanismo protettivo del neurone che sequestra diversi composti tossici in compartimenti
specifici. Tuttavia la presenza e l’accumulo di questi organelli potrebbe interferire con i normali
processi cellulari. Gli enzimi lisosomiali di questi organelli sono impegnati nel tentativo di
degradare le specie non degradabili come le neuromelanine e le lipofuscine; questo potrebbe ridurre
la disponibilità di enzimi lisosomiali necessari per altri processi autofagici fondamentali, come la
mitofagia.
In questo progetto verranno studiati i processi che portano alla formazione di questi particolari
organelli, per definirne la funzione e il ruolo nella vulnerabilità neuronale. Inoltre, verranno anche
isolati i mitocondri da tessuto cerebrale umano per poter identificare i target molecolari
dell’invecchiamento e dei processi neurodegenerativi.
Per quanto riguarda l’isolamento e la caratterizzazione degli organelli contenenti neuromelanina
sono stati ottenuti i seguenti risultati preliminari.
1)
Gli organelli contenenti neuromelanina sono stati isolati dalla sostanza nera umana e la
purezza di queste preparazioni è stata confermata mediante microscopia elettronica a trasmissione.
L’analisi proteomica di questi campioni è stata effettuata mediante cromatografia liquida abbinata a
spettrometria di massa ad alta risoluzione e, per ottenere informazioni più dettagliate, sono stati
analizzati anche i seguenti campioni: il pigmento neuromelanina isolato dagli organelli stessi e la
neuromelanina isolata direttamente dal tessuto di sostanza nera. Analisi proteomiche preliminari
degli organelli contenenti neuromelanina hanno identificato numerose proteine del lisosoma,
evidenziando così l’origine lisosomiale di questo particolare organello.
2)
La presenza di alcune proteine è stata confermata nell’organello isolato mediante western
blot; inoltre le proteine di particolare interesse sono state localizzate all’interno degli organelli di
neuromelanina mediante immunomicroscopia elettronica eseguita su tessuto cerebrale.
3)
Da una preliminare analisi lipidomica è emersa l’abbondanza di una particolare classe di
lipidi isoprenoidi che abbiamo recentemente identificato anche nelle neuromelanine isolate da
diverse aree cerebrali umane.
Attività da svolgere
1)
Verrà eseguita un’analisi dettagliata per identificare eventuali modificazioni a carico dei
lipidi e dei peptidi presenti negli organelli contenenti neuromelanina, con particolare attenzione a
quelle che si osservano frequentemente durante l’invecchiamento e a quelle coinvolte nei
meccanismi neurodegenerativi.
2)
I dati ottenuti dalle tecnologie high-throughput (proteomica/lipidomica) verranno elaborati
con approccio bioinformatico per identificare i pathways che hanno portato alla formazione di
questi organelli.
21
Sottoprogetto 3
3)
Per quanto riguarda gli organelli contenenti lipofuscine, stiamo attualmente lavorando per
mettere a punto un metodo di isolamento da tessuto cerebrale umano. La difficoltà nell’isolamento
di questo particolare tipo di organello risiede nel fatto che ad oggi non si conosce alcuna
informazione certa sulla sua composizione e in letteratura le lipofuscine sono descritte come
organelli con morfologia eterogenea in diverse aree cerebrali. Una volta ottenuti campioni di
organelli di lipofuscine ad elevato grado di purezza, controllata con western blot e microscopia
elettronica, verranno effettuate approfondite analisi proteomiche e lipidomiche.
4)
Per quanto riguarda l’isolamento dei mitocondri dal tessuto cerebrale, stiamo invece
lavorando per ottenere preparazioni mitocondriali ad elevato grado di purezza. Sebbene esistano in
letteratura diversi protocolli per il loro isolamento, il nostro obbiettivo è ottenere preparazioni di
mitocondri integri nella loro struttura e soprattutto senza alcun tipo di contaminanti subcellulari.
Le attività svolte e quelle da svolgere sono costose considerando le metodiche applicate e la piccola
quota di finanziamento assegnata per il suddetto workpackage risulta insufficiente, alla luce anche
della quota trattenuta dalla sede centrale.
La comprensione dei meccanismi cellulari che intervengono durante l’invecchiamento cerebrale
potrà fornire informazioni utili per la messa a punto di strategie antiaging e per la cura delle
malattie neurodegenerative.
La nostra Unità di Ricerca si avvale delle seguenti collaborazioni (riportiamo di seguito le più
importanti):
• dr. Pierluigi Mauri, Institute of Biomedical Technologies – CNR, Proteomics and
Metabolomics Unit, Segrate (MI);
• dr. David Sulzer, Departments of Psychiatry, Neurology and Pharmacology, Columbia
University, New York, NY, USA;
• prof. Jau-Shyong Hong, Neuropharmacology Section, Laboratory of Pharmacology and
Chemistry, NIEHS/NIH, Research Triangle Park, NC, USA;
• prof. Kazumasa Wakamatsu and Prof. Shosuke Ito, Department of Chemistry, Fujita Health
University, School of Health Sciences, Toyoake, Aichi, Japan;
• prof. Luigi Casella, Dipartimento di Chimica Generale, Università degli Studi di Pavia,
Pavia, Italy.
Cebrián C, Budhu S, Zucca FA, Mauri P, Mandelbaum J, Vonsattel JP, Scherzer CR, Zecca L,
Loike JD, Sulzer D. A role for neuronal MHC-I display in T-cell mediated neurodegeneration.
Submitted to Neuron.
22
Sottoprogetto 3
WP1.8 Modelli transgenici d’invecchiamento cerebrale e di longevità
(IBCN)
I membri della commessa CNR-EMMA producono e studiano modelli transgenici innovativi
d’invecchiamento cerebrale, in particolare per quanto riguarda le sindromi neurodegenerative ad
esso associate (malattia di Parkinson, ecc.).
Nel corso del 2012, a partire dall’analisi genetica e biochimica della famiglia di neurorecettori
orfani tipo GPR37/Pael-R, accoppiati a G-proteine, sono stati prodotti e analizzati nuovi ceppi
murini mutanti knock-out dei due geni omologhi GPR37 e GPR37L1.
GPR37 è un substrato della parkina, è espresso nei neuroni dopaminergici della substantia nigra, e,
nei pazienti della malattia di Parkinson, vi si accumula progressivamente in aggregati citotossici.
L’assenza di GPR37 conferisce una marcata resistenza a neurotossine Parkinsoniane (MPTP e
deriv.) ed induce specifiche alterazioni motorie, mostrando il coinvolgimento del recettore nella
modulazione del sistema dopaminergico nigro-striatale e delle risposte agli psicostimolanti d’abuso
(Marazziti et al. 2004-2011).
I suddetti ceppi mutanti knock-out sono stati utilizzati in studi mirati, con la messa a punto e
applicazione di analisi biochimiche, cito-istologiche, fisiologiche ad hoc e nuovi tests
comportamentali, per la caratterizzazione di specifiche sintomatologie neurodegenerative correlate
all’invecchiamento.
Lo studio del ceppo GPR37 knock-out ha permesso la caratterizzazione di specifiche alterazioni,
legate all’età e al sesso, di varie funzioni comportamentali non-motorie (Mandillo et al. 2012,
submitted). Questi risultati confermano che, nella messa a punto di modelli specifici di patologie
neurodegenerative, è cruciale analizzare specificamente un’ampia gamma di sintomi non-motori,
spesso altamente invalidanti, anche in relazione all’età e al sesso (ad es.: disturbi olfattivi, emotivi e
cognitivi).
Lo studio del ceppo GPR37L1 knock-out ha dimostrato come la mancanza di questo recettore
induca specifiche alterazioni biochimiche e citologiche dello sviluppo post-natale del cervelletto,
associate a modificazione delle capacità di apprendimento motorio, anche nell’adulto (Marazziti et
al. 2012, in preparation).
Risorse impegnate: Luglio 2011-Ottobre 2012:
Risorse Personale impegnate: Tot. ca 16 mesi/uomo (Ricercatori/Tecnologi CNR)
Risorse Investimento impegnate: Tot. ca. 20 KEuro (strumentazione laborat.)
Fondi Assegnati 2012: Euro 130.000
Fondi Ricevuti 2012: Euro 65.000
Risorse impegnate: Luglio 2011-Ottobre 2012:
Risorse Personale impegnate: Tot. ca 16 mesi/uomo (Ricercatori/Tecnologi CNR)
per produzione e caratterizzazione fenotipica (analisi biochimiche, cito-istologiche, fisiologiche
comportamentali) di nuovi ceppi murini, mutanti knock-out dei due geni omologhi GPR37
GPR37L1, quali modelli innovativi d’invecchiamento cerebrale
Risorse Investimento impegnate: Tot. ca. 20 KEuro (strumentazione laborat.)
per produzione e caratterizzazione fenotipica (analisi biochimiche, cito-istologiche, fisiologiche
comportamentali) di nuovi ceppi murini, mutanti knock-out dei due geni omologhi GPR37
GPR37L1, quali modelli innovativi d’invecchiamento cerebrale
e
e
e
e
Collaborazione con Enti, Organismi di ricerca
23
Sottoprogetto 3
Per la messa a punto di nuovi modelli d’invecchiamento cerebrale e di longevità, la commessa
CNR-EMMA, quale partner Italiano dei Consorzi internazionali IMPC-IKMC, INFRAFRONTIER
ed EMMA, partecipa fin dal 1996, assieme ai maggiori Enti ed Istituti di ricerca biomedica a livello
mondiale, alla produzione, caratterizzazione fenotipica primaria, crioconservazione e
disseminazione su larga scala ceppi mutanti condizionali, modelli di malattie umane.
I suddetti consorzi internazionali hanno reso disponibili fino ad oggi oltre 3500 modelli mutanti,
con l’obiettivo di produrre, caratterizzare e distribuire fino ad oltre 20000 nuovi modelli nel corso
del prossimo ventennio (www.mousephenotype.org; www.emmanet.org).
Mandillo S., Golini E., Marazziti D., Di Pietro C., Matteoni R., Tocchini-Valentini G.P.
Mice lacking the Parkinson's related GPR37/PAEL receptor show non-motor behavioral
phenotypes: effect of age and gender. 2012. Manuscript submitted.
Marazziti D., Di Pietro C., Mandillo S., Golini E., La Sala G., Matteoni R., Tocchini-Valentini G.P.
Altered postnatal cerebellum development and adult motor learning in mice lacking the orphan
GPR37L1 receptor. 2012. Manuscript in preparation.
C. Di Pietro, D. Marazziti, S. Mandillo, E. Golini, G. La Sala, R. Matteoni, G. P. TocchiniValentini. The orphan GPR37L1 receptor controls postnatal cerebellum development. Poster
presentation, n. 132.06/A23. Society for Neuroscience Meeting, 13-17 October 2012, New Orleans
Golini E., Mandillo S., Marazziti D., Di Pietro C., La Sala G., Matteoni R., Tocchini-Valentini G.P.
The Orphan Gpr37l1 Receptor Is Involved In Motor Learning In Mice. Poster presentation, n.
p153.05/D5. 8th FENS Forum of Neuroscience, 14-18 July 2012, Barcelona
24
Sottoprogetto 3
WP1.9 - Studio dei microRNA e dei meccanismi molecolari alla base della iperfosforilazione
di TrkA nella patogenesi e nella progressione della malattia di Alzheimer
(IBCN)
Il WP prevede due linee di attività (L1 e L2):
L1 :
Attività avviate: 1) In studi precedenti avevamo dimostrato che il miR-101, i cui livelli sono ridotti
nella corteccia temporale di un gruppo di pazienti affetti dalla patologia di Alzheimer (AD), è un
regolatore negativo dell’espressione dell’APP e riduce l’accumulo del peptide beta amiloide in
colture primarie di neuroni ippocampali (Vilardo et al . J.Biol. Chem. 2010; 11:18344-51).
Nell’ambito del progetto invecchiamento è stata costruita e validata una spugna lentivirale che
esprime selettivamente in neuroni un trascritto contenente sequenze ripetute complementari al
miR-101 maturo in grado di sottrarre il miR ai suoi geni bersaglio. Mediante esperimenti di
inibizione o di sovraespressione del miR-101 in neuroni ippocampali, sia in vitro che in vivo, è stato
identificato un nuovo gene bersaglio del miR-101, che è coinvolto nel processamento proteolitico
dell’APP. Utilizzando saggi di luciferasi abbiamo dimostrato l’interazione funzionale tra il miR101 e il sito responsivo presente nella sequenza della regione non tradotta del messaggero del gene
target; 2) Mediante PCR quantitativa real time stiamo analizzando l’espressione di selezionati
microRNA nella corteccia temporale di pazienti affetti dalla patologia di Alzheimer.
L’attività da avviare prevede: a) La generazione di vettori lentivirali che sovraespimono o
inibiscono in modo condizionale e inducibile selezionati microRNA per ottenere una deregolazione
concertata di diversi microRNAs in specifiche aree cerebrali in modelli murini. Studio morfologico
e funzionale dell’effetto della manipolazione dei microRNA in vivo. b) Validazione di miRNA quali
biomarcatori di patologia.
L2:
Attività avviate: I nostri studi riguardano il ruolo dello stress ossidativo nella degenerazione
neuronale nel morbo di Alzheimer e il possibile effetto delle neurotrofine nel modulare tale stress.
Studi recenti hanno mostrato che APP e il recettore per il NGF TrkA interagiscono e che TrkA
fosforila APP in residui specifici che hanno un ruolo importante per il corretto traffico
intracellulare di APP (Matrone et al. J Neurosci. 2011; 31:11756-11761). Nel frattempo è stato
anche dimostrato che APP è dotato di attività di ferrossidasi (ossidazione de Fe2+ a Fe3+)
importante per l’estrusione di ioni Fe dalle cellule (Duce et al. Cell. 2010;142:857-867). A
differenza di altre cellule i neuroni corticali non esprimono la ceruplasmina, altra principale
ferossidasi cellulare, e quindi sono fortemente dipendenti dal funzionamento di APP per mantenere
il Fe intracellulare a livelli tali da non provocare stress ossidativo. Noi stiamo quindi studiando se
l’attivazione di TrkA da parte del NGF regola l’attività di ferossidasi dell’ APP. Dato che il Fe
intracellulare regola l’espressione di proteine coinvolte nel metabolismo cellulare del Fe
promuovendo il loading sui polisomi dei rispettivi mRNA, noi abbiamo messo a punto protocolli
per isolare tramite immunoprecipitazione dei polisomi (TRAP translating ribosome affinity
purification) i messaggeri attivamente tradotti. Utilizzando PCR quantitativa stiamo investigando se
l’ NGF induce in cellule bersaglio un’attivazione traduzionale dei geni del metabolismo del Fe
compatibile con una modulazione dell’attivita di ferossidasi di APP.
L’attività da avviare prevede: a) La generazione di vettori lentivirali necessari per il TRAP. Fino
ad ora abbiamo utilizzato, per comodità sperimentale, la linea cellulare PC12 che può essere
facilmente trasfettata, ma noi vogliamo estendere i nostri studi a culture primarie neuronali, b) la
produzione di PC12 non esprimenti la ceruplasmina per ottenere un modello di cellule strettamente
dipendenti da APP per l’estrusione del ferro più simile ai neuroni corticali.
25
Sottoprogetto 3
Risorse impegnate:
L1: 22.000€ Costi Funzionali; 8.000€ Attrezzature; 18.000€ Formazione
L2: 25000€ Costi funzionali; 5.200€ spese di missione; 6.800€ Attrezzature
Il laboratorio della L1 possiede conoscenze e metodologie per lo studio dei microRNA nel sistema
nervoso ed ha esperienza nello studio di modelli murini. Le conoscenze saranno utilizzate per
svolgere l’attività descritta nel progetto e raggiungerne gli obiettivi mediante tecniche di biologia
molecolare e cellulare, biochimiche e immunoistochimiche . Le risorse economiche sono adeguate
per il raggiungimento degli obiettivi. Le risorse ottenute sono state utilizzate per l’acquisto di
materiale per biologia molecolare e cellulare e studi biochimici e saranno investite inoltre
nell’acquisto e analisi di modelli murini. L’acquisto di piccola strumentazione da laboratorio
(microcentrifuga refrigerata, macchina PCR, camera elettroforetica) ha permesso di procedere negli
studi finora svolti. La risorsa di personale sarà investita nel finanziamento di un dottorato di ricerca
che parteciperà attivamente allo svolgimento progetto.
Il laboratorio della L2 ha esperienza di lunga data in studi della regolazione dell’espressione genica
in risposta a NGF. Le conoscenze saranno utilizzate per svolgere l’attività descritta nel progetto e
raggiungerne gli obiettivi mediante tecniche di biologia molecolare,cellulare e biochimiche. Le
risorse economiche sono adeguate per il raggiungimento degli obiettivi. Le risorse ottenute sono
state utilizzate per l’acquisto di materiale per biologia molecolare e cellulare e studi biochimici. I
fondi di missione sono stati utilizzati per la partecipazione a congressi internazionali tra cui il
prossimo Neuroscience 2012
L1: il progetto si avvale di due ricercatori CNR con esperienza nello studio dei microRNA nel
sistema nervoso, di uno studente di laurea specialistica, di un tecnico di laboratorio impegnato nelle
colture cellulari. Uno studente di dottorato parteciperà a tempo pieno allo svolgimento degli studi
descritti nel progetto.
L2: Allo studio dello stress ossidativo partecipano un dirigente di ricerca e un primo ricercatore
CNR con la collaborazione di un assegnista.
L1: E’ in corso la collaborazione con il Dr Masotti, responsabile dell’unità Gene expressionmicroarray laboratory IRCCS Ospedale Pediatrico Bambin Gesù, per l’analisi bioinformatica.
E’ programmata la collaborazione con la Prof.ssa Paola Andreozzi, Dirigente medico responsabile
del Centro di Medicina Predittiva Dipartimento Scienze Cardiovascolari, Respiratorie,
Nefrologiche, Anestesiologiche e Geriatriche, per reperire campioni di fluidi biologici di individui
anziani sani, e di pazienti con Mild Cognitive Impairment o affetti da AD.
L2: E’ in corso una collaborazione con la Dr. Possenti del Dipartimento di Medicina dall’Università
“Tor Vergata” di Roma. E’ programmata una collaborazione con il Dr. Marco Canossa, Università
di Bologna/Fondazione EBRI per l’utilizzo della metodologia TRAP in neuroni corticali.
L1: E’ in preparazione un manoscritto sull’identificazione di un nuovo gene target del miR-101 in
neuroni ippocampali.
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Report Primo Anno SP1 - Il Progetto Invecchiamento

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