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Convegno multifocale
La sicurezza alimentare: passato, presente e futuro
Metodiche innovative in sede di analisi
microbiologica degli alimenti ed
interpretazione dei risultati di laboratorio
Rovigo 18/05/2012
Renzo Mioni
Direttore Struttura Complessa SC1 Microbiologia Alimentare
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie
Mioni R. - Rovigo – 18.05.2012
per la ricerca di batteri e tossine negli alimenti
Di solito si intende un metodo di analisi che si contrappone a
quello “tradizionale” di tipo microbiologico-colturale, che
permette:
 Maggiore rapidità di risposta
 Maggiore sensibilità e specificità
 Automazione di molte fasi
 Costi più contenuti
 Possibilità di avere una risposta quantitativa immediata
Metodi microbiologici classici
Scopo del metodo: isolamento della colonia ed identificazione biochimica del
batterio cercato.
Per ogni u.c.
25 g alimento in 225 ml di brodocoltura di
arricchimento
Passaggio in brodocoltura di arricchimento
selettivo
Isolamento in piastra/e di terreno selettivo e/o
differenziale
Aliquota 5 u.c.
Passaggio delle colonie sospette in piastre di
terreno di crescita preparativo
all’identificazione della specie
Identificazione della colonia tramite test
biochimici (assimilazione, fermentazione, attività enzimatica,…)
Regolamento (CE) 2073/05 della Commissione del 15
novembre 2005 sui criteri microbiologici applicabili ai
prodotti alimentari
Punti significativi
 Specifica
in maniera esplicita i metodi di analisi
con cui verificare la conformità degli alimenti
Metodiche previste dal Reg.(CE) 2073/05 e dal Reg. (CE)
1441/07 - CRITERI DI SICUREZZA ALIMENTARE
Microrganismi/
loro tossine,
metaboliti
Listeria
monocytogenes
Metodo d’analisi di riferimento
ISO 11290-1:1996 - Microbiology of food and animal feeding stuffs- Horizontal method for the detection and
enumeration of Listeria monocytogenes. Part 1: Detection method
Amendment 1:2004 - Modification of the isolation media and haemolysis test, and inclusion of precision data
ISO 11290-2 :1998 - Microbiology of food and animal feeding stuffs- Horizontal method for the detection and
Listeria
monocytogenes
enumeration of Listeria monocytogenes. Part 2: Enumeration method
Amendment 1:2004 - Modification of the enumeration medium
Nota 6 Reg.2073: 1 ml di inoculo viene posto su una piastra di Petri di 140 mm di diametro o su tre piastre di
Petri di 90 mm di diametro
Salmonella
ISO 6579:2002 - Microbiology of food and animal feeding stuffs- Horizontal method for the detection of
Enterobacter
sakazakii
ISO/TS 22964:2006 - Milk and milk products – Detection of Enterobacter sakazakii
Salmonella spp.Technical corrigendum 1: 2004
E. coli
MBV
ISO/TS 16649-3:2005 - Microbiology of food and animal feeding stuffs- Horizontal method for the
Enterotossine
stafilococciche
Metodo europeo di screening del LCR
Istamina
HPLC (Malle P., Valle M., Bouquelet S., «Assay of biogenic amines involved in fish decomposition». J.
enumeration of b -glucuronidase-positive Escherichia coli. Part 3: Most probable number technique using 5bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-glucuronide
AOAC Internat. 1996, 79, 43-49)
Segue…
Reg. (CE) 2073/05
Articolo 5, Paragrafo 5
Art. 5 – Norme specifiche per le analisi e il campionamento
Paragrafo 5 - L’impiego di metodi d’analisi alternativi è
accettabile quando tali metodi sono validati in base al metodo di
riferimento di cui all’allegato I e se è utilizzato un metodo proprietario
certificato da una terza parte in base al protocollo definito nella
norma EN/ISO 16140 o ad altri protocolli analoghi accettati a livello
internazionale.
Qualora gli O.S.A. intendano applicare metodi analitici diversi da
quelli validati e certificati, tali metodi sono validati in base a protocolli
riconosciuti a livello internazionale e il loro impiego è autorizzato
dall’Autorità Competente
Metodi biomolecolari
•Sono metodi che hanno come oggetto di analisi il materiale
genetico dell’organismo vivente considerato.
Il DNA è una molecola che
contiene tratti comuni alla specie e
sequenze specifiche per ogni
singolo organismo.
Riuscire
a
“vedere”
una
sequenza specifica per la specie,
permette di identificare in modo
certo l’organismo ricercato.
es. Listeria monocytogenes,
Salmonella spp,
E.coli O157
Camylobacter jejuni, coli, lari
Vibrio parahaemolyticus tossigeno,
ecc.
Per valutare la presenza della sequenza o
tratto di DNA cercato ci si avvale della
tecnica di PCR (Polymerase Chain
Reaction), scoperta negli anni ’80 da Kary
Mullis.
I metodi biomolecolari vengono indicati
come metodi innovativi poiché hanno
“rivoluzionato” il modo di approcciarsi ad
alcune analisi ed hanno dato risposta a
molti quesiti del passato.
La reazione di PCR, Polymerase Chain Reaction
Reazione di amplificazione in vitro di un segmento di DNA per mezzo
dell’enzima Taq polimerasi, che aggiunge i nucleotidi complementari
al tratto da duplicare, usando come innesco la coppia di primers
delimitanti il tratto di DNA target.
In pratica, la PCR significa che …..
 permette di amplificare un tratto di DNA per più di 1.000.000 di volte!!!
 permette di ottenere una grande quantità di una specifica sequenza di
DNA in vitro, che posso visualizzare tramite l’elettroforesi nella PCR
classica o nel video di amplificazione nella PCR real-time
termociclatore
Gel elettoforesi
PCR classica: i prodotti
dell’amplificazione nel
termocycler, devono
essere visualizzati tramite
elettroforesi su gel
PCR real-time: il
termocycler comunica
direttamente al PC lo stato
di amplificazione del DNA
target
PCR classica
e
PCR Real Time
Estrazione del DNA dal campione
Allestimento della mix di reazione:
Allestimento della mix di reazione:
DNA estratto dal campione
DNA estratto dal campione
Taq polimerasi
Taq polimerasi
DNTPs (i 4 desossinucleotidi)
coppia di primers delimitanti la regione da amplificare
Altri componenti (Mg, acqua,. ..)
DNTPs (i 4 desossinucleotidi)
coppia di primers delimitanti la regione da amplificare
Altri componenti (Mg, acqua,. ..)
Sonde fluorescenti che rendono visibile il DNA target
durante la PCR
termociclatore
Preparazione gel
agarosio con
marcatore
(rende
PCR real-time: il termocycler
comunica direttamente al PC
lo stato di amplificazione del
DNA target (grafici)
visibile il DNA target
amplificato solo a fine
PCR)
elettroforesi
Gel esposto a UV
Esito:
Mioni presenza/assenza
R. - Rovigo – 18.05.2012
Esito: presenza/assenza
quantificazione
Vantaggi e svantaggi dei Metodi microbiologici
classici
Vantaggi
Svantaggi
Posso disporre del microrganismo
per ulteriori accertamenti:
Tempi di risposta per l’ assenza del
patogeno lunghi ( 72 ore)
• biochimici
• sierologici
• conservazione del ceppo
Costi di materiali d’uso e di
apparecchiature di incubazione più
elevati calcolati per singola analisi
Non richiedono alta specializzazione
nel personale
Disponibilità di spazi maggiori per lo
svolgimento delle analisi
Sono metodi ben conosciuti e sono
utilizzati dalla quasi totalità dei
laboratori che analizzano alimenti
Vantaggi e svantaggi dei metodi biomolecolari
Vantaggi
Svantaggi
Tempi brevi per l’esito negativo
Costi iniziali delle apparecchiature e
dei kit commerciali
Costi di analisi più bassi
Manodopera specializzata
Processamento di molti campioni
Organizzazione del lavoro
Elevata specificità
Possibilità di confermare la presenza di
varianti produttrici di tossine
Non discrimina tra cellule vitali/non
vitali (falsi positivi), serve la conferma
del metodo microbiologico colturale
Ricerca di virus enteropatogeni
Non permette di isolare il ceppo
Automazione:
riproducibilità
elevata
ripetibilità
e
Metodi microbiologici classici
Scopo del metodo: isolamento della colonia del batterio patogeno cercato
Cosa prevedono:
Brodocoltura di arricchimento ………………………(24h)
Brodocoltura di arricchimento selettivo ……………(24-48 h)
Isolamento in piastra selettiva e/o differenziale…..(24-48 h)
Identificazione della colonia tramite test
biochimici (assimilazione, fermentazione, attività enzimatica,…)….(24h)
Ricerca di Salmonella spp.
ISO 6579:2002/Cor. 1:2004 E:
Omogeneizzazione del corpo e del liquido
intervalvare di almeno 10 individui
Microbiologia degli alimenti e dei mangimi Metodo per la ricerca di Salmonella
Diluizione di 25 g di mollusco in 225 di
APTS (1:10)
37°C ± 1°C x 24 ± 2h
Distribuzione 0.1 ml in:
RVB
RVB
MKTTn
41.5°C ± 1°C x 24h ± 3h
37°C ± 1°C x 24 ± 3h
Seminare ogni tubo in XLD e XLT
37°C ± 1°C x 24 ± 3h
Isolamento colonie, Identificazione
biochimica e sierologica delle colonie
sospette
37°C ± 1°C x 48 ± 3h
XLT-4
XLD
Tempi tecnici di risposta negativa : 3 giorni
Tempi tecnici di risposta positiva : 5 giorni
Ricerca di Listeria monocytogenes a 37°C
(ISO 11290-1:1996 Amd 1 2004 )
25g in 225 ml di HFB
30°C ± 1°C per 24h ± 3h
Semina di 0.1 ml in 10 ml di FB
37°c ± 1°C per 48h ± 3h
Tempi tecnici di
risposta negativa
4 giorni
Tempi tecnici di
risposta positiva
6 giorni
Striscio con ansa su OX e ALOA
37°C ± 1°C per 24 ± 3h o ulteriori 24 ± 3h
Trapianto di almeno 5 colonie sospette in TSA +YE
37°C ± 1°C per 18 – 24h od oltre
Identificazione biochimica
Catalasi + Gram + Emolisi + Xilosio – Ramnosio + CAMP.St.aureus CAMP. R. equi
Tecniche innovative : PCR
Scopo del metodo: arrivare a rilevare la presenza del patogeno
attraverso DNA
Cosa prevedono, attualmente:
Coltura di arricchimento ………………………..(24 h)
PCR Real Time ………………… ………………(3 – 5 ore)
Sicurezza alimentare e metodi alternativi
Screening dei campioni negativi
0-24 hrs
Arricchimento del
campione
20 – 50 min
Estrazione del DNA
3 - 5 hrs
Amplificazione in:
•Real-Time PCR
•PCR convenzionale
Tecniche innovative : PCR
Scopo del metodo: arrivare a rilevare la presenza del patogeno attraverso DNA
Cosa prevedono, attualmente:
Coltura di arricchimento …………………………………….(24 h)
PCR Real Time ………………… …………………………..(3 – 5 ore)
Sui positivi si procede all’analisi colturale
Sicurezza alimentare e metodi innovativi
Conferma mediante esame colturale dei
campioni positivi,
applicando i metodi di riferimento ISO
18
Sicurezza alimentare e metodi innovativi
Metodi in PCR per lo screening di patogeni in
alimenti ( IZSVE )
Real Time PCR per la ricerca di:
Listeria monocytogenes
Salmonella spp
E.Coli O:157
Campylobacter jejuni, coli
Norovirus
Yersinia enterocolitica
19
Altri impieghi della PCR con i metodi colturali
Identificazione in PCR delle colonie isolate in piastra.
Attualmente siamo in grado di identificare i seguenti batteri
patogeni
Campylobacter jejuni e coli
Salmonella typhimurium e
variante monofasica
Listeria monocytogenes
Vibrio cholerae
Vibrio vulnificus
Vibrio parahaemolyticus tossigeno
Clostridium botulinum tossigeno
E.coli O:157
Identificazione di Campylobacter jejuni e
Campylobacter coli con la PCR
Gene
amplificato
Regione del cromosoma batterico che codifica
per RNA 16S.
Campylobacter
termofili
R-DNA 16 S
Campylobacter
jejuni
mapA
Gene altamente conservato che codifica per una
proteina di membrana
Campylobacter
coli
ceuE
Gene altamente conservato che codifica per una
proteina coinvolta nel trasporto intracellulare del
complesso ferro-sideroforo
R-DNA 16S - Campylobacter
mapA - C.jejuni
ceuE - C. coli
Marker
campioni
Discriminazione tra Salmonella Typhimurium e sua
variante monofasica con la PCR
Gene amplificato
Salmonella spp in XLT4
Salmonella spp.
Gene invA
gene altamente conservato in tutti i
sierotipi di Salmonella spp.;
genera un prodotto di amplificazione di
284 bp
Salmonella spp in XLD
284 bp
La PCR nell’identificazione del Vibrio parahaemolyticus
tossigeno
Gene
amplificato
Vibrio
parahaemolyticus
toxR
Gene altamente conservato
all’interno del gen. Vibrio
tossigenicità
thd
Gene che codifica la emolisina
termostabile diretta
tossigenicità
trh
Gene che codifica l’emolisina
correlata all’emolisina
termostabile diretta
La virulenza di V. parahaemolyticus
gene tdh
I ceppi isolati dai casi di tossinfezione presentano
positività per una o entrambe le seguenti tossine:
 emolisina tdh (thermostable direct hemolysin)
responsabile della “reazione Kanagawa”
 emolisina trh (tdh-related hemolysin)
che non
provoca il fenomeno Kanagawa ma che induce allo
stesso modo la patologia.
1 - campione
2 - controllo positivo
Risultati dell’indagine sulla contaminazione da vibrioni nei
MBV Regione Veneto
totale campioni esaminati - 2007
164
%
23
1
35
22
19
13
12
45
Vibrio parahaemolyticus
Vibrio vulnificus
Vibrio alginolyticus
Vibrio harvey
Vibrio mediterranei
Vibrio anguillarum-like
Vibrio fluvialis
altri Vibrio
2011
TOTALE
% POS
14%
1%
21%
13%
12%
8%
7%
27%
Nel 2007 solo 3 dei 23 campioni
positivi per V.parahaemolyticus sono
risultati contaminati dai ceppi
tossigeni ( 1.8% )
Tot
campioni
Tot. campioni in cui è
stato isolato
V.parahaemolyticus
Analisi qualitativa
Tot. Campioni
tdh +
Tot. Campioni
trh +
122
40
0
4
33%
0%
3%
Nel 2011 solo 4 dei 40 campioni positivi per V.parahaemolyticus
sono risultati contaminati dai ceppi tossigeni ( 3% )
Altre applicazioni della PCR:
Ricerca del C.botulinum e sue
tossine
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie
Il Laboratorio di Microbiologia alimentare
è il Laboratorio di Riferimento Regionale
per la conferma dei sospetti casi di botulismo (mouse test)
Procedura Di Prova n.18 (PDP 18 08):
Ricerca di Clostridium botulinum e della tossina botulinica
La ricerca della tossina botulinica è basata sulla prova biologica su topini inoculati con
estratti dell’alimento sospetto (mouse test) ( Tempi di risposta 72 h )
La ricerca di Clostridium botulinum è basata sulla semina del campione in terreni colturali
liquidi, isolamento del germe in piastra e conferma mediante prove biochimiche e prova
biologica su topini (mouse test). In caso di morte dei topini si invia il campione all’ISS per la
conferma sierologica. ( tempi di risposta 14 gg. )
oggi
Si utilizza il metodo multiplex Real-time PCR sviluppato dall’Istituto Superiore di Sanità
(CNRB), validato in house nell’ambito del progetto di ricerca Infant Botulism e accreditato il
mese di novembre 2011. ( tempi di risposta 24 – 48 ore )
Il metodo individua i geni che codificano per le tossine botuliniche A, B, E, F
Rilevazione in PCR della presenza di Clostridium
botulinum produttore di tossine
Dall’arricchimento viene allestita una analisi in PCR Real Time per verificare la presenza
dei geni per le neurotossine:
Neurotoxin type A gene
Neurotoxin type B gene
Neurotoxin type E gene
Neurotoxin type F gene
La presenza del segnale in PCR fornisce un’indicazione indiretta della
presenza di Clostridium botulinum nel campione.
Altre applicazioni della PCR:
Identificazione di specie
zoologica
nei prodotti preparati o filettati sono frequenti le frodi per sostituzione
di specie pregiate con altre meno costose
Metodo tradizionale
A.G.I.D.
IDENTIFICAZIONE DELLA SPECIE ZOOLOGICA
30 g in
acqua distillata
Agar Gel ImmunoDiffusione
L'analisi immunologica è basata su una
reazione sierologica antigene-anticorpo
tra l'estratto dell'alimento crudo ed
una serie di sieri specie-specifici per:
Bovino
Suino
Pollo
Equino
Ovino
Gatto
Cane
Uomo
5 min a T.A.
Filtrare e ripetere 3
volte il lavaggio
Solo per
carni crude
Campione + 50 ml di
acqua distillata
Frigorifero per 24 h
Prelievo del
surnatante (estratto
del campione)
Tempi di analisi:
2 gg
Pozzetti su piastre di
Agar Noble
Siero nel pozzetto centrale ed
estratti dei campioni nei pozzetti
periferici
T.A. in camera umida per 24 h
Verifica presenza/assenza di
bande di precipitazione
Attribuzione specie
zoologica
L’uso della PCR Real Time nel caso di identificazione
della specie
Estrazione del
l’alimento è cotto
DNA
anche
se
Dubbi sull’origine della carne.
Tempi di analisi: 4-5 ore
PCR del campione e dei DNA di
riferimento estratti dal muscolo delle
carni commestibili e non:
Cavallo
Cane
Coniglio
Gatto
Cervo
Capriolo
Maiale
Bovino
……
Confronto tra la curva di amplificazione
del campione e quella delle carni di
riferimento
Enterotossine da Bacillus cereus
Forma emetica : causata da un’enterotossina termostabile preformata
nell’alimento con periodo di incubazione da 1-6 ore
( simile alla tossinfezione da Staphylococcus aureus )
Forma diarroica : causata da un’enterotossina termolabile prodotta
nell’intestino con periodo di incubazione di 8-16 ore
( simile alla tossinfezione da Clostridium perfringens )
Ricerca di enterotossina termolabile
(Sindrome diarroica)
Glisa - Rapid Test per la determinazione della presenza
della tossina emetica prodotta da B. cereus
Emetic tox
C = controllo
10 g/ml di campione + 90 ml brodo di
arricchimento
T = test
Incubare a 30°C x 18-24 ore
Glisa = Gold Labelled Immuno
Sorbent Assay
Test immunocromatografico, che si
basa sull’uso di anticorpi marcati con oro,
specifici per la proteina Marker che viene
co-espressa durante la sintesi della
tossina emetica da parte di B.cereus
Portare a temperatura ambiente sia il
campione che il kit
Mettere 150 microlitri di campione nella
finestralla del kit e leggere entro 30 min
la risposta.
Enterotossine stafilocciche
Reg. (CE) 1441/07, Capitolo 1. Criteri di sicurezza alimentare
Vidas SET2 kit
Prima del Reg.
2073/05
Test
semiquantitativo
utilizzato per la ricerca
delle
enterotossine
stafilococciche
A,B,C,D
mediante agglutinazione
passiva
inversa
al
lattice
Dal 2006, Reg.
2073/05
(13) Metodo europeo di
screening del LCR per il
latte (Hennekinne et al.,
J. AOAC Internat. Vol.
86, n. 2, 2003)
Reg. 1441/07
(13)
Metodo
europeo
di
screening del LCR per gli
stafilococchi coagulasi positivi
(latte e prodotti lattiero caseari)
Prevede la concentrazione del
campione per dialisi o con
acido tricloroacetico
Questo protocollo è raccomandato
per aumentare la concentrazione
delle tossine nei prodotti lattierocaseari e per sopprimere le rare
interferenze riscontrate per certi
formaggi a base di latte crudo
Esempio : Roquefort
Prevalenza di enterotossine stafilococciche in
formaggi di malga, a base di latte crudo
2006
Introduzione del metodo
CRL per la ricerca delle SEs
Criterio microbiologico
Enterotossine
stafilococciche
presente/assente
Tot
campioni
Tot
campioni
positivi
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
57
57
99
20
21
68
139
189
125
0
0
0
0
1
10
23
18
9
0%
0%
0%
0%
4,76%
14,71%
16,55%
9,52%
7.20%
Ogni campione è costituito da 5 u.c.
Criteri microbiologici
 Normativa
di riferimento :
interpretazione dei risultati
e criticità collegate
Normativa di riferimento e interpretazione dei
risultati dei rapporti di prova
Regolamento (CE) n° 2073/05 della
Commissione del 15 novembre 2005
sui criteri microbiologici applicabili
ai prodotti alimentari
Reg. (CE) 2073/05
Punti significativi
 Fissa solo criteri microbiologici rilevanti e necessari
(significativi) per la protezione della salute del consumatore basati
sulla “ valutazione del rischio ”
 Garantisce una più omogenea valutazione dei prodotti nell’ambito
del mercato unico
 Ridimensiona il peso che taluni parametri di scarsa o irrilevante
valenza sanitaria hanno avuto fino ad oggi nelle determinazioni
delle autorità sanitarie.
 Stabilisce per la prima volta criteri di sicurezza anche per gli
alimenti vegetali
 Specifica in maniera esplicita i metodi di analisi con cui verificare
la conformità degli alimenti
Reg. (CE) 2073/05 sui criteri microbiologici
applicabili ai prodotti alimentari
Importanti novità
 Criteri di sicurezza alimentare
 Criteri di igiene di processo
Reg. (CE) 2073/05
Criterio di sicurezza alimentare
Definisce l’accettabilità di un prodotto alimentare o
di una partita di prodotti; si applica ai prodotti
immessi sul mercato per l’intera durata del periodo
di conservabilità in condizioni ragionevolmente
prevedibili di distribuzione, conservazione e uso
Immissione sul mercato: la detenzione per la vendita,
l’esposizione per la vendita, la messa in vendita, la
vendita, la consegna o qualsiasi altro modo di
commercializzazione
Conservabilità: il periodo che corrisponde al periodo che
precede il termine minimo di conservazione o la data di
scadenza
Reg. (CE) 2073/05
Criterio di igiene di processo
Definisce l’accettabilità di un processo di
produzione si applica solo su campioni prelevati
durante il processo produttivo, fissa un valore
indicativo di contaminazione al di sopra del quale
sono necessarie misure correttive per ripristinare
l’igiene del processo
Storia dei criteri microbiologici
Legge ordinaria del Parlamento n° 283 del 30.04.1962 Disciplina igienica della produzione e della vendita delle
sostanze alimentari e delle bevande.
E' vietato impiegare nella preparazione di alimenti o bevande,
vendere, detenere per vendere o somministrare come mercede ai propri dipendenti, o
Art. 5 -
comunque distribuire per il consumo sostanze alimentari:
a) private anche in parte dei propri elementi nutritivi o mescolate a sostanze di qualità inferiore o comunque trattate
in modo da variarne la composizione naturale, salvo quanto disposto da leggi e regolamenti speciali;
b) in cattivo stato di conservazione;
c) con cariche microbiche
esecuzione o da ordinanze ministeriali;
superiori ai limiti
che saranno stabiliti dal regolamento di
d) insudiciate, invase da parassiti, in stato di alterazione o comunque nocive, ovvero sottoposte a lavorazioni o
trattamenti diretti a mascherare un preesistente stato di alterazione;
e)soppressa…;
f) soppressa…;
g) con aggiunta di additivi chimici di qualsiasi natura non autorizzati …. ;
h) che contengano residui di prodotti, usati in agricoltura …..
Storia dei criteri microbiologici
Reg. (CE) 2073/05 e Reg. (CE) 1441/07 sui
criteri microbiologici applicabili ai prodotti
alimentari
Ridimensionamento del punto c) con cariche
microbiche superiori ai limiti… della L. 283/62
Identificazione e quantificazione dei criteri microbiologici
di sicurezza e di processo
Reg. (CE) 2073/05
Punti significativi
Ridimensiona il peso che taluni parametri di scarsa o
irrilevante valenza sanitaria hanno avuto fino ad oggi nelle
determinazioni delle autorità sanitarie.
( dubbio significato sanitario )
Criteri di igiene di
processo
Azione Correttiva
C.M.T.
E. Coli
Staf. Coag. +
Enterobatteri
Miglioramento delle condizioni
Igieniche durante la produzione
e della scelta delle materie prime
Reg. (CE) 2073/05
Capitolo 2. Criteri di igiene di processo
2.1.6 Carne macinata
Categoria
alimentare
Microrganismi
Piano di
campionament
o (1)
n
2.1.6 Carne
macinata
Conteggio
delle colonie
aerobiche
5
c
2
Limiti (2)
m
Metodo
d’analisi di
riferimento
(3)
Fase a cui si
applica il
criterio
M
5x105 ufc/g 5x106 ufc/g
ISO 4833
Fine del
processo di
lavorazione
E. coli (8)
5
2
50 ufc/g
500 ufc/g
ISO 166491o2
(8) : E. Coli è qui utilizzato come indicatore di contaminazione fecale
Azione in caso
di risultati
insoddisfacenti
Miglioramento
delle
condizioni
igieniche
durante la
produzione e
miglioramento
della scelta
e/o
dell’origine
delle materie
prime
Reg. (CE) 2073/05
Capitolo 1.Criteri di sicurezza alimentare
(prodotti ittici)
Categoria alimentare
Microrganismi
/loro tossine,
metaboliti
Piano di
campionamento (1)
n
1.17 Molluschi
bivalvi vivi ed
echinodermi,
tunicati e
gasteropodi vivi
1.24 Molluschi
bivalvi vivi ed
echinodermi,
tunicati e
gasteropodi vivi
Salmonella
E. coli (14)
5
1
c
Limiti (2)
m
Metodo d’analisi di
riferimento (3)
M
0
Assente in 25 g
EN/ISO 6579
ISO TS 16649-3
0
230 MPN/100 g
di carne e
liquido
intravalvare
(14) : E. Coli è qui utilizzato come indicatore di contaminazione fecale
Fase a cui si applica il
criterio
Prodotti immessi
sul mercato
durante il loro
periodo di
conservabilità
Prodotti immessi
sul mercato
durante il loro
periodo di
conservabilità
E.coli come indicatore di
contaminazione fecale negli alimenti
 Escherichia coli ha come habitat l’intestino dell’uomo e degli animali a
sangue caldo
 È noto dalla fine dell’800, quando fu isolato da Théodor Ehrlich mentre in
Europa la diarrea infantile era ancora una malattia mortale.
 Tra tutti i coliformi è la specie che sopravvive meno a lungo nell’ambiente
esterno
Storicamente considerato indicatore di contaminazione fecale:
si riteneva che la presenza a concentrazioni crescenti indicasse una
maggior probabilità di isolare patogeni intestinali.
La presenza di E.coli è indicativa di una cattiva igiene di
produzione
Reg.(CE) 2073/05
Contaminazione da E.coli
E. coli viene considerato da un lato un criterio di igiene di
processo per alcune matrici alimentari con limiti di accettabilità
anche piuttosto alti il cui superamento comporta, come azione
correttiva, un semplice intervento di miglioramento delle condizioni
igieniche del processo
dall'altro viene considerato solo per i molluschi bivalvi un criterio
di sicurezza alimentare peraltro con un limite particolarmente
restrittivo( 2.3 ufc/g ) il cui superamento comporta un intervento di
tipo repressivo, penalmente perseguibile indipendentemente dalla
contemporanea presenza di un vero patogeno intestinale quale la
Salmonella spp.
MBV: Contaminazione da E.coli
Reg. (CE) 2073/05 - Capitolo 1. Criteri
Microrganismi
di sicurezza alimentare
Piano di
campionamento (1)
/loro tossine,
metaboliti
n
1.24 Molluschi bivalvi
vivi ed echinodermi,
tunicati e gasteropodi
vivi
E. coli
1
0
Microrganismi
/loro tossine,
metaboliti
criterio
ISO TS 16649-3
Prodotti immessi sul
mercato durante il loro
periodo di conservabilità
M
230 MPN/100 g di carne e
di igiene di processo
Piano di
campionamento (1)
n
2.2.2 Formaggi a base di
latte o siero di latte
sottoposto a trattamento
termico
m
Metodo d’analisi
di riferimento (3)
liquido intravalvare
c
Limiti (2)
E. coli
5
c
2
Limiti (2)
m
riferimento (3)
criterio
ISO TS 16649-1 o 2
Miglioramento
delle condizioni
igieniche durante
la produzione
M
100 ufc/g 1000 ufc/g
Reg. (CE) 2073/05 - Capitolo 1.
Criteri di sicurezza alimentare
Microrganismi
Piano di
campionamento (1)
/loro tossine,
metaboliti
n
vivi
E. coli
1
0
Microrganismi
/loro tossine,
metaboliti
criterio
ISO TS 16649-3
M
Piano di
campionamento (1)
n
2.5.1 Frutta e ortaggi
pretagliati ( pronti al
consumo )
m
Metodo d’analisi
di riferimento (3)
c
Limiti (2)
E. coli
5
c
2
Limiti (2)
m
Metodo d’analisi
di riferimento (3)
criterio
ISO TS 16649-1
o2
Miglioramento delle
condizioni
igieniche durante la
produzione
M
100 ufc/g 1000 ufc/g
Microrganismi
/loro tossine,
metaboliti
di sicurezza alimentare
Piano di
campionamento (1)
n
vivi
E. coli
Microrganismi
0
criterio
ISO TS 16649-3
M
Piano di
Limiti (2)
campionamento
(1)
5
E.coli
m
Metodo d’analisi
di riferimento (3)
n
2.4.1 Prodotti
sgusciati di
crostacei e
molluschi cotti
c
1
Categoria
alimentare
Limiti (2)
m
M
1 ufc/g
ufc/g
10
c
2
Metodo d’analisi
di riferimento (3)
Fase a cui si
applica il
criterio
Azione in caso di
risultati insoddisfacenti
ISO TS 16649-3
Fine del
processo di
lavorazione
Miglioramento
delle condizioni
igieniche durante
la produzione
Criteri microbiologici
Normativa di riferimento :
interpretazione dei risultati
e criticità collegate
“Salmonella nel pollame”
Cronistoria dei
limiti microbiologici “EU”
Reg.(CE) 2073/05
Introduce importanti novità:
Criteri di sicurezza alimentare (Cap.1)
e Criteri di igiene di processo (Cap.2)
Reg.(CE) 1441/07
Modifiche al Reg.(CE) 2073/05:
Enterrotos. stafilococciche
Enterobatteri
B.cereus presunto
Reg.(CE) 365/10
Cronobacter (ex E. sakazakii)
Salmonella
L. monocytogenes nel sale
L’articolo 10 del Reg. (CE) n°2073/2005 dispone
che i criteri microbiologici siano riesaminati
tenendo conto dei progressi della scienza, della
tecnologia e della metodologia, dell’emergenza di
microrganismi patogeni nei prodotti alimentari e
delle informazioni ottenute in base alla
valutazione dei rischi
Reg.(CE) 1086/11
Carne fresca di pollame:
Ricerca sierotipi di Salmonella (Cap.1)
Restrizione conformità Salmonella (Cap.2)
Reg. (CE) 2073/2005
Pollame
La Salmonella
criterio di sicurezza
alimentare
e……
criterio di igiene di
processo
L’intento dei Regolamenti è ridurre la prevalenza della salmonella a partire dagli
allevamenti lungo tutta la linea di produzione per ridurre il pericolo per la sanità
pubblica.
Criterio di sicurezza alimentare “Salmonella nel pollame”
pollame
Reg. (CE ) n° 2073/2005
Microrganismi
/loro tossine,
metaboliti
Piano di
campionamento
(1)
n
c
Limiti (2)
m
M
Metodo
d’analisi di
riferimento
(3)
Fase a cui si
applica il criterio
EN/ISO 6579
Prodotti immessi
sul
mercato
durante il loro
periodo
di
conservabilità
EN/ISO 6579
Prodotti immessi
sul
mercato
durante il loro
periodo
di
conservabilità
M2
M2
1.5 Carne macinata e
preparazioni a base di
carne
di
pollame
destinate
ad
essere
consumate cotte
1.9 Prodotti a base di
carne
di
pollame
destinati
ad
essere
consumati cotti
►M2
Salmonella
spp.
Salmonella
spp.
5
5
0
Dall’1.1.2006
Assente in 10 g
Dall’1.1.2010
Assente in 25 g
0
Dall’1.1.2006
Assente in 10 g
Dall’1.1.2010
Assente in 25 g
Regolamento (UE) n. 365/2010 della Commissione
del 28 aprile 2010
Criteri di sicurezza alimentare: Salmonella nel pollame
Deroghe scadute del Reg.(CE) 2073/05
Carne macinata e preparazioni a base di carne di
pollame destinate ad essere consumate cotte
Prodotti a base di carne di pollame destinati ad
essere consumati cotti
DAL 1 GENNAIO 2010
IL LIMITE E’ ASSENZA DI SALMONELLA SPP.
IN 25g
(formalizzato dal Regolamento 365/2010 CE)
Sa
AS lm
SE on
NT ella
E s
IN pp
25 .
g
Alimento:
Criteri di Sicurezza alimentare: Salmonella nel pollame
Integrazioni al Reg.(CE) 2073/05 da parte del Reg.(CE)
1086/11
M3
1.28 Carne fresca di
pollame ( 20 )
Microrganismi
Piano di
campionamento
Salmonella
typhimurium ( 21 )
Salmonella enteritidis
n
c
limiti
m
M
riferimento
EN/ISO 6579 (per la
rilevazione)
5
0
Assente in 25 g
schema WhiteKaufmann-Le Minor
(per la
sierotipizzazione)
Fase a cui si
applica il criterio
Prodotti immessi
sul mercato
durante il loro
periodo di
conservabilità
( 20 ) Questo criterio si applica alla carne fresca di esemplari da riproduzione di Gallus gallus, galline ovaiole, polli da carne e branchi di
tacchini da riproduzione e da ingrasso.
( 21 ) Per quanto riguarda i ceppi monofasici di Salmonella typhimurium è incluso solo quello con formula 1,4,[5],12:i:-. (considerato
variante della S.typhimurium che costituisce un rischio per la sanità pubblica al pari di altri ceppi di S. typhimurium
►
M3
Regolamento (UE)
n. 1086/2011 si
concentra sui
sierotipi S.
Typhimurium e S.
entertidis che sono
la causa dell’80%
dei casi di
salmonellosi umana
Criteri di Igiene di processo: Salmonella nel pollame
Modifiche al Reg.(CE) 2073/05 da parte del Reg.(CE) 1086/11
Piano di campionamento
Categoria
alimentare
Microrganismi
n
c
limiti
m
M
Metodo d’analisi
di riferimento
7
M3
2.1.5 Carne di
pollame (polli da
carne e tacchini)
Salmonella spp
(10)
50(5)
Da 1.1.2012 c=5 per
polli da carne
Da 1.1.2013 c=5 per
tacchini
Assente in 25 g
di un campione
aggregato di
pelle del collo
EN/ISO 6579 (per
la rilevazione)
Carcasse dopo il
raffreddamento
Azione in caso di
risultati
insoddisfacenti
Miglioramento delle
condizioni igieniche
della macellazione e
revisione dei controlli
del processo,
dell’origine degli
animali e delle
misure di
biosicurezza nelle
aziende di origine
( 10 ) Qualora venga rilevata Salmonella spp., vengono poi sierotipizzati gli isolati Salmonella typhimurium e Salmonella enteriditis al fine di
verificare se soddisfano il criterio microbiologico di cui al Capitolo I, riga 1.28
(5) I 50 campioni sono prelevati durante 10 sessioni di campionamento consecutive in base alle norme e alla frequenza di campionamento
A norma dell’art.10 del Reg. n° 2073/2005 i criteri e le condizioni concernenti la presenza di Salmonella sono
riesaminati alla luce di cambiamenti osservati nella prevalenza della Salmonella. Poiché l’obiettivo comunitario del
Regolamento (CE) n° 646/2007 è la riduzione all’1% entro il 31/12/2011 del numero di polli da carne positivi per S.
enteritidis e S. typhimurium è opportuno ridurre il numero di unità campionarie che possono superare il limite fissato.
Criteri di Igiene di processo: Salmonella nel pollame
Modifiche al Reg.(CE) 2073/05 da parte del Reg.(CE) 1086/11
Matrici:
Carcasse di pollame (polli da carne)
DAL 1 GENNAIO 2012
Il numero di “c” di campioni non conformi vengono ridotti da 7 a 5;
( Reg. (CE) n° 646/2007 )
inoltre è prevista la sierotipizzazione dei ceppi isolati
Carcasse di tacchini: “c” resta invariato a 7 per il 2012
DAL 1 GENNAIO 2013
Il numero di “c” di campioni non conformi vengono ridotti da 7 a 5
(Reg. (CE) n° 584/2008 )
Criterio microbiologico Salmonella
Carne fresca di pollame
Macello
Criterio di igiene
Salmonella spp. (10)
n = 50 c = 5
Risultato soddisfacente
assente in 25g di un campione
aggregato di pelle di pollo
(10) Sierotipizzazione dei ceppi isolati; se presenti
S.typhimurium e S.enteriditis, verificare se soddisfano
i Criteri di sicurezza punto 1.28
1.28 - Criterio di sicurezza:
S. typhimurium, S.enteriditis .
n=5, c=0, assente in 25g
Carne macinata
Preparazioni di carne
Criterio di sicurezza:
Salmonella spp.
spp
Macello
Criterio di igiene
n = 50 c = 5
S.typhimurium e S.enteriditis, verificare se
soddisfano i Criteri di sicurezza punto 1.28
Esempio : Salmonella Enteritidis
S. Enteritidis .
Carne macinata
Notifica di
irregolarità
Salmonella Enteritidis
notifica di
irregolarità
Macello
Criterio di igiene
n = 50 c = 5
S.typhimurium e S.enteriditis, verificare se
soddisfano i Criteri di sicurezza punto 1.28
Esempio : Salmonella
Livingstone
S. Livingstone
Carne macinata
Favorevole
Salmonella Livingstone
( da consumarsi previa cottura)
notifica di
irregolarità
Salmonella nel pollame
Prelievo ufficiale : produzione/ dettaglio
Carne avicola fresca
Esito del laboratorio
Presenza di
Salmonella Hadar
Reg. CE 1086/2011
Assenza in 25g di
S. Enteritidis e
S. Typhimurium
Esito Favorevole
Da consumarsi previa cottura
Prelievo ufficiale : produzione / dettaglio :
Preparazione a base di carne di pollame
Presenza di
Salmonella Hadar
Reg. CE 2073/2005
Assenza in 25g di
Salmonella spp.
Esito Sfavorevole
Da consumarsi previa cottura
Salmonella nel pollame
Come può difendersi il produttore ?
Produzione / dettaglio :
carne fresca di pollame
Reg. CE 1086/2011
Tutela il produttore
Produzione / dettaglio :
Preparazioni di carne di pollame
Valutazione del
rischio
(Reg. 178/2002)
Cucina
sperimentale
Regolamento (CE) n. 178/2002
art. 6 analisi del rischio
1.1.
Ai
Aifini
finidel
delconseguimento
conseguimentodell'obiettivo
dell'obiettivogenerale
generaledi
diun
un
livello
livelloelevato
elevatodi
di tutela
tuteladella
dellavita
vitaeedella
dellasalute
salute
umana,
umana,la
lalegislazione
legislazionealimentare
alimentaresi
sibasa
basa
sull'analisi
sull'analisidel
delrischio
rischio………..
………..
2.2.
La
Lavalutazione
valutazionedel
delrischio
rischiosisibasa
basasugli
suglielementi
elementi
scientifici
scientificiaadisposizione
disposizioneed
edèèsvolta
svoltain
inmodo
modo
indipendente,
indipendente,obiettivo
obiettivoeetrasparente.
trasparente.
Struttura complessa di microbiologia alimentare
Regolamento (CE) n. 178/2002
art. 14 requisiti di sicurezza degli alimenti
…..............
3. Per determinare se un alimento sia a rischio occorre prendere in
considerazione quanto segue:
a) le condizioni d'uso normali dell'alimento da parte del consumatore
in ciascuna fase della produzione, della trasformazione e della
distribuzione;
b) le informazioni messe a disposizione del consumatore, comprese le
informazioni riportate sull'etichetta o altre informazioni
generalmente accessibili al consumatore sul modo di evitare
specifici effetti nocivi per la salute provocati da un alimento o
categoria di alimenti.
…………..
Alimenti a rischio : informazioni in etichetta
IlIlproduttore
produttoreancora
ancorapiù
piùoggi
oggicon
conililnuovo
nuovoReg.
Reg.CE
CE1086/2011
1086/2011per
pertutelarsi
tutelarsi
nei
neiconfronti
confrontidella
dellapresenza
presenzadidiSalmonella
Salmonellaspp.
spp.nelle
nellepreparazioni
preparazionididicarne
carne
da
daconsumarsi
consumarsiprevia
previacottura
cotturapuò
puòfare
farelalavalutazione
valutazionedel
delrischio
rischiodei
deisuoi
suoi
prodotti
prodottieeinserire
inserireininetichetta
etichettaalcune
alcuneinformazioni
informazionichiare
chiareeeprecise
preciseper
peruna
una
sicura
sicuracottura
cotturadel
delprodotto
prodotto
Informazioni
Informazionicerte
certeeesicure
sicure
La
Lavalutazione
valutazionedel
delrischio
rischiosisibasa
basasu
suelementi
elementiscientifici
scientificiaadisposizione……
disposizione……
Struttura complessa di microbiologia alimentare
La Cucina Sperimentale IZSVe
Il laboratorio a servizio del produttore per la sicurezza del
consumatore
Sperimentazione
Formazione
La cucina sperimentale è un Laboratorio vero e proprio in cui si creano le
condizioni che riflettono le abitudini “tipiche”
tipiche dei consumatori e che
permette di gestire una serie di variabili. Questi studi consentono di
produrre dati scientifici e riproducibili rilevati in condizioni realistiche.
“La valutazione del rischio si basa su elementi scientifici a
disposizione……..
Obiettivi della Cucina Sperimentale IZSVe
prove di cottura di alimenti naturalmente o sperimentalmente contaminati e
verificare le condizioni di inattivazione di specifici patogeni ( Salmonella spp.
spp )
in matrici alimentari carnee.
protocolli di cottura per diverse tipologie di
alimenti che consentano di inattivare gli specifici
patogeni presenti.


Promuovere presso gli operatori del settore
alimentare (OSA ) l’adozione di una adeguata
“etichettatura” che fornisca al consumatore tutte
le
informazioni
necessarie
(
modalità ,
temperatura e durata della cottura ) per una
sicura e validata preparazione del prodotto.
prodotto

Contribuire a gestire il rischio microbiologico a
tutela della sicurezza del consumatore finale
(Sanità pubblica )
Cucina sperimentale IZSVe
Convegno multifocale
Metodologie innovative in sede di analisi microbiologica
degli alimenti e interpretazione dei risultati di laboratorio
Un grazie al personale della SC1

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