e CombiSet - Thermo Fisher Scientific

Istruzioni per l'uso
+
Famiglia Dynal AllSet ™ e
+
CombiSet ™ SSP
0088
ISTRUZIONI PER L'USO
Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP
SOMMARIO
Pagina
USO PREVISTO…………………………………………………………………………..…… 3
RIEPILOGO E SPIEGAZIONE…….........………………...…………………………..……
3
PRINCIPI DELLA PROCEDURA …………………………………...............…………..
3
REAGENTI...................................................................................................................
Reagenti inclusi nel kit di tipizzazione……………….……………………….….….
Conservazione …………………………………………………………………..…….
4
4
4
AVVERTENZE E PRECAUZIONI …………………………………………………………
5
MATERIALE RICHIESTO NON FORNITO DA DYNAL BIOTECH….…….……………
5
PROCEDURA ...........……………………………….....………….........…………………….
Raccolta e Preparazione dei Campioni.......................……………….........…
Preparazione dei Reagenti per la PCR........…………........………............….
Amplificazione……....................................………………..………..........….…
Analisi delle reazioni di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio ..…….
6
6
6
8
9
LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA ...............................................……........….....…… 10
RISULTATI ATTESI…………………………………………………………….………………
Controllo di Qualità ..…………………....................……………….............…
Controllo Interno ..………………………………………………………………….
Interpretazione dei Risultati ............................…................………....…...…
Interpretazione mediante Dynal SSPTool™ ….………………………………..
10
10
10
11
11
GUIDA ALLA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI ...…..........................………..............
12
BIBLIOGRAFIA ..................…………………….….......…………...….......…..........…...... 13
GARANZIA ………………………………………………………………………….…………. 14
MARCHI DI FABBRICA UTILIZZATI NEL PRESENTE DOCUMENTO/PRODOTTO … 14
BREVETTI UTILIZZATI NEL PRESENTE DOCUMENTO/PRODOTTO ..…………..….. 14
CONTATTI .....................................................................................................…………. 15
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ISTRUZIONI PER L'USO
Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP
Per uso diagnostico in vitro
USO PREVISTO
Tipizzazione del DNA degli alleli HLA di Classe I o Classe II.
RISOLUZIONE
Kit a bassa risoluzione: La tipizzazione degli alleli viene eseguita a livello generico, o del gruppo allelico,
che in genere corrisponde alle specificità definite sierologicamente.
Kit ad alta risoluzione: O kit di subtipizzazione, forniscono una genotipizzazione ad alta risoluzione o a
livello di allele .
RIEPILOGO E SPIEGAZIONE
Quasi tutte le metodiche di tipizzazione tissutale basate sul DNA utilizzano la tecnica PCR1 per
l'amplificazione del locus HLA da analizzare. Nella maggior parte delle metodiche per la tipizzazione
tissutale basate sul DNA la tecnica di PCR è impiegata per la fase di amplificazione, prima cioè della
tipizzazione effettiva, con lo scopo di aumentare la quantità di DNA bersaglio. Il processo di tipizzazione
HLA richiede quindi una fase di post-amplificazione finalizzata alla discriminazione allelica. A differenza
di altri metodi basati sulla PCR, la tecnica SSP2,3,4,5utilizzata da Dynal Biotech Ltd per gli AllSet+™ e
CombiSet+™ SSP discrimina i diversi alleli nel corso del processo stesso della PCR. Ciò consente di
abbreviare il tempo di analisi dei risultati post-amplificazione riducendolo ad una semplice fase di
rivelazione mediante gel-elettroforesi.
PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Il metodo SPP Dynal è una tecnica basata sulla PCR che impiega Sequence Specific Primers (SSP),
cioè Primer Sequenza Specifici, per la tipizzazione tissutale basata sul DNA.
I prodotti Dynal SSP sono costituiti da miscele diverse di primer, in cui ciascuna miscela contiene una o
più coppie specifiche di primer, vale a dire i primer specifici per un allele e/o un gruppo allelico, oltre ad
una coppia di primer di controllo per le sequenze non alleliche nel campione. La coppia di primer di
controllo ha la funzione di controllo interno della PCR e quindi di verifica dell'efficienza delle
amplificazioni.
Il metodo Dynal SSP si basa sul principio che un primer perfettamente corrispondente potrà essere
utilizzato con maggiore efficienza nella reazione PCR rispetto ad un primer che presenta uno o più
mismatch all'estremità 3’. La specificità della tipizzazione rientra nella fase di amplificazione e il
processo di elaborazione dei risultati dopo l’amplificazione è ridotto al minimo.
L'assegnazione degli alleli consiste semplicemente nel constatare se si è verificata o meno
l'amplificazione, cioè nel visualizzare l'amplificazione mediante elettroforesi su gel di agarosio. La
tecnica PCR-SSP assicura un elevato grado di risoluzione, in quanto ciascuna coppia di primer identifica
due siti polimorfici in cis. Il metodo ha un livello elevato di sensibilità, specificità e riproducibilità.
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ISTRUZIONI PER L'USO
Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP
REAGENTI
Reagenti inclusi in tutti i kit Dynal AllSet+™ SSP o CombiSet+™ SSP
Articolo
Descrizione
1. Vassoi PCR con miscele di primer
SSP disidratati pre- aliquotati
Ciascuna provetta del vassoio per la PCR contiene una
miscela disidratata di SSP composta da primer specifici
per un allele e/o un gruppo allelico e una coppia di
primer di controllo per le sequenze non alleliche.
La coppia di primer di controllo amplifica un gene
presente in tutti i campioni.
2. Tappi
Tappi per la chiusura ermetica dei vassoi per la PCR
N. di reazioni
di PCR per
3. Master Mix (il numero di flaconi
compresi nei kit dipende dal
numero di reazioni di PCR per test –
ved. tabella corrispondente)
No. di flaconi di
Master Mix inclusi
nei kit (tutti da 1,8
ml)
1-9
1
10-20
2
21-40
3
41-95
4
96
5
Concentrazione 1x pronta all'uso. La Master Mix è
stata ottimizzata per l'impiego con la DNA polimerasi
AmpliTaq® (Roche Molecular Systems, Inc.)
Informazioni sulla formulazione sono disponibili
all'indirizzo [email protected]
4. Istruzioni per l'uso del
prodotto/Opuscolo informativo sul
lotto specifico del prodotto
Istruzioni per l'uso e opuscolo informativo sul lotto
specifico del prodotto (BSPI).
5. Foglio di Lavoro per
Interpretazione
Modulo di registrazione delle reazioni positive
ottenute con le diverse miscele di primer.
Conservazione
1. I vassoi per la PCR e la Master Mix devono essere conservati a 2-8˚C.
2. Non congelare i reagenti
3. Se conservati in modo corretto, reagenti e miscele di primer sono stabili fino alla data di scadenza
indicata nell'opuscolo informativo allegato ad ogni prodotto.
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ISTRUZIONI PER L'USO
Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Per uso diagnostico in vitro
Per l’esecuzione dei test con i kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP è necessario attenersi alle
Buone Pratiche di Laboratorio e alle linee guida stabilite ad es. negli standard EFI, nelle direttive
CPA o in altre direttive locali.
Avvertenza - Rischio biologico: Manipolare tutti i campioni come potenzialmente in grado di
trasmettere malattie. Eseguire tutte le operazioni indossando guanti e protezioni adeguate.
Avvertenza - Rischio biologico: Per la preparazione dei campioni utilizzare sempre provette
con tappo a vite, al fine di evitare fuoriuscite e potenziali casi di contaminazione.
Avvertenza - Rischio biologico: Tutti i campioni devono essere manipolati come
potenzialmente infettivi utilizzando procedure di laboratorio sicure come quelle indicate in
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories6 e nel documento NCCLS M29-T7.
Pulire e disinfettare con cura tutte le superfici di lavoro utilizzando candeggina (NaClO) all'1%.
Sterilizzare in autoclave qualsiasi apparecchiatura o materiale che sia entrato in contatto con
campioni clinici prima di procedere allo smaltimento.
Avvertenza - Rischio biologico: Il bromuro di etidio utilizzato per la colorazione del DNA è un
potenziale agente cancerogeno. Durante l'impiego di gel colorati e bromuro di etidio, indossare
sempre guanti in nitrile.
Cautela: Indossare una protezione anti-UV per gli occhi e non guardare direttamente la fonte di
luce UV a occhio nudo durante l'analisi o la fotografia dei gel.
Cautela: Le pipette utilizzate per le operazioni post-PCR non devono essere utilizzate per le
operazioni pre-PCR.
Cautela - Contaminazione: Evitare la contaminazione batterica dei reagenti durante il prelievo
di aliquote dalle provette dei reagenti. Indossare sempre i guanti per evitare qualsiasi rischio di
contaminazione dei campioni. Si consiglia di utilizzare pipette e puntali con filtro monouso e
sterili. Non utilizzare reagenti con evidenti tracce di torbidità o contaminazione batterica.
Cautela - Smaltimento: Smaltire i reagenti non utilizzati e le sostanze di scarto in conformità con
le normative comunitarie, nazionali, regionali e locali.
La scheda dei dati di sicurezza dei materiali (MSDS) è disponibile per il download all'indirizzo
www.tissue-typing.com oppure su richiesta presso il rappresentante locale di Dynal Biotech
(Ved. i numeri di telefono elencati nell'ultima pagina del presente inserto.)
MATERIALE RICHIESTO NON FORNITO DA DYNAL BIOTECH:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Pipette calibrate per uso manuale (ad es. Eppendorf, Gilson)
Puntali con filtro per pipette sopra indicate
Vortex
Microcentrifuga
Vassoio per la conservazione delle microprovette di PCR
Perkin-Elmer GeneAmp® 9600 o 9700 o qualsiasi altro amplificatore approvato con
specifiche equivalenti
Piastra scaldante/forno a microonde per la preparazione dei gel di agarosio
Apparecchiatura per elettroforesi (ad es. ABgene Electro-Fast® Stretch 108 Complete, AB0708)
Transilluminatore UV
Sistema di documentazione per immagini/macchina fotografica per i gel
Taq polimerasi ricombinante (Dynal raccomanda AmpliTaq®)
Agarosio per gel
Bromuro di etidio
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ISTRUZIONI PER L'USO
Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP
PROCEDURA
NOTA: Questa procedura deve essere eseguita in due aree distinte del laboratorio (pre-amplificazione e
post-amplificazione) come indicato nelle istruzioni seguenti.
RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Attenzione: Manipolare tutti i campioni come potenzialmente in grado di trasmettere agenti
infettivi.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
NON UTILIZZARE SANGUE IN EPARINA8
Il DNA può essere estratto da cellule nucleate umane utilizzando il metodo di
preferenza
Per ottenere risultati ottimali di amplificazione e di tipizzazione utilizzare DNA
con un elevato grado di purezza (rapporto OD 260:280 compreso tra 1,6 e 1,8).
La concentrazione finale del DNA prima della PCR deve essere di circa 50 ng/µl
Il DNA estratto deve essere diluito in dH20
Il DNA può essere conservato a -20°C o a temperature inferiori per periodi più
prolungati (> 1 anno) senza influire sulla qualità dei risultati. Se conservato a +4°
per lunghi periodi il DNA si degrada, dando luogo ad una maggiore quantità di
artefatti, come ad esempio amplificazioni non specifiche.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI PER LA PCR (eseguita nell'area di pre-amplificazione)
Per eseguire una singola tipizzazione preparare la seguente miscela di PCR. Per i volumi necessari (in
funzione del numero di reazioni di PCR per test), consultare la tabella riportata nella pagina seguente.
•
•
•
Master Mix
DNA del campione (50 ng/µl)
AmpliTaq® DNA polimerasi (5 u.i./µl )
•
•
Miscelare accuratamente
Dispensare 10 µl della miscela PCR in ciascuna provetta della piastra Dynal AllSet+™ o
CombiSet+™ SSP
Apporre i tappi e chiudere accuratamente in modo da sigillare perfettamente le provette. Si
possono utilizzare chiudiprovette appositi. È inoltre possibile utilizzare le apposite pellicole
sigillanti. I campioni sono ora pronti per l'amplificazione.
Conservare i reagenti del kit di tipizzazione non utilizzati a 2-8˚C
•
•
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ISTRUZIONI PER L'USO
Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP
Tabella per la Preparazione della Miscela di PCR:
Reazioni di
PCR per test
Master
Mix (µl )
DNA
(µl )
AmpliTaq®
(µl )
1
4
6
8
10
32
48
64
80
96
7.6
11.4
15.2
19.0
22.8
0.32
0.48
0.64
0.80
0.96
12
14
16
18
20
112
128
144
160
176
26.6
30.4
34.2
38.0
41.8
1.12
1.28
1.44
1.60
1.76
22
24
26
28
30
208
224
240
256
272
49.4
53.2
57.0
60.8
64.6
2.08
2.24
2.40
2.56
2.72
40
42
44
46
48
352
384
400
416
432
83.6
91.2
95.0
98.8
102.6
3.52
3.84
4.00
4.16
4.32
96
864
206.0
9.00
NOTA: Le reazioni di PCR in numero dispari non vengono riportate nella tabella, fare riferimento
al numero pari successivo (ad es., nel caso di un test con 13 reazioni di PCR fare riferimento ai
volumi indicati per 14 reazioni di PCR).
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ISTRUZIONI PER L'USO
Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP
CONFIGURAZIONE DEL VASSOIO
L’orientamento corretto del vassoio è assicurato dalla miscela di primer della provetta numero uno
(identificata anche dalla presenza di un colorante blu), contrassegnata dal numero di lotto stampato
di lato.
e.g HLA-X
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
QUALSIASI ALTRO NUMERO STAMPATO SUL VASSOIO IN PLASTICA, AD ES. 1, 2, 3, DEVE ESSERE
IGNORATO
AMPLIFICAZIONE (eseguita nell'area di post-amplificazione)
1.
Collocare il vassoio AllSet+™ o CombiSet+™ SSP nel termociclatore
Impostare i seguenti parametri:
Fasi
Temperatura
(˚C)
96
Tempo
(sec.)
120
10 cicli
96
65
15
60
20 cicli
96
61
72
10
50
30
Denaturazione
Azione
Denaturazione
Denaturazione
Allineamento
Estensione
Denaturazione
Allineamento
Estensione
Per informazioni specifiche sul termociclatore fare riferimento al manuale del produttore
2.
3.
Dare inizio al programma
A programma ultimato togliere i campioni dal termociclatore
NOTA: Non portare il DNA amplificato nell'area di pre-amplificazione.
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ISTRUZIONI PER L'USO
Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP
ANALISI DELLE REAZIONI DI PCR MEDIANTE ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO
Nota: Si raccomanda di utilizzare lo stesso tampone per la preparazione del gel e del tampone
di corsa; ciò significa che se si utilizza TBE 0.5x per il gel è necessario utilizzare TBE 0.5x
anche come tampone di corsa.
1.
Preparare un gel di agarosio al 2% (p/v) (ad es.ABgene MultiABgarose, AG-0100c) in
tampone TBE 0.5x
a)
Far sciogliere l'agarosio (2 g/100 ml di tampone TBE 0.5x) mediante ebollizione nel
forno a microonde fino al completo scioglimento
• Lasciarlo raffreddare a 60˚C.
• Aggiungere bromuro di etidio alla concentrazione finale di 0.5 µg/ml di gel
b)
Versare il gel nell’apposito vassoio in modo da ottenere 3-4 mm di spessore e
pozzetti profondi 3 mm.
• Lasciare solidificare per almeno 15 minuti.
2.
a)
Trasferire il gel di agarosio nella cella elettroforetica. Il gel deve essere coperto da
TBE 0.5x per almeno 1-2 mm.
• Rimuovere con cautela il pettine
• Caricare in sequenza tutto l’amplificato di ogni reazione in ogni pozzetto del
gel
3.
Far correre i gel nel tampone TBE 0.5X
Far correre i minigel (gel con una distanza <10 cm tra i due elettrodi) per 10 minuti a 15 V/cm,
i gel più grandi per 15 minuti a 10 V/cm.
Per calcolare il voltaggio misurare la distanza (in centimetri) tra gli ELETTRODI della cella
elettroforetica (la lunghezza del gel NON È IMPORTANTE).
4.
Esaminare il gel al transilluminatore UV e scattare la fotografia.
1.
Lo stesso tampone TBE 0.5x può essere utilizzato più volte anche se l'impiego del
tampone fresco aumenta la nitidezza dei segnali.
AVVERTENZA:
Il bromuro di etidio è un potente agente mutageno. Indossare guanti in nitrile
e proteggere adeguatamente gli occhi durante la manipolazione dei gel o
delle soluzioni contenenti bromuro di etidio.
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ISTRUZIONI PER L'USO
Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP
LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA
1. L'elevata sensibilità analitica della PCR rende necessario procedere con estrema cautela al fine di
preservare la purezza dei reagenti del kit o delle miscele di amplificazione. Assicurarsi che il flusso
di lavoro all'interno del laboratorio sia unidirezionale e che gli ampliconi della PCR non vengano
portati nell'area di preparazione dei reagenti per la PCR. La purezza dei reagenti può essere
preservata solo attenendosi alle Buone Pratiche di Laboratorio. I risultati attesi possono essere
garantiti se si osservano rigorosamente le procedure descritte nel presente inserto.
2. I prodotti Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ sono stati sviluppati utilizzando esclusivamente campioni di
sangue intero non eparinato o campioni di DNA purificati. Non sono stati valutati risultati con altre
tipologie di campioni.
3. Il campione di DNA costituisce lo stampo per il processo di amplificazione e la sua qualità deve
rientrare nei valori indicati sia in termini di purezza che di concentrazione.
4. Con questi prodotti è possibile utilizzare qualsiasi termociclatore approvato , a condizione che le
specifiche dello strumento siano equivalenti a quelle dello strumento Perkin-Elmer GeneAmp® PCR
9600 o 9700.
5. Verificare che tutti gli strumenti e le apparecchiature siano calibrati in base alle specifiche del
produttore.
RISULTATI ATTESI
Controllo di Qualità
Il Controllo di Qualità e l'aggiornamento dei prodotti per la tipizzazione tissutale basata sul DNA sono
estremamente importanti. Gli oligonucleotidi di sintesi devono essere sottoposti a numerosi test con
DNA di linee cellulari note. Le soluzioni dei primer devono essere testate con DNA positivi e negativi
con sequenze molto simili.
La procedura del controllo di qualità si svolge nel modo seguente:
• Test dei primer sintetizzati con un pannello di DNA di linee cellulari ben caratterizzate
• Test di una soluzione di primer specifica con un pannello di DNA positivi e negativi
• Test del set di SSP completo
• Test del prodotto finale
Controllo Interno
La coppia dei primer di controllo9 viene inserito per verificare l'efficienza della reazione PCR. La sua
presenza conferma che la mancanza di un'amplificazione specifica in una determinata reazione è
effettivamente dovuta all'assenza di quel polimorfismo nel campione di DNA e non al fallimento della
reazione di PCR.
A causa delle diverse concentrazioni e delle differenti temperature di ibridazione della coppia di primer
specifici rispetto alla coppia di primer di controllo:
- L'intensità della banda di controllo spesso diminuisce in presenza di un'amplificazione specifica e
- I primer del controllo interno sono più sensibili a condizioni di PCR non ottimali e possono essere
utilizzati per monitorare l'efficienza della PCR.
L’assenza di amplificazione del controllo interno in reazioni senza amplificazioni specifiche deve essere
interpretata come segno che il sistema in cui si opera non è in condizioni ottimali. Per l’identificazione
delle possibili cause e delle azioni correttive da eseguire fare riferimento alla Guida alla risoluzione dei
problemi.
Le informazioni specifiche riguardanti il Controllo Positivo Interno sono contenute
nell'opuscolo informativo che accompagna ogni kit.
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ISTRUZIONI PER L'USO
Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
L'assegnazione degli alleli viene eseguita in base alla presenza di uno specifico prodotto di PCR.
Un'amplificazione specifica indica che i campioni di DNA contengono l'allele, oppure uno degli alleli del
gruppo definito dalla coppia di primer in quella determinata reazione di PCR. La tabella di interpretazione
fornita con ciascun lotto può essere utilizzata per assegnare l'allele o il gruppo di alleli identificato dalle
rispettive soluzioni di primer.
Nella maggior parte dei kit Dynal AllSet+™ o CombiSet+™ SSP, non in tutti, ciascun allele o gruppo di
alleli è amplificato da più di una soluzione di primer. È importante verificare che tutte le soluzioni dei
primer che dovrebbero risultare positive in quanto portatrici di quell'allele o gruppo di alleli lo siano
effettivamente.
Sebbene gli alleli vengano assegnati in base alla presenza del prodotto di PCR, le dimensioni relative dei
prodotti di PCR possono essere di aiuto nell'interpretazione delle tipizzazioni mediante SSP.
Le dimensioni approssimative dei prodotti di PCR specifici possono essere utilizzate per distinguere
un'amplificazione positiva vera e propria da: - artefatti di oligomeri (primer dimer)
- carry over da pozzetti adiacenti
- amplificazioni non specifiche
Nella tabella di interpretazione fornita con ciascun kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP viene indicata
la sequenza dei tre nucleotidi terminali, che determinano la specificità dell'estremità 3’ sia del primer
forward che del primer reverse.
•
•
Per i prodotti HLA di Classe I viene indicata la posizione del nucleotide negli esoni 2, 3 o 4
corrispondente all'estremità 3’ dei primer.
Per i kit HLA AllSet+™ SSP di Classe II, viene indicata la posizione del codone corrispondente
all'estremità 3’ dei primer.
Se si dispone della sequenza di un nuovo allele non elencato nella tabella di interpretazione, le
informazioni sulla sequenza del primer possono essere utilizzate per scoprire il pattern di amplificazione
del nuovo allele.
In questo caso si prega di contattare il Servizio Tecnico via e-mail:
[email protected] o via fax: +44 151 346 1223.
Interpretazione mediante Dynal SSPTool™
Dynal SSPTool™ è un software appositamente concepito come supporto nell'interpretazione dei risultati.
Le tabelle di interpretazione di ogni lotto specifico dei kit AllSet+™ e CombiSet+™ SSP vengono inserite
nel database del software. Il database viene aggiornato in concomitanza con la produzione di nuovi lotti.
Per qualsiasi richiesta di assistenza e di informazioni riguardanti l'inserimento dei risultati e l'utilizzo del
software fare riferimento alla sezione Help del programma SSPTool™.
Per ordinare una copia gratuita del Dynal SSPTool™ (codice prodotto 990.80), rivolgersi al
rappresentante locale di Dynal Biotech.
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ISTRUZIONI PER L'USO
Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP
GUIDA ALLA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI
PROBLEMA
Amplificazione assente (né
amplificazione del controllo
interno, né amplificazione
specifica)
“
CAUSA
Quantità insufficiente del DNA
Il DNA contiene inibitori della PCR, ad es. proteine, etanolo
(dalle fasi di precipitazione).
“
Il DNA è stato estratto da sangue eparinato
“
Il DNA è sospeso in tampone contenente EDTA
I tappi delle provette di PCR non chiusi ermeticamente sono
causa di evaporazione e successivo fallimento
dell’amplificazione
Episodi casuali di mancata
amplificazione
“
“
“
Errori di caricamento del gel
Utilizzo di pipette non calibrate
AZIONE
Controllare che il volume e la concentrazione del DNA siano
corretti.
Determinare la qualità del DNA. Seguire esattamente il metodo di
estrazione del DNA indicato dai fornitori.
Provare un metodo alternativo per l'estrazione del DNA.
Ripetere l'estrazione del DNA
Utilizzare sangue non eparinato, oppure provare il trattamento con
eparinasi (ved. rif. 8)
Ripetere l'estrazione del DNA e sospenderlo in acqua sterile
Accertarsi che tutti i tappi siano chiusi ermeticamente.
Utilizzare gli appositi chiudiprovette
Controllare che siano stati caricati correttamente i pozzetti e che
ciascuno contenga una quantità simile di miscela di PCR
Calibrare regolarmente tutte le pipette in base alle indicazioni dei
fornitori
“
Errori di pipettamento
Il DNA, la Taq polimerasi o la miscela di PCR non sono
miscelati adeguatamente prima dell'impiego
Controlli Interni deboli
DNA impuro
Determinare la qualità del DNA. Ripetere l'estrazione del DNA
con soluzioni appena preparate.
Quantità di DNA insufficiente
Determinare la concentrazione del DNA e diluirlo a 50 ng/µl
Temperatura di ibridazione eccessiva, il termociclatore non è
calibrato
Calibrare il termociclatore e controllare il programma di PCR. Un
termociclatore utilizzato di routine per PCR-SSP deve essere
calibrato ogni 6 mesi.
Quantità insufficiente di DNA polimerasi termostabile
Utilizzare una quantità maggiore di enzima nelle reazioni di PCR
DNA polimerasi termostabile di bassa qualità
Utilizzare Amplitaq® Perkin-Elmer
“
“
“
“
Amplificazione non specifica
(ladder o smear)
DNA non pulito
(Alcune miscele di primer presentano una maggiore tendenza
a dare luogo ad amplificazione non specifica, ved. note a piè
di pagina delle Tabelle di Specificità)
Segnali di amplificazione
progressivamente più deboli
“
La soluzione di etidio bromuro per la colorazione del gel di
agarosio è vecchia
Una delle lampade UV è rotta
Amplificazioni false-negative
Temperatura di ibridazione eccessiva, il termociclatore non è
calibrato
Amplificazioni false-positive
Potrebbero essere causate da contaminazione
“
“
Pattern di amplificazione
anomalo
“
“
DNA non pulito
Temperatura di ibridazione troppo bassa
Il termociclatore non è calibrato
È stata utilizzata la tabella di interpretazione sbagliata
Il pattern di amplificazione contiene un "falso-positivo"
Nuovo allele, non compreso nella tabella di interpretazione
Bande sfocate e indistinte
Il tampone di elettroforesi può essere caldo
“
Corsa non adeguata
dell'amplicone
Il pettine utilizzato ha i denti troppo spessi
Il tampone di corsa e il tampone utilizzati presentano una
concentrazione differente
Tampone di corsa non compatibile con l'amplicone
Bolle d'aria nella pipetta
Eseguire con maggiore attenzione il pipettamento
Miscelare brevemente mediante vortex
Tutti i frammenti di dimensioni maggiori rispetto al controllo interno
possono essere ignorati
Controllare la qualità del DNA
Ripetere l'estrazione del DNA
L'assenza di DNA può anche causare smear
Preparare una nuova soluzione di bromuro di etidio in modo tale
da ottenere una migliore colorazione del gel.
Controllare l'apparecchiatura di illuminazione UV.
Calibrare il termociclatore e controllare il programma di PCR
impostato. Un termociclatore utilizzato di routine per PCR-SSP
deve essere calibrato ogni 6 mesi.
Utilizzare guanti, puntali con filtro, eseguire le operazioni di pre e
post-PCR in aree separate. Manipolare con cura i campioni in
tutte le fasi. Controllare l'eventuale contaminazione utilizzando
primer per il controllo della contaminazione Dynal (codice prodotto
990.05)
Determinare la qualità del DNA. Ripetere l'estrazione del DNA
con soluzioni appena preparate.
Calibrare il termociclatore e controllare il programma di PCR
impostato. Un termociclatore utilizzato di routine per PCR-SSP
deve essere calibrato ogni 6 mesi.
Controllare che il numero di lotto del prodotto utilizzato
corrisponda a quello della tabella di interpretazione.
Controllare che tutte le amplificazioni siano delle dimensioni
corrette o se un artefatto (carry-over, dimero) è stato
erroneamente interpretato come un'amplificazione
Ripetere la tipizzazione. Se il nuovo pattern di amplificazione è
riproducibile, si prega di contattare il rappresentante locale Dynal
Biotech per informazioni sul pattern di amplificazione di alleli di
recente descrizione.
Utilizzare il tampone TBE consigliato.
Far correre il gel ad un voltaggio inferiore
Utilizzare pettini con denti sottili (4 x1mm)
Utilizzare lo stesso tampone per il gel e per il tampone di corsa
Si consiglia TBE 0.5x
Pipettare adeguatamente
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ISTRUZIONI PER L'USO
Kit Dynal AllSet+™ e CombiSet+™ SSP
BIBLIOGRAFIA
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ISTRUZIONI PER L'USO
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I prodotti sono garantiti per l'acquirente originale solo per essere conformi alla quantità e al contenuto indicati sul
flacone o sulle etichette esterne per la durata indicata. L'obbligo di Dynal Biotech e l'unico risarcimento per
l'acquirente previsti dalla presente garanzia si limitano alla sostituzione, a spese di Dynal Biotech, di qualsiasi
prodotto che presenti difetti di produzione e che sia restituito a Dynal con pagamento anticipato del trasporto, o a
discrezione di Dynal Biotech, al rimborso del prezzo di acquisto.
I reclami per merci danneggiate durante il trasporto devono essere presentati allo spedizioniere.
La presente garanzia non verrà applicata a prodotti che abbiano subito alterazioni al di fuori di Dynal Biotech, né a
prodotti sottoposti a uso improprio o cattivo uso. TUTTE LE ALTRE GARANZIE, ESPRESSE, IMPLICITE O
LEGALI, SONO SPECIFICATAMENTE ESCLUSE, INCLUSE MA NON LIMITATAMENTE AD ESSE, LE
GARANZIE DI COMMERCIABILITÀ O IDONEITÀ A SCOPI PARTICOLARI. La responsabilità massima di Dynal
Biotech è limitata in ogni caso al prezzo dei prodotti venduti da Dynal Biotech. IN NESSUN CASO DYNAL
BIOTECH SARA’ RESPONSABILE PER DANNI PARTICOLARI, INCIDENTALI O DIRETTI. Alcuni stati non
pongono limiti a garanzie o risarcimenti in caso di violazioni in determinate transazioni. In tali stati, i limiti di cui
sopra potrebbero non essere applicati.
Il presente prodotto non può essere in alcun modo reimballato, riformulato o rivenduto senza il consenso scritto di
Dynal Biotech Ltd, UK.
MARCHI DI FABBRICA UTILIZZATI NEL PRESENTE DOCUMENTO/ PRODOTTO
Dynal® è un marchio registrato di DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norvegia
AllSet™ e AllSet+™ sono marchi registrati di DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norvegia
DynaMix™ è un marchio di DYNAL BIOTECH Ltd., U.K.
CombiSet™ e CombiSet+™ sono marchi di DYNAL BIOTECH., U.K.
SSPTool™ è un marchio di DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norvegia
AmpliTaq® è un marchio registrato di Roche Molecular Systems, Inc. USA.
Electro-Fast® è un marchio registrato di Advanced Biotechnologies Ltd (ABgene®)
GeneAmp® è un marchio di Roche Molecular Systems, Inc. USA
BREVETTI UTILIZZATI NEL PRESENTE DOCUMENTO/PRODOTTO
* I prodotti Dynal SPP sono venduti sul licenza concessa da ZENECA Ltd. ARMS™ in base al brevetto europeo N.
0332435 e dei corrispondenti brevetti internazionali. ARMS™ è un marchio registrato di ZENECA Ltd.
** Questo prodotto è STATO ottimizzato per l'impiego nel processo di reazione a catena della polimerasi (“PCR”)
protetto da brevetti di proprietà di Roche Molecular Systems Inc. e F. Hoffmann-La Roche Ltd (“Roche”). Con
l'acquisto di questo prodotto, all'acquirente non viene concessa alcuna licenza espressa o implicita di utilizzo del
processo di PCR coperto da tali brevetti. Per ulteriori informazioni sull'acquisto di licenze per l’utilizzo del processo
di PCR, contattare il Director of Licensing presso Roche Molecular Systems,, Inc.,1145 Atlantic Avenue, Alameda,
California, 94501, per quanto riguarda gli Stati Uniti e il PCR Licensing Manager, F. Hoffman-La Roche Ltd,
Grenzacherstr. 124, DH-4070 Basilea, Svizzera, per gli altri paesi.
Prodotto da Dynal Biotech Ltd.,U.K.
Sviluppato da Dynal Biotech Ltd.,U.K.
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CONTATTI
Dynal Biotech Ltd.,
11 Bassendale Road, Croft Business Park,
Bromborough, Wirral, CH62 3QL, U.K.
Tel: +44 151 346 1234, Fax: +44 151 346 1223
E-mail: [email protected], Internet: http://www.tissue-typing.com
Dynal Biotech A.S.A
PO Box 114 Smestad,
N-0309, Oslo, Norvegia
Tel: +47 2206 1000
Fax: +47 22 50
E-mail:[email protected]
Internet: http://www.dynalbiotech.com
DYNAL BIOTECH GmbH
Bramfelder Chaussee 41
22177 Hamburg, Germania
Tel: +49 40 36 15 73-0
Fax: +49 40 36 15 73-30
E-mail: [email protected]
Dynal Biotech Inc.
HLA Diagnostics Division
555 Andorra Glen Court
Suite 5 Lafayette Hill, PA 19444, USA
Toll Free: +1 1866 DYNAL TT (396 2588)
Tel: +1 610 940 1511
Fax: +1 610 940 3606
E-mail: [email protected]
Dynal Biotech A.S.A
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66 Avenue de Landshut
60200 Compiègne, Francia
Tel: +33 3 44 23 45 95
Fax: +33 3 44 23 16 14
E-mail: [email protected]
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PO Box 204, Carlton South,
Victoria 3053, Australia
Tel: 1 800 623 453
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