Il vaccino vivo “Sterne” - Associazione Consigli Ordini Provinciali

Contributi pratici
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Il vaccino vivo “Sterne”
nella profilassi del carbonchio ematico in Italia
G. Garofolo
A. Fasanella
D. Chiocco
S. Sciasciamacchia
IZS della Puglia
e della Basilicata
Centro di Referenza
Nazionale per
l’Antrace - Foggia
Parole chiave:
- carbonchio ematico,
- Sterne 34F2,
- vaccino.
F. Ciuchini
R. Adone
I.S.S. Roma
Introduzione
In Italia il carbonchio ematico è una malattia
endemica a carattere sporadico che colpisce prevalentemente gli animali erbivori al
pascolo. Ogni anno si registrano un numero
ridottissimo di episodi localizzati prevalentemente nelle regioni centrali, meridionali e
insulari, mentre sono rare le segnalazioni in
quelle dell’Italia settentrionale.
Nonostante in questi ultimi anni siano stati
segnalati episodi carbonchiosi a carattere
epidemico (Fasanella et al.,2007), possiamo
affermare che rispetto al passato, i focolai di
carbonchio ematico, che in genere tendono a coinvolgere pochi animali, sono sensibilmente diminuiti e questo grazie alle campagne di profilassi vaccinale avviate fin dagli anni ‘50. A differenza della quasi totalità
dei Paesi del mondo che utilizza il vaccino
Sterne (Turnbull, 1998), in Italia venivano utilizzati due tipi di vaccini vivi attenuati, ambedue prodotti e distribuiti dall’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della
Basilicata (IZS PB).
Nella profilassi del carbonchio ematico degli ovini e dei bovini veniva utilizzato il vaccino Carbosap, costituito da una sospensione di spore vive di un ceppo attenuato
di B. anthracis, capsulato e tossigeno, allestita in soluzione fisiologica con saponina all’1%.
Nella profilassi del carbonchio ematico degli equini e dei caprini, invece, veniva utilizzato un vaccino Pasteur 1° tipo, costituito da
una sospensione di spore vive di un ceppo
attenuato di B. anthracis capsulato e atossigeno, allestita in soluzione fisiologica con
saponina all’1%.
Nonostante le prime prove sperimentali per
l’introduzione del vaccino Sterne in Italia risalgano ai primi anni ‘70, solo nel 2006 esso
è stato introdotto come vaccino ufficiale nelle campagne di profilassi contro il carbonchio ematico.
L’assenza di patogenicità del ceppo vaccinale Sterne, strettamente legata alla mancanza della capsula, garantisce una elevata riduzione dei rischi e offre il vantaggio di po-
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ter essere utilizzato in tutte le specie di animali da reddito (bovini, ovini, equini e caprini).
I diversi test a cui è stato sottoposto il vaccino Sterne, sono stati descritti in un apposito dossier e presentati al Ministero della
Salute. Nel 2006 il Ministero della Salute,
sentito il parere del Consiglio Superiore di
Sanità ha autorizzato l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata (IZSPB) a produrre il vaccino Sterne e
ha incaricato l’Istituto Superiore di Sanità
(ISS) di effettuare il collaudo di ogni lotto
vaccinale presso la sede di produzione
allo scopo di assicurare che tutte le procedure di allestimento e controllo dei lotti
vaccinali avvengano nel rispetto
delle norme di sicurezza dettate dalla Farmacopea Ufficiale
Italiana. Questa forma di controllo è stata stabilita di concerto tra il Ministero della Salute, l’Istituto Superiore di Sanità
(ISS) e l’Istituto Zooprofilattico
Sperimentale di Puglia e Basilicata (IZSPB) in quanto trattasi di
un vaccino non registrato (quindi non commerciabile) che viene distribuito ai veterinari del
Servizio Sanitario Nazionale
previa autorizzazione dei servizi veterinari regionali.
Questa breve nota è la sintesi
del lavoro di oltre tre anni in
cui sono stati effettuati molti
test che garantissero la validità,
l’efficacia e soprattutto l’innocuità del vaccino Sterne.
Sono stati adottati criteri rigidissimi che sono andati ben oltre quelli richiesti dalle vigenti normative nazionali ed europee perché era necessario addivenire ad un prodotto che si ponesse come uno dei più sicuri nell’ambito di quelli presenti sulla scena mondiale.
Allo stato attuale presso l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della
Basilicata (IZSPB) viene prodotto un lotto
di vaccino Sterne ogni anno sul quale vengono effettuati tutti i test descritti tranne
quelli relativi alla patogenicità residua nella
cavia e nel topo, innocuità della somministrazione di una dose ripetuta e lo studio di
campo.
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Il vaccino Sterne italiano
Il ceppo utilizzato per l’allestimento del vaccino è lo Sterne 34F2, ceppo di B. anthracis
attenuato, tossigeno e acapsulato, che possiede solo il plasmide pXO1, responsabile
della produzione delle tossine, mentre è
privo del plasmide pXO2 che codifica la
capsula.
Il vaccino è costituito da una sospensione
di spore vive in soluzione fisiologica contenente saponina allo 0,5% contrariamente
ad altri Paesi dove il vaccino Sterne è adiuvato ad un mix di saponina e glicerina.
La dose vaccinale è di 1 ml e contiene circa 1,3x107 ± 20% spore per gli animali a-
dulti (bovini, ovini, equini e caprini).
Per gli animali sotto i 6 mesi si utilizza una
dose dimezzata.
Saggi di controllo
I lotti di vaccino Sterne sono sottoposti ad
una serie di controlli secondo le indicazioni della Farmacopea Ufficiale Italiana ed
Europea e del “Manuale di Standard per
Test Diagnostici e Vaccini” dello OIE, rispetto alle quali, tuttavia, sono state adottate alcune modifiche, non sostanziali, che
hanno reso i saggi più precisi e rigorosi.
Identificazione
L’identificazione del ceppo vaccinale
Sterne di B. anthracis, viene eseguita medi9 / 405
ante saggi morfologici, colturali e biochimici come da Farmacopea, integrati da specifici test biomolecolari (OIE, 2004; Fasanella et al., 2001; Fasanella et al., 2005;
Muscillo et al., 2005)
Vitalità delle spore
Nel corso della fase sperimentale, una sospensione di spore del ceppo Sterne allestita in soluzione fisiologica e contenente
saponina allo 0,5%, conservata in frigo a +
4 °C, è stata sottoposta a controlli periodici per circa due anni.
Ad intervalli di tempo regolari, il numero
delle spore vive è stato determinato mediante conta delle colonie su piastra, effettuando 4 repliche per ciascuna diluizione.
La sospensione del ceppo vaccinale Sterne è risultata avere
un numero di spore costante
nel tempo, con variazioni che
sono sempre rientrate nel range del ± 20% del valore di partenza indicato in etichetta.
Contaminazione batterica
e fungina
Per il controllo della presenza
di batteri o funghi contaminanti, la sospensione vaccinale viene sottoposta ad esami colturali utilizzando terreni solidi e
liquidi appropriati.
Patogenicità residua
Tali prove, ad integrazione dei
saggi indicati dalla Farmacopea, sono state effettuate nel
corso della fase sperimentale e
finalizzate a determinare nel
modo più preciso possibile il
grado di patogenicità residua ed il rischio
di un recupero di virulenza del ceppo vaccinale (Fasanella et al., 2001).
Le prove sono state effettuate su cavie di
300-350 g e topini adulti di 20-25 g.
Sia le cavie che i topini sono stati inoculati
per via sottocutanea con 0,25 ml della sospensione vaccinale.
Il vaccino Sterne è risultato completamente
avirulento per entrambe le specie.
Innocuità
I saggi di innocuità sono stati effettuati seguendo i criteri generali di valutazione dell’innocuità dei vaccini per uso veterinario e
la monografia specifica della Farmacopea
Ufficiale Italiana per l’allestimento dei vac-
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cini vivi sporulati del carbonchio ematico.
Sono state utilizzate capre di circa 6 mesi
di età in quanto categoria animale più sensibile fra le specie bersaglio.
Sono stati effettuati tre tipi di prova.
a) Innocuità della somministrazione della
dose singola: due capre di circa 6 mesi
sono state inoculate sottocute con una
dose vaccinale d’uso (0,5 ml).
Le capre sono tenute in osservazione
per 14 giorni.
b) Innocuità della somministrazione di una
dose in eccesso: due capre di circa 6
mesi sono state inoculate sottocute con
una dose doppia (1 ml) e due capre della stessa età sono state inoculate con
una quantità di spore esattamente 10 volte la dose
d’uso (5 ml).
Da tali animali sono stati
prelevati campioni di sangue per 10 giorni sui quali
sono stati effettuati esami
microbiologici per l’isolamento di eventuali forme
vegetative del batterio.
c) Innocuità della somministrazione di una dose ripetuta:
due capre di circa 6 mesi
sono state sottoposte alla
somministrazione ripetuta di
una singola dose d’uso (0,5
ml) per verificare l’eventuale capacità del vaccino di
indurre shock anafilattici.
Le capre sono state vaccinate tre volte con la dose
d’uso a distanza di una settimana e tenute in osservazione per 14
giorni dall’ultima vaccinazione per evidenziare i segni di reazioni locali o generali.
Il vaccino è stato sempre inoculato nel sottocute della parte interna della coda.
Durante il periodo di osservazione, 14 giorni, è stata registrata la temperatura rettale
come criterio obiettivo di valutazione dell’innocuità. Nessun animale sottoposto ai
saggi di innocuità ha evidenziato reazioni
sistemiche ad eccezione di un modesto e
temporaneo arrossamento nel punto di inoculo del vaccino.
La temperatura registrata ha evidenziato rialzi fisiologici rientrati successivamente nei
valori della norma, anche nei soggetti inoculati con dosi in eccesso.
Non sono mai stati registrati processi a carattere necrotico.
Gli esami batteriologici effettuati sul sangue
delle capre vaccinate con 10 dosi sono risultati sempre negativi.
L’assenza di reazioni locali o generali nelle
capre vaccinate con tre dosi ripetute a
breve distanza ha escluso la presenza, nel
vaccino, di sostanze che predispongano
l’organismo a shock anafilattici.
Attività biologica
Nonostante la Farmacopea Italiana e il manuale OIE suggeriscano la cavia come modello animale per le prove di efficacia del-
lo Sterne, in questo studio la prova di protezione è stata effettuata utilizzando il coniglio perché risulta l’animale di laboratorio
più sensibile alla tossiemia, causa principale dell’azione letale di B. anthracis, e manifesta una più costante evoluzione della sintomatologia carbonchiosa (Zaucha GM, et
al., 1998). La Dose letale 50 (DL50) è stata
preferita alla Dose Letale Minima (DLM) prevista dalla Farmacopea Ufficiale Italiana perché l’elaborazione statistica risulta più accurata. Il test è stato eseguito su 14 conigli
del peso di circa 1,5 kg, suddivisi in due
gruppi, il gruppo A, costituito da 10 conigli e quello B, costituito da 4 conigli.
Gli animali appartenenti al gruppo A sono
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stati vaccinati con 1/10 della dose d’uso
prevista. La vaccinazione è stata eseguita
per via sottocutanea sul dorso, nella regione interscapolare.
Un richiamo, con le stesse modalità, è stato
eseguito dopo 21 giorni.
I conigli del gruppo B, non vaccinati, sono
stati tenuti come controllo.
A 14 giorni dalla seconda vaccinazione,
tutti i conigli sono stati sottoposti al challenge; come ceppo patogeno per l’infezione
è stato utilizzato un ceppo italiano di B.
anthracis classificato come A0843 (cluster
A1a, genotipo 3). I conigli del gruppo A sono stati infettati con 200 DL50, mentre quelli di controllo sono stati infettati con 20
DL50. Tutti i conigli vaccinati sono sopravvissuti al challenge;
non sono stati evidenziati sintomi clinici conseguenti alla vaccinazione o all’infezione sperimentale ad eccezione di un
piccolo nodulo nel punto di
inoculo del vaccino.
Al contrario, i soggetti appartenenti al gruppo di controllo sono deceduti tra le 48 e 96 ore
dall’infezione.
Tutti i soggetti deceduti, sottoposti a esame necroscopico,
hanno evidenziato lesioni anatomo-patologiche specifiche;
gli esami microscopico, batteriologico e biomolecolare hanno sempre confermato la diagnosi di carbonchio ematico.
Studi di campo
A supporto dei saggi di laboratorio sono stati effettuati studi di campo
sulle specie bovina, ovina e caprina attraverso il rilievo degli anticorpi indotti dal
vaccino. Gli animali, dieci per ogni specie,
tutti di oltre 6 mesi di età, sono stati inoculati secondo lo schema vaccinale che prevede una vaccinazione sottocute con 1 ml
seguita da richiamo a 21 giorni.
Tutti i soggetti sono stati sottoposti a visite
cliniche e a prelievi prima della vaccinazione (tempo 0), dopo 21 giorni e successivamente a cadenza mensile.
Sui prelievi di sangue è stato effettuato il
test ELISA per verificare la produzione di
anticorpi anti-fattori tossici di B. anthracis
come criterio della valutazione dell’attività
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biologica protettiva (Garofolo et al., 2004). Gli animali sottoposti al
programma di vaccinazione non hanno manifestato alcun sintomo
clinico. Nel gruppo degli ovini è stata inserita anche una pecora
gravida la quale ha regolarmente partorito senza manifestare effetti collaterali. Il test ELISA ha evidenziato un incremento notevole
della produzione degli anticorpi subito dopo la vaccinazione di
richiamo. In seguito il livello è diminuito in maniera progressiva
anche se molto lentamente. Infatti, dopo sei mesi dalla vaccinazione il livello di anticorpi specifici era ancora molto elevato in tutte
le specie animali trattate.
Conclusioni
Il vaccino Sterne è un vaccino largamente utilizzato nel mondo per
le sue proprietà protettive e per la sua nota avirulenza a partire da
topini adulti di 20-25 grammi (Fasanella et al. 2001).
Il vaccino Sterne comporta indubbi vantaggi operativi. Oltre al suo
utilizzo per tutte le specie da reddito, che consente un notevole
abbattimento dei costi di produzione, la dose vaccinale impiegata risulta di più facile somministrazione e può contribuire a ridurre
gli errori legati ai dosaggi molto bassi che caratterizzavano i vaccini precedentemente utilizzati. L’uso del vaccino Sterne facilita altresì le prove di identificazione previste dalla Farmacopea Europea per il controllo di qualità sul prodotto finito, condotte con
metodi classici. I risultati delle prove effettuate sul lotto sperimentale di vaccino Sterne prodotto dall’IZSPB, hanno confermato che
il vaccino induce una ottima protezione in tutti i conigli vaccinati e
risulta ben tollerato nei saggi di innocuità condotti sulla specie più
sensibile fra quelle bersaglio, anche quando somministrato in dosi
in eccesso o ripetute. L’effetto booster registrato a seguito della
seconda vaccinazione suggerisce un protocollo che prevede una
prima somministrazione del vaccino seguita da una seconda dopo
21 giorni e da richiami da effettuarsi ogni anno.
Il vaccino ha scadenza di un anno, come previsto dalle norme generali europee sui vaccini vivi.
Considerazioni
L’introduzione del vaccino Sterne rientra nei programmi di miglioramento del sistema di sorveglianza e controllo del carbonchio
ematico in Italia, divenuti prioritari a seguito dell’impatto sulla opinione pubblica determinato dagli attacchi bioterroristici negli USA
del 2001 e che hanno visto l’IZSPB e l’ISS svolgere un ruolo importante nella gestione del piano di emergenza italiano. Quegli episodi, in cui 5 persone morirono e molte altre furono contaminate a
seguito del deliberato rilascio di spore di Bacillus anthracis, rappresentano un punto di svolta nella storia degli agenti altamente
patogeni e del loro uso come mezzo di offesa nei confronti della
popolazione civile: quello che fino ad allora era considerata solo
una remota probabilità era diventata una terribile realtà e un pericoloso esempio che potrebbe essere imitato da chiunque.
Come test ufficiale di rilevamento delle spore in campioni sospetti fu adottata una PCR, messa a punto nel corso di una collaborazione scientifica tra IZSPB e ISS, e basata sull’amplificazione di
frammenti di DNA del cromosoma e dei due plasmidi di B. anthra-
cis (Fasanella et al., 2001, Fasanella et al., 2003). Pur essendo sensibile ed efficace, il test aveva il limite di non permettere la differenziazione tra il ceppo vaccinale Carbosap e un ceppo patogeno (Adone et al., 2002; La Rosa et al., 2006) dato che entrambi possiedono ambedue i plasmidi. Oggi siamo in grado di differenziarli (Fasanella et al., 2005; Muscillo et al., 2005) ma all’epoca questo rappresentava un serio problema perché non si doveva più continuare a produrre e distribuire un ceppo di B. anthracis, che se pur
apatogeno, risultava geneticamente simile ai ceppi patogeni.
Il ceppo Sterne quindi rappresentava una garanzia anche sotto
questo punto di vista in quanto esso è facilmente riconoscibile
perché privo del plasmide pXO2 (plasmide codificante la capsula).
Gli episodi legati al deliberato rilascio di spore di antrace e il cresciuto livello di attenzione dei governi dei paesi occidentali nei
confronti degli agenti altamente patogeni, hanno anche reso
necessaria l’adozione di sistemi di sicurezza più efficaci soprattutto in quei laboratori specializzati per la manipolazione di agenti altamente patogeni. I provvedimenti presi a riguardo sono stati tempestivi e hanno portato in breve tempo alla realizzazione sia presso l’IZSPB che l’ISS di laboratori di sicurezza di classe 3a previsti
per la manipolazione di microrganismi ad alto rischio (Ciuchini e
Adone, 2002) e di locali e armadi di sicurezza per la stabulazione
degli animali durante i test di protezione dei vaccini dove è previsto l’utilizzo di ceppi di antrace patogeni.
La bibliografia è disponibile sul sito
www.ilprogressoveterinario.it