Relazione scientifica - Istituto Zooprofilattico Sperimentale del

Rotaviruses in Buffaloes
Prof G. Iovane
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno
Introduzione
¾ I Rotavirus appartengono alla
famiglia delle Reoviridae
¾ RNAds s
¾ sono così denominati perché il
virione completo ricorda
l’immagine di una ruota
¾ sono responsabili di diarree
neonatali in numerose specie
animali, uomo compreso
¾ negli animali la diarrea neonatale
da Rotavirus si osserva entro i
primi 15 giorni di vita
Stima della ripartizione dei 800,000 decessi
per infezioni da rotavirus per anno
Aetiology of neonatal diarrhoea in calves
Rotavirus
27,6%
Coronavirus
9,6%
Cryptosporidium
22.9%
Coccidiosis
7,3%
Salmonella spp
4,8%
No diagnosis
31,7%
Eziologia
¾ I Rotavirus maturi
non hanno envelope
¾ presentano un core a
simmetria icosaedrica
¾ un capside costituito
da due strati
Spettro d’ospite in vivo
¾ L’isolamento dei Rotavirus è ottenibile, oltre che
nell’uomo, in numerose specie animali, sia
domestiche sia selvatiche
¾ Caratteristica interessante dei Rotavirus è che
essi non sono specie-specifici
¾ L’identificazione nell’uomo di stipiti virali correlati
antigenicamente a rotavirus animali
Caratteri fisico biologici
¾ hanno la proprietà di agglutinare a diverse temperature
i globuli rossi di varie specie animali
¾ L’infettività è favorita dalle basse temperature e da
condizioni di umidità elevata
¾ Sono stabili a ph 3 e, in quanto privi di envelope,
resistono ai comuni disinfettanti quali etere,
cloroformio e acidi
¾ Sensibili formalina
Spettro d’ospite in vitro
¾ Per la coltivazione in vitro è utilizzata la linea
cellulare MA-104
¾ Condizione essenziale per lo sviluppo del virus e
per la comparsa dell’effetto citopatico è l’aggiunta
d’enzimi proteolitci (tripsina)
¾ L’effetto citopatico si manifesta nel giro di 24-72
h, ed è caratterizzato dalla comparsa di cellule
rifrangenti che si distaccano dal monostrato e
vanno incontro a lisi
Struttura del genoma e delle
proteine virali
¾ I Rotavirus possiedono 11 segmenti di RNA a
doppia elica contenuti nel core
¾ Ogni segmento di RNA codifica per una
proteina, tranne l’ultimo segmento che possiede
due ORF
¾ 6 proteine strutturali (VP) e 6 proteine non
strutturali (NSP)
Struttura antigene
¾ Nel genere Rotavirus sono stati identificati 7
sierogruppi, indicati con le lettere da A a G.
¾ I sierogruppi sono antigenicamente distinguibili
mediante diverse tecniche:
¾ immunoelettromicroscopia
¾ immunofluorescenza
¾ ELISA
in base ad un antigene di gruppo comune
localizzato sulla proteina VP6
Struttura antigene
1.
I Rotavirus nell’ambito di un
sierogruppo sono divisi in
sottogruppi,
1.
2.
due antigeni di sottogruppo, SI e
SII, presenti su proteine VP6 e VP2
I Rotavirus di gruppo A, i più
studiati, sono ulteriormente
classificati in sierotipi in base alle
caratteristiche della VP4 e della
VP7
1. La VP4 identifica il P-tipo
(Protease-sensible)
2. La VP7 identifica il G-tipo
(Glicoproteina)
Struttura antigene
¾ Sino ad oggi sono noti 15 G-tipi e 23 P-tipi
I tipi più diffusi sono:
¾ nei bovini:
¾ nel bufalo:
¾ negli equini:
¾ nei suini:
¾ nell’uomo:
P1, P11, P5, G6 e G10
P1 , P11 , P5 , G8, G6
P7, P12, P17, G4 e G5
P6, P7, G4 e G5
P4, P6, P8, G1, G2, G3 e G4
Rotavirus, strain variation
ƒ Reassortment of genome segments can
lead to generation of new serotypes
– Occurs in host infected simultaneously with 2 or
more serotypes
– Probably a more important cause of crossspecies transmission
Epidemiologia
¾ La via di trasmissione principale è di tipo orizzontale,
attraverso il ciclo oro fecale
¾ E’ possibile anche una trasmissione indiretta
attraverso le attrezzature, utensili, mangimi ed acque
inquinati da feci infette
¾ la via transplacentare e quella attraverso gli insetti
ematofagi è da escludere in quanto la malattia non
presenta fasi viremiche
Patogenesi
¾ il virus, assunto per ingestione, si localizza nel
duodeno e nel tratto superiore del digiuno, aderendo
elettivamente alle cellule epiteliali situate all’apice dei
villi intestinali
¾ Gli enzimi pancreatici agiscono attivando la proteina
VP4, sui suoi siti di clivaggio, scindendola nelle 2
frazioni VP5 e VP8 aumentando così la capacità di
penetrazione nella cellula
Patogenesi
¾ Segue lo svestimento delle particelle, inteso come
rimozione del capside esterno
¾ La degradazione del capside esterno comporta
contemporaneamente
l’attivazione
dell’RNApolimerasi e degli altri enzimi per il capping e la
metilazione degli RNAm in via di formazione
¾ Questi RNAm sono prodotti, con un meccanismo di
trascrizione conservativo unico nel mondo dei
virus, sullo stampo del filamento (-)
Patogenesi
¾ Le cellule cilindriche, così infettate, sono
distrutte e rimpiazzate da cellule cuboidi
delle cripte ghiandolari
¾ La presenza di queste cellule cuboidali
rappresenta una risposta dell’organismo
per proteggere la lamina propria dei villi
Patogenesi
¾ Questa risposta permette l’acquisizione di uno stato
di resistenza al proseguimento dell’infezione
¾ Queste nuove cellule, infatti, sono apparentemente
refrattarie all’infezione, essendo prive di recettori
specifici per il virus
Patogenesi
¾ Le cellule cuboidali sono cellule immature
¾ sostituiscono, in corso di diarrea, quelle altamente
differenziate accelerando la loro migrazione verso
l’apice dei villi
¾ queste cellule sono infatti carenti di enzimi specifici
quali la disaccaridasi, lattasi, NA+-ATPasi e K+ATPasi
¾ Tutto ciò determina
¾ difetti di trasporto ionico,
¾ una scarsa capacità di assorbimento di glucosio e
galattosio
¾ una diminuita capacità ad utilizzare il lattosio per
deficienza di lattasi.
Patogenesi
1.
2.
3.
4.
5.
zuccheri non digeriti nel lume intestinale
metabolizzati, da parte di batteri intestinali,
trasformati in acidi grassi a corta catena,
richiamo osmotico di plasma e di altri liquidi organici
aumento della pressione osmotica nel lume
intestinale
6. segue diarrea e disidratazione
¾ l’assorbimento di metaboliti tossici derivati dalla
fermentazione degli idrati di carbonio, alla quale
spesso concorrono anche patogeni secondari quali E.
coli, salmonelle ed altri, spiegano così l’alta mortalità
soprattutto di vitelli e suinetti affetti da rotavirosi.
Sintomatologia
¾ Negli adulti il virus è in grado di moltiplicarsi senza
provocare una sintomatologia manifesta
¾ I giovani, sprovvisti di immunità mucosale a livello
intestinale, invece manifestano la sintomatologia
clinica
¾ Il quadro sintomatologico è simile in tutte le specie
ed è sovrapponibile alle altre enteriti.
Sintomatologia
¾ La forma clinicamente manifesta compare, nelle
varie specie, dopo un periodo di incubazione di 1-4
giorni e persiste circa 3-7 giorni
¾ Gli animali colpiti dall’infezione mostrano i segni di
un enterite acuta, che si manifesta con diarrea,
talvolta muco-emorragica
¾ La febbre si manifesta ad intermittenza o può essere
assente
Sintomatologia
¾ Gli animali giovani colpiti dalla diarrea possono
sviluppare rapidamente una grave disidratazione,
accompagnata da acidosi
¾ L’estensione delle alterazioni, la compromissione
dello stato generale e l’eventuale partecipazione
di E.coli o di altri germi di irruzione secondaria,
possono spiegare la mortalità non indifferente,
oltre il 50%, che si osserva specialmente nei vitelli
e nei suinetti
Lesioni anatomopatologiche
¾ stato scadente di nutrizione
¾ grave disidratazione
¾ enterite catarrale acuta
¾ linfoadenomegalia mesearica
¾ ipertrofia delle placche del Peyer
¾ lieve splenomegalia
Lesioni anatomopatologiche
¾ esame istologico:
¾ infiltrazione nella mucosa di cellule linfomonocitarie
¾ aumento di volume dei follicoli linfatici
¾ I villi intestinali appaiono accorciati ed atrofici
¾ le cellule cilindriche dell’apice di questi ultimi sono
sostituite da cellule cuboidi e nei casi più gravi da
cellule pavimentose
¾ iperplasia delle cripte
Small intestines of mice above uninfected and below infected
with rotavirus stained with PAS/Alcian Blue
Histopathology
Diagnosi
¾ E’ abbastanza difficile emettere un giudizio
sulla sola base sintomatologica
¾ diagnosi differenziale
¾ le rotavirosi si manifestano entro i primi 15 giorni
di vita
¾ Le coronavirosi si manifestano tra i 15 e 45 giorni
d'età
¾ le parvovirosi dai 15 giorni fino a 6 mesi
Diagnosi
¾
natura istopatologica delle lesioni
¾ rotavirosi: lisi e necrosi delle cellule degli apici dei villi
mentre quelle delle cripte appaiono lievemente
iperplastiche
¾ coronavirosi le lesioni interessano tutto il villo intestinale e
le cellule delle cripte appaiono notevolmente iperplastiche
¾ parvovirosi le cellule delle cripte sono in completa aplasia
ed i processi rigenerativi sono compromessi
Diagnosi
¾Tuttavia per una conferma definitiva occorrono
esami di laboratorio
¾Quelli più usati sono indirizzati ad evidenziare il
virus nelle feci eseguiti con diverse tecniche
quali
Test rapido immunocromatografico
(Rotascreen dipstick M580)
Diagnosi
¾microscopia
elettronica
Diagnosi
¾ Colture cellulari
Diagnosi
¾immunofluorescenza
Diagnosi
¾ PAGE (elettroforesi in gel di poliacrilamide)
Diagnosi
¾ RT-PCR (reverse polimerase chain reaction)
RT-PCR con i primers Beg9End9. Amplificazione del
gene VP7 (1060 bp).
RT-PCR con i primers Con2Con3. Amplificazione di
frammenti di 876 bp del gene
della proteina VP4
Profilassi sanitaria
¾ è in grado di realizzare una riduzione della carica
infettante negli ambienti di allevamento
¾ Garantendo una temperatura ed areazione
ottimale degli animali in allevamento, una pulizia
e disinfezione dei locali con disinfettanti a base
di formalina
Immunità passiva
¾ le madri guarite da rotavirosi o immunizzate contro
Rotavirus sono in possesso di anticorpi specifici che
trasmettono alla prole per vie diverse, secondo la
specie
¾ gli animali ne acquisiscono in quantità notevole
soprattutto con il colostro e in parte con il latte
¾ quindi l’assunzione di colostro è indispensabile ed il
privarli di esso significa renderli senza difesa
Immunità attiva
¾ l’infezione acuta della malattia provoca un notevole
stimolo antigenico a carico dei linfociti della parete
intestinale
¾ i primi anticorpi a comparire sono quelli della classe
IgM, successivamente le IgG
¾ immunità omotipica, cioè rivolta solo nei
confronti del sierotipo che ha causato
l’infezione.
Immunità attiva
¾ Di maggior rilievo, invece, hanno in questa infezione
gli anticorpi della classe IgA che risultano più avidi e
che sono in grado di bloccare la sintesi virale
¾ ma la loro produzione è transitoria, perdurando solo da
4 a 10 giorni
¾ nell’uomo ed in molte specie animali sono stati isolati
da feci anticorpi non solo della classe IgA ma anche
quelli di classe IgG ed IgM
G and P genotIpI di rotavirus bufalini in sette allevamenti
Strains
Herd
Year of isolation
G-type
P-type
BuRV/1
A
2001
G-8
P[1]
BuRV/2
A
2001
G-8
P[1]
BuRV/3
A
2002
G-8
P[5]
BuRV/4
A
2002
G-8
P[5]
BuRV/5
G
2002
G 10
P[1]
BuRV/1S
E
2003
G 10
P[1]
BuRV/2S
E
2003
G 10
P[1]
BuRV/B
E
2003
G 10
P[1]
BuRV/90
B
2003
G6
P[5]
BuRV/377
A
2003
G6
P[5]
BuRV/378
A
2004
G6
P[5]
BuRV/562
F
2004
G6
P[5]
BuRV/547
F
2004
G6
P[5]
BuRV/549
F
2004
G6
P[5]
BuRV/F1
D
2004
G6
P[5]
BuRV/F2
D
2004
G6
P[5]
BuRV/F3
D
2004
G6
P[5]
BuRV/M
C
2004
G6
P[5]
BuRV/2M
C
2004
G6
P[5]
BuRV/304
A
2004
G6
P[5]
BuRV/404
A
2004
G6
P[5]
Relative frequencies of various combination of the G and P genotypes
observed in buffalo rotavirus field isolates in Italy.
Genotype
P[1]
P[5]
P[11]
Total
G6
-
12 (57,14)
-
12 (57,14)
G8
2 (9,52)
3 (14,28)
-
5 (23,8)
G10
4 (19,04)
-
-
4 ( 19,04)
Total
6 (28,56)
15 (71,42)
-
21 (100)
Strains buffalo
¾ P[5] G6
57%
¾ P[1] G10
19%
¾ P[5],G8
14%
¾ P[1],G8
9.5%
Strains
¾ An intersting finding was the identification of strains
displaying the P[1],G10 combination
¾ reassortment between a P[1] buffalo strain and G10
bovine strain
Distribution of rotavirus strains in the various
herds
Herds
2001
A
G8-P1 (2)
B
2003
2004
G8-P5 (3)
G6-P5 (1)
G6-P5 (3)
-
-
G6-P5 (1)
-
C
-
-
-
G6-P5 (2)
D
-
-
-
G6-P5 (3)
E
-
-
G10-P1 (3)
-
F
-
-
-
G6-P5 (2)
G
-
-
G10-P1 (1)
-
Escape immunity
2002
Conclusion
¾ buffalo and bovine rotaviruses share similar VP4 and
VP7 antigenic specificities
¾ G8 more frequent in buffaloes.
¾ a novel reassortant strain, P[1],G10 occurred in
buffaloes.
Conclusion
¾ Three vaccines are available in Italy
¾ a killed vaccine P[7] G5
¾ two live modified vaccines P[1] G6 and P[5] G6
¾ Not contain G10
Partial immunity
Conclusion
Continual surveillance for rotavirus
genotypes in buffalo herds is required
for a better understanding of the global
rotavirus ecology and for the
optimisation of current vaccines and
prevention programs of rotavirus
diarrhoea in buffalo.
Grazie per
l’attenzione