sir mycoplasma 62781 10 test - Bio-Rad

SIR MYCOPLASMA
10 TEST
62781
ANTIBIOGRAMMA PER MICOPLASMI UROGENITALI
1- USO CLINICO
SIR MYCOPLASMA è un reagente per l'antibiogramma dei micoplasmi
urogenitali: Ureaplasma spp (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma
parvum) e Mycoplasma hominis (Mh). Fino ad oggi, l'identificazione
differenziale di Ureaplasma urealyticum e U. parvum è sempre risultata
problematica.
SIR MYCOPLASMA è un kit costituito da una micropiastra contenente
8 antibiotici attivi contro questi microrganismi e comunemente utilizzati per
il trattamento delle infezioni genitali.
L'emergere di ceppi resistenti, in particolare agli antibiotici della famiglia
delle cicline e dei macrolidi (antibiotici di prima linea) (10, 11, 18), rende
l'antibiogramma assolutamente necessario per evitare terapie inefficaci.
L'utilizzo di un inoculo standard rende inoltre questa tecnica altamente
concordante con il metodo di riferimento (9).
2- PRINCIPIO
SIR MYCOPLASMA è un antibiogramma in terreno liquido in cui ogni
antibiotico è presente a due concentrazioni diverse (dossiciclina, tetraciclina,
azitromicina, josamicina, eritromicina, ofloxacina) o a concentrazione singola
(clindamicina, pristinamicina).
Il test è basato sull'inibizione metabolica.
La crescita dei micoplasmi viene misurata oggettivamente attraverso la loro
attività metabolica: l'idrolisi dell'urea in terreno di coltura U 9 mediante
Ureaplasma spp, e l'idrolisi dell'arginina in terreno di coltura contenente
arginina mediante Mh, con rilascio di ammoniaca, che rende il terreno alcalino
e l'indicatore di pH rosso fenolo nel terreno da giallo diventa rosso.
Se il microrganismo è sensibile all'antibiotico analizzato, il suo metabolismo
viene inibito e il terreno resta giallo.
Se il microrganismo è resistente, è in grado di crescere e il terreno diventa rosso.
3- PRESENTAZIONE
SIR MYCOPLASMA comprende:
• 10 micropiastre SIR (lo schema dei 16 pozzetti è riprodotto sull'etichetta
in modo da consentire l'identificazione del campione).
• 10 pellicole sigillanti adesive.
• 1 inserto nella confezione.
Ogni singola micropiastra è avvolta nell'alluminio con una pellicola
sigillante e un sacchetto di essiccante.
4- CONSERVAZIONE
Se conservato a una temperatura compresa fra + 2 e – 8°C, SIR
MYCOPLASMA può essere utilizzato fino alla data di scadenza riportata
sulla confezione.
46
5- MATERIALE NECESSARIO (NON FORNITO)
• Brodo U9: codice 62762 (confezione da 10 fiale di brodo U9 liofilizzato
Q.S.P. (Quadro Siero Proteico) 2 ml)
• Brodo arginina: codice 62763 (confezione da 10 fiale di brodo arginina
liofilizzato Q.S.P. (Quadro Siero Proteico) 2 ml)
• MYCOPLASMA DUO (scatola da 20 test – codice 62740)
• Acqua distillata sterile
• Pipette da 2 ml, 200 µl, 100 µl, 20 µl
• Incubatore a 37°C
• Contenitore per smaltimento rifiuti contaminati
6- PROCEDURA
A) MICROPIASTRA SIR
La micropiastra SIR è una microstrip con due file di 8 pozzetti sensibilizzati
con vari antibiotici. Gli antibiotici vengono reidratati quando l'inoculo viene
distribuito nei pozzetti per ottenere concentrazioni vicine alle
concentrazioni critiche, consentendo in tal modo l'analisi del profilo di
sensibilità dei ceppi testati e la classificazione di ciascun antibiotico come
sensibile, intermedio o resistente.
Controllo della crescita in assenza di antibiotico
Doxycycline (4 mg/L e 8 mg/L)
Tetracycline (4 mg/L e 8 mg/L)
Azithromycin (2 mg/L e 4 mg/L)
Josamycin (2 mg/L e 8 mg/L)
Erythromycin (1 mg/L e 4 mg/L)
Clindamycin (2 mg/L)
Pristinamycin (2 mg/L)
SMA
PLA
E1
MYCO
SIR
2
OFX
CM
1
OFX
4
PT
E
2
JM
4
AZM
2
JM
8
TE
2
AZM
4
DO
4
TE
8
Tc
4
DO
8
Tc
a spp
plasm
minis
Urea
a ho
lasm
Mycop
Ofloxacin (1 mg/L e 4 mg/L)
B) SCELTA DEGLI ANTIBIOTICI
La scelta degli antibiotici da analizzare è stata effettuata sulla base delle
prescrizioni terapeutiche consigliate per le infezioni neonatali e da micoplasmi
genitali (17). Ad oggi non è nota alcuna concentrazione critica specifica per i
micoplasmi; di conseguenza, le concentrazioni critiche scelte nel microarray
SIR MYCOPLASMA si basano su quelle pubblicate in numerose riviste
scientifiche e/o raccomandate da associazioni mediche come il CA–SFM
(Comité de l'Antibiogramme – Société Française de Microbiologie). La scelta
delle concentrazioni di azitromicina è basata su una valutazione derivante
dall'uso di ceppi clinici (19).
47
Test con le cicline: tetraciclina e dossiciclina (a concentrazioni di 4 e
8 mg/L).
I ceppi Mh e Ureaplasma spp., considerati resistenti alle tetracicline, vengono
identificati chiaramente da quando è stato reso noto che le Concentrazioni
Minime Inibitorie (MIC, Minimum Inhibitory Concentrations) erano ≥ 8 mg/L
rispetto a ≤ 2 mg/L per i ceppi sensibili (15, 18). Per questa classe di
antibiotici, esistono resistenze di basso livello che richiedono un tempo di
incubazione di 48 ore (19). Il tasso di resistenza alle cicline fra i ceppi varia a
seconda del paese e del livello di esposizione agli antibiotici (18).
Test con i macrolidi: eritromicina (a concentrazioni di 1 e 4 mg/L),
azitromicina (a concentrazioni di 2 e 4 mg/L), josamicina (a concentrazioni
di 2 e 8 mg/L).
I ceppi Mh sono naturalmente resistenti alla eritromicina e azitromicina. La
josamicina rimane attiva. Di conseguenza, i risultati ottenuti con questi
antibiotici dovrebbero confermare l'identificazione del ceppo
precedentemente ottenuto. La frequenza della resistenza acquisita ai
macrolidi fra i ceppi Mh e Ureaplasma spp isolati in clinica non è nota ma
probabilmente è particolarmente bassa (18).
Test con i lincosamidi: clindamicina (a una concentrazione di 2 mg/L).
I ceppi Ureaplasma spp sono naturalmente resistenti a questo antibiotico (18).
Test con la streptogramina: pristinamicina (a una concentrazione di
2 mg/L).
I ceppi di micoplasmi sono altamente sensibili a questo antibiotico.
Test con i fluoroquinoloni: ofloxacina (a concentrazioni di 1 e 4 mg/L).
Questa molecola è attiva sui ceppi Mh e Ureaplasma spp. La frequenza di
resistenza non è del tutto nota, ma è stata stimata a meno dell'1% per
Ureaplasma spp. (6, 18).
C) ESECUZIONE DELL'ANTIBIOGRAMMA
L'antibiogramma può essere realizzato a partire dal contenuto del
pozzetto X di MYCOPLASMA DUO (codice 62740).
Per la durata e la temperatura di conservazione dei campioni biologici,
consultare le raccomandazioni attualmente in uso (13).
1) Standardizzazione dell'inoculo
Per seminare l'antibiogramma con un inoculo contenente da 103 a 105 di
CCU/ml (CCU = Colour Changing Units), è necessario eseguire una precoltura
del terreno seminato con il campione.
La precoltura (eseguita conformemente ai protocolli descritti di seguito)
determina una crescita dei micoplasmi fino a un titolo massimo da 106 a 107
CCU/ml. Una diluizione in rapporto 1/100 di tale precoltura in brodo U9 o
arginina, a seconda delle specie isolate, produce un inoculo standard.
48
• Utilizzo di MYCOPLASMA DUO
Quando l'antibiogramma viene eseguito utilizzando MYCOPLASMA DUO,
il contenuto del pozzetto X a 24 o 48 ore di incubazione per Mh, e 24 ore
per Ureaplasma spp, corrisponde alla precoltura; successivamente, il
contenuto del pozzetto deve essere diluito in brodo U 9 o arginina
conformemente al protocollo descritto di seguito al fine di ottenere
l'inoculo standard.
1. Per Mycoplasma hominis
A partire dal pozzetto X (a 24 o 48 ore di incubazione), effettuare una
diluizione in rapporto 1/100 in brodo di arginina (20 µl del contenuto del
pozzetto X in 2 ml di brodo di arginina).
2. Per Ureaplasma spp
• Dopo 24 ore di incubazione: effettuare una diluizione in rapporto 1/100
del contenuto del pozzetto X in brodo U9 (20 µl del contenuto del
pozzetto X in 2 ml di brodo U9).
• Dopo 48 ore di incubazione: in questo caso, non è possibile utilizzare il
contenuto dal pozzetto X poiché c'è il rischio che l'Ureaplasma possa aver
subito autolisi. Effettuare una diluizione in rapporto 1/10 del terreno di
sospensione di trasporto conservato a + 4°C (200 µl in 2 ml di brodo U9).
• A partire dal brodo di coltura arricchito di micoplasmi
Il campione urogenitale può essere messo in terreni di coltura specifici per
micoplasmi (15). Se si è in attesa di identificazione o dei risultati di conta,
l'antibiogramma può essere eseguito in un secondo momento e il terreno
può essere conservato a +4°C (cfr. l'inserto del prodotto del terreno di
coltura utilizzato). Successivamente, si consiglia l'incubazione del terreno
di coltura a 37°C per 16 ore al fine di ottenere un inoculo arricchito di
micoplasmi. Il titolo generalmente ottenuto è compreso fra 10 6 e 10 7
CCU/ml. Conformemente alle raccomandazioni pubblicate (15), la
realizzazione dell'antibiogramma suggerisce di utilizzare un inoculo
standard. Di conseguenza, 20 µL del terreno di coltura arricchito vengono
diluiti in 2 ml di brodo U 9 o arginina (diluizione in rapporto 1/100), a
seconda dell'identificazione del ceppo di micoplasmi.
2) Aliquotazione dell'inoculo standard
100 µl di inoculo standard (diluizione in rapporto 1/100 di precoltura, in brodo
U9 o arginina) vengono aliquotati in ogni pozzetto della micropiastra SIR.
Ricoprire la micropiastra con pellicola sigillante e incubare a 37°C per 48 ore.
49
50
SIR MYCOPLASMA
Antibiogramma
dell’ Ureaplasma spp
Antibiogramma
del M.hominis
Distribuire
100 µl/Pozzetto
U9
2 ml
U9 Brodo
20 µl
Incubazione
dopo 24 h
SIR MYCOPLASMA
ARGININE
2 ml
Brodo Arginina
20 µl
å
MYCOPLASMA DUO
Pozzetto x
Incubazione dopo
24 h o 48 h
O
Antibiogramma
del M.hominis
U9
2 ml
U9 Brodo
20 µl
Antibiogramma
dell’ Ureaplasma spp
SIR MYCOPLASMA
Distribuire
100 µl/Pozzetto
SIR MYCOPLASMA
ARGININE
2 ml
Brodo Arginina
20 µl
MEZZO DI COLTURA ARRICCHITO
CON MICOPLASMI
ç
O
SIR MYCOPLASMA
Antibiogramma
dell’ Ureaplasma spp
Antibiogramma
del M.hominis
Distribuire
100 µl/Pozzetto
U9
2 ml
U9 Brodo
200 µl
SIR MYCOPLASMA
ARGININE
2 ml
Brodo Arginina
200 µl
MEZZO DI SOSPENSIONE
Trasporto - conservato a + 4°C
é
D) CAMPIONI CONTENENTI Ureaplasma spp e Mh
In questo caso, seminare 2 micropiastre SIR: una con l'inoculo standard
ottenuto mediante diluizione in brodo U9 (antibiogramma per il ceppo
Ureaplasma spp), e l'altro con l'inoculo standard ottenuto mediante
diluizione in brodo arginina (antibiogramma per il ceppo Mh).
7- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
L'antibiogramma può essere letto non appena i pozzetti di controllo della
crescita da gialli diventano rossi.
Una prima lettura viene effettuata dopo 24 ore e la successiva dopo
48 ore. La lettura a 48 ore consente l'individuazione delle resistenze di
basso livello alle cicline (19) e la conferma dei risultati quando l'inoculo
iniziale si rivela basso (103 CCU/ml) o quando il cambiamento di colore era
dubbio dopo 24 ore.
2 pozzetti gialli:
Assenza di crescita
Ceppo Sensibile
2 pozzetti rossi:
Crescita in presenza di antibiotico
Ceppo Resistente
Pozzetto con una bassa concentrazione di
antibiotico: rosso. Pozzetto con un'elevata
concentrazione di antibiotico: giallo
Ceppo Intermedio
Per la clindamicina e la pristinamicina (concentrazione singola), sono
possibili solo 2 risultati: sensibile o resistente.
Esempio:
JM
2
JM
8
giallo / giallo:
S
Ceppo Sensibile
TE
4
TE
8
rosso / giallo:
I
Ceppo Intermedio
AZM2
AZM4
rosso / rosso:
R
Ceppo Resistente
Caso particolare: se si osserva un colore arancione.
Si potrebbe osservare l'inizio di un cambiamento da giallo a rosso,
risultante in un colore arancione nei pozzetti a bassa concentrazione. Ciò
deve essere interpretato come positivo e dopo 48 ore sarà visibile un
cambiamento di colore netto.
51
8- CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORE
Tutti i prodotti fabbricati e commercializzati da Bio–Rad sono sottoposti
ad un sistema di assicurazione qualità dal ricevimento delle materie
prime fino alla commercializzazione dei prodotti finiti.
Ciascun lotto di prodotto finito è soggetto a un controllo di qualità e
viene messo in commercio soltanto se risulta conforme ai criteri di
approvazione.
Tutta la documentazione relativa alla produzione e al controllo di
ciascun lotto è conservata negli archivi della nostra società.
9- CONTROLLO DI QUALITÀ INTERNO
Il controllo di qualità può essere eseguito utilizzando un ceppo da un
prelievo liofilizzato (Ureaplasma parvum ATCC 700970). Rimettere in
sospensione il ceppo liofilizzato in 1 ml di terreno U9 appena ricostituito
(riferimento 62762). Effettuare una diluizione in rapporto 1/10 in terreno U9
appena ricostituito.
Incubare il terreno U9 seminato per 18 ore a 37°C in atmosfera aerobica.
A partire da questo terreno U9 arricchito con Ureaplasma, effettuare una
diluizione in rapporto 1/100 (prendere un'aliquota di terreno da 20 µl e
aggiungere 2 ml di brodo U9 ricostituito).
L'inseminazione del microarray SIR MYCOPLASMA viene eseguita
conformemente al protocollo abituale, ad esempio, effettuando
un'aliquotazione di 100 µl in ogni pozzetto. Ricoprire il microarray con
pellicola sigillante e incubare a 37°C per 48 ore. Il microarray può essere
letto se i pozzetti di controllo della crescita da gialli sono diventati rossi.
Il profilo previsto è il seguente:
Controll Controll DO
o della o della 4– 8
crescita crescita mg/L
+
+
S
TE
4– 8
mg/L
JM
2– 8
mg/L
AZM
2– 4
mg/L
E
1– 4
mg/L
CM
2
mg/L
PT
2
mg/L
OFX
1– 4
mg/L
S
S
S
S/I
R
S
S/I
10- EFFICACIA
La scelta degli antibiotici analizzati mediante SIR MYCOPLASMA è stata
maturata in funzione dei trattamenti terapeutici, l'antibiogramma SIR
MYCOPLASMA è stato rivalutato in vista dei trattamenti modificati.
Nel caso delle due valutazioni descritte di seguito, il metodo di riferimento
utilizzato è stato quello delle Concentrazioni Minime Inibitorie in terreno
liquido (MIC) (6, 15).
52
La prima valutazione (senza pozzetti di azitromicina) è stata eseguita su
80 ceppi di cui 60 di Ureaplasma spp e 20 di Mycoplasma hominis (9).
Con ceppi Ureaplasma spp:
Per le tetracicline, le percentuali di concordanza erano comprese fra il 90%
[79,5 - 96,2%]a e il 95% [86,1 - 99%]a a seconda dell'antibiotico.
Per i macrolidi, le percentuali di concordanza erano comprese fra il 92% [81,6
- 97,3%]a e il 100% [95,1 - 100%]a a seconda dell'antibiotico.
Per la clindamicina, la percentuale di concordanza era dell'85% [73,4 92,9%]a.
Per la pristinamicina, la percentuale di concordanza era del 100% [95,1 100%]a.
Per i fluoroquinoloni, la percentuale di concordanza era del 93% [83,8 98,2%]a.
Con ceppi Mycoplasma hominis:
La percentuale di concordanza è dell'85% [62,1 - 96,8%]a per la tetraciclina e
del 100% [86,1 - 100%]a per tutti gli altri antibiotici.
La concordanza totale per tutti gli antibiotici menzionati in precedenza è del
94,6% [92,4 - 96,4%]a con una discordanza massima del 2,6%. Nessun ceppo
resistente al metodo di riferimento è stato rilevato sensibile con il microarray
SIR MYCOPLASMA (nessuna discordanza elevata).
La seconda valutazione è stata effettuata in seguito alla sostituzione della
minociclina con l'azitromicina a concentrazioni di 2 e 4 mg/mL.
Uno studio comparativo è stato condotto fra il metodo per la determinazione
delle MIC in terreno liquido e il microarray SIR MYCOPLASMA per i pozzetti di
azitromicina. I ceppi testati sono ceppi di riferimento e ceppi clinici wild-type.
Ogni inoculo è stato standardizzato e confermato entro limiti accettabili
raccomandati, ad esempio, 104 e 105 CCU/ml (15). I risultati dei due metodi
sono stati interpretati come Sensibili (S), Intermedi (I) o Resistenti (R) per le
varie concentrazioni nel microarray.
Per 15 ceppi di micoplasmi di riferimento (13 ceppi ATCC Ureaplasma spp e
2 ceppi ATCC Mycoplasma hominis), la percentuale di concordanza per la
classificazione clinica S o R è stata del 100% [81,9 - 100%]a. Tutti i ceppi
Ureaplasma spp avevano un profilo sensibile e i due ceppi Mycoplasma
hominis avevano un profilo resistente che corrisponde alla resistenza naturale
di questa specie.
Per 15 isolati clinici di Ureaplasma spp, la concordanza è stata del 100% [81,9
- 100%] a fra la classificazione clinica consentita dal microarray SIR
MYCOPLASMA e quella ottenuta con le MIC di riferimento.
a
: [CI 95%] = intervallo di confidenza 95%.
53
11- LIMITI DEL TEST
Se il terreno diventa rosso e torbido, indica la crescita di batteri diversi dai
micoplasmi (la crescita di questi ultimi non altera infatti la limpidità del terreno).
Questo fenomeno può essere osservato nel brodo di coltura U9 e arginina se
sono stati incubati a 37°C. La presenza di altri batteri potrebbe essere
confermata sull'agar cioccolato.
L'interpretazione finale dei risultati, come per l'interpretazione di ogni risultato
biologico, non può essere eseguita sulla base di un singolo test, ma deve
essere basata sui dati clinici e risultati biochimici, citologici e immunologici.
Se l'inoculo utilizzato per seminare il microarray SIR MYCOPLASMA è basso
(<103 CCU/ml), l'alterazione del colore nei pozzetti potrebbe essere inaffidabile.
Qualora il risultato dovesse apparire anomalo, si raccomanda di ripetere
l'inoculo standard e l'antibiogramma utilizzando un microarray SIR
MYCOPLASMA.
Se, per un determinato antibiotico, il pozzetto con la massima concentrazione
è rosso e quello con la concentrazione minima rimane giallo, il risultato non
può essere utilizzato. Si raccomanda di eseguire un altro antibiogramma a
partire da un nuovo inoculo standard.
I macrolidi, in particolare l'eritromicina, sono noti per essere sensibili al pH (14).
Effettivamente, è possibile osservare un'alterazione del colore nel pozzetto a
bassa concentrazione che comporta un risultato intermedio dovuto a un
effetto del pH piuttosto che a un'attività antibiotica.
Questa alterazione del colore può essere osservata anche con i pozzetti di
azitromicina.
12- REFERENCES
1. BEBEAR C. Activité comparée de la minocycline et doxycycline sur les mycoplasmes pathogènes pour l'homme.
Pathol. Bio., 1985,33, 577-580.
2. CANTET P et BEBEAR C. Activité comparée in vitro de sept quinolones sur Ureaplasma urealyticum. Pathol. Bio.
1983, 31, 501-503.
3. DAVIS J.W. Antimicrobial susceptiblity of Ureaplasma urealyticum. J. Clin. Microb., 1981, 13, 320-325.
4. EVANS R.T and TAYLOR ROBINSON D. The incidence of tetracycline resistant strains of Ureaplasma urealyticum. J.
Antimicrob. Chemother, 1978 , 4, 57-63.
5. ROBERT M.C. Dissemination of the Tet-M Tetracycline resistance determinant to Ureaplasma urealyticum.
Antimicrob. Agents Chemother, 1986, 29, 350-352.
6. ROBERTSON J.A. Standardized Method for determining antimicrobial susceptibility of strains of Ureaplasma
urealyticum and their response to tetracycline, erythromycin and rosaramincin. Antimicrob. Agents Chemother, 1981,
20, 50-58.
7. TAYLOR-ROBINSON D. Clinical antibiotic resistances of Ureaplasma urealyticum. Pediatr. Infec. Dis., 1986, 5, 335337.
8. SOBETZKO R., HARTMANN A.A., ELSNER P. Susceptibility of Ureaplasma urealyticum to ten chemotherapeutic
Agents. Zbl.Bakt. Hyg. 1988, A269, 245-250.
9. RENAUDIN H., BEBEAR C. Evaluation des systèmes Mycoplasma Plus et SIR Mycoplasma pour la détection
quantitative et l'étude de la sensibilité aux antibiotiques des mycoplasmes génitaux. Path.Biol., 1990, 38, n°5, 431435.
10. CUMMINGS M.C., Mc CORMACK W.M. Increase in resistance of Mycoplasma hominis to tetracyclines. Antimicrob.
Agents Chemother. 1990, 34, 2297-2299.
11. BAURIAUD R., SEROR C.,LARENG M.B., LEFEVRE J.C. Sensibilité in vitro aux antibiotiques des mycoplasmes
génitaux isolés à Toulouse. Etude de nouvelles molécules (macrolides et quinolones).Path. Biol. 1992, 40, n°5, 479482.
12. WAITES K., DUFFY L., HAMRICK W., CROUSE D., CASSEL G. Microbiologic efficacy of intravenous erythromycin
against Ureaplasma urealyticum in the lower respiratory tract of preterm neonates. 10th International IOM congress –
Bordeaux July 19-26th 1994 - Poster n°163.
13. BEBEAR C.M., RENAUDIN H., CHARRON A., CLERC M., PEREYRE S., BEBEAR C. 2003. DNA gyrase and
topoisomerase IV mutations in clinical isolates of Ureaplasma spp. and Mycoplasma hominis resistant to
fluoroquinolones. Antimicrob. Agents Chemother. 47:3323-3325.
14. KENNY G. E, CARTWRIGHT F.D. 1993. Effect of pH, Inoculum size, and Incubation time on the susceptibility of
Ureaplasma urealyticum to Eryhtromycin in vitro. Clin. Infect. Dis.; 17 (Suppl 1).
15. WAITES K.B., BEBEAR C.M., ROBERTSON J.A., TALKINGTON D. F., KENNY G. E.
Laboratory Diagnosis of Mycoplasmal Infections. Cumitech 34.
st
16. Basic laboratory procedures in clinical bacteriology. Geneva : World Health Organization (WHO), 1991, 1 edition.
17. Sexually transmitted diseases treatment guidelines. MMWR. 2002. May 10, 2002 / 51 / No-RR6.
18. BEBEAR C.M. 2006. L’antibiogramme. Chap. 43.. Paris : Eska Editor, 1 st edition.
19. BEBEAR C.M., RENAUDIN H. 2007. Evaluation de la galerie SIR Mycoplasma incluant l’azithromycine.
55
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette France
Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00
Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33
06/2007
code: 880095