biologia cellulare e biotecnologie vegetali

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BIOLOGIA CELLULARE
E
BIOTECNOLOGIE VEGETALI
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Dello stesso Editore:
ARIENTI – Le basi molecolari della nutrizione
BARNES/HUGHES – Ecologia marina
BATCHELET – Matematica per biologi
BELLI – Patologia vegetale
BREWER – Principi di ecologia
BROWN – Genetica molecolare
BRUNI/NICOLETTI – Dizionario di erboristeria e di fitoterapia
CABRAS/MARTELLI – Chimica degli alimenti
CASTINO/ROLETTO – Statistica applicata
CHIARELLI – Dalla Natura alla Cultura: Principi di
antropologia biologica e culturale
CHRISPEELS/SADAVA – Biologia vegetale applicata
CONNER/HARTL – Elementi di genetica ecologica
COOPER/HAUSMAN – La cellula: un approccio molecolare
COZZANI/DAINESE – Biochimica degli alimenti
e della nutrizione
CROMER – Fisica per medicina, farmacia e scienze biologiche
D’ALESCIO – Il laboratorio di chimica organica
DE CICCO/BERTOLINI/SALERNO – Patologia post-raccolta
dei prodotti vegetali
DEL GOBBO – Immunologia
DEWICK – Chimica, biosintesi e bioattività delle sostanze
naturali
D’ISCHIA – La chimica organica in laboratorio
DOLARA – Tossicologia generale e ambientale
DURANTI/PAGANI – Enzimologia
EVANGELISTI/RESTANI – Prodotti dietetici
FANTONI/BOZZARO/DEL SAL/FERRARI/TRIPODI – Biologia
cellulare e Genetica
FESSENDEN/FESSENDEN – Chimica organica
FINESCHI – Catalogo tassonomico delle rose del Roseto
botanico “Carla Fineschi”
FOYE’S – Principi di chimica farmaceutica
FRANCHINI/CALZOLARI – L’educazione alimentare nell’età
evolutiva
FREEMAN – Atlante di anatomia degli invertebrati
FREIFELDER – Biologia molecolare: l’essenziale
FREUND/WILSON – Metodi statistici
GALLI/CORSINI/MARINOVICH – Tossicologia
GALZIGNA – Elementi di enzimologia
GARRETT/GRISHAM – Principi di biochimica
GASTALDO – Compendio della flora officinale italiana
GIGLIOTTI/VERGA – Biotecnologie alimentari
GIUDICE/AUGUSTI-TOCCO/CAMPANELLA – Biologia
dello sviluppo
GIUNCHEDI/CONTI/GALLITELLI/MARTELLI – Elementi
di virologia vegetale
GRASSI/LABRA/SALA – Introduzione alla biodiversità
del mondo vegetale
HARRISON – Biologia umana
HOGNESS – Analisi qualitativa
JANEWAY/TRAVERS/WALPORT/SHLOMCHIK – Immunobiologia
JAWETZ/MELNICK/ADELBERG – Microbiologia medica
JUDD et al.– Botanica sistematica + CD
JUNQUEIRA/CARNEIRO – Istologia
KEISLER – Elementi di analisi matematica
KOLTHOFF – Clinica analitica quantitativa
LEPORATTI/FODDAI/TOMASSINI – Testo-atlante di anatomia
vegetale e delle piante officinali
MADER – Biologia l’essenziale
MAFFEI – Biochimica vegetale
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MARZONA – Chimica delle fermentazioni e microbiologia
industriale
MASTERTON/HURLEY – Chimica: Principi e reazioni
MAUGINI/MALECI BINI/MARIOTTI LIPPI – Manuale di botanica
farmaceutica
MCKNIGHT/HESS – Geografia fisica
MCMURRY – Chimica organica
MCNEILL/ALEXANDER – Gli invertebrati
MEZZOGIORNO/MEZZOGIORNO – Compendio di anatomia
umana
MICHELIN LAUSAROT/VAGLIO – Stechiometria per chimica
generale
MILLER – Ambiente, Risorse, Sostenibilità
MINELLI/DEL GRANDE – Anatomia comparata dei vertebrati
MITA/FEROCI – Fisica biomedica
MONESI – Istologia
NIELSEN/FORLANI – Gli erbicidi
ODUM – Fondamenti di ecologia
PAGANI/ABBOTTO – Chimica eterociclica
PASQUA/ABBATE/FORNI – Botanica generale e diversità
vegetale
PETRUCCI/HARWOOD/HERRING – Chimica generale
PILATO – Guida pratica per il riconoscimento dei gruppi
animali
PIPKIN – Geologia ambientale
QUADERNI DI BIOCHIMICA
QUADERNI DI BIOLOGIA VEGETALE
Serie Verde:
SALA/CELLA – Colture di cellule vegetali
LOVISOLO et al. – Le infezioni da virus nelle piante
BENNICI – Lo sviluppo nei vegetali superiori
RIGANO – Ciclo biologico dell’azoto
GAVAZZI/SALAMINI – Mutagenesi e miglioramento delle
piante coltivate
BALDACCI – La diagnosi delle malattie delle piante
ALPI et al. – Ormoni delle piante e fitoregolatori sintetici
BONFANTE/GIOVANNETTI – Le micorizze
VERONA – Unità biologiche individuali come biocenosi
NUTI – La fissazione biologica dell’azoto
GAVAZZI – La genetica dei pigmenti nelle piante
PACINI/FRANCHI – Il polline: biologia e applicazioni
RANALLI – Miglioramento della patata
NIELSEN/FORLANI – Gli erbicidi
RAVEN/JOHNSON/MASON/LOSOS/SINGER – Biologia
RHOADES/PFLANZER – Fisiologia generale e umana
RIGHETTO – L’ecosistema urbano
RINALLO – Botanica delle piante alimentari
ROHEN/YOCOCHI/LÜTJEN-DRECOLL – Atlante a colori
di anatomia umana descrittiva e topografica
RUPPERT/BARNES – Zoologia: gli invertebrati
SAVELLI/BRUNO – Analisi chimico farmaceutica
SENATORE – Biologia e botanica farmaceutica
SICA/ZOLLO – Chimica dei composti eterociclici
farmacologicamente attivi
SILIPRANDI/TETTAMANTI – Biochimica medica
SLOWINSKI – Laboratorio di chimica
TAIZ/ZIEGER – Fisiologia vegetale
WHITTEN/DAVIS/PECK/STANLEY – Chimica generale
WILSON/BOSSERT – Introduzione alla biologia
delle popolazioni
ZIEGLER – Conoscenze attuali in nutrizione
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GABRIELLA PASQUA
BIOLOGIA CELLULARE
E
BIOTECNOLOGIE VEGETALI
AUTORI
S. COZZOLINO, G.P. DI SANSEBASTIANO, C. FORNI,
A. GENRE, L. LANFRANCO, A. MICCHELI, G. PASQUA,
L. TRAINOTTI, A. VALLETTA
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Tutti i diritti sono riservati
È VIETATA PER LEGGE LA RIPRODUZIONE
IN FOTOCOPIA
E IN QUALSIASI ALTRA FORMA
È vietato riprodurre, archiviare in un sistema
di riproduzione o trasmettere sotto qualsiasi forma
o con qualsiasi mezzo elettronico, meccanico,
per fotocopia, registrazione o altro, qualsiasi parte
di questa pubblicazione senza autorizzazione scritta
dell’Editore. Ogni violazione sarà perseguita secondo
le leggi civili e penali.
ISBN 978-88-299-2124-9
Stampato in Italia
© 2011, by Piccin Nuova Libraria S.p.A., Padova
www.piccin.it
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AUTORI
Prof. Salvatore Cozzolino
Dipartimento di Biologia Strutturale
e Funzionale
Complesso Universitario di Monte S. Angelo
Università di Napoli “Federico II”
Dr. Gian Pietro Di Sansebastiano
Dipartimento di Scienze e Tecnologie
Biologiche e Ambientali
Università del Salento
Prof.ssa Luisa Lanfranco
Dipartimento di Biologia Vegetale
Università di Torino
Dr. Alfredo Miccheli
Dipartimento di Chimica
Università di Roma “Sapienza”
Prof.ssa Gabriella Pasqua
Dipartimento di Biologia Ambientale
Prof.ssa Cinzia Forni
Dipartimento di Biologia
Università di Roma “Tor Vergata”
Prof. Livio Trainotti
Dipartimento di Biologia
Università di Padova
Dr. Andrea Genre
Dipartimento di Biologia Vegetale
Università di Torino
Dr. Alessio Valletta
Dipartimento di Biologia Ambientale
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PREFAZIONE
Il testo si propone di approfondire lo studio
dell’organizzazione strutturale e funzionale della
cellula vegetale, di cui sono state poste le basi nel
corso di Botanica Generale e di illustrare le potenzialità biotecnologiche di cellule, tessuti ed organismi vegetali. Il testo è stato scritto grazie all’esperienza degli autori stessi nei campi della Biologia
Cellulare, della Biochimica e delle Biotecnologie
Vegetali e sulla base delle più recenti acquisizioni
pubblicate su riviste internazionali e monografie di
rilievo.
Il testo è rivolto principalmente agli studenti dei
corsi di laurea in Biologia, Biotecnologie ed Agraria ed i contenuti sono stati pensati per rispondere alle esigenze dei nuovi ordinamenti didattici;
non solo per fornire gli strumenti utili a superare
gli esami, ma anche per stimolare la curiosità in
campi in rapida e costante evoluzione. Alla fine di
ogni capitolo sono state indicate alcune letture di
approfondimento che si possono trovare facilmente
nel web ed ogni docente che adotterà questo testo
potrà stimolare gli studenti a cercare nuovi articoli
per restare aggiornati.
Il libro è diviso in quattro parti: la prima e la
seconda trattano della Biologia Cellulare Vegetale
che, grazie all’apporto di nuove tecnologie ed anche alla luce di tutte le nuove conoscenze derivanti
dalle scienze “omiche”, ha fatto passi da gigante.
Questo ha contribuito ad una migliore comprensione dei processi biologici, con una visione integrata
dell’organismo, come un sistema complesso, portan-
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do alla nascita della “Biologia dei Sistemi”. Inoltre
lo studio delle cellule staminali in campo animale
ha fatto emergere grande attenzione e prospettive
anche in campo vegetale, precedentemente relegato
a pochi specialisti. Nella terza e quarta parte vengono descritti i principali sistemi sperimentali e le
tecniche di studio della biologia cellulare, classiche e innovative, con l’obiettivo di far comprendere
le profonde e molteplici connessioni tra ricerca di
base ed applicata.
La realizzazione di questo testo si deve ad un
gruppo di giovani docenti e ricercatori della Biologia Vegetale italiana, altamente considerati nel
mondo scientifico internazionale, con i quali ho
avuto il piacere di collaborare perché entusiasti del
loro lavoro, e che hanno trattato i diversi argomenti, spesso complessi, in modo esauriente ed aggiornato.
Il testo è corredato di un’ampia iconografia a
colori con immagini e schemi originali che, grazie anche al prezioso aiuto dell’illustratore Marco
Marzola, possono rendere lo studio più attraente.
Vorrei rivolgere un grazie particolare all’Editore Dr. Massimo Piccin che mi ha stimolato a scrivere questo testo, dopo il successo che ha riscosso nei
diversi atenei italiani il libro di Botanica Generale
e Diversità Vegetale, mettendomi a disposizione il
suo prezioso staff che ha collaborato con grande
competenza e pazienza.
GABRIELLA PASQUA
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INDICE GENERALE
PARTE PRIMA
LA CELLULA VEGETALE
1 • Lo studio della cellula vegetale . . . . . . . 3
A. Genre, G.P. Di Sansebastiano
1.1 La cellula vegetale come massima
espressione della complessità degli eucarioti. . 3
1.1.1 Dinamicità della cellula vegetale . . . . . . . . . 4
1.2 Mitocondri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3 Microcorpi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.4 La biologia della cellula vegetale come
modello per la comprensione della cellula
umana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.4.1 Segnali legati alla luce e ciclo circadiano. . . 10
1.4.2 Immunità innata e recettori intracellulari . . 11
1.4.3 Proteine Argonauta e silenziamento genico. . 11
1.4.4 Scoperta di nuovi meccanismi molecolari
e nuove potenzialità sperimentali. . . . . . . . . . 11
Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2 • Il nucleo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
S. Cozzolino
2.1 Organizzazione generale del nucleo
e del DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.1.1 Involucro nucleare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.1.2 Scambi nucleo-citoplasma . . . . . . . . . . . . . 14
2.1.3 DNA e cromosomi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.4 Proteine istoniche e non istoniche . . . . . . . 17
2.1.5 Controllo epigenetico della trascrizione:
l’imprinting genomico . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.2 Il ciclo cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2.1 Ciclo cellulare mitotico. . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2.2 Regolazione del ciclo cellulare . . . . . . . . . . 20
2.2.3 Divisione cellulare: mitosi e meiosi . . . . . . 21
3 • Il genoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
L. Lanfranco
3.1 Il genoma nucleare. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.1.1 Progetti genoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
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3.2 Il DNA mitocondriale: origine ed evoluzione,
organizzazione e contenuto . . . . . . . . . . . . . . 30
3.2.1 Ricombinazione ed eteroplasmia . . . . . . . . 33
3.2.2 Sterilità maschile citoplasmatica . . . . . . . . 34
3.3 Il DNA plastidiale: origine ed evoluzione,
organizzazione e contenuto . . . . . . . . . . . . . . 35
3.4 Il trasferimento di DNA dagli organelli
al nucleo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.5 L’espressione genica negli organelli . . . . . . . 40
4 • Il sistema di endomembrane . . . . . . . 43
G.P. Di Sansebastiano
4.1 Il Reticolo Endoplasmico . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.1.1 Reticolo Endoplasmico Rugoso . . . . . . . . . 46
4.1.2 Traslocazione e maturazione
delle proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.1.3 Reticolo Endoplasmico Liscio. . . . . . . . . . . 47
4.1.4 Altri domini funzionali del reticolo
endoplasmico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.2 L’apparato di Golgi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.2.1 Matrice del Golgi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.2.2 Funzioni dell’apparato di Golgi . . . . . . . . . 50
4.3 Il Trans Golgi Network e l’endocitosi . . . . . . 51
4.4 Esocitosi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.5 Maturazione delle membrane attraverso
variazioni della loro composizione lipidica
e proteica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.6 Trasporto vescicolare . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.7 Determinanti della specificità nel traffico
vescicolare: SNARE e Rab. . . . . . . . . . . . . . . 55
5 • I vacuoli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
G.P. Di Sansebastiano, C. Forni
5.1 Biogenesi dei vacuoli e organizzazione
del complesso vacuolare. . . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.2 Il succo vacuolare. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
5.2.1 Meccanismi di accumulo dei flavonoidi
nei vacuoli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
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X
5.3 Proteine intrinseche del tonoplasto . . . . . . . . 64
5.4 Acidificazione dei compartimenti
endomembranosi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
5.5 Crescita per distensione, turgore
e movimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
5.6 Accumulo e degradazione delle proteine . . . . 66
5.6.1 Trasporto delle proteine solubili
verso i vacuoli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
5.6.2 VSD sequenza specifici e loro recettori. . . . 67
5.6.3 VSD C-terminali e i loro recettori. . . . . . . . 67
5.6.4 VSD influenzati dalla struttura fisica
della proteina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
5.6.5 Compartimento pre-vacuolare . . . . . . . . . . 69
5.6.6 Trasporto alternativo al vacuolo . . . . . . . . 69
5.7 Potenziale biotecnologico . . . . . . . . . . . . . . . 69
Letture di approfondimento
e fonti delle illustrazioni. . . . . . . . . . . . . . . . . 70
6 • Il citoscheletro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
A. Genre
6.1 Le componenti del citoscheletro . . . . . . . . . . 71
6.1.1 Microtubuli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
6.1.2 Microfilamenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
6.1.3 Filamenti intermedi . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
6.1.4 Proteine associate al citoscheletro . . . . . . . 78
6.2 Il citoscheletro nel differenziamento
cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
6.2.1 Il citoscheletro durante
il ciclo mitotico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
6.3 La regolazione del citoscheletro . . . . . . . . . . 85
6.4 Il citoscheletro nelle interazioni
tra piante e microrganismi . . . . . . . . . . . . . . . 86
7 • La parete cellulare. . . . . . . . . . . . . . . . 89
L. Trainotti
7.1 I polimeri della parete . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
7.1.1 Cellulosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
7.1.2 Emicellulose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
7.1.3 Pectine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
7.1.4 Proteine strutturali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
7.1.5 Lignina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
7.1.6 Acqua e altre molecole . . . . . . . . . . . . . . . . 97
7.2 La biosintesi dei polimeri di parete . . . . . . . . 98
7.2.1 Biosintesi della cellulosa . . . . . . . . . . . . . . 98
7.2.2 Biosintesi dei polimeri di matrice . . . . . . . 100
7.2.3 Biosintesi della lignina
e degli altri composti fenolici. . . . . . . . . . . . 102
7.2.4 Assemblaggio dei componenti
della parete. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
7.3 La struttura della parete . . . . . . . . . . . . . . . . 103
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INDICE GENERALE
7.3.1 Lamella mediana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
7.3.2 Parete primaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
7.3.3 Parete secondaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
7.4 Ruolo della parete nella crescita
e nel differenziamento cellulare . . . . . . . . . . 104
7.4.1 Divisione ed espansione cellulare
e loro controllo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
7.4.2 Modificazioni della parete
nel differenziamento cellulare . . . . . . . . . . . 107
7.4.3 Separazione cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . 109
7.4.4 Plasmodesmi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
7.5 Le funzioni della parete . . . . . . . . . . . . . . . . 111
7.5.1 Trasporto apoplastico
e simplastico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
e fonti delle illustrazioni. . . . . . . . . . . . . . . . 113
8 • I plastidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
G. Pasqua
8.1 Proplastidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
8.2 Biogenesi e differenziamento
dei plastidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
8.2.1 Divisione dei plastidi . . . . . . . . . . . . . . . . 117
8.2.2 Stromuli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
8.3 Morfologia, struttura e funzione
dei differenti tipi di plastidi . . . . . . . . . . . . . 119
8.3.1 Cloroplasti e pigmenti fotosintetici. . . . . . 119
8.3.2 Interazioni tra DNA nucleare
e plastidiale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
8.3.3 Cromoplasti. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
8.3.4 Ezioplasti. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
8.3.5 Leucoplasti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
8.3.6 Gerontoplasti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
8.4 Origine evolutiva dei plastidi . . . . . . . . . . . . 129
9 • La comunicazione cellulare. . . . . . . . 131
A. Genre, L. Lanfranco
9.1 I recettori di membrana . . . . . . . . . . . . . . . . 131
9.2 La segnalazione mediata da endosomi. . . . . 135
9.2.1 Endocitosi dei recettori
di membrana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
9.2.2 Endosomi come piattaforme
citoplasmatiche di segnalazione. . . . . . . . . . 136
9.3 Le MAP chinasi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
9.4 Il ruolo del calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
9.4.1 Generazione del segnale . . . . . . . . . . . . . . 140
9.4.2 Decodifica del segnale . . . . . . . . . . . . . . . 141
Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 143
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XI
INDICE GENERALE
PARTE SECONDA
CRESCITA E DIFFERENZIAMENTO
10 • Crescita e diﬀerenziamento
cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
G. Pasqua, C. Forni
10.1 Totipotenza delle cellule vegetali. . . . . . . . 147
10.2 Crescita per divisione e per distensione. . . 152
10.3 Cellule meristematiche e cellule adulte . . . 153
10.4 Controllo del destino cellulare . . . . . . . . . . 155
10.4.1 RNA, proteine che si legano al RNA
e regolazione dell’espressione genica . . . . . 156
10.4.2 Ruolo dei ribosomi nello sviluppo . . . . . 160
11 • Morte cellulare programmata
e necrosi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
G. Pasqua
11.1 Morte cellulare programmata (apoptosi) e
necrosi nei diversi organismi (animali, piante,
batteri) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
11.2 Morte cellulare nelle piante: meccanismi
di attivazione, geni coinvolti e modelli
di studio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
11.3 Morte cellulare programmata nei processi
di sviluppo vegetativi e riproduttivi . . . . . . . 167
11.4 Morte cellulare programmata nel
differenziamento degli elementi vascolari
xilematici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
11.5 Morte cellulare programmata in risposta
ai patogeni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170
11.6 Senescenza e abscissione . . . . . . . . . . . . . . 170
PARTE TERZA
TECNICHE CELLULARI E MOLECOLARI
12 • Microscopia ottica. . . . . . . . . . . . . . 175
A. Valletta
12.1 Il microscopio ottico composto . . . . . . . . . 176
12.1.1 Percorso della luce . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
12.1.2 Ingrandimento e potere di risoluzione . . 177
12.1.3 Obiettivi a secco e ad immersione . . . . . 178
12.1.4 Profondità di campo . . . . . . . . . . . . . . . . 179
12.1.5 Contrasto. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
12.2 Preparazione del campione per il MO . . . . 180
12.2.1 Prelievo e fissazione . . . . . . . . . . . . . . . . 180
cap00.indd XI
12.2.2 Disidratazione, diafanizzazione,
infiltrazione ed inclusione . . . . . . . . . . . . . . 181
12.2.3 Taglio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182
12.2.4 Colorazione. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184
12.3 Microscopio stereoscopico. . . . . . . . . . . . . 184
13 • Microscopia a fluorescenza . . . . . . 187
A. Genre
13.1 La fluorescenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187
13.2 I fluorocromi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188
13.2.1 Proteine fluorescenti . . . . . . . . . . . . . . . . 189
13.3 Il microscopio ottico a epifluorescenza . . . 192
13.4 Preparazione del campione . . . . . . . . . . . . 195
13.5 Applicazioni in ambito vegetale. . . . . . . . . 196
14 • Microscopia confocale . . . . . . . . . . . . 199
A. Genre
14.1 Il microscopio confocale
a scansione laser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
14.1.1 Laser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
14.1.2 Pinhole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
14.1.3 Fotomoltiplicatori . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
14.1.4 Che cosa significa confocale?. . . . . . . . . 201
14.2 Sezioni ottiche e ricostruzioni 3D . . . . . . . 201
14.3 Applicazioni della microscopia
confocale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
14.3.1 FRET e FRAP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206
14.4 Altri tipi di microscopi confocali . . . . . . . . 207
14.4.1 Microscopio confocale a disco
di Nipkow . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207
14.4.2 Microscopio confocale multifotone. . . . . 208
14.5 La microscopia confocale su campioni
vegetali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
15 • Microscopia elettronica . . . . . . . . . . . 211
A. Valletta
15.1 Microscopia elettronica a scansione . . . . . 211
15.1.1 SEM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211
15.1.2 Interazione tra il fascio elettronico
incidente e il campione e generazione
dei segnali. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213
15.1.3 Preparazione del campione. . . . . . . . . . . 216
15.1.4 ESEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
15.2 Microscopia elettronica a trasmissione . . . 218
15.2.1 TEM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218
15.2.2 Preparazione dei campioni biologici
per l’osservazione al TEM . . . . . . . . . . . . . . 220
17/05/2011 11.16.27
XII
16 • Ibridazione in situ
ed immunocitochimica . . . . . . . . . . . . . . 223
A. Valletta, C. Forni
16.1 Tipi di sonda impiegati per l’ISH
e loro sintesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
16.2 Preparazione del campione per l’ISH . . . . 227
16.3 Reazione di ibridazione e lavaggi . . . . . . . 227
16.4 Rivelazione dei segnali di ibridazione . . . . 228
16.5 Controllo della specificità dell’ibridazione . 228
16.6 Ibridazione in situ fluorescente
e genomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229
16.7 Immunocitochimica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231
16.7.1 Antigeni ed anticorpi. . . . . . . . . . . . . . . . 231
16.8 Immunolocalizzazione . . . . . . . . . . . . . . . . 232
18.1.1 Marker. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232
16.8.2 Preparazione del campione. . . . . . . . . . . 233
16.8.3 Metodi per IEM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234
e fonti delle illustrazioni . . . . . . . . . . . . . . . 235
17 • Dalla genomica alla metabolomica
verso la biologia dei sistemi . . . . . . . . . . 237
S. Cozzolino, C. Forni, L. Lanfranco, A. Miccheli
17.1 Genomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237
17.1.1 Metodi classici di sequenziamento
del genoma: BAC e WGS . . . . . . . . . . . . . . . 237
17.1.2 Tecnologie di sequenziamento
massimo di nuova generazione. . . . . . . . . . . 241
17.2 Trascrittomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244
17.2.1 RT-PCR quantitativa . . . . . . . . . . . . . . . . 244
17.2.2 Array . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244
17.2.3 Sequenziamento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248
17.3 Profili di espressione genica:
dagli organi alle cellule . . . . . . . . . . . . . . . . 249
17.4 Proteomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251
17.4.1 Separazione delle proteine . . . . . . . . . . . 252
17.4.2 Profili proteici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254
17.4.3 Spettrometria di massa . . . . . . . . . . . . . . 254
17.4.4 Proteomica quantitativa . . . . . . . . . . . . . 255
17.4.5 Purificazione per affinità
di complessi proteici. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256
17.5 Metabolomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256
17.5.1 Metodi analitici. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258
17.5.2 Analisi multivariata dei dati e modelli . . 260
17.5.3 Analisi dei flussi metabolici mediante
impiego di substrati marcati con 13C:
analisi degli isotopomeri . . . . . . . . . . . . . . . 261
17.5.4 Applicazioni della metabolomica
nella biologia vegetale . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
cap00.indd XII
INDICE GENERALE
PARTE QUARTA
BIOTECNOLOGIE CELLULARI VEGETALI
18 • Coltura in vitro di cellule
e tessuti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269
A. Valletta
18.1 Selezione, sterilizzazione e messa
in coltura degli espianti . . . . . . . . . . . . . . . . 269
18.2 Mezzi colturali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271
18.3 L’utilizzo di regolatori di crescita
nelle colture in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273
18.4 Principali tipi di colture in vitro . . . . . . . . . 275
18.4.1 Colture di cellule indifferenziate. . . . . . . 275
18.4.2 Colture di organi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278
18.4.3 Saggi di vitalità cellulare . . . . . . . . . . . . 282
18.5 Variabilità somaclonale . . . . . . . . . . . . . . . 284
18.5.1 Origine della variabilità somaclonale . . 284
18.5.2 Selezione di varianti somaclonali . . . . . . 285
19 • Propagazione in vitro
delle piante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287
G. Pasqua
19.1 Micropropagazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288
19.2 Coltura di apici vegetativi per risanamento
delle piante da virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290
19.3 Organogenesi in vitro (caulogenesi,
rizogenesi) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290
19.4 Embriogenesi somatica . . . . . . . . . . . . . . . 292
19.4.1 Confronto tra embiogenesi zigotica
e somatica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293
19.4.2 Embriogenesi somatica diretta
e indiretta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294
19.4.3 Fattori induttivi e ruolo degli ormoni . . . 294
19.4.4 Analisi molecolare e marcatori
dell’embriogenesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296
19.4.5 Fecondazione in vitro . . . . . . . . . . . . . . . 297
19.4.6 Semi artificiali o sintetici . . . . . . . . . . . . 298
19.5 Embriogenesi da polline, produzione
di piante apolidi e diploidi omozigoti . . . . . 299
19.5.1 Manipolazione genetica del polline
e produzione di embrioni transgenici. . . . . . 301
20 • Conservazione ex situ
del germoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
C. Forni
20.1 Biodiversità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
20.2 Strategie per la conservazione
del germoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
17/05/2011 11.16.27
XIII
INDICE GENERALE
20.3 Metodi di conservazione
del germoplasma ex situ . . . . . . . . . . . . . . . . 304
20.3.1 Conservazione negli Orti Botanici . . . . . 304
20.3.2 Banche del seme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304
20.3.3 Crioconservazione . . . . . . . . . . . . . . . . . 306
21 • Cellule vegetali come biofabbriche
di prodotti chimici e farmaceutici . . . . . 311
G. Pasqua con la collaborazione di A.R. Santamaria
21.1 Metaboliti secondari
e loro ruolo nelle piante . . . . . . . . . . . . . . . . 311
21.2 Uso dei metaboliti secondari in campo
farmaceutico, cosmetico ed agroalimentare. . 315
21.3 Metaboliti secondari da colture di cellule
ed organi in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317
21.4 Strategie per incrementare la produzione
di metaboliti secondari in sistemi in vitro . . 319
21.4.1 Ottimizzazione delle condizioni colturali
per aumentare la resa. . . . . . . . . . . . . . . . . . 319
21.4.2 Selezione delle linee cellulari,
trasformazioni geniche ed ingegneria
metabolica per aumentare la produttività
di metaboliti secondari. . . . . . . . . . . . . . . . . 320
21.4.3 Permeabilizzazione di membrane
per il recupero dei metaboliti . . . . . . . . . . . . 321
21.4.4 Immobilizzazione cellulare . . . . . . . . . . . 322
21.4.5 Elicitazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322
21.4.6 Produzione di metaboliti in bioreattore . 323
21.5 Biotrasformazione di substrati per produrre
molecole di interesse industriale . . . . . . . . . 324
21.6 Estrazione ed analisi chimica
dei metaboliti secondari . . . . . . . . . . . . . . . . 325
22 • Bioproduzioni e biomasse . . . . . . . 329
C. Forni, G.P. Di Sansebastiano
22.1 Biomassa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329
22.2 Uso energetico delle biomasse . . . . . . . . . 330
22.3 Biocarburanti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331
22.3.1 Produzione di olio vegetale puro
e biodiesel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331
22.3.2 Produzione di bioetanolo . . . . . . . . . . . . 332
22.3.3 Produzione di biogas. . . . . . . . . . . . . . . . 334
22.4 Valutazione delle biomasse per la
sostituzione dei combustibili fossili e
la diminuzione dei cambiamenti climatici . . 334
22.5 Bioproduzione di polimeri . . . . . . . . . . . . . 335
22.5.1 “Biotecnologie bianche” . . . . . . . . . . . . 335
22.5.2 “Biotecnologie rosse”. . . . . . . . . . . . . . . 336
cap00.indd XIII
23 • Dalla scala di laboratorio alla scala
industriale: sistemi cellulari . . . . . . . . . . 341
A. Miccheli
23.1 Dalle cellule in sospensione
alle cellule immobilizzate. . . . . . . . . . . . . . . 341
23.2 Idrogeli e tecnologie per
l’immobilizzazione in gel. . . . . . . . . . . . . . . 343
23.2.1 Sodio alginato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 344
23.2.2 Preparazione delle sfere di alginato . . . . 345
23.3 Sistemi cellulari immobilizzati:
aspetti diffusivi e relativi modelli. . . . . . . . . 346
23.3.1 Diffusione in gel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 347
23.3.2 Diffusione in gel contenente cellule . . . . 348
24 • Dalla scala di laboratorio
alla scala industriale: bioreattori . . . . . . 349
A. Miccheli
24.1 Modelli cinetici di crescita cellulare . . . . . 350
24.2 Trasferimento di massa in bioreattori . . . . 351
24.2.1 Modello di trasferimento dell’ossigeno . 352
24.2.2 Ossigeno come substrato limitante
la crescita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354
24.3 Bioreattori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354
24.3.1 Shake flasks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355
24.3.2 Stirred tank reactors . . . . . . . . . . . . . . . . 356
24.3.3 Bioreattori pneumatici o airlift reactors . 356
24.3.4 Bioreattori a letto fisso
o a letto fluidizzato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 357
25 • Ingegneria genetica nelle piante . . 359
L. Trainotti, L. Lanfranco, G.P. Di Sansebastiano
25.1 Tecniche di trasformazione genica. . . . . . . 359
25.1.1 Metodi chimico-fisici. . . . . . . . . . . . . . . . 361
25.1.2 Metodi biologici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363
25.2 “Strumenti molecolari”
dell’ingegneria genica . . . . . . . . . . . . . . . . . 371
25.2.1 Vettori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371
25.2.2 Sistemi di selezione . . . . . . . . . . . . . . . . . 372
25.2.3 Promotori per le biotecnologie vegetali . 375
25.2.4 Geni reporter. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377
25.3 Il silenziamento genico mediato
da piccoli RNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 378
25.3.1 Basi molecolari dei meccanismi
di silenziamento mediato da piccoli RNA. . . 378
25.3.2 Applicazioni del silenziamento
genico mediato da piccoli RNA
per la manipolazione genetica . . . . . . . . . . . 385
17/05/2011 11.16.27
XIV
26 • Aspetti applicativi della transgenesi
nei sistemi vegetali . . . . . . . . . . . . . . . . . 389
L. Lanfranco, G.P. Di Sansebastiano, L. Trainotti
26.1 I sistemi sperimentali vegetali . . . . . . . . . . 390
26.1.1 Specie modello . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 390
26.1.2 Dicotiledoni: Arabidopsis, Solanaceae,
Pioppo, Fabaceae. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 390
26.1.3 Monocotiledoni: riso, mais . . . . . . . . . . . 393
26.1.4 La briofita Physcomitrella patens . . . . . . 394
26.2 I caratteri ingegnerizzabili . . . . . . . . . . . . . 395
26.2.1 Piante transgeniche di prima
generazione: resistenza agli insetti,
agli erbicidi e ai virus . . . . . . . . . . . . . . . . . 395
cap00.indd XIV
INDICE GENERALE
26.2.2 Piante transgeniche per il
miglioramento degli aspetti nutrizionali . . . 397
26.2.3 Piante transgeniche come bioreattori
per la produzione di proteine eterologhe . . . 398
26.2.4 Piante transgeniche per la produzione
di biocombustibili . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400
26.3 Il dibattito sul rischio biotecnologico . . . . 402
Indice analitico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405
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biologia cellulare e biotecnologie vegetali

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