Seminario Metabolismo e metodi di studio

Il metabolismo è l’insieme delle trasformazioni chimiche che avvengono
all’interno di un organismo e che sostengono i processi vitali. L’insieme
delle reazioni, catalizzate da enzimi, permette all’organismo di crescere,
riprodursi, autoripararsi e rispondere alle necessità ambientali.
Il metabolismo di un individuo riflette le trasformazioni di materia ed
energia che sono attuate sia per il mantenimento di strutture esistenti
che per la produzione di nuova biomassa. Tra i gruppi tassonomici e
funzionali, gli organismi allocano una frazione relativamente costante del
metabolismo alla produzione (Ernest et al., 2003).
IL metabolismo si basa su due classi di energie biologicamente importanti:
• L’energia chimica-potenziale, liberata dalla ossidazione di composti a base di carbonio o
idrogeno, e
• l’energia cinetica a livello molecolare.
Questi tipi di energia sono correlati negli animali in maniera complessa.
Tutto il lavoro ottenuto dalla conversione dell’energia chimica-potenziale è necessariamente
inefficiente e produce calore metabolico. Tutte le reazioni chimiche, comprese le reazioni
biochimiche cataboliche e di biosintesi, producono variazioni nel contenuto calorico di un
sistema.
A sua volta la performance metabolica è proporzionale alla temperatura dell’organismo.
Quindi è impossibile separare nettamente i problemi di bilancio termico con quelli collegati
all’acquisizione e all’allocazione di energia chimica potenziale.
Il metabolismo è solitamente suddiviso in due categorie
Insieme delle vie metaboliche che
utilizzano energia per produrre composti
cellulari come proteine ed acidi nucleici
Insieme delle vie metaboliche che liberano
energia dalla rottura di legami molecolari
ad alta energia mediante la respirazione
Oltre il 70% della spesa energetica totale umana è dovuta al
metabolismo basale . Circa il 20% della spesa energetica
viene consumato nell’attività fisica e un altro 10% per la
termogenesi o la digestione.
Per il metabolismo basale la maggior
parte dell’energia viene consumata per
mantenere costante i livelli dei fluidi
mediante l’osmoregolazione e solo
1/10 viene consumata per il lavoro
meccanico come digestione,
contrazione cardiaca e respirazione.
I tassi metabolici non sono costanti ma possono variare a seconda dell’esposizione a diverse
condizioni ambientali. I meccanismi di variazione sono:
• Acclimatamento
• Plasticità fenotipica
• Evoluzione
Acclimatamento è il processo attraverso il quale gli organismi regolano il proprio
metabolismo per mantenere costante la performance in presenza di variazioni graduali
ambientali (temperatura, umidità, fotoperiodo, pH…) . L’acclimatamento avviene in periodi di
tempo brevi ed è un processo individuale. Può essere discreto o ciclico. Può riguardare tratti
generalmente fisiologici, comportamentali o biochimici.
Plasticità fenotipica è la capacità di un organismo di cambiare il proprio fenotipo in risposta
a variazioni ambientali. Le variazioni possono essere morfologiche, fisiologiche
comportamentali e biochimiche e possono essere (o no) permanenti. In alcuni casi è dovuta
a modifiche dell’espressione genica in risposta a stimoli ambientali e possono essere
mutazioni epigenetiche
Evoluzione è la capacità della specie di adattarsi a variazioni dell’ambiente di lungo periodo
con possibilità di speciazione
Risposta dei tassi metabolici alle perturbazioni
Fattori che influenzano il metabolismo
Endogeni
Esogeni
Taglia corporea
Temperatura
Attività
Concentrazione di O2
Stato di salute e stress
Disponibilità di cibo
Luce, salinità, corrente
Attività e tasso metabolico
Taglia corporea: già analizzata con la Teoria Metabolica dell’Ecologia
Attività:
Routine
MR
Field
MR
Standard
MR
Maximum
MR
Active
MR
Metabolismo standard (standard metabolic rate, SMR): energia richiesta per mantenere le
funzioni biologiche di base indipendentemente dall’attività, dalla digestione e dagli stress
ambientali
Metabolismo basale (basal metabolic rate, BMR): energia richiesta da un omeotermo per
mantenere le funzioni biologiche di base indipendentemente dall’attività, dalla digestione e
dagli stress ambientali in condizioni di termoneutralità
Metabolismo totale (routine metabolic rate RMR o field metabolic rate, FMR): energia
richiesta dall’organismo durante una «normale» attività fisica e in assenza di stress
ambientali
Metabolismo attivo (active metabolic rate, AMR): energia richiesta dall’organismo durante
una attività fisica specifica
Metabolismo massimo (maximum metabolic rate, MMR): energia richiesta dall’organismo
durante la massima attività fisica
Attività e tasso metabolico
Metabolic scope:
la differenza tra metabolismo
massimo e metabolismo standard
Fattori che influenzano il metabolismo
Endogeni
Esogeni
Taglia corporea
Temperatura
Attività
Concentrazione di O2
Stato di salute e stress
Disponibilità di cibo
Luce, salinità, corrente
Temperatura e tasso metabolico
La temperatura influenza tutte le reazioni chimiche comprese quelle che avvengono nei
sistemi biologici e catalizzate da enzimi. Quindi sia le reazioni biochimiche singole che il
metabolismo dell’intero organismo sono dipendenti dalla temperatura.
Curve di performance termiche
endotermici
thermal neutral zone
ectotermici
Ectotermici mobili
L’effetto della temperatura sul metabolismo viene generalmente espresso dal Q10.
A
k1
B
A temperatura T+10°C
A temperatura T
K1= costante di velocità della reazione
K2= costante di velocità della reazione
V1=k1 [A]
V2=k2 [A]
𝑄10 =
𝑘2(𝑇+10°𝐶)
𝑘1(𝑇 °𝐶)
L’effetto della temperatura sul metabolismo viene generalmente espresso dal Q10.
Per i tassi respiratori
𝑅2
𝑄10 =
𝑅1
10
𝑇2 −𝑇1
Il Q10 non è un valore costante ma varia a sua volta
a diverse latitudini
Nielsen et al 1999
stagionalmente
L’endotermia si è evoluta nei mammiferi e negli uccelli allo scopo di tenere la temperatura
corporea entro uno stretto intervallo prefissato di temperatura. Il complesso degli enzimi in
questi organismi funziona in maniera più efficiente alle temperature corporee normali.
Costi/benefici dell’endotermia
1. Gli ectotermi hanno generalmente tassi metabolici più bassi degli endotermi, per cui
richiedono meno energia. Una maggior quantità di energia può contribuire alla
creascita e alla riproduzione.
2. Gli ectotermi che controllano la temperatura corporea non sempre possono incontrare
le condizioni ambientali adatte per farlo. Il corredo enzimatico lavora spesso in
condizioni non ottimali
3. Gli endotermi hanno bisogno di un alto apporto energetico per sostenere i propri tassi
metabolici e sono sfavoriti quando le dimensioni corporee sono piccole.
4. Gli alti tassi respiratori negli endotermi inducono alti tassi di evaporazione d’acqua.
5. Gli endotermi hanno l’opportunità di occupare gli habitat a climi più freddi, mentre gli
ectotermi sono più adatti ai climi tropicali. Non ci sono ectotermi nelle regioni polari.
Fattori che influenzano il metabolismo
Endogeni
Esogeni
Taglia corporea
Temperatura
Attività
Concentrazione di O2
Stato di salute e stress
Disponibilità di cibo
Luce, salinità, corrente
Concentrazione di O2 e tasso metabolico
In generale gli organismi possono rispondere alla riduzione della concentrazione di ossigeno
ambientale in due modi:
Gli organismi regolatori mantengono il tasso
respiratorio costante fino al raggiungimento di
una pressione critica; quando l’ossigeno è al di
sotto del valore critico il tasso respiratorio
declina rapidamente (Prosser 1973)
Gli organismi conformi hanno tassi respiratori
proporzionali alla concentrazione ambientale di
ossigeno con scarse possibilità di regolazione. A
basse concentrazioni di ossigeno essi passano
ad un metabolismo anaerobio prima che
l’ossigeno vengano consumato completamente
(Mangum & Van Winkle 1973).
Concentrazione di O2 e tasso metabolico
Differenze notevoli possono essere osservate
anche tra specie filogeneticamente vicine;
Heisey & Porter (1977) hanno osservato come
Daphnia galeata si comporti da conformer,
mentre Daphnia magna da regolatore.
Questo dipenderebbe dalle differenze di
habitat. Daphnia magna vive in sistemi spesso
esposti ad ipossia mentre Daphnia galeata vive
in sistemi solitamente ben ossigenati.
L’effetto viene ottenuto aumentando la
concentrazione di emoglobina nel sangue in
condizioni di ipossia (Fox & Phear 1953).
Fattori che influenzano il metabolismo
Endogeni
Esogeni
Taglia corporea
Temperatura
Attività
Concentrazione di O2
Stato di salute e stress
Disponibilità di cibo
Luce, salinità, corrente
Disponibilità di cibo e tasso metabolico
Il cibo può influenzare I tassi metabolici in diversi modi:
• La ricerca del cibo in molti caso induce un aumento dei tassi respiratori
• es.1 Il cladocero Polyphemus pediculus aumenta i tassi respiratori appena
individua la preda, (Butorina et al 1979).
• es.2 Molti filtratori bentonici riducono i movimenti delle appendici quando
aumenta la disponibililtà di cibo
• L’ingestione di cibo comporta sempre un consumo energetico che viene definito
Azione Dinamico-specifica che può comportare un aumento fino al 50% dei valori
di metabolismo standard
Azione dinamico-specifica
ADS, aumento del tasso
metabolico standard causato
dall'ingestione di cibo.
Il suo valore varia a seconda della
composizione del cibo ingerito,
proteine, grassi o carboidrati, inizia
con la fase digestiva e dura da poche
ore ad alcuni giorni.
Azione dinamico-specifica
E’ composta da più fasi temporali:
• Preassorbitiva
(ingestione, peristalsi, secrezione,…)
• Assorbitiva
(Assorbimento, trasporti, ormoni…)
• Postassorbitiva
(Sintesi proteica, amminazioni, escrezioni…)
Varia in intensità e durata a seconda delle
dimensioni del cibo
Fattori che influenzano il metabolismo
Endogeni
Esogeni
Taglia corporea
Temperatura
Attività
Concentrazione di O2
Stato di salute e stress
Disponibilità di cibo
Luce, salinità, corrente
Altri fattori ambientali e sperimentali e tasso metabolico
Luce:
Alcuni eufausiacei aumentano il tasso respiratorio in presenza di luce (Summers 2004)
Effetti fototassici
Corrente:
Velocità della corrente nei filtratori
Diaptomus (copepode)Byron 1981
Effetti sperimentali
Effetto confinamento
Stress osmotici
Pressione idrostatica
Unità di misura in ecologia energetica
Unità di misura dell’energia
calorie
cal
Energia richiesta per elevare di 1°C un ml di acqua (4,18 J)
chilocalorie
Kcal
Energia richiesta per elevare di 1°C un litro di acqua
British thermal unit
BTU
Energia richiesta per elevare di 1°F un pound (0,454 Kg) di acqua
Joule
J
Lavoro richiesto per elevare di 10cm il peso di 1 Kg opp
Lavoro richiesto per esercitare una forza di un newton per una distanza di un
metro (0,24 cal)
Foot-pound
chilowattora
Lavoro richiesto per elevare di 1 piede (30,48 cm) il peso di 1 pound
KWh
Quantità di energia elettrica prodotta in un ora da una potenza costante di
1000 Watt (=3,6 x 106 Joule o 859,8 kcal)
Unità di potenza (lavoro applicato nel tempo o velocità di trasformazione di energia)
Watt
W
1 Joule /secondo o 0,239 cal/sec
Cavallo-vapore
Hp
745,7 watts
Approssimazioni ecologiche utili
costituente
Peso secco
(Kcal/g)
AFDW
(Kcal/g)
carboidrati
4.5
proteine
5.5
lipidi
9.2
piante terrestri
4.5
4.6
semi
5.2
5.3
alghe
4.9
5.1
invertebrati (esclusi insetti)
5.0
5.5
insetti
5.4
5.7
vertebrati
5.6
6.3
Misura del metabolismo
CALORIMETRIA
• DIRETTA
• INDIRETTA
RESPIROMETRIA
• STATO STAZIONARIO
• FLUSSO CONTINUO
SVILUPPO DI CO2
TRACCIANTI RADIOISOTOPICI
• DOPPIA MARCATURA
• ACQUA A DOPPIA MARCATURA
METABOLOMICA AMBIENTALE
Calorimetria
• La calorimetria è l’unico metodo che permette misure dirette di
quantità termodinamiche.
• Consiste di un insieme di tecniche che consentono di misurare la
quantità di calore cedute o assorbite durante le reazioni chimiche
indipendentemente dal fatto che siano reazione aerobie o anaerobie
• Si basa sull'accettazione del principio di conservazione dell'energia e
della completa equivalenza tra calore e lavoro meccanico.
• La calorimetria permette di studiare l’energetica dai livelli
biomolecolari (macromolecole biologiche, legami, interazioni tra
macromolecole, cinetiche enzimatiche, ormoni) fino a livelli di intere
comunità biologiche
Calorimetria
diretta
misura lo scambio diretto di calore
• Adiabatica
• Per gradiente
Calorimetria
indiretta
misura il consumo di gas respiratori
• A circuito chiuso
• A circuito aperto
Calorimetria diretta
La calorimetria misura direttamente il rilascio di calore da parte di un organismo o di un
tessuto.
E’ suddivisa fondamentalmente in tre grandi classi:
• Bomba calorimetrica
• Calorimetria a scansione differenziale (Differential Scanning calorimetry , DSC),
• Calorimetria isotermica di titolazione(Isothermal Titration Calorimetry ITC)
Calorimetria diretta. 1. bomba calorimetrica
La bomba calorimetrica viene usata per misurare il contenuto energetico
complessivo all’interno di un tessuto o di un organismo
Il principio su cui si basa è:
Q= c m DT
Q = calore scambiato
DT = temperatura finale- temperatura iniziale
c = calore specifico
m=massa
La capacità termica di un corpo si
determina misurando il calore fornito al
corpo e determinando la sua variazione di
temperatura:
C = Q/ΔT
Il calore specifico di un corpo si determina
dividendo la capacità termica per la massa
del corpo
c = C/m
Un calorimetro è fondamentalmente una camera a contatto
con camera termicamente schermata e riempita con acqua.
Quando un corpo caldo viene inserito nella camera la
temperatura del sistema aumenta. Misurando l’aumento di
temperatura nel calorimetro si può calcolare il calore
specifico del corpo (cioè la quantità di calore perso per unità
di grammo)
Un’altra applicazione della calorimetria è la determinazione
del contenuto calorico (la quantità di energia ottenibile dalla
combustione)
Lavoisier inventò un calorimetro a ghiaccio e dimostrò che
la presenza di un animale aumentava la quantità di acqua
formatasi, per fusione del ghiaccio, nell’unità di tempo
Nel calorimetro una parte della
biomassa viene bruciata in presenza di
ossigeno puro e il calore rilasciato
viene assorbito dall’acqua che
circonda la cella di combustione. Il
calore prodotto viene misurato in
calorie(cal), chilocalorie (kilocal) o
Joule
tempo
Il calore prodotto dalla combustione viene
quantificato dall’aumento di temperatura
misurato nell’acqua che circonda da cella di
ignizione.
Per convertire la variazione di temperatura
in energia liberata è necessario procedere
alla calibrazione del calorimetro mediante
standard di massa nota e potere calorico
noto (tradizionalmente acido benzoico che
ha un potere calorico di 26.43 kJ g–1) e le
opportune correzione per il calore
sviluppato dal filo fusibile
Es di Termogramma
postperiodo
ignizione
preperiodo
Calorimetria diretta. 2. calorimetria differenziale a scansione
La calorimetria differenziale a scansione, ( DSC differential scanning calorimetry) è la
principale tecnica di analisi termica utilizzabile per caratterizzare molti tipi di processi a
livello molecolare come lo svolgimento della struttura dei polinucleotidi, la stabilità dei
complessi proteine-acidi nucleici (ribosomi) o la transizione di fase di strutture lipidiche
come le membrane
Il principio di base di queste tecnica consiste
nel ricavare informazioni sul materiale
riscaldandolo o raffreddandolo in maniera
controllata a pressione costante. In
particolare il DSC si basa sulla misura della
differenza di flusso termico tra il campione in
esame e uno di riferimento mentre i due
sono vincolati ad una temperatura variabile
definita da un programma prestabilito.
Funzionamento
La macchina viene predisposta mettendo sugli alloggiamenti due crogioli identici scelti in modo da resistere alle temperature di
prova senza interagire con il campione in esame. Uno dei due crogioli rimarrà vuoto in quanto servirà come riferimento per la
misura differenziale.
Tramite l'unità di controllo si chiude ermeticamente la fornace in modo da isolare l'ambiente di prova dall'esterno. Una volta
inserito il programma termico (solitamente una rampa lineare di temperatura), all'interno della fornace contenente il materiale
da analizzare viene creata un'atmosfera inerte con un flusso continuo ed uniforme di Ar o N2. Una volta iniziata la prova, il calore
ceduto dalla fornace riscalda sia il campione che il provino di riferimento in egual modo. Ogni variazione di temperatura tra i due
è dovuta a fenomeni che insorgono nel materiale da analizzare: una reazione esotermica innalzerà la temperatura del campione
mentre una endotermica farà l'opposto.
Durante tutto l'arco dell'esperimento un sistema di termocoppie raccoglie i dati di temperatura e li invia ad un elaboratore che
mediante un apposito software li elabora per generare l'output per l'utente. Una volta terminata la prova il sistema di
raffreddamento permette all'operatore di aprire la macchina e rimuovere i crogioli.
Introducendo delle opportune approssimazioni, è possibile analizzare quantitativamente il meccanismo di funzionamento del
calorimetro dimostrando che il flusso termico differenziale (dato dalla differenza tra il flusso di calore che dovrebbe essere
erogato dallo strumento al campione ed al provino di riferimento in modo da mantenerli in equilibrio termico secondo lo schema
di temperature impostato per la prova) è direttamente proporzionale alla differenza di temperatura tra campione di riferimento e
campione in analisi.
È quindi giustificato il principio di funzionamento dello strumento che misura tramite termocoppie la differenza di temperatura
tra il campione e il riferimento per stimare il flusso termico delle reazioni che avvengono all'interno del materiale in quanto
direttamente proporzionali tra loro.
Calorimetria diretta. 3. calorimetria isotermica di titolazione
La calorimetría isotermica di titolazione (ITC Isothermal Titration Calorimetry, ) è una
tecnica calorimetrica usata negli studi di biochimica fisica e di farmacologia, che permette
di determinare quantitativamente in maniera diretta l'entalpia di unione di una molecola o
di un complesso molecolare, in genere semplici, senza necessità di modelli o ipotesi
aggiuntive, mediante la misura del calore liberato e assorbito a pressione costante durante
una reazione disegnata specificamente per l'esperimento.
La tecnica ITC offre una misura diretta a partire dalla
stechiometria, dall'entalpia di formazione e dalla
costante di unione dei legami molecolari in maniera
che è possibile calcolare l'energia libera di Gibbs della
formazione dei legami, rappresentata da ΔG, e di
conseguenza l'entropia del processo:
ΔG = -RTlnK = ΔH-TΔS dove Ka è la misura diretta
dell'affinità di legame, R è la costante dei
gas, T la temperatura in kelvin, ΔH l'entalpia e
ΔS l'entropia.
Calorimetria indiretta
Si basa sul principio della Termochimica respiratoria: L’organismo ricava energia
mediante l’ossidazione di substrati energetici contenuti negli alimenti in reazioni
stechiometriche conosciute in cui è consumato ossigeno e prodotta anidride
carbonica.
Permette di stimare la spesa energetica a
partire:
dal consumo di ossigeno
dalla produzione di anidride carbonica
dall’escrezione urinaria di azoto
Calorimetria indiretta
E’ una misura utile quando il campione non è sacrificabile o le misure devono essere
ripetute nel tempo sullo stesso organismo
Si basa sull’equazione di Weir
M=3.941 VO + 1.106 VCO -2.17 uN2
2
2
M= dispendio energetico in Kcal/min
uN2=escrezione urinaria di azoto
VO2 e VCO2 flussi misurati in litri/min
La Calorimetria indiretta consente la misurazione del metabolismo basale
mediante misura degli scambi gassosi polmonari a riposo su soggetto a respirazione
spontanea, mediante il metodo della diluizione (casco canopy)
La Calorimetria indiretta consente la misurazione del metabolismo attivo mediante
misura degli scambi gassosi polmonari su soggetto in attività a respirazione
spontanea, mediante sistemi di fornitura di gas respiratori adeguati
Respirometria
La respirometria è un complesso di metodi atti a misurare il consumo di ossigeno in
un sistema biologico. La respirazione è un importante indice dell’attività enzimatico metabolica ed è stata tradizionalmente utilizzata per ricavare informazioni sul
metabolismo
Poiché l’ossigeno viene consumato a livello subcellulare nella catena di trasporto
degli elettroni il consumo di ossigeno rappresenta una misura corretta del
metabolismo aerobico, ma non tiene conto delle reazioni metaboliche che non
comportano consumo di ossigeno.
In alcuni casi le misure di respirometria possono essere integrate con misure di
emissione di CO2
Respirometria
Misura il tasso di consumo di ossigeno
• A volume o a pressione costante
• Warburg
• Gilson
• Divers Cartesiani
• Coulometrica
• Elettrometrica
• Stato stazionario
• Flusso continuo
Respirometria a volume costante o a pressione costante
E’ una misura respirometrica indiretta perchè misura la variazione di volume o
di pressione indotta dalla variazione di concentrazione di O2 in contenitori
sigillati.
Può essere realizzata:
• mantenendo il volume costante e misurando la variazione di pressione mediante un
manometro
• variando continuamente il volume mantenendo costante la pressione sul manometro
Respirometro a volume costante (Warburg)
• La CO2 prodotta viene
adsorbita da una soluzione
di KOH
• La densità del liquido
colorato nel manometro
deve essere bassa
• Il volume della camera deve
essere proporzionato alla
taglia dell’animale
Divers cartesiani
Respirometro a pressione costante (Gilson)
• La CO2 prodotta viene
adsorbita da una soluzione
di KOH
• Il volume della camera deve
essere proporzionato alla
taglia dell’animale
• Richiede continui
aggiustamenti di pressione
Vantaggi:
Non è necessario conoscere
esattamente il volume della
camera respirometrica
Svantaggi:
Azione continua dell’operatore
Respirometria coulometrica
• Misura la differenza di pressione tra la
camera respirometrica e la camera di
riferimento con termobarometro
• Quando la pressione nel respirometro
scende sotto un valore minimo si attiva una
coppia di elettrodi che liberano O2 per
elettrolisi da una soluzione di CuSO4
2CuSO4 + 2H2O -> 2H2SO4 + 2Cu + O2
• Il processo si ripete fino ad ottenere valori
costanti di consumo di O2
Respirometria elettrometrica
E’ una misura respirometrica diretta perchè misura la
variazione di concentrazione di O2 con elettrodi
specifici.
-0.6 -0.8 mV
Catodo Pt
e-
Anodo Ag
Ag
O2
2H2O
Ag+
4OH-
Respirometria elettrometrica
Il segnale generato è proporzionale al
flusso di molecole di ossigeno, che a sua
volta, è proporzionale a:
• Pressione parziale di ossigeno
• Permeabilità della membrana
• Temperatura dell’acqua
• Superficie di reazione del catodo
Gli elettrodi devono avere:
• Bassi consumi di ossigeno al catodo
• Alte velocità di risposta
• Alte precisioni
Respirometria elettrometrica
In stato stazionario
A flusso continuo
Respirometria in stato stazionario
L’animale viene rinchiuso in un sistema
chiuso. La concentrazione di O2 viene
misurata continuamente.
Il tasso respiratorio viene calcolato dalle
pendenza del consumo di O2 nel tempo e
corretto per il volume del contenitore e la
massa dell’animale.
Rappresenta in un certo senso l’inverso del
metodo della bottiglia chiara e scura.
Respirometria a flusso continuo
L’animale viene rinchiuso in un sistema a flusso continuo di acqua o aria. La concentrazione di
O2 viene misurata continuamente.
Il tasso respiratorio viene
calcolato dalla differenza
di concentrazione in
ingresso e in uscita dalla
camera respirometrica
tenendo conto
• del volume della
camera,
• del flusso di ricambio e
• della massa
dell’animale
Respirometria a flusso continuo
L’animale viene rinchiuso in un sistema a flusso continuo di acqua o aria. La concentrazione di
O2 viene misurata continuamente.
[O2]
tempo
Confronto tra respirometria in stato stazionario e respirometria a flusso continuo
Stato stazionario
Flusso continuo
L’aumento del tasso respiratorio dovuto
allo stress iniziale abbassa la
concentrazione di O2 e deve essere
corretto
L’aumento del tasso respiratorio dovuto
allo stress iniziale può essere ignorato
L’O2 viene gradualmente consumato,
l’animale può shiftare verso un
metabolismo anaerobio
La concentrazione di O2 viene mantenuta
costante
I prodotti di escrezione si accumulano
I prodotti di escrezione vengono
allontanati
Non c’è possibilità di misure a
concentrazioni di O2 costanti
Sono possibili misure a concentrazioni di
O2 costanti
Il volume può essere grande
Il volume va mantenuto minimo per le
condizioni di misura
Calcoli semplici
Maggior numero di fattori di variazione
da controllare
Misura dei tassi metabolici sul campo
Tecniche di tracciatura isotopica:
• Doppia marcatura radioattiva (due risorse diverse, due vie metaboliche diverse…)
• Isotopi stabili dC, dN, dO, dS…
• Acqua a doppia marcatura isotopica
Camere bentiche
Metabolomica
Flow-Through Respirometry
Il quoziente respiratorio
Il rapporto tra anidride prodotta ed ossigeno consumato (VCO2/VO2) è
il quoziente respiratorio (Respiratory quotient, o RQ).
Il RQ differisce a seconda dei diversi substrati energetici ossidati:
RQ dei lipidi
RQ dei carboidrati
RQ delle proteine
RQ dell'alcool
0.71
1,00
0.83
0.66
Acqua a doppia marcatura
La maggior parte degli studi attuali sul campo attualmente utilizza acqua marcata
con deuterio e ossigeno-18 (D218O; a volte detto deuterossido)
Si somministra al soggetto da analizzare l’acqua a
doppia marcatura e si misurano i tassi di
eliminazione del deuterio e dell’ 18O nel tempo
campionandone i liquidi corporei (saliva, urine,
sangue…)
La tecnica consiste nel misurare la produzione di CO2 durante diversi intervalli di tempo. La
CO2 contiene 2 atomi di O e uno di essi deriva dall’acqua nel corpo. Se l’O dell’acqua è
marcato allora alcune delle molecole di CO2 saranno marcate con 18O.
Inoltre l’18O, viaggiando attraverso il flusso sanguigno si trasforma in bicarbonato (anidrasi
carbonica) equilibrandosi sia con il bicarbonato corporeo che con la CO2 disciolta.
Quindi l’ 18O viene perso dal corpo con l’esalazione della CO2 e con le perdite attraverso le
urine e l’evaporazione.
Il deuterio viene perso solo con l’acqua corporea, quindi la perdita di deuterio attraverso
l’acqua può essere usata per compensare matematicamente l’ 18O perso attraverso l’acqua.
In questo modo si calcola la perdita netta 18O con la CO2.
Questa misura è un’eccellente misura della produzione di CO2. Da questa si può stimare il
tasso metabolico totale con delle semplici assunzioni relative al rapporto tra ossigeno
utilizzato nel metabolismo e CO2 eliminata mediante il quoziente respiratorio.
Questo quoziente può essere misurato in altri modi e si aggira quasi sempre tra 0.7 e 1 per
una dieta mista con valori medi intorno a 0.8.
Il metabolismo può essere calcolato dal rapporto O2 in /CO2 out
Il D viene perso solo attraverso
• l’acqua persa con urine, saliva ed evapotraspirazione
Acqua marcata
persa come acqua
L’ 18O viene perso dal corpo in due vie :
• CO2 esalata
• Acqua persa con urine, saliva ed evapotraspirazione
Correzione per la perdita di acqua
e stima della CO2 prodotta
Il rapporto del deuterio sull 18O nel corpo è fisso per cui la perdita complessiva di deuterio
moltiplicata per questo rapporto da immediatamente la perdita di 18O in acqua.
La misura della diluizione di 18O nel tempo da la perdita complessiva dell’isotopo attraverso tutte
le vie.
Poichè il rapporto del 18O sull’ossigeno
totale nell’acqua corporea viene
misurato, è possibile convertire la perdita
di 18O in respirazione dall’ ossigeno che
ha lasciato il corpo sottoforma di
CO2 possiamo calcolare il metabolismo.
La perdita di CO2 ci permette di misurare
l’energia prodotta se conosciamo il
quoziente respiratorio (rapporto tra
CO2 prodotta e O2 utilizzato).
K.A. Nagi, 2005 J. Exp.Biol.
Le camere bentiche
La metabolomica ambientale
La metabolomica è lo studio sistematico dei metaboliti a basso peso molecolare che
derivano da specifici processi cellulari. Si realizza su cellule, biofluidi o tessuti.
Il Metaboloma rappresenta l'insieme di tutti i metaboliti di un organismo biologico,
che sono i prodotti finali della sua espressione genica.
Mentre i dati dell'espressione genica dell'mRNA e delle analisi proteomiche non
spiegano esaurientemente ciò che potrebbe succedere in una cellula, il profilo
metabolico può fornire un'istantanea della fisiologia di quella cellula.
Una delle sfide della biologia sistemica è di integrare la proteomica, la trascrittomica
e le informazioni metabolomiche per avere una visione d'insieme più completa del
bilancio energetico degli organismi viventi.
Applicazioni della metabolomica
La metabolomica basata essenzialmente sull’ NMR-based (ma anche HPLC e
Spettrometria di massa) può essere un valido mezzo per espandere le ricerche sugli
impatti di stress ambientali sugli organismi viventi. Attualmente è stata già utilizzata
con successo per:
Monitoraggio ambientale su specie “sentinella” vertebrati o invertebrati (pesci,
mammiferi o lombrichi) per l’esposizione ad inquinanti e tossici ambientali
Valutazione del rischio chimico e biologico di farmaci, pesticidi e prodotti chimici
industriali
Studi di impatto ambientale
Ambiti di applicazione dell’ecologia energetica
• Ecotossicologia . Studio degli effetti di xenobiotici su organismi ed effetti a
breve e medio termine sugli individui e sulla dinamica di popolazione
• Ecofisiologia: Gli ecofisiologi studiano l’effetto degli eventi stressogeni
ambientali sugli organismi. Quali variazioni ambientali, impatti, effetti
nutritivi malattie ed esposizione a tossine
• Fisiologia evolutiva lo studio delle evoluzione fisiologica cioè il modo in cui
le caratteristiche funzionali degli individui di una popolazione hanno
risposto alla selezione durante la storia della popolazione stessa
• Studio della struttura e funzione di ecosistemi
• Ecologia applicata
• La maggior parte degli ambiti in cui si articola la vostra ricerca!
Misura dell’ATP