Determinazione della proteinuria

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International Congress of
the Italian Association of Companion
Animal Veterinarians
May 19 – 21 2006
Rimini, Italy
Next Congress :
62nd SCIVAC International Congress
&
25th Anniversary of the SCIVAC Foundation
May 29-31, 2009 - Rimini, Italy
Reprinted in IVIS with the permission of the Congress Organizers
53° Congresso Nazionale Multisala SCIVAC
137
This manuscript is reproduced in the IVIS website with the permission of the Congress Organizing Committee
Determinazione della proteinuria: quali tests
effettuare nel cane e nel gatto e come interpretarli
George E. Lees
Med Vet, MS, Dipl ACVIM, Collage Station, Texas, USA
L’identificazione della proteinuria è importante per almeno
due ragioni. In primo luogo, recenti dati hanno dimostrato che
sia nel cane che nel gatto è associata ad un esito clinico sfavorevole. In altre parole, il riscontro della proteinuria identifica
gli animali maggiormente esposti al rischio di malattie potenzialmente letali. In secondo luogo, si vanno raccogliendo sempre più dati che indicano che il trattamento dei cani e dei gatti
con proteinuria con terapie mediche che riducono l’entità della proteinuria stessa migliora l’esito clinico di questi pazienti.
Quindi, il trattamento corretto degli animali con proteinuria è
clinicamente importante ed inizia con l’accurata identificazione della proteinuria mediante i test di screening, che devono
essere eseguiti ed interpretati correttamente.
ESEGUIRE UN’ANALISI COMPLETA
DELL’URINA
ze in cui si ritiene necessario eseguire degli esami di laboratorio completi (ad es., esame emocromocitometrico completo e/o profilo biochimico) per un cane o un gatto. Ciò di solito avviene in uno dei seguenti due casi: (a) quando si studia
la causa di una malattia in un animale malato e (b) quando si
effettua una valutazione di routine delle condizioni di un
soggetto apparentemente sano. Inoltre, gli animali (in particolare i cani) con malattie croniche note per essere spesso
complicate da nefropatie proteinuriche devono essere sottoposti alla ricerca della proteinuria ad intervalli di ≤ 6 mesi.
Analogamente, lo screening periodico per la proteinuria
contribuisce ad identificare precocemente le nefropatie in
animali apparentemente sani, ma noti per essere “a rischio”
di sviluppo di disordini glomerulari (ad es., cani che possono essere colpiti da una glomerulopatia ereditaria).
TEST PER LA PROTEINURIA
Il primo punto importante è che i test per lo screening della
proteinuria devono sempre essere effettuati in associazione con
l’esame completo delle urine (cioè la determinazione delle proprietà fisico-chimiche come il peso specifico mediante rifrattometria e i test colorimetrici tramite strisce reattive, nonché l’esame microscopico del sedimento urinario). Ci sono numerose
ragioni che spiegano l’importanza di questa associazione. Prima
di tutto, un’analisi completa dell’urina consente di effettuare lo
screening anche per alcune importanti malattie non urinarie (ad
es., diabete mellito), nonché di evidenziare parecchi tipi di affezioni delle basse vie urinarie (ad es., infezione batterica del tratto urinario, urolitiasi, neoplasia) che si riscontrano comunemente nel cane e nel gatto. Queste ultime condizioni sono importanti quanto la proteinuria per la salute del tratto urinario di questi
animali e spesso sono clinicamente occulte (cioè non si manifestano tramite segni clinici), mentre sono rilevabili sulla base di
anomalie dei riscontri dell’esame delle urine (ad es., ematuria,
piuria e/o batteriuria microscopica). Infine, anche quando si
considerano solo gli argomenti correlati ai test per la proteinuria, i risultati derivanti da altre parti dell’esame delle urine (in
particolare il peso specifico e i riscontri nel sedimento) forniscono degli importanti contributi all’iniziale interpretazione ed
alla valutazione di tutti i test di screening per la proteinuria.
Quando effettuare lo screening
per la proteinuria
La raccomandazione generale è quella di eseguire un’analisi completa dell’urina, prestando attenzione all’identificazione dell’eventuale proteinuria, in tutte le stesse circostan-
Test colorimetrico mediante strisce reattive
Questo test ha il grande vantaggio di essere relativamente
semplice, economico e già di uso comune come componente dell’esame convenzionale delle urine. Queste prove effettuate mediante cuscinetti reattivi sono basati su un fenomeno detto “errore proteico di coloranti indicatori di pH”. Fondamentalmente, il test è basato sulla capacità dei gruppi aminici delle proteine di legarsi ad alcuni indicatori acido-basici e modificarne il colore anche se il pH del campione viene
mantenuto costante da un tampone contenuto all’interno dello stesso cuscinetto reattivo. Poiché rispetto alle altre proteine l’albumina ha un maggior numero di gruppi aminici liberi disponibili per reagire con il colorante indicatore, il test
mediante strisce reattive evidenzia principalmente l’albumina urinaria piuttosto che altre proteine (ad es., globuline,
proteine di Bence Jones, mucoproteine). Il limite inferiore
della sensibilità per l’esame delle urine mediante strisce
reattive per la proteinuria è di circa 30 mg/dl.
Il principale difetto di questo test è la sua scarsa specificità sia nel cane che nel gatto. In altre parole, il test spesso fornisce risultati falsi positivi. In una recente indagine Grauer
et al. hanno riferito, ad esempio, che la specificità ottenuta
mediante strisce reattive in confronto ai metodi immunometrici quantitativi specie-specifici per l’albumina era del 69%
(31% di falsi positivi) nel cane e solo del 31% (69% di falsi
positivi) nel gatto. Quando dall’analisi sono stati esclusi i
campioni di urina con pH alcalino (≥ 7,5) e/o ematuria (≥ 10
eritrociti/campo microscopico ad elevato ingrandimento),
piuria (≥ 5 leucociti/campo microscopico ad elevato ingran-
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dimento) o batteriuria, la specificità è migliorata passando
all’84% nel cane ed al 55% nel gatto. Quindi, anche nelle
migliori circostanze, una risposta positiva alla ricerca delle
proteine con il metodo delle strisce reattive nell’urina del gatto corrisponde in realtà ad un autentico esito positivo solo in
poco più della metà delle volte (e, in tutte le circostanze, in
meno di un terzo dei casi). La ragione di una percentuale così
elevata di reazioni false positive all’esame mediante strisce
reattive dell’urina del cane e del gatto è che l’elevata concentrazione e/o il pH alcalino dell’urina prodotta da queste specie animali spesso supera la capacità tampone dei cuscinetti
di reagente (che sono stati formulati per l’urina dell’uomo).
Il test colorimetrico mediante strisce reattive per l’analisi
dell’urina presenta un paio di altri aspetti negativi di cui bisogna tenere conto. In primo luogo, la “lettura” effettiva dipende
in qualche misura dall’operatore. Vale a dire che quando il test
viene eseguito manualmente, persone differenti possono giudicare in modo diverso le variazioni di colore. Inoltre, l’alterazione cromatica dell’urina può modificare il cambiamento di
colore nel cuscinetto reattivo. Una delle potenziali soluzioni a
questi problemi è l’impiego di un apparecchio automatizzato
per la “lettura” della striscia. Questi apparecchi standardizzano
la valutazione colorimetrica e le strisce per l’esame dell’urina
che sono state studiate per l’impiego con questi strumenti di lettura sono dotate di un “cuscinetto di riferimento” che viene utilizzato per regolare la valutazione di qualsiasi alterazione cromatica “di fondo” del campione. Anche se un altro potenziale
difetto dell’uso delle strisce è il fatto che non rilevano la presenza nell’urina di quantità di albumina basse, ma comunque
anormali, che determinano una condizione detta “microalbuminuria” (concentrazione di albumina compresa fra 1 e 30
mg/dl). Questo argomento verrà trattato successivamente a proposito dei test immunologici specie-specifici per l’albuminuria.
Test turbidimetrico con acido solfosalicilico
Il test turbidimetrico con acido solfosalicilico (SSA) è un
altro metodo relativamente semplice e poco costoso. Come la
determinazione mediante strisce reattive, l’SSA-test è semiquantitativo (i risultati vengono riferiti come negativo, tracce,
1+, 2+, 3+ o 4+), ma è sia più sensibile che più specifico di
quello con le strisce reattive. In effetti, a causa della sua maggiore specificità, i laboratori di analisi cliniche veterinarie di
maggiori dimensioni (ad es., laboratori commerciali, laboratori di ospedali veterinari didattici) impiegano di routine l’SSA come test “di riserva” per la proteinuria. Ogni volta che la
striscia è positiva, si effettua sul campione un SSA-test, per
stabilire se si tratta davvero di un’autentica positività (positivo anche il SSA) o di un falso positivo (SSA negativo).
Il test turbidimetrico con SSA si effettua mescolando pari
volumi di surnatante urinario e una soluzione al 5% di acido solfosalicilico in una provetta di vetro pulita. Il test si basa sul fatto
che il pH acido della soluzione di SSA determina la precipitazione delle proteine, causando un intorbidamento che è approssimativamente pari alla quantità di proteine presenti nell’urina.
L’entità dell’intorbidamento viene graduata (da negativo fino a
4+, come sopra) da un operatore, facendo riferimento a standard
descrittivi (scritti) o visivi. Quindi, benché sia meno comodo di
quello delle strisce reattive e sia ancora in qualche misura
“dipendente dall’operatore” (per cui osservatori differenti
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potrebbero non assegnare lo stesso grado all’intorbidamento), il
test con SSA ha il vantaggio di essere molto più specifico per la
proteinuria. Inoltre, è più sensibile di quello delle strisce reattive; il limite inferiore di rilevamento dell’SSA-test è di circa 5
mg/dl e rileva anche le proteine di Bence Jones nelle urine.
Test immunometrico specie-specifico
per l’albumina urinaria
I più recenti metodi di screening per l’esame delle urine nel
cane e nel gatto alla ricerca di proteine anomale utilizzano anticorpi anti-albumina specie-specifici nell’ambito di prove immunometriche semiquantitative o quantitative. Questi test sono
molto sensibili e molto specifici; rilevano solo l’albumina. Tuttavia, quest’ultima di solito è la più abbondante e la più significativa dal punto di vista diagnostico fra le proteine anormali dell’urina. I test semiquantitativi (ad es., E.R.D – Screen Urine
Tests, Heska, Ft. Collins, CO, USA) sono destinati all’impiego
diretto accanto al paziente (Point-of-care test) e sono calibrati
principalmente per l’identificazione della microalbuminuria
(concentrazione di albumina nell’urina entro il range di 1-30
mg/dl dopo diluizione dell’urina ad un peso specifico standard
di 1.010). Tuttavia, il risultato “altamente positivo” del test semiquantitativo di solito corrisponde ad un’albuminuria palese (cioè
una concentrazione di albumina > 30 mg/dl) e non fornisce ulteriori informazioni su differenti entità di albuminuria, molto superiori a questa concentrazione. I reagenti contenenti anticorpi
anti-albumina specie-specifici sono stati adattati anche alla realizzazione di test immunometrici quantitativi (ad es., ELISA)
disponibili presso alcuni laboratori privati. Questi test (da eseguire effettuando una diluizione secondo necessità, per mantenere entro la gamma dinamica del test stesso la concentrazione
di albumina nel campione che viene esaminato) possono fornire
una ragionevole stima della effettiva concentrazione di albumina
nell’urina attraverso l’intera gamma dei possibili risultati (cioè
sia per i valori microalbuminurici che per quelli chiaramente
albuminurici). Quando si effettua lo screening per la proteinuria,
i test semiquantitativi (cioè Point-of-care) per la microalbuminuria trovano principalmente due applicazioni potenzialmente
importanti. Una di queste è l’esame dei campioni di urina risultati negativi all’analisi mediante strisce reattive, per rilevare la
microalbuminuria nei campioni in cui una proteinuria di questa
entità, bassa ma comunque anormale, sfuggirebbe altrimenti
all’identificazione. Le implicazioni della microalbuminuria isolata (microalbuminuria senza alcun altro riscontro anormale)
verranno illustrate in una successiva relazione. Una seconda
applicazione del test è il follow-up dei campioni che hanno fornito risultati debolmente positivi (equivoci) all’esame con le strisce reattive. In altre parole, poiché i test immunometrici per la
ricerca dell’albumina nell’urina sono altamente specifici, possono venire utilizzati (come il SSA-test precedentemente descritto) per distinguere fra le reazioni autenticamente positive e quelle false positive all’esame con le strisce reattive.
Letture consigliate
1.
2.
Osborne CA, Stevens JB. Urinalysis: A Clinical Guide to Compassionate Patient Care. Bayer Animal Health, Shwanee Mission, Kansas, USA, 1999, pp 111-116.
Lees GE, Brown SA, Elliott J, Grauer GF, Vaden SL. Assessment and
management of proteinuria in dogs and cats: 2004 ACVIM Forum Consensus Statement (Small Animal) J Vet Intern Med 2005;19:377-385.