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Scheda tecnica
GENEDIA
GD 315 Real Fattore V
Ricerca del polimorfismo A1691G nel Fattore V di Leiden
mediante Real Time PCR
DESTINAZIONE D’USO:
Il dispositivo Real Fattore V è un test “in vitro” per l’identificazione del
polimorfismo (A1691G) gene codificante per il fattore V della coagulazione sul cromosoma 1, a partire da
DNA genomico
FATTORE V, SIGNIFICATO CLINICO:
Alterazioni genetiche rappresentano le principali cause di
trombosi ereditarie.
Nel 1994 una mutazione puntiforme (sostituzione A-G) in posizione 1691, nell’esone 10 (nt 1487-1701) del gene
codificante per il fattore V della coagulazione sul cromosoma 1, con conseguente sostituzione di un Arginina
con una Glicina nell’aminoacido 506, è stata associata alla resistenza alla degradazione da Proteina C
attivata (Bertina et al). Questa alterazione funzionale dell’emostasi sembra correlabile ad un incremento del
rischio di trombosi venosa. Il saggio funzionale alla rAPC (resistenza alla proteina C attivata), si basa sulla
determinazione di aPTT nel plasma del paziente in assenza ed in presenza di una concentrazione fissa di
Proteina C attivata.
Tale test viene naturalmente influenzato da molti fattori quali il citrato usato come anticoagulante, il cloruro
di calcio, il tipo di attivatore, e la purezza della proteina C attivata. Si vede inoltre che ridotti livelli di F II e
X possono alterare il risultato verso valori falsamente normali. Ciò rende impossibile la determinazione
funzionale della rAPC durante la terapia anticoagulante orale, nel qual caso si deve ricorrere esclusivamente
all’analisi genetica del DNA che permette di individuare la mutazione.
La resistenza alla proteina C attivata è a trasmissione autosomica dominante.
La mutazione è stata descritta nel 2-4% di un gruppo di controllo olandese , e nel 3-5% in quella di controllo
del Regno Unito.
La mutazione in eterozigosi è associata ad un aumento del 5-10%
del rischio trombotico, mentre in omozigosi è associata ad un
aumento del 50%.
Distribuzione delle frequenze alleliche nelle diverse popolazioni.
Legenda: A/A = area arancione
A/G = area verde
G/G = area blu
Fonte: SNPedia.com/rs6025
PRINCIPIO
DEL METODO Il dispositivo GD 315 Real Fattore V consente la ricerca del
polimorfismo (rs6025) per il Fattore V di Leiden in campioni contenenti DNA genomico estratto
da sangue intero. La procedura analitica eseguita in Real Time PCR consente la
genotipizzazione, mediante l’utilizzo di due probes alleli specifici.
SVILUPPATO E PRODOTTO IN ITALIA DA: GeneDia S.R.L.: VIA LOMBARDA, 169/A – 55013 LAMMARI (LU) TEL./FAX +39(0)583 962672 – EMAIL [email protected] ; WWW.GENEDIA.IT
AMPLIFICAZIONE E RIVELAZIONE
La reazione d’amplificazione utilizza due sonde allele specifiche che consentono la discriminazione allelica.
La fluorescenza emessa dalle due sonde, in due canali distinti (FAM e JOE) durante la fase d’estensione
permette al termine della reazione di determinare la presenza dell’allele ricercato.
•
La presenza di un segnale d’amplificazione nel canale del FAM è relativo all’allele G
•
La presenza di un segnale d’amplificazione nel canale del JOE è relativo all’allele A
Completata la reazione d’amplificazione il software visualizza il segnale d’amplificazione per i due canali
(FAM e JOE) e selezionando un campione per volta è possibile verificare la presenza dell’allele ricercato.
Fig.1 Esempio di campione omozigote G/G
Fig.2 Esempio di campione omozigote A/A
Fig.3 Esempio di campione eterozigote G/A
PLOT DI DISCRIMINAZIONE ALLELICA
Cycling A .Green - No Markers
Cycling A .Yellow - Circles
0,55
0,50
0,45
0,40
0,35
Norm. Fluoro.
La normalizzazione dei due segnali
d’amplificazione e la determinazione del
Ciclo Soglia del campione, nei canali FAM
e JOE, consente al software per la
discriminazione allelica di fornire il
genotipo del campione in esame.
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
Threshold
0,00
1
No.
1
Name
Sample 1 •-----•
•-----•
2
Sample 2
9
Sample 9 •------•
2
3
4
Genotype
ALLELE A
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Cycle
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
Cycling A.Green Cycling A.Yellow
No Reaction
Reaction
Eterozigote G/A
Reaction
Reaction
ALLELE G
Reaction
No Reaction
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GD 315 REAL FATTORE V
APPLICABILITÀ:
Estratti di gDNA
VOLUME DEL CAMPIONE:
Minimo 10 microlitri
NUMERO DI TEST:
40 reazioni
SPECIFICITÀ:
Rs6025 - Mutazione A1691G del gene del Fattore V di Leiden
PROTOCOLLO VALIDATO PER STRUMENTAZIONE:
Bio-Rad: CFX96™- iQ™5.
Qiagen: Rotor-Gene® Q- Rotor-Gene® 6000-Rotor-Gene® 3000.
Applied Biosystems: 7500- 7300- 7000- StepOne™ e StepOnePlus™
CONSERVAZIONE:
a -20°C (spedizione refrigerata)
STABILITÀ:
24 mesi se correttamente conservato.
REAGENTI RICHIESTI:
Dispositivo per l’estrazione del gDNA da sangue periferico
(GD 241 Spin blood mini kit).
NON COMPRESI NEL KIT
DISPOSITIVI CORRELATI
GD 316 REAL FATTORE II
APPLICABILITÀ:
Estratti di gDNA
VOLUME DEL CAMPIONE:
Minimo 10 microlitri
NUMERO DI TEST:
40 reazioni
SPECIFICITÀ:
G20210A - Mutazione puntiforme della protrombina
PROTOCOLLO VALIDATO PER STRUMENTAZIONE:
Bio-Rad: CFX96™- iQ™5.
Qiagen: Rotor-Gene® Q- Rotor-Gene® 6000-Rotor-Gene® 3000.
Applied Biosystems: 7500- 7300- 7000- StepOne™ e StepOnePlus™
CONSERVAZIONE:
a -20°C (spedizione refrigerata)
STABILITÀ:
24 mesi se correttamente conservato.
REAGENTI RICHIESTI:
Dispositivo per l’estrazione del gDNA da sangue periferico
(GD 241 Spin blood mini kit).
NON COMPRESI NEL KIT
BIBLIOGRAFIA:
•
Bertina RM, Koeleman BPC, Koester T, Rosendaal FR, Dirven RJ, de Ronde H, van der Valden PA, Reitsma PH. Mutation in blood coagulation factor
V associated with resistance to activated protein C. Nature. 1994;369:64–67.
• Furie B, Furie CB. Molecular and cellular biology of blood coagulation. N Eng J Med. 1992;326:800–806.
• Malm J, Laurell M, Nilsson IM, Dahlback B. Thromboebolic disease. Critical evaluation of laboratory investigation. Thromb Haemost. 1992;68:7–13
• De Stefano V, Leone G, Mastrangelo S, Tripodi A, Rodeghiero F, Costaman G, Barbui T, Finazzi G, Bizzi B, Mannucci PM. Clinical manifestation and
management of inherited trombophilia: retrospective analysis and follow-up after diagnosis of 238 patients with congenital deficiency of antithrombin
III, protein C, protein S. Thromb Haemostas. 1994;72:352–358
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