docDiagnostica microbiologica delle infezioni delle basse vie respiratorie
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Diagnostica microbiologica delle infezioni delle basse vie respiratorie
Infezioni basse vie respiratorie LA DIAGNOSI MICROBIOLOGICA Diagnostica microbiologica delle infezioni delle basse vie respiratorie Presenza di patogeni piu frequentemente isolati oppure di patogeni non comuni • influenza la terapia che è in funzione di Presenza di patogeni che mostrano antibiotico resistenza Presenza di patogeni per i quali le linee guida non prevedono un trattamento ottimale • permette di individuare cluster epidemici Lucia Martelli Infezioni basse vie respiratorie Perchè una corretta diagnosi eziologica è importante? • per studiare l’andamento dell’antibiotico resistenza • Per aumentare l’accuratezza delle raccomandazioni delle linee guida • permette di individuare patologie causate da patogeni non endemici in quell'area Infezioni basse vie respiratorie La diagnosi microbiologica rende possibile una: • Diagnosi probabile quadro clinico compatibile + • Diagnosi definita quadro clinico tipico • Per guidare i comportamenti in caso di patologie particolari come SARS, Influenza,Legionellosi patologie da bioterrorismo E’importante ma non sempre efficace nelle cap che necessitano di ricovero per pazienti ospedalizzati per pazienti immunocompromessi con infezioni delle basse vie gravità della È limitato + + agente eziologico probabile un campione non contaminato probabile patogeno che non colonizza le vie respiratorie superiori Infezioni basse vie respiratorie La diagnosi microbiologica malattia rilevazione di un patogeno polmonare in quantità medio alta (in modo semiquantitativo) Infezioni basse vie respiratorie Fattori interferenti con la diagnosi microbiologica - Adeguatezza del campione( assenza di contaminazione da parte della flora del tratto respiratorio superiore) nelle bronchiti nelle cap non complicate e in assenza di fattori di rischio (sono sufficienti le linee guida) - Uso di test diagnostici rapidi e sensibili importanti sono: esame microscopico la ricerca di antigeni tests di biologia molecolare 1 Infezioni basse vie respiratorie Infezioni basse vie respiratorie Correlazione tra agenti patogeni e patologia Correlazione tra agenti patogeni ed età età microrganismi più probabili Neonati(0-1 mo) Escherichia coli, Streptococcus agalactiae lattanti (1-6 mo) Chlamydia trachomatis , RSV Tipo di polmonite Acquisita in comunità bambini (6 mo-5 yr) RSV, Parainfluenza Primaria atipica tosse non produttiva ragazzi (5-15 yr) Viruses Mycoplasma pneumoniae , Influenza Virus Tipo A giovani adulti(16-30) Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus pneumoniae adulti patogeni comuni Tipo di polmonite patogeni comuni patogeni rari polmonite ematogena Staphylococcus spp., bacilli Gram negativi Streptococcus spp. polmonite in paz. immunodepressi batteri come nella CAP* Pneumocystis carinii, Cytomegalovirus, HSV, Nocardia sp. Legionella,Listeria Histoplasma, Coccidioides Funghi opportunisti * Candida * Mucor * Aspergillus Polmonite da aspirazione anaerobi Staphylococcus, S. pneumoniae, H. influenzae, Staphylococcus K. pneumoniae M.catarrhalis N. meningitidis Mycoplasma pneumoniae Adenovirus, RSV, Influenza, Clamydia spp. Legionella spp., tuberculosis, polmoniti fungine acute bacilli Gram neg(Enterobacter, legionella Klebsiella, Acinetobacter S. pneumoniae , Pseudomonas), S. aureus, batteri anaerobi Polmonite nosocomiale Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae Infezioni basse vie respiratorie patogeni rari Diagnosi Microbiologica Materiale Idoneo Escreato Escreato indotto Germi comuni, Legionella Micobatteri Nocardia , miceti + P.carinii Bronco Aspirato Idem Lavaggio Bronchiale Solo per Micobatteri, Legionella, P.carinii e miceti filamentosi Lavaggio Broncoalveolare Idoneo per tutte le ricerche batteriologiche,virologiche fungine parassitologiche Liquido pleurico Germi comuni,Miceti,Anaerobi Micobatteri,Legionella,Nacardia Bacilli Gram negativi aerobi Infezioni basse vie respiratorie Diagnosi Microbiologica Materiale Idoneo La diagnosi Microbiologica Sangue Batteri Gram+,GramMiceti Metodi diretti es batteroscopico es colturale Urina Rilevazione antigeni di Legionella, Pneumococco su materiali respiratori emocoltura rilevazione di antigeni Metodi di amplificazione genica Siero Per ricerche di anticorpi ricerca di antigene di Aspergillus tecnologie microarray Metodi indiretti tests sierologici 2 Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie Infezioni basse vie respiratorie Inoltre Esame microscopico Permette di Stabilire l'idoneità del materiale di avviare una terapia empirica verso patogeni meno comuni e di abbandonare terapie inappropriate Valutare la quantità di PMN e microrganismi (processo infiammatorio e infezione batterica) Fare una diagnosi presuntiva mediante il rilevamento di potenziali patogeni può indurre ad attuare iter diagnostici diversi da quelli routinari Infezioni basse vie respiratorie Esame colturale Esame microscopico Materiale Biologico Idoneo Esame Colturale Di validare i risultati dell'esame colturale Di valutare l'azione inibente della terapia antibiotica su microrganismi presenti che non si sviluppano in coltura Infezioni basse vie respiratorie Esame colturale dei materiali ottenuti con procedimenti non invasivi • l'eventuale precedente terapia antibiotica • l'eventuale scarsa idoneità spesso non è specifico nè sensibile del campione P e • difficoltà di interpretazione la presenza di flora delle r alte vie che può includere eventuali patogeni (falsi positivi) Isolamento batteri e miceti non esigenti Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie Esame colturale di materiali ottenuti con procedimenti invasivi o coprire il vero patogeno (falsi negativi) Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie Esame colturale Semina su terreni idonei Incubazione a 37° per 24-48h In atmosfera normale o in Co2 permette LETTURA di attribuire un significato eziologico ai vari isolati se accompagnati da una valutazione numerica ANTIBIOGRAMMA (se previsto) IDENTIFICAZIONE 3 Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie Emocoltura Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie Rilevazione antigeni su materiali respiratori si basano su ● E' raccomandata per tutti i pazienti con grave polmonite e se positiva permette di fare diagnosi ● ● Si ha positività nel 5-14% ● Agglutinazione al lattice ● Immunofluorescenza diretta ● EIA Il più comune isolato è S.pneumoniae Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie Ricerca antigeni su materiali respiratori Vantaggi • Sono rapidi • Idonei per Virus influenzali A e B RSV Adenovirus Virus parainfluenza 1,2,3 HCMV HSV1,HSV2 Legionella, Pneumococco Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie Rivelazione antigeni su urine • Tests immunocromatografici S. pneumoniae sier 1 e Vantaggi • Rapidi • semplici • Positivi anche dopo l'inizio della terapia Infezioni basse vie respiratorie Infezioni basse vie respiratorie S.pneumoniae Antigene (polisaccaride parete) Vantaggi Specificità >90% Sensibilità 50-80% < nei bambini portatori sani Antigene urinario di legionella Il test non rileva tutti i sierotipi Vantaggi Non distingue infezione in atto da infezione pregressa Svantaggi •Positività prolungata nel tempo Svantaggi Cross-reattività con S.oralis e S.mitis legionella pneumophila • Sensibilità 70-100% • Specificità 100% Il valore diagnostico è maggiore se associato a emocultura 4 Infezioni basse vie respiratorie Diagnostica molecolare Si basa • Ricerca del DNA mediante amplificazione con metodica PCR • Tecnologia microarray Infezioni basse vie respiratorie Diagnostica molecolare identifica un organismo in base a sequenze geniche specifiche • ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO •AMPLIFICAZIONE CON PRIMER IDONEI A LIMITARE LA SEQUENZA GENICO SPECIFICA •IDENTIFICAZIONE DNA AMPLIFICATO IMMUNO CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA SU GEL DI AGAROSIO FLUORESCENZA (REALTIME) Diagnostica molecolare Diagnostica Molecolare Vantaggi Svantaggi Elevata sensibilità Elevata specificità Non necessita di isolamento batterico Non necessit di microrganismi vitali Può essere eseguita su materiale preventivamente congelato • Determinazione qualitativa in Pcr tipo nested • Determinazione quantitativa (virus erpetici latenti) • Costo elevato • Se qualitativa non indica se infezione in atto o pregressa • Non consente di procedere alla determinazione della sensibilità ai chemioterapici • Richiede esperienza di metodiche molecolari • • • • • Diagnostica Molecolare • Nel nostro laboratorio vengono rilevati con PCR • Virus respiratori Adenovirus VRS Influenza A-B HSV1-2 HCMV • Batteri atipici • Miceti Mycoplasma Legionella Chlamydia Microarray Rappresenta un potenziale interessante per il laboratorio di microbiologia • Un DNA microarray (o DNA chip) è costituito da una collezione di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie solida. Permette di • Esaminare il profilo di espressione di un gene • Di identificare un gene in una miscela di migliaia • Sfrutta la tecnica di ibridazione inversa Aspergillo 5 Metodi indiretti Microarray Vantaggi • Rapido (non necessita di reazioni di amplificazione) • E' un sistema miniaturizzato • Dotato di alta processività • Permette analisi parallele su larga scala • Nei laboratori di ricerca è stato utilizzato per 1. 2. 3. Identificare funghi patogeni coinvolti nelle micosi invasive Identificazioni batteriche Per una rapida identificazione da bottiglie di emocolture positive Infezioni basse vie respiratorie Metodi sierologici Tests di immunofluorescenza Tests di FC Non sono utili per una diagnosi precoce Sono importanti a scopi epidemilogici Utili per la diagnosi di infezione dei patogeni atipici Necessitano di due campioni uno in fase acuta ed uno in fase di convalescenza (sieroconversione) • Permette di valutare se infezione in atto o infezione pregressa • • • • • • Polmonite da C.pneumoniae • La C.pneumoniae è responsabile del5%15% delle polmoniti Diagnostica di alcune patologie • Raramente è necessario il ricovero (anziani con comorbidità, associata ad altri patogeni) • La reinfezione è comune Polmonite da C.pneumoniae Diagnosi microbiologica difficile • La chlamydia è difficilmente coltivabile • La sierologia è problematica e non specifica Nelle infezioni primarie le IgM possono impiegare anche 3 settimane a manifestarsi Le IgG 8 settimane: la negatività non esclude la malattia Nelle reinfezione leIgM rimangono costanti Le IgG salgono rapidamente • PCR con marchio CE e IVD Recentemente è uscita Real time PCR solo qualitativa Viene eseguita su materiale respiratorio É specifica per la specie Polmonite da M.pneumoniae Il Mycoplasma è responsabile del10%-20% delle polmoniti nei giovani adulti Diagnosi • Esame colturale (troppo lento) • Tests sierologici Le agglut a freddo >1.64 supportano la diagnosi ma sono poco specifiche La reazione di FC rileva le IgM se il prelievo è precoce • PCR con marchio CE e IVD 6 Legionellosi Diagnosi di laboratorio metodiche utilizzate: - esame colturale * - rilevazione dell’antigene urinario - test di immunofluorescenza diretta * - rilevazione di anticorpi -ibridizzazione degli acidi nucleici * Esame colturale Rappresenta il gold standard per la diagnosi (per un risultato positivo occorrono da 3 a 5 giorni ) Materiali idonei sputo * campioni broncoscopici *E’ IMPOTANTE L’IDONEITA’ DEL MATERIALE .Terreni idonei BCYE (buffered charcoal yeast extract) BCYE con antibiotico Esame colturale Esame colturale Fattori che influnzano la sensibilità • E’ importante per • Scarsa sopravvivenza nelle secrezioni Confermare i risultati positivi dell’antigenemia • Produzione scarsa di secrezioni Individuare infezioni sostenute da specie e sierogruppi diversi da sier 1 Identificazione Ricerca dell’antigene urinario un metodo rapido che produce una diagnosi precoce (1 giorno dopo dopo l’insorgenza dei sintomi , può permanere per mesi ) Vengono valutate le seguenti caratteristiche L’atg è un componente della frazione polisaccaridicadella parete Capacità di crescita su BCYE Morfologia tipica delle colonie Capacità di reagire con antisieri specifici fluorescenti e non Metodiche RIA EIA ( per più più sierogruppi ) Immunocromatografiche (solo per legionella p. sier 1 ) E’ un esame ritenuto sufficiente a fornire un criterio microbiologico di certezza nelle definizione di caso Test di ibridizzazione del DNA 7 Antigene urinario Data la sua possibile permanenza protratta nelle urine può risultare difficile la distinzione tra • • • infezione acuta fase di convalescenza infezione pregressa Immunofluorescenza diretta Questa tecnica che utilizza anticorpi fluorescenti specifici messi a contatto con frammenti di tessuto polmonare o secrezioni respiratorie pemette di • Antigene urinario • Test immunocromatografico ( BIOTEST ) Sensibilità 70-100 % ( dopo centrifugazione aumenta ) Specificità 100 % Vantaggi Svantaggi semplicità rapidità rileva solo la presenza di Lp 1 Immunofluorescenza diretta • Permette di evidenziare le legionelle anche dopo alcuni giorni dall’inizio della terapia antibiotica di rilevare le presenza di legionelle nei materiali respiratori • di identificare eventuali colonie sviluppatesi su terreni selettivi per legionella • L. non pneumophila (specificità e sensibilità di questi reagenti non è stata ancora ben valutata) • E’ possibile identificare L.pneumophila (sensibilità da 25 a 75% specificità sup a 95%) Diagnosi sierologica PCR La rilevazione di anticorpi specifici (IgG, IgM IgA ) può essere fatta con varie metodiche • Diagnosi rapida • Immunofluorescenza indiretta • Rileva la presenza di varie specie e sierogruppi di legionella • Metodi immunoenzimatici • Metodi di microagglutinazione E’ utile per una diagnosi retrospettiva ( E’ significativo un aumento del titolo di almeno 4 volte) Produce : • E’ applicabile a campioni ambientali • Ha una sensibilità simile all’esame colturale 8 Sindrome polmonare da hantavirus Polmonite da P.carinii • Malattia sistemica frequentemente letale In pazienti con deficit dell'immunità cellulo-mediata Diagnosi • Sierologica Rilevazione IgM specifiche IgG specifiche in aumento diagnosi immunofluorescenza diretta sul BAL PCR • PCR Rilevazione RNA specifico nei capioni cinici Aspergillosi polmonare • Diagnosi • es. microscopico diretto non specifico • Rilevazione del galattomannano su siero -La positività può precedere di 5-8 gg i sintomi clinici -Il test dovrebbe essere usato come screening -La rilevazione di risultati positivi in due campioni successivi supporta la diagnosi -Può essere usato come follow up della risposta clinica alla terapia -Il titolo diminuisce in caso di risposta clinica eccetto che per i paz. In terapia con echinocandine Sensibilita 80% Specificità 89,2% • PGR 9
