espressione del cd20 nella differenziazione delle b-cll

ESPRESSIONE DEL CD20 NELLA DIFFERENZIAZIONE DELLE B-CLL
MORFOLOGICAMENTE TIPICHE E ATIPICHE
SILVIA SALE, TEODORA CATALANO, MAURIZIO FUMI, DIANE MARTINS, YLENIA PANCIONE, GIUSEPPE GAUDENZI,
MARISA SIMEONE, NICOLA SARRACCO, VINCENZO ROCCO
Laboratorio Patologia Clinica “A.O. G. Rummo” Benevento
Riassunto
Nell’ambito delle malattie linfoproliferative croniche, le leucemie linfatiche croniche (LLC) risultano essere le
forme più rappresentative. Tra queste, una classificazione morfologica discrimina le LLC con immunofenotipo
tipico (score 4-5) ma atipiche dal punto di vista morfologico: questo va a delineare un gruppo di patologie che,
similmente alle altre atipiche dal punto di vista immunofenotipo e ai B-LNH, presentano prognosi peggiore. Casi con immunofenotipo tipico (score 4-5), ma con valori border-line di linfociti atipici e presenza di ombre di
Gumprecht, possono creare difficoltà nella diagnosi. Abbiamo utilizzato il CD20 come marcatore discriminante tra le LLC morfologicamente tipiche e atipiche. Una rivalutazione mediante l’analisi dell’espressione del CD20
di 17 casi di LLC atipiche e 113 LLC tipiche ha permesso di discriminare correttamente l’84% delle LLC morfologicamente atipiche. Queste ultime risultavano avere una minore dispersione del cluster del CD20 dovuta ad un
valore minimo di espressione più elevato.
Abstract
As part of the chronic lymphoproliferative disease, chronic lymphocytic leukemia (CLL) found to be the most representative forms. Among these, LLC typical immunophenotype (score 4-5) but atypical in terms of morphology, can be discriminated through a morphological classification: this define a group of diseases that have, like
the other atypical and B -NHL in terms of immunophenotype, a worse prognosis. Cases with typical immunophenotype (score 4-5), but borderline values of atypical lymphocytes and presence of shadows of Gumprecht,
can lead to difficulties in diagnosis. We used CD20 as a marker discriminating between typical and atypical CLL
morphology. A re-evaluation of CD20 expression by analysis of 17 cases of atypical CLL and 113 typical CLL
allowed to discriminate properly the 84 % of morphologically atypical CLL. The latter were considered to have
a lower dispersion of the CD20 cluster, result to a higher minimum value of expression.
Introduzione
Le leucemie linfatiche croniche (LLC) rappresentano
la maggior parte dei casi di leucemie linfoidi croniche. La diagnosi si basa sulle caratteristiche cliniche
e laboratoristiche.
Le caratteristiche cliniche come l’insorgenza e il decorso delle patologie sono variabili: il decorso clinico è nella maggior parte dei casi indolente, ma in pochi altri si è evidenziato un decorso clinico aggressivo con prognosi peggiore.
La WHO, secondo le linee guida redatte nel 2008,
identifica la CLL/SLL come neoplasia caratterizzata
da monomorfismo di piccoli linfociti B, rotondi o lievemente indentati, con cromatina addensata a zolle.
Per la diagnosi è richiesta una conta linfocitaria superiore a 5x109/L nel sangue periferico, la cui clonalità deve essere confermata mediante studio dell’immunofenotipo (Hallen et al, 2008).
Vi sono casi in cui vi è una normale conta linfocitaria, ma l’immunofenotipo evidenzia una popolazione clonale di B linfociti identificati dalla WHO con il
termine MBL, ovvero Linfocitosi B Monoclonale.
Molti ritengono che le MBL rispetto alle LLC rappresentino una condizione precancerosa come le
MGUS per il MM.
Infine con il termine SLL, vengono designati i casi
non vi è coinvolgimento del sangue periferico, ma la
morfologia e l’immunofenotipo tissutale risulta da
LLC. Lo studio immunofenotipico della LLC rileva
che, nella stragrande maggioranza dei casi, il clone
leucemico CD5+, CD23+, presenta anche mancata o
ridotta espressione del FMC7, mancata o ridotta
espressione del CD22/CD79b, debole/mancata
espressione delle sIg. Questi marcatori sono integrati in un sistema a score (Matutes and Polliak, 2000),
in cui un valore pari a 4 o 5 punti definisce un immunofenotipo LLC-tipico.
Dal punto di vista morfologico, le CLL possono essere distinte in:
- Tipiche: monomorfismo di piccoli linfociti (>90%)
con nucleo rotondo o lievemente indentato, cromatina addensata a zolle, scarso citoplasma;
- Atipiche: che comprendono le CLL/PLL, le mixedtype e le a-CLL (Tab. 1) (Frater et al, 2001).
Nelle CLL mixed-type rientrano i casi in cui vi è una
commistione di piccoli e grandi linfociti.
Le CLL “atipiche” (a-CLL), presentano una quota di
linfociti atipici clivati o indentati, uguale o superiore
al 10%. Nelle LLC/PLL sono riscontrabili occasionali immunoblasti e una quota di prolinfocitoidi tra
il 10 e il 55%.
Una conta border-line (circa 55%) di prolinfociti,
45
Tab. 1* Definizione delle B-Cell CLL e delle PLL
Tipo
Prolinfociti (%)
Commistione di piccoli
e grandi linfociti (%)
Linfociti atipici clivati
e indentati (%)
Immunofenotipo
solitamente riscontrato
CLL
≤10
No
<10
CD5+, CD19/CD20+,
CD23+, sIgdeb
CLL, mixed-type
≤10
Sí
<10
come per CLL
aCLL
≤10
No
10 o più
come per CLL
CLL/PLL
>10 e <55
No
---
come per CLL
PLL
≥55
No
CD5-, CD19/CD20-,
--- CD23-, sIgneg
CLL, Leucemia Linfatica Cronica; a-CLL, LLC atipica; PLL, Leucemia a pro linfociti; sIg, Immunoglobuline di superficie
*da John L.Frater(1), adattata da Bennet et al con l’aggiunta della definizione corrente di a-LLC.
d’altro canto, non crea difficoltà nella diagnosi differenziale delle PLL, dal momento che queste ultime si
presenteranno con un immunofenotipo differente
(Tab. 1).
Le LLC morfologicamente atipiche si presentano con
il medesimo immunofenotipo delle LLC-tipiche.
Il decorso della patologia risulta essere, però, a prognosi peggiore (Fig. 1) e quindi simile a quello di una
trasformazione prolinfocitoide o di una leucemia a
prolinfociti.
Il tutto è riconducibile ad alterazioni molecolari,
quali, in maggior misura, la trisomia 12 (Matutes et
al, 2007; Matutes et al, 1996; Cordone I, 1992; Criel
A, 1994).
A fronte di un difficile inquadramento dal punto di
vista morfologico (conta linfociti atipici, ombre di
Gumprecht), si rende necessaria la valutazione di
marcatori atti a discriminare i due gruppi. A tale scopo è stato preso in considerazione il CD20.
Dalla letteratura, esso risulta espresso a bassi livelli
nelle LLC tipiche, seguendo pari passo il suo epitopo
FMC7. Questa parziale correlazione in effetti, po-
Figura 1. Analisi Kaplan-Meier. Comparazione tra Leucemie Linfatiche Croniche atipiche e gruppo controllo (LLC tipiche): le prime risultano avere una maggiore probabilità di progressione della patologia rispetto il gruppo di controllo. (P=0.028 aggiustato
per età sesso, stage e diagnosi) (Frater et al, 2001).
46
trebbe essere spiegata dal momento che l’FMC7, lega il complesso multimerico del CD20 (Delgado et
al, 2003, Serke et al, 2001) con una conformazione
dettata dallo stato di glicosilazione. Mutazioni puntiformi nella regione extracellulare o delezioni nella
regione intracellulare del CD20, possano indurre
una ridotta espressione di FMC7, presumibilmente a
causa del cambio conformazionale dello stesso
(Deans e Polyak, 2008). L’FMC7, inoltre, risulta essere un epitopo insolitamente sensibile al colesterolo
di membrana (Poliak et al, 2003). Difatti i livelli di
espressione possono risultare differenti, in funzione
di uguali valori di CD20 ma differente concentrazione di colesterolo; similmente a quanto accade per diverse linee cellulari e per vari stadi di maturazione
delle cellule B.
Delgado et al (Delgado et al, 2003) hanno analizzato l’espressione di CD20 e FMC7 in 932 pazienti di
cui 630 LLC. Lo scopo era quello di sostituire il
CD20 nel sistema di score a 5 punti, al posto del suo
epiteto (Matutes e Polyak, 2000). Il 27,3% dei casi
CLL risultavano avere uno score pari a 3.
Delgado et al, evidenziavano un’ottima correlazione
tra l’espressione di CD20 e FMC7 nei B-NHL. L’analisi delle LLC evidenziava che, anche nei casi di
positività per il CD20, non vi era correlazione con il
suo epitopo: per tanto il CD20 risultava essere meno
specifico del suo epitopo FMC7.
Dal momento che, come detto in precedenza, le LLC
con morfologia atipica presentano una prognosi peggiore e dal momento che come evidenziato da Delgado
et al, il CD20 risulta nell’ambito delle linfoproliferative con score 4/5 meno specifico del suo epitopo FMC7,
scopo di questo lavoro è stata la valutazione del CD20
come possibile marcatore discriminante le a-LLC, utile
nell’affiancare la valutazione morfologica.
Materiali e Metodi
Pazienti e campioni
Dal novembre 2010 ad aprile 2011 sono stati analizzati un totale di 150 campioni di sangue periferico,
derivanti dalla normale routine, 113 LLC tipiche, 17
casi di LLC atipica, in prima diagnosi o in follow-up
non in terapia. Come controlli di immunofenotipo
normale, sono stati utilizzati campioni derivanti da
20 donatori sani adulti.
L’età media dei pazienti è risultata essere 71±13 anni
(range: 29 a 94 anni).
La diagnosi di B-CLPD, in osservanza alle linee guida redatte dalla WHO, si è basata sull’anamnesi clinica, caratteristiche morfologiche/immunofenotipiche ed in alcuni casi sulla genetica.
Reagenti ad anticorpi
Per l’analisi citofluorimetrica dei campioni, sono stati utilizzati gli anticorpi monoclonali CD45, CD19,
CD20 (clone B9E9), FMC7 della Beckman&Coulter.
Sono stati incubati 100μL di sangue intero (in EDTAK3) con 10μL di anticorpo monoclonale. L’incubazione e la lisi è stata effettuata mediante apparecchio
COULTER®TQ-PREP™ con reattivo IMMUNOPREP™ Reagent System a procedura standardizzata.
Per ogni campione sono stati acquisiti mediante
software CXP-Cytometer, ed analizzati mediante
CXP-Analisys, (in dotazione al Cytomic FX500),
5.000 eventi su gate immunologico linfocitario
CD45PC5/SSC. In three-color experiment il gate sulla popolazione CD19+ ci ha permesso di valutare l’espressione del CD20 e dell’FMC7 dei linfociti B.
Prima della analisi dei campioni è stato utilizzato il
Kit QuantiBRITE™PE (Becton Dickinson) per la
quota di siti leganti anticorpali per cellula (ABC).
Ogni campione è stato inoltre esaminato per altri
marcatori di superficie, quali CD10, CD22, CD23,
CD25, CD38, CD103, CD11c, CD79b, marcati con
isotiocianato di fluoresceina.
Per la valutazione dell’espressione delle sIg Kappa e
Lamda è stato utilizzato l’anticorpo triplo marcato
CD19ECD/KappaFITC/LambdaPE.
Tutti i campioni sono stati processati, mediante procedure standardizzate, entro 4 ore dal prelievo.
Analisi statistica
L’analisi statistica è stata effettuata mediante foglio
Figura 2 a) Box and Whiskers v. medio min tra Norm. LLC, aCLL e NHL
Figura 2 b) Box and Whiskers v. medio min tra Norm. LLC, aCLL e NHL
elettronico Microsoft Excel 2007 e software statistico MedCalc ver. 11.4.2.0. La comparazione tra i
gruppi è stata valutata mediante Box and Wiskers.
La correlazione e l’associazione tra i gruppi è stata
analizzata mediante test di correlazione di Spearman. E’ stata inoltre valutata una possibile capacità
discriminante tra due gruppi in studio, mediante valutazione dell’AUC individuata dalla ROC-Curve
corrispondente.
Risultati
Nella valutazione dell’espressione del CD20, è stato
considerato il valore di espressione minino e massino
del cluster dei linfociti B CD19+. Come atteso, le
LLC e le aCLL, a fronte di una ridotta espressione
del CD20 rispetto ai campioni normali e ai NHL, risultano avere una ridotta espressione sia del livello
minimo che del livello massimo del cluster linfocitario (p<0,0001) (Fig.3).
CD20: LLC vs LLC morfologicamente atipiche
Livello minimo. La media dei valori minimi del
CD20, nei linfociti B delle LLC tipiche è risultata pari a 205 (range 72-422), mentre nelle a-LLC pari a
511 (range 195-973); statisticamente significativo è
risultato il valore di p=0,0026.
Livello massimo. Nessuna significatività statistica
(p=0,402) è stata riscontrata per il valore medio del
livello massimo di espressione; le LLC infatti, con un
valore pari a 6399 (range 3186-8990) non risultano
differenti rispetto le a-LLC (media, 7239; range
3164-13597) (Fig.5a-5b; Tab.3).
E’ stata inoltre costruita la R.O.C. curve per il livello del minimo tra le LLC e le LLC morfologicamente atipiche (Fig.6) e l’AUC è risultata pari a 0,907.
Discussione e conclusioni
La diagnosi differenziale tra le LLC morfologicamente tipiche e quelle atipiche riveste notevole importanza ai fini prognostici del paziente.
Dal punto di vista immunofenotipico, il sistema di
score proposto da Moreau et al, successivamente
47
CD20
M. Min
Mediana
M. MAX
Mediana
LLC (range)
a-LLC (range)
205(72-422)
213
511(195-973)
555
p=0,0026
6399(3186-8990) 7239(3164-13597)
3967
6630
p=0,402
N.B. Data are given as number ± devSTD. P-value si riferisce alla comparazione valore medio min/MAX del CD20 in funzione
delle LLC.
Tab. 2 Media del valore medio min e MAX dell’espressione del
CD20 dei linfociti B CD19+ in LLC, a-LLC
CD20_Cut-Off LLC vs aLLC
100
Sensitivity: 91,3
Specificity: 83,9
Criterion : >248,155
Sensitivity
80
60
LLC vs a-LLC
40
20
Figura 3 Dot-plot esemplificativi mostranti la distribuzione dell’espressione del CD20 della popolazione di linfociti B CD19+
nelle LLC tipiche e nelle LLC morfologicamente atipiche.
0
0
20
40
60
80
100
100-Specificity
Figura 5 Reciver Operator Curve per il livello di espressione minimo del CD20 tra LLC e a-LLC. La sensibilità è risultata 91,3%
mentre la specificità 83,9%; AUC= 0,907
Figura 4 a) Box and Whiskers v. medio min LLC vs a-CLL; b)
Box and Whiskers v. medio MAX LLC vs a-CLL
modificato da Matutes e Polliack, ha mostrato una
buona sensibilità e specificità nel discriminare le
LLC dalle altre B-CLPD (linfomi e a-CLL). La discriminazione delle LLC con score 4-5 e morfologia atipica, può risultare difficoltosa a causa di valori border-line di linfociti varianti e a causa della presenza
di ombre di Gumprecht.
Le cellule della LLC tipica, infatti, presentano un minor numero di siti leganti anticorpali. Per cui, valori
di minimo inferiori a fronte di uguali valori di massimo, evidenziano un’ampia distribuzione del cluster
linfocitario. In uno studio effettuato su pazienti af-
48
fetti da LLC tipica, sono stati evidenziati normali livelli dell’mRNA del CD20 ma una ridotta espressione delle proteina (Shannon et al, 2010) evidenziando, un difetto post-trascrizionale.
Nella determinazione delle patologie linfoproliferative croniche, la valutazione di un marcatore PAN B,
quale il CD20 (sensibilità 92%, specificità 84%), risulterebbe un utile supporto al morfologo per la diagnosi di a-LLC.
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Pervenuto il 19/09/2011
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