INTRODUZIONE - Università Politecnica delle Marche

INTRODUZIONE
Ci sono numerose evidenze scientifiche che attribuiscono ad uno stile di vita adeguato e ad
una corretta alimentazione, ricca di frutta e verdura, una riduzione dell’incidenza del
cancro e delle malattie degenerative. É stato suggerito che tale ruolo protettivo derivi dagli
antiossidanti contenuti nella dieta (Ames et al 1993)
Nel lavoro di Block del 1991 sono stati esaminati circa 200 studi che mettevano in
relazione il consumo di frutta e verdura e vari tipi di cancro. Il risultato è stato che, nella
maggior parte dei lavori svolti, la frutta e i vegetali proteggono dall’insorgenza di possibili
malattie.
È noto ormai da tempo il coinvolgimento di una condizione di stress ossidativo come
denominatore comune nella patogenesi di svariate patologie croniche. Anche le più
moderne e complesse teorie sul ruolo dello stress ossidativo, in processi tanto fisiologici
quanto patologici, confermano che un equilibrio tra produzione di specie ossidanti e difese
antiossidanti sia indispensabile per preservare la salute umana e la longevità.
Parallelamente, un crescente numero di studi suggerisce una costante associazione tra il
consumo di diete prevalentemente su base vegetale, e una ridotta incidenza di patologie
croniche, quali malattie proliferative, neurodegenerative e cardiovascolari. In questo
scenario, l’ampia gamma di composti ad azione antiossidante contenuti in frutta e verdura
sembra giocare un importante ruolo benefico, confermato sia da studi clinici che
epidemiologici. In questo contesto emerge il frutto fragola, in quanto fonte di una
significativa quantità di composti antiossidanti.
Recentemente la fragola ha avuto un grande sviluppo commerciale, per questo motivo è
il frutto a bacca rossa più studiato sia a livello agronomico, sia genomico che
nutrizionale. Dal punto di vista nutrizionale ha un elevato contenuto di micronutrienti e
composti fitochimici, la maggior parte dei quali esprimono, almeno in vitro, importanti
proprietà antiossidanti (Hannum, 2004).
1
1.1 LO STRESS OSSIDATIVO
Lo stress ossidativo è una condizione patologica causata dalla rottura dell'equilibrio
fisiologico (Fig. 1) in un organismo vivente fra la produzione e l'eliminazione, da parte dei
sistemi di difesa antiossidanti, di specie chimiche ossidanti.
Fig. 1 Equilibrio tra produzione ed eliminazione di specie ossidanti
Tutte le forme di vita mantengono un ambiente riducente entro le proprie cellule;
l'ambiente cellulare è preservato da enzimi che mantengono lo stato ridotto attraverso un
costante input di energia metabolica. Eventuali disturbi in questo normale stato red-ox
possono avere effetti tossici per la produzione di radicali liberi e specie reattive
dell’ossigeno e dell’azoto che danneggiano tutti i componenti della cellula, incluse
proteine, lipidi e DNA.
Le specie reattive ed i radicali liberi svolgono importantissimi ruoli fisiologici, quali la
difesa nei confronti dei batteri, la trasmissione dei segnali biochimici fra le cellule, il
controllo della pressione arteriosa ecc.
2
Specie chimica
Formula
Classe
Specie chimica
Formula
Classe
Ozono
O3
Non radicale
Ossido nitrico
NO•
Radicale
Anione superossido
O2•
Radicale
Acido nitroso
HNO2
Non radicale
O2*
Radicale (?)
Tetrossido nitrico
N2O4
Non radicale
Perossido di idrogeno
H2O2
Non radicale
Triossido nitrico
N2O3
Non radicale
Radicale ossidrile
HO•
Radicale
Perossinitrito
ONOO-
Non radicale
Radicale alchilico
R•
Radicale
Acido perossinitroso
ONOOH
Non radicale
(Alchill-)perossil radicale
ROO•
Radicale
Catione nitronio
NO2+
Non radicale
(Alchil)idroperossido
ROOH
Non radicale
(Alchil)perossinitrito
ROONO
Non radicale
Semichinone (dal Coenz.
Q)
Q•
Radicale
Acido ipocloroso
HOClO
Non radicale
Fenossile (dalla vitamina
E)
E-O•
Radicale
Tiile
-S•
Radicale
Ossigeno singoletto
1
Tabella 1: Specie reattive di rilevante interesse biologico.
È solo il loro eccesso, generalmente riferito ad una o più classi di ossidanti, ad essere implicato
nello stress ossidativo, oggi ritenuto associato ad oltre cento patologie umane (quali fibroplasia
retrolenticolare, aterosclerosi, ipertensione arteriosa, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer,
diabete mellito, colite, artrite reumatoide ecc.), e potrebbe inoltre essere importante nel processo
di invecchiamento (Fig. 2).
3
Fig. 2: Le specie chimiche reattive possono essere sia la causa sia l’effetto dello
stress ossidativo.
Quindi, i responsabili dello stress ossidativo non sono solo i radicali liberi dell'ossigeno. Possono
provocare questa patologia specie sia radicaliche sia non radicaliche (come, ad esempio, l'anione
superossido e il perossido d'idrogeno) o su altri elementi, quali lo zolfo (ad esempio il radicale
tiile) o il cloro (ad esempio acido ipocloroso).
Quindi come abbiamo già anticipato lo stress ossidativo e nitrosativo sono condizioni alla base di
molte malattie acute e croniche oltre che nel fisiologico processo d’invecchiamento. Tuttavia non
è ancora stato possibile stabilire l’effettivo ruolo delle specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto
nella patologia umana. Per questo motivo è necessario individuare dei marcatori validi di stress
ossidativo, che permettano di distinguere i processi biologici fisiologici da quelli patologici e di
monitorare la risposta ad un intervento terapeutico.
L’analisi diretta delle ROS/RNS è estremamente difficile (Tarpey et al. 2004, Swartz et al. 1972)
a causa della loro elevata reattività e breve emivita (10-5, 10-6, 10-9 sec rispettivamente per il
radicale superossido, l’ossigeno singoletto e il radicale idrossile).
Lo studio dello stress ossidativo si avvale principalmente di metodi in grado di rilevare le
alterazioni indotte su proteine, lipidi e DNA (Tab. 3).
4
Anche la diminuzione delle molecole con capacità antiossidante, ad esempio il glutatione e le
vitamine lipo- e idrosolubili, è considerata un marcatore indiretto di stress ossidativo sebbene sia
più soggetto all’interferenza della dieta.
Le tecniche utilizzate spaziano dai più semplici saggi spettrofotometrici a quelle più complesse
che prevedono l’utilizzo di cromatografia liquida ad elevata prestazione (HPLC), gas
cromatografia e spettrometria di massa; in questi ultimi anni sono stati messi a punto anche
alcuni saggi ELISA.
Sono disponibili molteplici procedure per l’analisi dei marcatori indiretti di stress ossidativo sia
nei fluidi biologici (sangue, urine, saliva, tab.2), principalmente usati negli studi sull’uomo, sia
nei tessuti, sfruttati per lo studio approfondito di modelli animali. (Franzini et al.2009)
Fig. 3 Effetto dell’azione dei radicali liberi su una cellula.
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Campioni
biologici
LIPIDI
PROTEINE
MARCATORI:
MARCATORI:
DNA
MARCATORI:
8-OHDG GC-MS
CARBONILI
NO2-TYR
CL-TYR
BR-TYR
TYR-TYR
AGE
NEOEPITOPI
PRODOTTI DI OSSIDAZIONE DI
SINGOLI AMINOACIDI
MDA E TBARS
4-HNE
DIENI CONIUGATI
BASI OSSIDATE
F2-ISOPROSTANI
ROTTURA DELLA DOPPIA ELICA
LIPOPEROSSIDI
LDL-OSSIDATE
METODI DI
ANALISI
METODI DI
ANALISI
Spettrofotometria
Elisa
(Tba-Test)
HplcFluorimetria
Elisa
Immunoistochimi
ca
METODI DI
ANALISI
Spettrofotometria
Elisa
Western Blot
Immunoistochimica
Gc-Ms
Hplc
Elisa
Saggio Delle Comete (Comet)
Immunoistochimica
Elisa
Spettrofotometria
Western Blot/Immunoistochimica
Tabella 2 Alcuni marcatori di stress ossidativo quantificabili nei tessuti e fluidi biologici (plasma,
siero, urine) e loro metodi di analisi
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Abbreviazioni: AGE: composti finali di glicazione; Br-Tyr: 3bromo-tirosina; Cl-Tyr: 3-cloro-tirosina; GC-MS: gas
cromatografia-spettrometria di massa; GSH: glutatione ridotto; GSSG: glutatione ossidato; 4-HNE: 4-idrossinonenale; LCAPCI-MS: cromatografia liquida-atmospheric pressure chemical ionization-spettrometria di massa; MDA: malonildialdeide; 8OHdG: 8-idrossi-2’-deossiguanosina; NO2-Tyr: 3-nitro-tirosina; TBA: acido tiobarbiturico; TBARS: sostanza reattiva al TBA
1.2 BIOMARCATORI DI OSSIDAZIONE DELLE PROTEINE
Il processo di ossidazione delle proteine generalmente comporta l’introduzione di nuovi gruppi
funzionali che possono contribuire ad alterare la funzione e il metabolismo delle stesse (Dean et
al. 1997).
Gli studi sulle modificazioni ossidative delle proteine hanno dimostrato una serie di conseguenze
irreversibili incluse frammentazione, alterazione della struttura tridimensionale, aggregazione,
che comportano perdita funzionale (Dean et al. 1997, Davies et al. 1999).
Il destino di queste molecole è generalmente la degradazione da parte del proteosoma o dei
lisosomi, ma in alcuni casi si formano aggregati che si accumulano all’interno o all’esterno della
cellula insensibili alla degradazione.
I residui aminoacidici più sensibili all’ossidazione sono quelli contenenti gruppi aromatici o
tiolici, ma anche i residui alifatici sono soggetti a fenomeni di ossidazione con generazione di
gruppi carbonilici. I principali biomarcatori di ossidazione delle proteine sono i gruppi
carbonilici e i prodotti di ossidazione della tirosina.
1.2.1 Gruppi carbonili delle proteine
I gruppi carbonilici sono un generico prodotto di ossidazione delle biomolecole, sulle proteine
possono essere generati tramite ossidazione diretta degli aminoacidi prolina, arginina, lisina, e
treonina da parte di radicali liberi, oppure in conseguenza a fenomeni di lipoperossidazione
(LPO), legame di α-β-aldeidi insature su residui di istidina , lisina, cisteina o di
glicazione/glicossidazione (reazione tra un carboidrato e un amino - gruppo proteico) con
formazione dei composti finali di glicazione (Stadtman et al. 1997, Burcham et al. 1996, Vlassara
et al. 1994) . (Fig.4)
La formazione di gruppi carbonilici sulle proteine è considerato un marcatore di stress ossidativo
severo e generalizzato, dalla sua analisi non è possibile estrapolare quale sia l’origine delle
ROS/RNS responsabili delle reazioni pro-ossidanti, d’altra parte rappresentano un prodotto di
ossidazione chimicamente stabile addirittura nell’arco di 10 anni se il campione è conservato a 7
80°C (Stadtman et al.2003). La misura totale dei carbonili proteici può essere condotta su
campioni di plasma, siero, lisati cellulari, proteine purificate e prevede la derivatizzazione di tali
gruppi con il composto dinitrofenil-idrazina (DNPH). Dalla reazione si genera un cromoforo
idrazone con un picco di assorbimento a 360 nm e un coefficiente di estinzione molare di 22000
M-1cm-1 (Reznick et al. 1994, Levine et al. 2000).
La determinazione spettrofotometrica diretta è poco utilizzata perché non fornisce informazioni
sull’identità delle proteine ossidate, per questo è piuttosto associata a tecniche cromatografiche o
elettroforetiche (SDS-PAGE, bidimensionale) per la separazione delle proteine. In quest’ultimo
caso la derivatizzazione dei gruppi carbonilici con DNPH è condotta dopo trasferimento delle
proteine su membrana di PVDF(polivinildenfluoruro) e la rivelazione avviene con l’ausilio di
anticorpi specifici che riconoscono il gruppo dinitrofenile (DNP)(Reznick et al. 1994, Levine et
al. 2000, Talent et al.1998). Gli anticorpi contro il gruppo DNP sono stati utilizzati anche per
sviluppare tecniche ELISA)(Reznick et al. 1994, Levine et al. 2000, Talent et al.1998, Buss et al.
1997) per la quantificazione dei gruppi carbonilici e tecniche di immunoistochimica per
localizzare nel tessuto il danno ossidativo (Pompella et al. 1996, Frank et al. 2000).
Un accumulo di carbonili proteici è stato dimostrato nell’invecchiamento cellulare, nel danno da
ischemia/riperfusione, nelle infiammazioni croniche, nella fibrosi cistica (Dalle-Donne et al.
2003).
Figura 4 Tre possibili vie di ossidazione delle proteine con conseguente introduzione di
gruppi carbonilici e formazione di nuovi epitopi.
8
1.3 BIOMARCATORI DI OSSIDAZIONE DEI LIPIDI
I fosfolipidi di membrana e i trigliceridi nelle lipoproteine LDL sono particolarmente suscettibili
ad attacco radicalico.
Il processo di ossidazione dei lipidi, LPO, ha inizio con la sottrazione di un atomo d’idrogeno da
un gruppo etilenico adiacente a un doppio legame di un acido grasso
polinsaturo (PUFA), si forma così un radicale centrato su un atomo di carbonio. Dal
riarrangiamento del doppio legame si forma un diene coniugato, mentre l'ossigeno
molecolare presente reagisce con il radicale centrato sul carbonio formando un radicale perossile
che a sua volta reagisce con un altro PUFA formando un idroperossido e un nuovo radicale
centrato sul carbonio.
Gli idroperossidi lipidici possono reagire ulteriormente e formare perossidi ciclici, endoperossidi
ciclici, aldeidi α,β-insature come la 4-idrossi nonenale (4-HNE), la acroleina, e la
malonildialdeide (MDA). Oltre alle aldeidi altri prodotti terminali della LPO sono il pentano e
l'etano, i dieni 2,3 trans-coniugati, gli isoprostani e i colesterolo-ossidi.
Le aldeidi prodotte nella LPO, sono molecole chimicamente reattive e in grado di
reagire e
formare legami covalenti con le proteine e gli acidi nucleici, perciò contribuiscono ad
amplificare il danno radicalico.
Idroperossidi lipidici e aldeidi possono essere assorbiti anche con la dieta e quindi escreti con le
urine. Perciò la misura di queste specie nel plasma e nelle urine non può
essere considerata un buon indice di LPO, a meno che non ci sia un stretto controllo sulla dieta.
1.3.1 F2-isoprostani
Una particolare classe di composti generati durante LPO a carico dell’acido arachidonico sono
gli isoprostani.
Inizialmente gli isoprostani sono formati come acidi grassi esterificati ai fosfolipidi colpiti da
attacco radicalico, poi sono rilasciati in circolo per azione di fosfolipasi di membrana (Roberts et
al. 2000).
In particolare gli F2-isoprostani (F2-IsoPs) sono la classe più studiata come marcatore di LPO
per le seguenti ragioni:
9
a) aumentano in funzione del grado di stress ossidativo; (Morrow et al. 2005, Pratico et al. 2001,
Pratico et al. 2004)
b) le tecniche di analisi a disposizione (gas-cromatografia e cromatografia liquida associata a
spettormetria di massa (Morrow et al. 2005, Pratico et al.2004) permettono di misurare
concentrazioni picomolari;
c) sono chimicamente stabili nei campioni di fluidi biologici;
d) non sembrano essere influenzati dai lipidi contenuti nelle dieta (Richelle et al.1999, Higdon et
al 2000);
e) sono un prodotto specifico di LPO radicalica e non un prodotto secondario del metabolismo
dell’acido arachidonico da parte delle ciclo- e lipo-ossigenasi (Tsikas et al.2003).
Il plasma è ricco di lipidi e di acido arachidonico, per evitare la formazione di F2-IsoPs ex vivo è
consigliabile aggiungere un antiossidante (ad es. il butilidrossitoluene e la trifenilfosfina) e
conservare il campione a -80°C (Schwedhelm et al. 2003). Inoltre gli F2-IsoPs in circolo sono
presenti sia liberi che esterificati ai fosfolipidi delle lipoproteine, per quantificare questi ultimi è
necessario un processo di idrolisi per ottenerli in forma libera. L’emivita degli F2-IsoPs nel
plasma è di circa 18 minuti, quindi la concentrazione plasmatica rappresenta una situazione di
equilibrio tra produzione ed eliminazione (Griffiths et al 2002).
Nelle urine gli F2-IsoPs sono solo in forma libera e il basso contenuto in lipidi riduce il rischio di
auto-ossidazione, comunque è consigliata l’aggiunta di EDTA (Schwedhelm et al.2003). Gli F2IsoPs nelle urine sono stabili e non ulteriormente metabolizzati, perciò se si vuole misurare la
produzione di F2- IsoPs nel tempo è necessario quantificarli nelle urine (Griffiths et al. 2002).
La validità biologica degli F2-IsoPs come indice di stress ossidativo è stata comprovata in varie
condizioni cliniche, ad esempio nelle infiammazioni acute e croniche, nel danno da
ischemia/riperfusione, nel diabete, nell’aterosclerosi (Roberts et al. 2000, Morrow et al. 2005,
Halliwell et al.2004, Cracowski et al. 2002, Montuschi et al.2004, Janssen et al.2001, Montine et
al.2005) .
Recentemente è stato proposto che la concentrazione di 8-iso-PGF2-alfa, il componente della
famiglia di F2-IsoPs più frequentemente misurato nelle urine, rappresenti un fattore indipendente
di rischio per le malattie cardiovascolari (Schwedhelm et al.2003).
In questi ultimi anni sono state sviluppate anche tecniche immunologiche (RIA, ELISA) per la
quantificazione di F2-IsoPs (Morrow et al. 2005), ma sono ancora scarsi i dati riguardo
l’accuratezza e la precisione di questi saggi e per ciò che concerne il confronto con la tecnica di
riferimento (gas cromatografia- spettrometria di massa).
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1.4 BIOMARCATORI DI OSSIDAZIONE DEL DNA
L’attacco delle ROS, in particolare del radicale idrossile, sugli acidi nucleici può causare
mutazioni su specifiche basi e anche rottura della doppia elica. In questo stesso numero speciale,
dedicato allo stress ossidativo, un articolo è proprio dedicato al ruolo del danno ossidativo agli
acidi nucleici nella patogenesi delle malattie cardiovascolari.
Per misurare i prodotti di ossidazione del DNA sono state messe a punto numerosi metodi
cromatografici (in fase gassosa o liquida) seguite da analisi in spettrometria
di massa, ma anche tecniche immunometriche.
1.4.1. L’8OhdG
Il marcatore di danno ossidativo sul DNA più utilizzato è la 8-idrossi-2’-deossiguanosina (8HdG) (Griffiths et al. 2002, Halliwell et al.2004, Collins et al. 2004) per il quale sono disponibili
anche metodi ELISA competitivi per la sua quantificazione in estratti di tessuto o nei fluidi
biologici(Halliwell et al.2004).
Uno dei principali problemi nello studio del danno ossidativo al DNA è la limitata disponibilità
di tessuto umano dal quale estrarre il DNA stesso. La maggior parte degli studi è condotta su
DNA estratto da linfociti o dai leucociti totali presupponendo che costituiscano uno specchio per
tutti gli altri tessuti (Halliwell B. 2002).
Durante il processo di riparazione in vivo del DNA, e soprattutto in seguito alla degradazione
degli acidi nucleici conseguente alla morte cellulare, la 8-OHdG viene liberata e secreta nelle
urine sia come base singola sia inclusa in oligomeri di DNA senza ulteriori modifiche (Lindahl
T. 2001). Data la stabilità e la specificità, la concentrazione di 8-OHdG nelle urine è uno dei
marcatori più affidabili per valutare il grado di stress ossidativo sistemico. Comunque bisogna
considerare che la 8-OHdG può derivare anche dalla degradazione del deossinucleotide dGTP, e
che non è l’unico prodotto di ossidazione del DNA. Quindi la 8-OHdG rappresenta una misura
parziale di danno al DNA, relativa solo ai residui di guanina e ai suoi precursori (Dizdaroglu et
al. 2007).
11
1.5 CARATTERISTICHE DI UN BIOMARCATORI DI STRESS
OSSIDATIVO
In molte condizioni patologiche è possibile riscontrare un aumento dello stress ossidativo,
individuare un valido biomarcatore di questa condizione potrebbe aiutare a capire in quali
malattie le ROS/RNS hanno un ruolo causale e quindi sviluppare strategie preventive per
ritardare lo sviluppo della malattia.
Un biomarcatore è definito come una sostanza quantificabile, particolarmente resistente alla
degradazione, utilizzata quale indicatore di un particolare stato biologico, normale o patologico,
o come indice di risposta a una terapia farmacologica. Secondo questa definizione possono
essere considerati marcatori di stress ossidativo sia prodotti di ossidazione delle biomolecole
(acidi nucleici, lipidi, proteine) sia il consumo degli antiossidanti.
Il biomarcatore ideale di stress ossidativo dovrebbe (Griffiths et al. 2002):
essere un prodotto stabile nel tempo, non soggetto ad alterazioni durante la
manipolazione e conservazione del campione
avere un ruolo nella patogenesi della malattia ed essere predittivo per lo sviluppo futuro
della malattia
essere presente nel tessuto d’indagine o in altro tessuto che comunque rifletta le
modificazioni ossidative del primo,
essere presente in concentrazione tale da essere quantificabile tramite una tecnica
specifica, sensibile e riproducibile,
non essere influenzato da fattori dietetici,
avere una bassa variabilità biologica ed essere facilmente
misurabile nella popolazione.
Nessuno dei marcatori attualmente disponibile soddisfa tutti i criteri elencati, quelli che più si
avvicinano dal punto di specificità e stabilità del campione sono la 8-OHdG nelle urine, come
marcatore di danno al DNA, gli F2-isoprostani e i suoi metaboliti nelle urine, come indice di
LPO, i prodotti di ossidazione delle Tyr per il danno sulle proteine.
Data la molteplicità dei bersagli delle ROS/RNS e il complesso metabolismo al quale vanno
incontro i prodotti delle loro reazioni, è verosimile che l’insieme di più marcatori sia più
informativo di uno solo, anche perché ognuno di essi rispecchia una sfaccettatura dell’intero
fenomeno.
12
Il sistema antiossidante negli organismi viventi
Antiossidanti (AO)
AO enzimatici (endogeni)
AO non enzimatici
Superossido-dismutasi
AO endogeni (GSH, AU,…)
Catalasi
Vitamine AO (A, E, AL, B, C, …)
Perossidasi
AO simil-vitaminici
(polifenoli,…)
Difesa contro le SCR
Fig. 5 Il sistema antiossidante negli organismi viventi. Contro le SCR, antiossidanti enzimatici e
non enzimatici, esogeni e endogeni, lipofili e idrofili.
1.6 ANTIOSSIDANTI:
1.6.1 Visione d'insieme
Gli antiossidanti sono sostanze chimiche (molecole, ioni, radicali) o agenti fisici, che rallentano
o prevengono l'ossidazione di altre sostanze. L'ossidazione è una reazione chimica che trasferisce
elettroni da una sostanza ad un ossidante. Le reazioni di ossidazione possono produrre radicali
liberi, responsabili dell'avvio di una reazione a catena che danneggia le cellule; gli antiossidanti
terminano queste reazioni a catena intervenendo sui radicali intermedi ed inibendo altre reazioni
di ossidazione facendo ossidare se stessi. Come risultato, gli antiossidanti sono definiti
chimicamente agenti riducenti - come tioli o polifenoli - in quanto le reazioni chimiche coinvolte
sono di ossido-riduzione.
Anche se le reazioni di ossidazione sono fondamentali per la vita, possono essere altrettanto
dannose; perciò, piante ed animali mantengono complessi sistemi di molteplici tipi di
antiossidanti, come glutatione, vitamina C e vitamina E, così come enzimi quali catalasi,
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superossido dismutasi e vari perossidasi. Livelli troppo bassi di antiossidanti o di inibizione degli
enzimi antiossidanti causano stress ossidativo e possono danneggiare o uccidere le cellule.
Così come lo stress ossidativo potrebbe essere la causa di molte malattie umane, così l'uso degli
antiossidanti in farmacologia è stato intensamente studiato, in particolare nei trattamenti
dell'ictus e delle malattie neurodegenerative; ma non si sa se lo stress ossidativo sia la causa o la
conseguenza di queste malattie. Gli antiossidanti sono largamente usati come ingredienti negli
integratori alimentari con la speranza di mantenere il benessere fisico e prevenire malattie come
cancro e cardiopatie coronariche. Anche se alcuni studi hanno suggerito che l'integrazione di
antiossidanti ha benefici sulla salute, molti altri studi di ricerca medica non hanno rilevato alcun
beneficio per le formulazione testate, mentre un eccesso di integrazione può risultare dannoso
(Bjelakovic G, et al 2007). In aggiunta a questi usi in medicina, gli antiossidanti hanno molti usi
industriali, ad esempio come conservanti in cibo e cosmetici e nella prevenzione della
degradazione di gomma e benzina.
1.6.2 Gli antiossidanti idrofilici o lipofilici
In generale, gli antiossidanti idrosolubili reagiscono con gli ossidanti nel citoplasma cellulare e
nel plasma, mentre quelli liposolubili proteggono le membrane cellulari dalla perossidazione
lipidica (Sies 1997). Questi composti possono essere sintetizzati dal corpo umano o ottenuti dalla
dieta (Vertuani et al. 2004). I differenti antiossidanti sono presenti nei fluidi e nei tessuti corporei
in un ampio intervallo di contrazioni, come glutatione e ubichinone presenti per la maggior parte
nelle cellule, mentre altri come l'acido urico sono uniformemente distribuiti attraverso il corpo
(vedi tabella in basso). L'importanza relativa e le interazioni tra questi differenti antiossidanti è
un ambito complesso, con i vari metaboliti e sistemi enzimatici che hanno effetti sinergici e
interdipendenti fra di loro (Chaudière et al. 1999, Sies 1993). L'azione di un ossidante può
dipendere dalla corretta funzione degli altri membri del sistema antiossidante. La quantità di
protezione fornita da un antiossidante dipende quindi dalla sua concentrazione, dalla sua
reattività verso la particolare specie reattiva dell'ossigeno considerata e lo stato degli
antiossidanti con cui interagisce (Vertuani et al. 2004). Alcuni composti contribuiscono alla
difesa fornita dagli antiossidanti chelando i metalli di transizione prevenendo così l'effetto
catalitico che questi forniscono nella produzione dei radicali liberi nella cellula. Particolarmente
importante è l'abilità di sequestrare il ferro, funzionale alle proteine adibite al trasporto del ferro
nell'organismo (iron-binding proteins) quali transferrina e ferritina (Imlay 2003). Selenio e zinco
sono comunemente considerati nutrienti antiossidanti, ma questi elementi chimici non hanno
14
un'azione antiossidente di per sé ma sono invece necessari per l'attività antiossidante di alcuni
enzimi.
Antiossidante
Solubilità
Concentrazione in siero
Concentrazione nel tessuto
umano (µM)
del fegato (µmol/kg)
Acqua
50 - 60
260 (umano)
Glutatione
Acqua
325 - 650
6.400 (human)
Acido lipoico
Acqua
0.1 - 0.7
4 - 5 (ratto)
Acido urico
Acqua
200 - 400
1.600 (umano)
Caroteni
Lipidi
β-carotene: 0.5 - 1
metabolita
Acido ascorbico
(vitamina C)
5 (umano, carotenoidi totali)
retinolo (vitamina A): 1
3
α-tocoferolo
Lipidi
10 - 40
50 (umano)
Lipidi
5
200 (umano)
(vitamina E)
Ubichinolo
(coenzima Q)
1.6.2.1 Acido ascorbico
L'acido ascorbico o "vitamina C" è un monosaccaride antiossidante che si trova sia negli animali
sia nelle piante. Negli umani non può essere sintetizzato tal quale e deve essere introdotto con la
dieta (Smirnoff 2001). Molti altri animali sono in grado di produrre questo composto nei loro
corpi e non ne hanno bisogno nella loro dieta (Linster et al. 2007).
Nelle cellule, viene mantenuto nella sua forma ridotta per reazione con glutatione, che può essere
catalizzata da proteina disulfide isomerasi e glutaredossine (Meister 1994, Wells et al. 1990).
L'acido ascorbico è un agente riducente e può ridurre e di conseguenza neutralizzare le specie
reattive dell'ossigeno come il perossido di idrogeno (Padayatty et al. 2003). In aggiunta ai suoi
effetti antiossidanti, l'acido ascorbico è un substrato per l'enzima antiossidante ascorbato
perossidasi, una funzione particolarmente importante nella resistenza alla tensione delle piante
(Shigeoka et al. 2002).
15
1.6.2.2 Glutatione
Fig. 6 Il meccanismo dei radicali liberi della perossidazione lipidica
Il glutatione è un peptide contenente cisteina che si trova in molte forme di vita aerobiche
(Meister et al. 1983). Essendo sintetizzato nelle cellule dai suoi costituenti, gli amminoacidi, non
è richiesto nella dieta (Meister et al. 1988). Il glutatione mantiene le sue proprietà antiossidanti
finché il gruppo tiolo presente nella cisteina è un agente riducente e può essere ossidato e ridotto
in maniera reversibile. Nelle cellule, il glutatione viene mantenuto in forma ridotta dall'enzima
glutatione riduttasi e a sua volta riduce altri metaboliti e sistemi enzimatici reagendo
direttamente con gli ossidanti (Meister et al. 1984). Per la sua alta concentrazione e per il ruolo
centrale nel mantenere la cellula allo stato redox, il glutatione è uno dei più importanti
antiossidanti cellulari ((Meister et al. 1983).
1.6.2.3 Melatonina
La melatonina è un forte antiossidante che può facilmente attraversare le membrane cellulari e la
barriera ematoencefalica (Reiter et al.1997). A differenza di altri antiossidanti, la melatonina non
percorre un ciclo redox, che è l'abilità di una molecola di essere soggetta a ripetute riduzioni e
ossidazioni. Il ciclo redox può consentire agli altri antiossidanti (come la vitamina C) di agire
16
come proossidanti e promuovere la formazione di radicali liberi. La melatonina, una volta
ossidata, non può più essere ridotta al suo stato precedente perché forma numerosi prodotti finali
stabili una volta reagito con i radicali liberi. Quindi, viene definito un antiossidante terminale (o
suicida) (Tan et al. 2000).
1.6.2.4 Tocoferoli e tocotrienoli (vitamina E)
La vitamina E è il nome collettivo di un set di otto tocoferoli e tocotrienoli relazionati fra loro,
che sono vitamine antiossidanti liposolubili (Herreraet al. 2001). Di queste, l'α-tocoferolo è stata
quella più studiata, data la sua elevata biodisponibilità nel corpo, che preferenzialmente assorbe e
metabolizza questa forma (Brigelius-Flohè et al. 1999). La forma α-tocoferolo è il più importante
antiossidante liposolubile e protegge le membrane cellulari dall'ossidazione reagendo con i
radicali lipidici prodotti nella reazione a catena della perossidazione lipidica (Herreraet al. 2001).
Rimuove i radicali liberi intermedi e impedisce la continuazione della reazione di propagazione.
I radicali ossidati di α-tocoferossile prodotti in questo processo possono essere riportati alla
forma ridotta attiva per riduzione con ascorbato, retinolo o ubichi none(Wang et al. 1999). Le
funzioni delle altre forme della vitamina E sono state meno studiate, anche se l'γ-tocoferolo è un
nucleofilo che può reagire con elettrofili mutageni (Brigelius-Flohè et al. 1999), e i tocotrienoli
possono avere un ruolo specifico nella neuro protezione (Sen et al. 2006).
1.6.3 ATTIVITÀ PROOSSIDANTE
Gli antiossidanti che sono riducenti possono anche agire come proossidanti. Ad esempio, la
vitamina C ha un'attività antiossidante quando riduce sostanze ossidanti come il perossido di
idrogeno,(Duarte et al. 2005) ma può anche ridurre ioni metallici che portano alla generazione di
radicali liberi attraverso la reazione di Fenton (Carr e Frei 1999, Stohs e Bagchi 1995).
2 Fe3+ + ascorbato → 2 Fe2+ + deidroascorbato
2 Fe2+ + 2 H2O2 → 2 Fe3+ + 2 OH· + 2 OH−
L'importanza relativa delle attività antiossidanti e proossidanti degli antiossidanti sono un'area di
ricerca attuale, ma la vitamina C, per esempio, sembra avere perlopiù un'attività antiossidante nel
corpo.(Valko et al. 2005, Carr e Frei 1999). Comunque, sono disponibili ancora meno
informazioni per gli altri antiossidanti presenti nella dieta, come polifenoli antiossidanti
(Halliwell 2007) zinco(Hao e Maret 2005) e vitamina E (Schneider 2005).
17
1.6.4 SISTEMI ENZIMATICI
Fig. 5 Ciclo metabolico enzimatico per la detossificazione di specie reattive dell'ossigeno
Così come avviene per i composti chimici antiossidanti anche le cellule sono protette contro lo
stress ossidativo, grazie ad una rete interattiva di enzimi antiossidanti.(Davies 1995, Sies 1997).
Qui, il superossido rilasciato dai processi come la fosforilazione ossidativa è dapprima convertito
a perossido di idrogeno e successivamente ridotto ad acqua. Questa via metabolica di
detossificazione è il risultato dell'azione di più enzimi, con le superossido dismutasi che
catalizzano il primo stadio e poi catalasi e varie perossidasi che rimuovono il perossido di
idrogeno. Come per i metaboliti antiossidanti, i contributi di questi enzimi sono difficilmente
separabili gli uni dagli altri, ma la generazione di topi transgenici con un solo enzima
antiossidante può essere informativa.( Ho et al. 1998).
1.6.4.1 Superossido dismutasi, catalasi e perossiredossine
Le superossido dismutasi (SOD) sono una classe di enzimi strettamente correlati che catalizzano
la rottura dell'anione superossido in ossigeno e perossido di idrogeno (Zelko et al. 2002,
Bannister et al. 1987).Gli enzimi SOD sono presenti in quasi tutte le cellule aerobiche e nei fluidi
extracellulari(Johnson e Giulivi 2005). Contengono ioni metallici come cofattori che, a seconda
dell'isozima, può essere rame, zinco, manganese o ferro. Negli umani, la SOD rame/zinco
(SOD1) è presente nel citosol, mentre la manganese-SOD (SOD2) è presente nei mitocondri
(Bannister et al. 1987). Esiste anche una terza forma di SOD nei fluidi extracellari (SOD3), che
contiene rame e zinco nei suoi siti attivi.(Nozik-Grayck et al. 2005). L'isozima micondriale
sembra essere biologicamente il più importante di questi tre, poiché i topi privi di questo enzima
muoiono presto dopo la nascita ( Melov et al. 1998). Per contro, la generazione di topi cui manca
la SOD rame/zinco è possibile ma presentano una bassa fertilità, mentre i topi senza la SOD
extracellulare hanno difetti minimi(Ho 1998, Reaume 1996). Nelle piante, gli enzimi SOD sono
18
presenti nel citosol e nei mitocondri, con una SOD ferro trovata nei cloroplasti che è assente in
vertebrati e lievito (Van Camp et al. 1997). Le catalasi sono enzimi che catalizzano la
conversione di perossido di idrogeno in acqua e ossigeno, usando come cofattori sia ferro che
manganese (Chelikaniet al. 2004, Zámocký et al. 1999). Questa proteina è localizzata nel
perossisoma di molte cellule eucariote(del Río et al. 1992). La catalasi è un enzima inusuale
poiché, anche se il perossido di idrogeno è il suo solo substrato, segue un meccanismo pingpong: il suo cofattore viene ossidato da una molecola di perossido di idrogeno e poi rigenerato
trasferendo l'ossigeno legato ad una seconda molecola del substrato(Hiner et al. 2002).
Nonostante la sua apparente importanza nella rimozione del perossido di idrogeno, gli umani con
deficienza genetica della catalasi — "acatalasemia" — soffrono pochi effetti dovuti alla
malattia(Mueller et al. 1997, Ogata 1991). Le perossiredossine sono perossidasi che catalizzano
la riduzione di perossido di idrogeno, perossidi organici e perossinitriti(Rhee et al. 2005). Sono
divise in tre classi: 2-cisteina perossiredossine tipiche, 2-cisteina perossiredossine atipiche e 1cisteina perossiredossine (Wood et al. 2003). Questi enzimi condividono lo stesso meccanismo
catalitico di base, in cui la redox-attiva cisteina (la cisteina perossidatica) nel sito attivo è
ossidata ad acido sulfenico dal substrato perossido.( Claiborne et al. 1999). Le perossiredossine
sembrano essere importanti nel metabolismo antiossidante, in quanto topi cui manca la
perossiredossina 1 o 2 hanno vita breve e soffrono di anemia emolitica, mentre le piante usano le
perossiredossine per rimuovere il perossido di idrogeno che si genera nei cloroplasti (Neumann
et al. 2003, Leeet al. 2003, Dietz et al. 2006).
1.6.4.2 Sistemi tioredossina e glutatione
Il sistema tioredossina contiene la proteina 12-kDa tioredossina e la tioredossina riduttasi
(Nordberg e Arner 2001). Proteine correlate alla tioredossina sono presenti in tutti gli organismi
sequenziali, tra cui piante come la Arabidopsis thaliana hanno una grande e particolare diversità
di isoforme (Vieira Dos Santos e Rey 2006). Il sito attivo della tioredossina consiste in due
cisteine adiacenti come parte di una sequenza genetica CXXC, altamente conservativa, che può
ciclizzare tra la forma ditiolo (ridotta) alla forma ossidata disolfuro. Nel suo stato attivo, la
tioredossina agisce come un efficiente riduttore, ricercando le specie reattive dell'ossigeno e
mantenendo le altre proteine al loro stato ridotto(Arnér e Holmgren 2000). Dopo essere stata
ossidata, la tioredossina attiva viene rigenerata per azione della tioredossina riduttasi, usando
NADPH come elettrondonatore (Mustacich e Powis 2000).
19
Il sistema glutatione include glutatione, glutatione riduttasi, glutatione perossidasi e glutatione Stransferasi (Meister et al. 1983). Questo sistema si trova negli animali, nelle piante e nei
microorganismi(Creissenet al. 1996 e Meister et al. 1983). La glutatione perossidasi è un enzima
contenente quattro selenio-cofattori che catalizzano la rottura di perossido di idrogeno e
idroperossidi organici. Ci sono almeno quattro differenti isozimi glutatione perossidasi negli
animali (Brigelius-Flohé 1999). La glutatione perossidasi 1 è la più abbondante ed è un efficiente
scavenger di perossido di idrogeno, mentre la glutatione perossidasi 4 è molto attiva con gli
idroperossidi lipidici. Sorprendentemente, la glutatione perossidasi 1 non è indispensabile,
poiché i topi cui manca questo enzima hanno un corso di vita normale (Ho et al. 1997) ma
presentano una ipersensività verso lo stress ossidativo indotto(De Haan et al. 1998). In aggiunta,
la glutatione S-transferasi sono un'altra classe di enzimi antiossidanti glutatione-dipendenti che
mostrano un'elevata attività con i perossidi lipidici (Sharma et al. 2004). Questi enzimi sono
presenti a livelli particolarmente elevati nel fegato e servono anche nel metabolismo della
detossificazione (Hayes et al. 2005).
1.7 PREVENZIONE DELLE MALATTIE
Fig. 7 Struttura del polifenolo antiossidante resveratrolo
Gli antiossidanti possono eliminare gli effetti dannosi che i radicali liberi hanno sulle cellule
(Sies H 1997) e le persone che mangiano frutta e verdura ricchi in polifenoli e antocianine hanno
un minor rischio di avere il cancro, o malattie cardiovascolari e alcune malattie neurologiche
(Stanner et al. 2004). Questa osservazione suggerisce che questi composti possono prevenire
condizioni quali degenerazione maculare, (Bartlett et al. 2003) diminuzione delle difese
immunitarie a seguito di una nutrizione povera (Wintergerst et al. 2006) e neurodegenerazione,
che sono conseguenza dello stress ossidativo (Wang et al. 2006). Nonostante il chiaro ruolo dello
stress ossidativo nelle malattie cardiovascolari, studi controllati con l'utilizzo di vitamine
antiossidanti hanno dimostrato che non c'è una significativa riduzione sia nello sviluppo sia nella
20
progressione delle malattie cardiache (Bleys et al. 2006, Cook et al. 2007). Ciò suggerisce che
altre sostanze in frutta e verdura (forse flavonoidi) spiegano almeno parzialmente il migliore
benessere cardiovascolare in coloro che consumano più frutta e verdura (Cherubini et al. 2005 ).
Si pensa che l'ossidazione nel sangue delle lipoproteine a bassa densità contribuisca all'insorgere
di malattie cardiache, e i primi studi hanno dimostrato che le persone che assumono integrazioni
di vitamina E hanno un minor rischio di sviluppare malattie cardiache (Rimm et al.1993).
Conseguentemente, almeno sette grandi esperimenti clinici sono stati condotti per testare gli
effetti dell'integrazione antiossidante con vitamina E, in dosi che variano da 50 a 600 mg al
giorno; ma nessuno di questi esperimenti ha dimostrato statisticamente un significativo effetto
della vitamina E sul totale dei morti per malattie cardiache (Vivekananthan et al. 2003). Mentre
numerosi esperimenti hanno investigato le integrazioni con alte dosi di antiossidanti, studi della
"Supplémentation en Vitamines et Mineraux Antioxydants" (SU.VI.MAX) hanno testato l'effetto
dell'integrazione con dosi comparabili a quelle di una dieta sana (Hercberg et al. 2004). Più di
12.500 uomini e donne francesi hanno assunto sia una bassa dose di antiossidanti (120 mg di
acido ascorbico, 30 mg di vitamina E, 6 mg di beta-carotene, 100 µg di selenio e 20 mg di
zinco), sia pillole placebo per un periodo di 7 anni e mezzo. I ricercatori hanno scoperto che non
c'è statisticamente un significativo effetto degli antiossidanti sul totale di sopravvivenza, cancro
o malattie cardiache. Ad ogni modo, un sottogruppo analizzato ha mostrato una riduzione del
31% del rischio di cancro negli uomini, ma non nelle donne. Molte aziende alimentari e
nutraceutiche attualmente vendono formulazioni di antiossidanti come integratori alimentari,
largamente utilizzati nei paesi industrializzati (Radimer et al. 2004).Questi integratori possono
includere antiossidanti specifici, come resveratrolo (dai chicci d'uva), combinazioni di
antiossidanti, come i prodotti "ACES" che contengono beta-carotene (provitamina A), vitamina
C, vitamina E e Selenio, o erbe particolari conosciute per il loro contenuto di antiossidanti come
tè verde e Gynostemma pentaphyllum. Anche se un certo livello di vitamine e minerali
antiossidanti sono richiesti nella dieta per raggiungere il benessere, c'è un considerevole dubbio
sul fatto che l'integrazione di antiossidanti sia benefica, e se anche fosse vero, su quali
antiossidanti siano benefici e in quali quantità (Shenkin 2006,Woodsideet al. 2005, Stanner et al.
2004). Mentre l'integrazione di antiossidanti è largamente usata nel tentativo di prevenire lo
sviluppo del cancro, è stato suggerito che gli antiossidanti possono, paradossalmente, interferire
con i trattamenti anti-cancro (Schumacker et al. 2006). Ciò si è pensato che accada poiché
l'ambiente delle cellule cancerose causa alti livelli di stress ossidativo, rendendo queste cellule
più suscettibili all'ulteriore stress ossidativo indotto dai trattamenti. Come risultato, si è pensato
che riducendo lo stress redox nelle cellule cancerose le integrazioni di antiossidanti diminuissero
21
l'efficacia di radioterapia e chemioterapia (Seifried et al. 2003). Questa preoccupazione però
sembra non essere valida, come indicato da più test clinici che indicano che gli antiossidanti
sono sia neutrali che benefici nella terapia contro il cancro (Simone et al. 2007,Moss 2006).
1.8 MISURAZIONE E LIVELLO DI ANTIOSSIDANTI IN MATRICI
ALIMENTARI
1.8.1 FRUTTA E VERDURA SONO BUONE FONTI DI ANTIOSSIDANTI
La misurazione degli antiossidanti non è un processo lineare, poiché questo è un gruppo di
composti con differenti reattività per differenti specie reattive dell'ossigeno. In agronomia, la
oxygen radical absorbance capacity (ORAC, letteralmente "capacità di assorbimento
dell'ossigeno radicale") è diventato l'attuale standard industriale per stimare la forza di un
antiossidante in cibi, succhi e additivi alimentari (Cao et al. 1993,Ou et al. 2001). Altri test di
misurazione includono il reagente Folin-Ciocalteu e il trolox equivalent antioxidant capacity
assay (Priore et al. 2005). In medicina, un certo numero di saggi differenti sono utilizzati per
stimare la capacità antiossidante del plasma sanguigno e di questi il saggio ORAC potrebbe
essere il più affidabile (Cao et al. 1998) insieme al saggio TEAC. A livello di analisi chimica per
la determinazione del potere antiossidante di un composto si usano differenti metodiche che,
usando diversi reagenti, spesso non forniscono la medesima corrispondenza. Tra le metodiche
chimiche le più usate sono:
• Metodo DMPD: si basa sul composto 4-ammino-N,N-dimetilanilina diidrocloruro che non
mostra possedere alcun picco di assorbimento nel campo del visibile mentre assume una intensa
colorazione rossa in ambiente acido ed in presenza di un opportuno agente ossidante.
• Metodo ABTS: valuta la formazione di un composto colorato il cui massimo di assorbanza si
trova a 734 nm. Il meccanismo di funzionamento dell’ABTS quale cromogeno è del tutto simile
a quello descritto precedentemente per il DMPD.
Gli antiossidanti si trovano in quantità variabili nei cibi quali ortaggi, frutti, cereali, legumi e
noci. Alcuni antiossidanti come licopene e acido ascorbico possono essere distrutti da un lungo
stoccaggio o da una cottura prolungata (Xianquan et al. 2005, Rodriguez-Amaya 2003). Altri
composti antiossidanti sono più stabili, come i polifenoli antiossidanti nei cibi come frumento e
tè (Baublis et al. 2000, Rietveld et al. 2003). In generale, i cibi lavorati contengono meno
antiossidanti di quelli freschi o non cucinati, poiché i processi di preparazione possono esporre il
cibo all'ossigeno(Henry et al. 2002).
22
Cibi che contengono alti livelli di
Composti antiossidanti
questi antiossidanti
Vitamin C (acido ascorbico)
Frutta e verdura
Vitamin E (tocoferoli, tocotrienoli)
Oli vegetali
Antiossidanti polifenolici
Tè, caffè, soia, origano, frutta, olio d'oliva,
(resveratrolo, flavonoidi)
cioccolato e vino rosso.
Carotenoidi (licopene, carotene)
Frutta e verdura
Tab. 3
Cibi ricchi in antiossidanti
Alcuni antiossidanti sono prodotti nel corpo e non sono assorbiti dall'intestino. Un esempio è il
glutatione, prodotto a partire dagli amminoacidi. Poiché ogni glutatione nell'intestino viene
scisso in cisteina, glicina e acido glutammico prima di essere assorbito, anche grandi dosi orali
hanno un piccolo effetto sulla concentrazione di glutatione nel corpo (Witschi et al. 1992). L'
ubichinone (coenzima Q) è anch'esso scarsamente assorbito dall'intestino ed è prodotto negli
umani attraverso la via metabolica dell'acido mevalonico (Turunen et al. 2004)
1.8.2 LIMITI DEGLI STUDI SUGLI ANTIOSSIDANTI IN VITRO:
RICERCA DI CONFERME IN VIVO
La maggior parte degli studi effettuati sono stati eseguiti in vitro. Questi studi prevedono un
utilizzo di concentrazioni molto alte del materiale da analizzare molto più alte di quelle a cui
la dieta giornaliera potrebbe andare incontro. Allo stesso modo, non si conosce molto riguardo
l’assorbimento, la distribuzione, il metabolismo e l’escrezione, per esempio, dei polifenoli
nell’uomo (Manach et al., 2005; Williamson & Manach 2005).
La maggior parte dei risultati volti a determinare il potere antiossidante di un dato prodotto
sembra sempre molto interessante, ma questo non basta per rendere quel prodotto efficace in
vivo. A tal fine
eventuali interventi terapeutici e sussidi dietologici, dovrebbero essere
confermati da studi in vivo. Per quanto riguarda le fragole è possibile avere dei riscontri
tangibili attraverso un crescente numero di dati e informazioni disponibili che riguardano
23
l’assorbimento, la distribuzione, il metabolismo e l’escrezione dei composti bioattivi delle
stesse dopo il loro consumo. Tuttavia dopo un’accurata indagine in letteratura, si può notare
uno scarso numero di studi epidemiologici riguardanti il nesso tra consumo di fragole e il
rischio di malattie.
Per concludere, infine, risultati non chiari provengono da un recente studio sulla salute della
donna in USA, sugli effetti del consumo di fragole sui lipidi, e il rischio di malattie
cardiovascolari, confermando come più complesso e difficile è il progetto e l’interpretazione
dei risultati negli studi in vivo sull’uomo (Sesso et al., 2007).
24
2. SCOPO DELLA TESI
Il presente lavoro di tesi va inquadrato in un progetto di ricerca più ampio, che riguarda lo
studio dei meccanismi molecolari naturali che interessano l’organismo in seguito ad
un’alimentazione integrata da un elevato quantitativo di fragole. Ma perché abbiamo scelto
proprio le fragole? Le fragole rappresentano uno dei piccoli frutti di maggior consumo sia
come frutto fresco sia processato, ma è anche quello più studiato dal punto di vista
agronomico e nutrizionale, grazie al suo elevato impatto economico e commerciale. L’alto
valore nutrizionale della fragola è stato correlato al notevole contenuto di vitamina C e all’alta
concentrazione e varietà di composti fenolici, molti dei quali mostrano elevate proprietà
antiossidanti in vitro.
Nel lavoro di tesi svolto in questi tre anni di dottorato, abbiamo voluto testare gli effetti in
vivo di un consumo acuto di fragole e prolungato su soggetti sani di età compresa tra i 20 e i
30 anni, con un BMI compreso nei range di riferimento per la normalità, e con una dieta
controllata, al fine di osservare poi gli eventuali cambiamenti nella resistenza degli eritrociti
all’emolisi spontanea ed indotta da un agente ossidante, nei sei tempi dello studio ed avere
percezione dei potenziali effetti benefici di un elevato consumo di fragole sullo stress
ossidativo.
Il disegno dello studio in vivo , infatti, si è articolato in due fasi, la prima fase in cui i soggetti
sono stati sottoposti ad integrazione con 500gr di fragole della cultivar Alba e la seconda fase,
del consumo prolungato, in cui i soggetti hanno integrato la loro alimentazione con 300gr
delle cultivar Adria e Sveva. La scelta di queste varietà di fragola è legata alle loro
caratteristiche, in primis per il loro periodo di maturazione ma soprattutto, e mi riferisco ad
Adria e Sveva, per le loro qualità organolettiche e nutrizionali. Queste due cultivar sono frutto
dei programmi di miglioramento genetico per le aree collinari centroadriatiche effettuate dal
dip. SAPROV dell’Università Politecnica delle Marche. La presentazione di queste due
varietà è stata resa possibile sostanzialmente grazie ai pregi di queste due fragole, in
particolare esse si caratterizzano per un buon contenuto in composti antiossidanti abbinati a
un ottimo equilibrio zuccheri/acidi. Questi frutti utilizzati nel nostro progetto sono state
caratterizzate dal punto di vista nutrizionale per quanto concerne la capacità antiossidante
totale (CAT ), il contenuto totale di polifenoli (TPC ), la quantità di flavonoidi (FLAVO ), il
contenuto totale di antocianine (ACY ), e il contenuto di Vitamina C.
25
I soggetti in studio sono stati a vari prelievi ematici: la baseline (prima di iniziare
l’integrazione), dopo Alba (dopo aver integrato la loro alimentazione con 500gr/die per 15gg
con la cultivar Alba), il primo washout (dopo aver interrotto l’integrazione per 15gg), dopo
Adria (in cui i soggetti hanno mangiato 300gr della cultivar Adria per 15gg), dopo Sveva (in
cui i soggetti hanno continuato dopo Adria ad assumere 300gr della cultivar Sveva) e al
termine l’ultimo washout (dopo 15gg di integrazione). Ad ogni prelievo abbiamo raccolto
anche campioni di urine per valutare lo stress ossidativo attraverso biomarker specifici.
Per concludere, risultati ottenuti da uno studio precedente del nostro gruppo avevano
evidenziato un cambiamento significativo nel numero delle piastrine in particolare anche delle
loro dimensioni in seguito ad assunzione di fragole. Siamo andati perciò ad approfondire
queste conseguenze valutando una possibile attivazione piastrinica causata da quantità
considerevoli di fragole.
Accanto allo studio in vivo abbiamo voluto valutare l’eventuale effetto protettivo degli estratti
puri sull’induzione di ulcere gastriche in ratti.
26
3. MATERIALI E METODI :
3.1 LA FRAGOLA
Negli ultimi decenni, ricerche mirate sono state condotte su specifici frutti che mostrano per se
un valore nutrizionale rilevante. La fragola (Fragaria x ananassa, Dutch.) rappresenta uno dei
piccoli frutti a bacca rossa (berry) di maggior consumo, sia come frutto fresco sia processato ed
è anche il berry di gran lunga più studiato, sia dal punto di vista agronomico sia genomico e
nutrizionale grazie al suo elevato impatto economico e commerciale. L’alto valore nutrizionale
della fragola è stato correlato al notevole contenuto di vitamina C e folati e, più recentemente,
all’alta concentrazione e varietà di composti fenolici, molti dei quali mostrano elevate proprietà
antiossidanti in vitro. La qualità nutrizionale della fragola varia in modo decisivo a seconda di
diversi fattori pre- e post-raccolta. Tra tutti, è ormai noto come il genotipo svolga un ruolo
determinante (Tulipani et al. 2009). Di conseguenza, gli attuali programmi di miglioramento
genetico della fragola si avvalgono di strategie di incrocio controllato al fine di ottenere nuove
varietà di frutti nutrizionalmente arricchiti. Il successo delle strategie di incrocio dipende,
ovviamente, dalla conoscenza dei diversi genotipi, selvatici e coltivati, utilizzati negli incroci.
Tuttavia, pochi sono i genotipi di fragola finora dettagliatamente caratterizzati dal punto di
vista della qualità nutrizionale.
3.1.1 L'INFLUENZA DEL GENOTIPO SULLA QUALITÀ
NUTRIZIONALE DELLA FRAGOLA
Le attuali conoscenze degli strumenti molecolari per modulare la biosintesi e l'accumulo di
sostanze fitochimiche antiossidanti nelle fragole è ancora scarsa, così come l'approccio
biotecnologico è solo un'opzione integrativa per estendere il miglioramento della qualità
nutrizionale della fragola.
Tuttavia, è già noto che la composizione in micronutrienti e fitochimici del frutto varia
notevolmente a seconda di diversi fattori pre- e post-raccolta.
Il genotipo varietale è il fattore più importante nel determinare la qualità nutrizionale della
fragola, con le condizioni di coltivazione (ambientali e tecniche colturali), di stagione di
maturazione, durata di conservazione e trasformazione che mostrano un ulteriore importante
27
ruolo (Wang & Hsin-Shan, 2000; Wang et al, 2002; Olsson et al, 2004; Proteggente et al,
2002).
Per questi motivi, l'attuale programma di miglioramento della fragola, oltre alle priorità già
stabilite negli ultimi decenni (miglioramento di specifiche agronomiche, qualitative,
caratteristiche sensoriali, miglioramento del rendimento, la malattia e la resistenza ai parassiti,
l'adattabilità delle piante e la durata di conservazione della fragola), oggi è indirizzo di un
rinnovato interesse per acquisire nuove varietà e migliorare il valore nutrizionale.
Per aumentare la produzione delle fragole ed esaltare le proprietà salutari del frutto, gli attuali
programmi di miglioramento genetico si avvalgono di strategie di incroci controllati.
Naturalmente, il successo della strategia è legato alla profonda conoscenza delle più utili
differenze genetiche selvatiche e coltivate da utilizzare in incroci combinati.
A proposito, alcuni genotipi sono stati ben caratterizzati per queste importanti caratteristiche,
ed è disponibile una conoscenza ancora limitata sulla possibilità di migliorare le caratteristiche
nutrizionali della fragola con metodi di selezione.
In particolare, il programma di miglioramento genetico eseguito dal Saprov-Politecnica delle
Marche di Ancona che ha avuto inizio nel 1993, dopo 10 anni di valutazioni ha reso pubbliche
2 cultivar ( Adria e Sveva) che mostravano interessanti caratteristiche agronomiche associate ad
un'alta adattabilità a diverse condizioni di coltivazione (principalmente suolo calcareo e
argilloso e condizioni climatiche intermedie tra la valle del Po ed il Sud Italia) (Capocasa et al.,
2008). Inoltre è stato osservato che tali cultivar hanno un buon equilibrio zucchero/acidi e
un’interessante CAT, tenendo a mente però che Sveva ne detiene il primato. I risultati ottenuti
sui parentali e sulle progenie analizzate fino ad ora possono far ben sperare per ottenere, in
futuro, fragole con CAT maggiori insieme ad elevati standard produttivi e qualitativi (Mezzetti
et al., 2005).
3.1.2 LE CULTIVAR IN STUDIO
Per i miei studi quindi ho utilizzato 5 cultivar tra cui abbiamo inserito appunto le predette
Adria e Sveva, le cultivar prese in esame quindi sono: ALBA, ADRIA, SVEVA e CALYPSO
di cui abbiamo valutato anche una linea OGM.
28
ALBA:
Fig. 8a Cultivar Alba
Alba è una cultivar a maturazione precoce diffusa nel 2002 da New Fruits di Cesena. La
pianta è di medio accestimento e produttiva. I frutti sono di media pezzatura, di bella forma
conico- allungata, molto regolare anche nei primari, di facile distacco dalla pianta e dotati di
superficie piuttosto resistente e di bella colorazione rossa, brillante. La polpa è piuttosto
consistente, ma di limitate caratteristiche organolettiche.
ADRIA:
Fig.8b Cultivar Adria
29
Adria è una fragola a maturazione tardiva, diffusa nel 2003 dal DiBIAGA dell'Università di
Ancona nell'ambito del progetto "Frutticoltura". Caratterizzata da elevata rusticità ed
adattabilità della pianta a terreni non fumigati e di tipo argilloso calcareo la pianta, di medio
vigore ed accestimento, presenta una produzione elevata. Il frutto appare di forma conica,
regolare, di colore rosso brillante che rimane tale anche dopo la raccolta. Di qualità
organolettica media, presenta un buon rapporto zuccheri/acidi. Soprattutto per le migliori
caratteristiche del frutto, colore e consistenza, Adria può offrire un'ulteriore possibilità di scelta
tra le varietà a maturazione tardiva (Baruzzi et al., 2010).
SVEVA:
Fig. 8c Cultivar Sveva
La Cultivar Sveva è una varietà unifera a maturazione molto tardiva, anch’essa diffusa nel 2003
dal DiBIAGA dell'Università di Ancona nell'ambito del progetto "Frutticoltura". La pianta è
molto vigorosa, rustica, non molto produttiva. I frutti sono di grossa pezzatura, di forma
conico-allungata, regolare, ma con superficie piuttosto delicata e di colore rosso scuro, poco
brillante. La polpa è mediamente consistente e di media qualità organolettica.
La cultivar Sveva (Figura...) si caratterizza per un periodo di maturazione molto tardivo e da
un’elevata rusticità ed adattabilità della pianta a terreni non fumigati e di tipo argilloso
calcareo. La pianta è produttiva, vigorosa e il frutto è di pezzatura e consistenza elevata, di
forma conico-allungata, regolare, di colore rosso intenso che tende a divenire scuro a piena
maturazione. Presenta una qualità organolettica media e un contenuto zuccherino basso, ma
tendenzialmente acido.
Dal punto di vista nutrizionale,come è noto dalla letteratura, ha un elevato contenuto in
vitamina C e un elevato potere antiossidante. Tali caratteristiche sono state rilevate in pieno
30
campo in diversi ambienti della regione Marche e del cesenate. Nella sua epoca di maturazione
presenta caratteristiche produttive e qualitative superiori a tutto il materiale attualmente in
commercio. Appare di interesse soprattutto per lo sviluppo di una fragolicoltura tardiva (Faedi
et al., 2004).
Fig. 8d Cultivar Calipso
CALIPSO
La fragola Calypso (Fragaria x ananassa) è una pianta rifiorente perenne di media pezzatura e
medio periodo di maturazione (Mese di giugno) si raccoglie nel mese di giugno e di nuovo
nel periodo tardo estivo-autunnale. I frutti tendono a scurire una volta che sono maturi e il
sapore è descritto come eccellente.
Nel nostro caso siamo andati a valutare le caratteristiche nutrizionali e gli effetti positivi in vivo
su cavie di laboratorio della cultivar Calipso e una sua linea OGM, geneticamente modificata
per quanto riguarda il contenuto in antocianine, una sottoclasse di flavonoidi caratteristiche
della colorazione rosso-blu dei frutti.
3.2 VALUTAZIONE DELLA QUALITÀ NUTRIZIONALE DELLE
FRAGOLE
3.2.1 ESTRAZIONE IDROFILICA
A Seconda dell'analisi da eseguire, l'estrazione di composti è stata effettuata attraverso
31
l'omogeneizzazione, tramite sonicazione o per liofilizzazione.
Via omogeneizzazione. Le fragole congelate sono state scongelate parzialmente. Dieci grammi
di aliquote dei frutti sono stati aggiunti a 100 mL di soluzione di estrazione, composta da
metanolo / acqua milliQ / concentrato di acido formico (FA)
(80:20:0.1 v / v)
successivamente sono stati omogeneizzati con un omogeneizzatore Ultraturrax T25 ( Janke &
Kunkel, IKA Labortechnik) a velocità medio-alta per 2 min. L'estrazione è stata massimizzata
agitando la sospensione per 2 ore al buio a temperatura ambiente, dopodiché l’estratto è stato
suddiviso in quantità uguali in altrettanti tubi che sono stati poi centrifugati a 3500 rpm per 15
minuti in due tempi sequenziali, il surnatante risultante è stato filtrato attraverso un
filtro da
0,45 micron Minisart (PBI International),e stoccato in vials di vetro ambrate e conservate a -20
° C fino all'analisi.
Via sonicazione. I frutti conservati a -80 ° C sono stati ulteriormente passati in azoto liquido, e
ridotti in polvere finissima con un macinino da caffè preraffreddato (IKA A11 di base). Le
polveri sono stati conservate congelate a -80 ° C fino all'analisi. Immediatamente prima
dell’analisi, 2 mL di soluzione di estrazione ghiacciata è stata aggiunta a 0.5 g di polvere di
fragole congelata pesata in provette da 10 ml di vetro ghiacciato, e la miscela sonicata a 4 ° C
per 15 min al buio.
Per la quantificazione della vitamina C, la soluzione di estrazione consisteva in acqua MilliQ
contenente il 5% di acido metafosforico e DTPA 1 mM, mescolato bene prima dell'uso, fino
alla dissoluzione, sonicato e conservato in frigorifero. Dopo l'estrazione ultra-suono assistita, le
pareti delle cellule e proteine sono state precipitate mediante centrifugazione a 2500 giri / min
per 10 min a 4 ° C, il surnatante è stato filtrato attraverso un filtro di 0,2 ìm PTFE in flaconi 1,8
mL HPLC, e immediatamente analizzati.
Via Liofilizzazione: i frutti congelati appena dopo la raccolta a -20°C, sono stati pesati e subito
posti in 5 ripiani ad uguali condizioni in un liofilizzatore Heto Drywinner 6-85 della A. De
Mari Strumenti , per 5 giorni, fino, cioè, a completa liofilizzazione, dopodiché nell’immediato,
sono stati polverizzati (i frutti erano stati divisi a metà e posti sui ripiani e sono stati ottenuti
parti di frutti raggrinziti completamente privi d’acqua) con un macinino da caffè (IKA A11 di
base) e immediatamente posti a -80°C pronti per le eventuali analisi nutrizionali.
32
3.2.2 MISURA DEL CONTENUTO D’ACQUA
Il contenuto d’acqua nei frutti è stato determinato pesando le fragole congelate prima e la
polvere risultante dopo la liofilizzazione a bassa pressione con liofilizzatore Heto Drywinner 685 -A. De Mari Strumenti. I campioni una volta liofilizzati sono stati polverizzati con un
macinino da caffè preraffreddato (IKA A11 di base) e poi immediatamente pesati onde evitare
un eventuale riassorbimento d’acqua dopo l'essiccazione.
3.2.3 MISURA DELLA CAPACITÀ ANTIOSSIDANTE TOTALE (CAT)
Diversi sono i metodi utilizzati per la determinazione della CAT in matrici alimentari e
campioni biologici, in questo lavoro parleremo di: Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
(TEAC), del saggio FRAP, che consiste nell’azione riducente degli antiossidanti sullo ione
ferrico, per quanto riguarda il frutto; mentre per la valutazione della capacità antiossidante
totale nel plasma faremo riferimento ai precedenti test validi anche per questo scopo, a cui
abbiamo aggiunto il BAP test, l’SHp test e di contro per la valutazione dell’attacco operato dai
radicali liberi, il test del dROMs nel plasma, e i test degli isoprostani e dell’8 OHdG nelle
urine.
3.2.3.1 Metodi per la valutazione della cat nel frutto:
3.2.3.1a Metodo TEAC (Fia-Abts Decolorization Assay)
Per l’analisi della capacità antiossidante totale (CAT) è stato impiegato il metodo TEAC (
Trolox equivalent antioxidant capacity) in accordo con il metodo modificato da Re e colleghi
(1999) e migliorato dall’aggiunta di un sistema a flow injection (FIA) . Tale metodo, chiamato
anche saggio di decolorazione FIA-ABTS, è basato sull’abilità dei composti antiossidanti di
inattivare il composto 2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) o ABTS,
riducendo la sua forma radicalica ABTS˙+ che possiede il massimo assorbimento nella luce
visibile fino ad una forma neutrale priva di colore. Questo cromogeno è in condizioni normali
privo di colorazione ed assume una spiccata colorazione quando viene trasformato da un agente
33
ossidante nel radicale monocationico (ABTS˙+) che possiede il massimo assorbimento nel
range del visibile.
Quando vengono aggiunti dei campioni biologici o chimici (standard) che contengono dei
composti antiossidanti, questi ultimi reagiscono con l’ABTS˙+, neutralizzano il radicale e si può
notare ad occhio nudo una decolorazione della soluzione in uso, producendo un’ inibizione
dell’assorbanza e favorendo la trasformazione del radicale cationico colorato in una forma non
colorata.
La soluzione con il radicale catione dell’ABTS (ABTS˙+) è stata ottenuta facendo reagire 7mM
di una soluzione acquosa stock di ABTS con 2,45 mM di potassio persolfato e mantenuto al
buio per 12 ore prima del suo utilizzo. In questa forma, la soluzione ABTS˙+ risulta stabile per
almeno due giorni, se mantenuta scrupolosamente al buio a 25°. Immediatamente prima
dell’analisi, la soluzione in esame è stata prodotta diluendo la soluzione stock (campione) 1:50
con il PBS a pH 7,4. Il sistema a flow-injection consiste di una pompa Beckman 126 HPLC, un
detector 166 UV/VIS Beckman model, di una valvola di iniezione manuale con un loop di 10
µl nel quale viene iniettato il campione, una bobina di reazione e un fornetto ( Eurisco
Diagnostic, Cornedo Vicentino, Italy) programmato a 35°C.
Fig. 9 Impianto strumentale per la metodica TEAC a flow-injenction (Fonte: Tulipani, 2008)
34
L’estratto non diluito di fragole (10 µl) è stato iniettato in modo da poter reagire con la
soluzione di lavoro ABTS. + iniettata nella bobina ad una velocità di flusso di 1,2 ml/min.
Il grado di decolorazione della soluzione di lavoro, ovvero l’espressione della capacità
antiossidante di ciascun campione, è stata misurata attraverso l’area di un picco negativo
captato dal detector durante la reazione di decolorazione. La capacità totale antiossidante dei
campioni è stata calcolata relativamente alla reattività di diluizioni seriali di Trolox (analogo
idrosolubile della vitamina E) in etanolo (0,1-3,0 mM). Il sistema descritto si può osservare
dalla Figura 9 (Bompadre et all., 2004). I risultati TEAC vengono espressi in micromoli di
Trolox equivalenti per grammo di peso fresco di fragole ( µmoles TE/g FW).
3.2.3.1b Metodo Frap
La tecnica FRAP ( Ferric Reducing Antioxidant Power) è stata eseguita secondo un
protocollo proposto da Scottish Crop Research Institute (Deighon et al. 2000) e riadattato da
Benzie e Strain (1996). La capacità antiossidante dei campioni è determinata dalla loro
abilità di ridurre lo ione ferrico a ferroso. Quando il ferro è complessato con il TPTZ (2,4,6tripyridyl-s-trizine) in una soluzione di sodio acetato a pH acido, la sua riduzione è evidente
dal cambiamento di colorazione della soluzione (da ambra diventa blu). L’assorbanza della
soluzione a 593 riflette l’estensione della riduzione. Il potere riducente è normalmente
comparato con quello dell’ammonio ferro-solfato ma altri antiossidanti idrofilici, come il
trolox, analogo della vitamina E, vengono usati come standard alternativi. La soluzione
reagente FRAP è stata preparata immediatamente prima di iniziare la procedura mediante la
combinazione di dieci volumi di acetato di sodio (300 mM, pH 3.6) con un volume di TPTZ
(10 mM HCl in 40 mm) e un volume di cloruro ferrico (20 mm) acquosa soluzioni L'acetato
di sodio e le soluzioni TPTZ sono state preparate in anticipo e conservato in bottiglie di
vetro scure a temperatura ambiente, mentre la soluzione di cloruro ferrico devono essere
preparate immediatamente prima dell'uso, il giorno di analisi, il reagente FRAP è stabile per
almeno 2 ore a temperatura ambiente. Le diluizioni di Trolox sono state usate per la
calibrazione.
Il bianco per l'azzeramento dello spettrofotometro consisteva nell’acqua milliQ, dal
momento che non si sospetta interferenza da parte del solvente di estrazione.
In breve, 100 µL di bianco, in alternativa, standard Trolox o estratto di fragola (attraverso
l'omogeneizzazione) 10 volte diluito in acqua milliQ sono stati aggiunti a 900 µL di
reagente FRAP in eppendorfs da 1,5 ml. La miscela è stata poi rapidamente agitata per 15
35
secondi e successivamente si aspetta fino a quando non sono passati i 4 minuti. Dopo
esattamente 4 minuti, si effettua la lettura a 593 nm (spettrofotometro Beckman, modello
DU644) contro bianco. Ogni campione è stato analizzato in quattro repliche e i risultati
FRAP sono stati espressi come µmol TE/100g fruit FW.
3.2.3.2 Misura del contenuto di vitamina c
Vitamina C (acido ascorbico) è stata misurata come descritto da Helsper e collaboratori
(2003). Gli Estratti di fragola sono stati sottoposti ad analisi HPLC immediatamente dopo la
procedura di estrazione (tramite sonicazione e liofilizzazione). Il sistema HPLC Waters 600
comprendeva un controllore, un Waters 996 fotodiodi (PDA) rivelatore fissato a assorbanza di
262 e 244 nm, e un incubatore colonna a 30 ° C. La colonna HPLC utilizzata è stata una YMC
Pack Pro 150x4.6 mm. L'eluizione è stata isocratica con 50 mM di fosfato di potassio
(KH2PO4) in acqua MQ, portando a pH 3.2 (al di sotto del pKa di acido ascorbico) con
l'aggiunta di acido fosforico, e l'analisi consisteva in 10 minuti di corsa, dopo di che la
colonna è stata pulita con 50% di acetonitrile. La vitamina C eluita a RT ≈ 5.3 min.
Quantificazione del contenuto di vitamina C è stata effettuata attraverso una curva di
calibrazione preparata eseguendo concentrazioni standard di vitamina C allo stesso modo
preparato rispetto al estratti, e misurato in duplice copia presso l'inizio e la fine delle analisi.
I risultati sono espressi come mg di vitamina C per grammo di peso fresco di fragola mg vit C
/ g FW] (valore medio di tre repliche tecnico ± DS).
3.2.3.3 Misura dei polifenoli totali (TPC)
Il contenuto fenolico totale (TPC) degli estratti idrofilici è stato determinato usando il metodo
colorimetrico di Folin-Ciocalteau, modificato da Slinkard&Singleton (1977), usando acido
gallico come sostanza standard di riferimento per le curve di calibrazione. La metodica si
avvale di un riconoscimento specifico per via spettrofotometrica del complesso colorato
formato dai polifenoli con la sostanza reagente. Una soluzione standard di acido gallico
(100µl) viene aggiunta a 500 µl di reagente Folin-Ciocalteau precedentemente diluito con
acqua 1:10 e mantenuto al buio a 4°. La miscela ottenuta viene messa ad incubare per 1 o 8
minuti a temperatura ambiente, vengono aggiunti 400 µl di carbonato di sodio 0,7 M e poi si
passa al vortex . La soluzione viene incubata per 2 ore a temperatura ambiente al buio, poi
viene letta l’assorbanza a 760 nm, dopo aver azzerato lo spettrofotometro con il bianco.
36
Viene inoltre preparata una soluzione di metanolo/acqua (80:20) di acido gallico 6 mM e
conservata a 4°per una settimana. Le diluizioni standard seriali vengono preparate dalla
soluzione stock per diluizioni. I risultati finali vengono espressi in mg di equivalenti acido
gallico per grammo di peso fresco di fragole ( mg GAEq/g FW).
3.2.3.4 Misura del contenuto di flavonoidi totali (flavo)
Il contenuto Totale di flavonoidi è stato determinato utilizzando un metodo colorimetrico
descritto in precedenza da Jia et al, 1998; Dewanto et al, 2002). In breve, 250 µL di bianco
(acqua), o di estratto di fragola idrofilico (via omogeneizzazione) o di soluzione standard di (+)catechina è stato aggiunto a 1,25 ml di acqua MilliQ in una provetta, in seguito sono stati
aggiunti 75 µL di una soluzione di nitrato di sodio al 5% (NaNO2). Dopo 6 minuti, sono stati
aggiunti alla miscela 150 µL di una soluzione al 10% di cloruro di alluminio esaidrato (AlCl3 *
6H2O) , e il tutto è lasciato a riposare per 5 minuti. Poi, sono stati aggiunti 500 µL di idrossido
di sodio (NaOH) 1M , la miscela è stata portata a 2,5 ml di acqua MilliQ e ben mescolata, e
l'assorbanza è stata immediatamente letta a 510 nm contro il bianco. I risultati sono espressi
come mg di equivalenti di catechina per grammo di peso fresco di fragola [CEq mg / g FW]
(valore medio di quattro repliche) ± SD.
3.2.3.5 Misura del contenuto di antociani totali (acy)
Il contenuto di antociani totali degli estratti di fragola idroalcolica è stato determinato utilizzando
un metodo differenziale a pH modificato (Giusti & Wrolstad, 2001), con alcune modifiche. Il
metodo si basa sulle trasformazioni reversibili strutturali del cromoforo antocianina in funzione
del pH, che si manifestano da diversi spettri di assorbanza. Sulla base di queste reazioni
antocianina specifiche, il metodo del pH differenziale permette una misurazione accurata e
rapida degli antociani totali, anche in presenza di pigmenti degradati e polimerizzati.
Brevemente, si preparano i due tamponi a PH1 e 4,5, il primo tampone è dato da 0,025 M di
cloruro di potassio (KCl) , il secondo tampone è dato dal sodio acetato (CH3CO2Na) 0,4 M.
Dopodichè si preparano due diluizioni degli estratti fragola e delle soluzioni standard, e si fanno
reagire una con il tampone a pH 1.0 (1 / 10, v / v), e l'altra con il tampone a pH 4.5 (1 / 10).
Queste diluizioni vengono poste in incubazione al buio a temperatura ambiente per 15 minuti,
prima di procedere alla lettura spettrofotometrica a 500 e 700 nm contro una cuvetta vuota
37
riempita di acqua milliQ.
Il valore definitivo dei campioni diluiti (A) è stato calcolato come segue:
( vis-max-A700) pH 1.0 - (A λvis-max-A700), pH 4,5
La soluzione madre è stata preparata diluendo 0,002 g di Pg-glc in 10 ml di metanolo/acqua
80:20, v / v (0,2 mg / mL). La soluzione madre è stata portata ad un PH di circa 4, quindi è stato
aliquotata in vials di vetro ambra e conservati a -80 ° C fino all'analisi.
I risultati sono stati espressi in milligrammi di equivalenti di Pg-glc per grammo di peso fresco di
fragola [mg Pg-glcEq / g FW] (valore medio di quattro repliche ) ± SD.
Figura 3.3 Caratteristiche spettrali di antociani purificato (derivati acylatedpelargonidin-3sophoroside-5-glucoside), del pH 1.0 e pH 4.5. buffer.
3.2.3.6 Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software SAS JMP 8. I dati sono stati
sottoposti all’analisi della varianza, e le differenze significative sono state calcolate secondo il
test T Student. I dati sono riportati come media ± deviazione standard (SD). Le differenze a
seconda dei casi, con p <0.05 e p< 0,001 sono state considerate statisticamente significative.
3.3 EFFETTO GASTROPROTETTIVO DELL’ESTRATTI DI
FRAGOLA PORTATI A SECCO
3.3.1 PARTE I DELLO STUDIO: EFFETTO PROTETTIVO
I frutti maturi, destinati a quest'analisi sono stati raccolti a mano, entro 2 ore dopo la raccolta,
i frutti interi vengono conservati a -80 ° C. La frutta congelata, dopo snap-frozen in azoto
liquido, è stata ridotta in polvere sottile utilizzando un macinino da caffè preraffreddato e le
polveri congelate sono stati conservate a -80 ° C fino all'analisi. Le polveri di frutta surgelata
sono state diluite con una soluzione di metanolo e acqua (80% v/v) ad un rapporto finale di
1:10 per peso e volume. Il pH di ciascun campione è stato corretto con 1 mol / L di NaOH
fino a che non ha raggiunto i 5,0 ±0,2 e quindi il campione è stato centrifugato a 2000 x g per
10min. Il surnatante è stato recuperato e concentrato in vacuo, pronto per essere testato in
questo saggio.
38
In questo studio sono stati utilizzati ratti maschi Wistar del Biomedical Research Center, R &
D Institute, Galenika (Belgrado, Serbia), del peso di 180-200 g. I ratti sono stati alloggiati 3
per gabbia in condizioni ambientali costanti (ciclo di 12 h di luce / buio, 20-24 ° C), e hanno
avuto accesso ad libitum a pellet alimentare commerciale e acqua.
48 ratti sono stati divisi in otto gruppi di sei ratti ciascuno. I ratti sono stati alimentati una
volta al giorno per dieci giorni con sonda gastrica con 0,3 ml / kg di estratto di fragole
disciolto in PEG 400 (BASF, Germania) al 10% in acqua milliQ; il gruppo di controllo ha
ricevuto 1 ml di PEG 400 al 10%, anche questi per 10 giorni; il gruppo di controllo positivo
ha ricevuto 100 mg / kg di quercetina (Sigma) disciolto in PEG 400 al 10%, per 10 giorni.
18-20 ore prima dell'inizio della sperimentazione i topi sono stati posti in gabbie individuali e
sono stati privati di cibo, con libero accesso all’acqua del rubinetto. L'ultima
somministrazione è stata data 120 min. prima della somministrazione di etanolo per
l'induzione delle lesioni gastriche.
60 min. dopo la somministrazione di etanolo, i ratti sono stati sacrificati per dislocazione
cervicale; il loro stomaco è stato rimosso e aperto lungo la grande curvatura.
Il contenuto dello stomaco è stato svuotato e completamente recuperato mediante lavaggio
con 10 ml di soluzione salina isotonica. Il contenuto dello stomaco e la soluzione di lavaggio
sono stati combinati e centrifugati a 3500 giri / min, per 10 min. e successivamente è stato
misurato il valore del pH del surnatante. Gli stomaci sono stati sciacquati con acqua, appuntati
aperti su una piccola lastra di polistirolo per l'esame macroscopico e per la foto
documentazione (vedi immagini) attraverso una fotocamera digitale (SONY DSC-H50,
Giappone) e conservati a -80 ° C fino alle analisi biochimiche.
3.3.1.1 Calcolo delle dosi
3,75 ml di estratto corrispondono a 500 g di fragole.
L'uomo (70 kg) mangia 500g di cibo secco / giorno + 3.75 ml di estratto di fragola (500 g di
fragole).
Il Ratto (250g) mangia 10g di cibo secco / giorno + 0,075 ml (solo cinquanta volte di meno),
il che significa 0,3 ml di estratto di fragola / kg di ratto.
3.3.1.2 Analisi delle immagini
39
Le aree di lesioni emorragiche gastriche sono state misurate e calcolate utilizzando un
softwere d'elaborazione delle Immagini Ed Analisi In Java (ImageJ) del National Institutes of
Health (NIH) (http://rsb.info.nih.gov/ij/)
L’Indice di ulcerazione (UI) e la percentuale di inibizione dell’indice di ulcerazione UI in
relazione al gruppo di controllo sono stati stimati utilizzando le formule:
UI = [ulcerazione, area emorragica (mm2) / superficie totale della parte secretoria dello
stomaco (mm2)] x100
% di inibizione della UI = [1 - (UI gruppo pre-trattato / UI controllo )] x100
3.3.1.3 Analisi statistica
Tutti i risultati sono espressi come Media ± SD. Analisi statistiche sono state effettuate con il
t-Test e con p ≤ 0,05 considerato significativo.
3.3.2 PARTE II DELLO STUDIO: BIOCHIMICA DEL CONTENUTO GASTRICO
3.3.2.1 Esame biochimico della mucosa gastrica
Il tessuto della mucosa di ogni animale è stato raschiato dallo stomaco con un coltello
spuntato ed è stato pesato, trasferito in una provetta di ghiaccio raffreddata e omogeneizzato
con Ultra-turrax T25, (Janke & Kunkel GmbH & Co., IKA ®-Labortechnik , Staufen,
Germania) in 20 mmol / l di Tampone Tris, pH 7,4, contenente 5 mmol butilidrossitoluolo per
prevenire la nuova perossidazione lipidica che può verificarsi durante l'omogeneizzazione.
L'omogenato viene poi centrifugato a 12 000 giri / min a 4 ° C, (Megafuge 2.0.R, Heraeus,
Germania) per 10 min. Il surnatante è stato aliquotato e conservato a -80 ° C fino alla
determinazione del contenuto proteico totale, catalasi (CAT), superossido dismutasi (SOD) e
di malondialdeide (MDA).
Il contenuto proteico dei campioni di tessuto è stato stimato con il metodo di Lowry et al.
utilizzando sieroalbumina bovina come standard.
La perossidazione lipidica della mucosa gastrica è stata determinata spettrofotometricamente
(UV Vis spettrofotometro HP 8453, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) a 533 nm. I
livelli di MDA sono stati misurati mediante il test TBA secondo il metodo suggerito da Buege
e Aust.
40
L’attività della Catalasi nella mucosa gastrica è stata determinata secondo la procedura di
Goth, seguendo l 'estinzione del perossido di idrogeno a 230 nm e pH 7.0.
L’attività SOD nella mucosa gastrica è stata determinata misurando l'inibizione
dell’autossidazione dell’adrenalina a pH 10,2 a 30 °C con il metodo di Misra & Fridovich.
Una unità di attività SOD rappresenta la quantità di SOD necessaria per causare il 50% di
inibizione dell’autossidazione dell’adrenalina.
3.3.2.2 Analisi statistica
Tutti i risultati sono espressi come Media ± SD. Analisi statistiche sono state effettuate con il
t-Test e con p ≤ 0,05 considerato significativo.
3.4 STUDIO SUL CONSUMO ACUTO E PROLUNGATO DI
FRAGOLE
3.4.1 ARRUOLAMENTO DEI VOLONTARI
Durante il periodo della raccolta abbiamo effettuato uno studio sugli effetti di un consumo acuto
e consecutivamente prolungato di fragole. Tutti i soggetti che si sono offerti per lo studio sono
studenti dell’ Università Politecnica delle Marche, Polo Monte D'ago (Ancona), e sono stati
reclutati attraverso mail e passaparola vocali. I minori, i fumatori e i soggetti che hanno
dichiarato di assumere integratori di vitamine o altri integratori alimentari sono stati esclusi
dalla tutte le prove. Altri criteri di esclusione erano la storia di casi di allergia alla fragola o altri
frutti di bosco, storia di una malattia cronica, che può essere legata allo stress ossidativo, e
sintomi attuali di qualsiasi malattia acuta. Per confermare la buona salute dei volontari
selezionati, sono stati effettuati esami di laboratorio chimico-clinici di routine presso il
Laboratorio Analisi dell’INRCA di Ancona. Il disegno sperimentale è stato accuratamente
spiegato ai volontari prima della prova, e di conseguenza sono stati invitati a dare il loro
consenso scritto per procedere alle prove dello studio.
I soggetti presi in considerazione per lo studio sulla resistenza dei globuli rossi all’emolisi
spontanea ed indotta da un agente ossidante quale l’AAPH, sono 23, di cui 12 femmine e 11
41
maschi, con un’età media di 27 anni ± 3 (range 20-30 anni) ed un peso medio di 64 ± 13 kg
(BMI 22 ± 3 kg/m2) . Tab.4
Nella valutazione dei parametri di stress ossidativo e di barriera antiossidante nel plasma sono
stati presi in considerazione tutti i soggetti precedentemente descritti, tranne nel caso della
valutazione dell’acido ascorbico e dell’urato, dei residui carbonilici delle proteine e dello
studio sull’attivazione piastrinica per cui sono stati presi in considerazione rispettivamente 14
soggetti (7 maschi e 7 femmine, età media 27 ± 3, BMI 21,6±2,5), 12 soggetti (7 maschi e 7
femmine, età media 28 ± 3,4; BMI 21,9±2,5), 9 soggetti ( 5 femmine e 4 maschi, età media
29 ± 2; BMI 21,8 ± 2,6 ).
Nella valutazione degli isoprostani e dell’8OHdG sono stati presi in considerazione 12
campioni dei 23 soggetti dello studio (8 maschi e 4 femmine, età media 27 ± 4, BMI 22,4 ±
2,7).
soggetti
2009
n
23
Genere (F/M)
12/11
età (x ± SD)
27 ± 3
altezza (m ± SD)
1.70 ± 0.9
peso (Kg ± SD)
64 ± 13
BMI (Kg/m2 ± SD)
22 ± 3
Tab. 4 Caratteristiche fisiche dei soggetti coinvolti nello studio(valore medio ± deviazione
standard).
3.4.2 DISEGNO DELLO STUDIO
Nell’aprile del 2009 tre dei cinque genotipi di fragole in studio ("Alba", "Adria", "Sveva")
sono state selezionate per il saggio in vivo di consumo acuto e prolungato.
Le fragole sono state fornite a seconda del periodo di maturazione, da due aziende
produttrici di fragole, una nella provincia di pesaro e urbino ha fornito la cultivar Alba,
l’altra l’Azienda Concetti Bruno e Sergio di Montefiore dell'Aso, Ascoli Piceno, ci ha
fornito le cultivar Adria e Sveva ogni tre giorni che venivano poi immediatamente distribuite
ai partecipanti. Poche fragole extra sono state aggiunte alle dosi giornaliere per perdite
dovute alla deperibilità.
42
I partecipanti sono stati invitati ad astenersi dal mangiare frutta, verdura e loro succhi, vino,
tè o caffè per 12 ore prima della prova per standardizzare in parte la baseline, e per
mantenere il loro abituale apporto dietetico antiossidante nei giorni precedenti l'esperimento.
Ai partecipanti è stato chiesto di non cambiare la loro dieta tipica, e di compilare un diario
dettagliato sulla loro dieta quotidiana nel periodo pre-studio fino all’inizio dello studio
stesso, per garantire che non ci sono grandi cambiamenti delle abitudini alimentari, e di
ridurre l'assunzione di cibo ricco di polifenoli nella cena prima di ogni prelievo di sangue.
Ad ogni volontario è stato chiesto di mangiare inizialmente 500gr di fragole della cultivar
Alba lontano dai pasti, onde evitare un possibile minor assorbimento dei fotocomposti, per
15 giorni consecutivi. Prima e dopo il consumo sono stati effettuati dei prelievi, il 1° per la
Baseline e l’altro dopo 15gg di assunzione di Alba. Successivamente per annullare l’effetto
della predetta cultivar è seguito un periodo di washout di altri 15 gg in cui i volontari sono
stati invitati a non consumare fragole. Anche dopo il washout c’è stato un prelievo di sangue
a rappresentare una seconda baseline. Dopodichè per 30 gg i volontari sono stati invitati a
consumare 300 gr di fragole della cultivar Adria prima e Sveva poi, e ogni 15gg, al cambio
di cultivar quindi sono stati sottoposti a prelievo. Al termine di questa alimentazione
arricchita da fragole per un mese e mezzo, i volontari sono stati invitati a sospendere
totalmente il consumo di fragole per altri 20 gg dopodiché sono stati sottoposti all’ultimo
prelievo. Il giorno di ogni prelievo ai volontari è stato richiesto anche un campione delle
urine delle ultime 12 ore utili per valutare la quantità di Isoprostani, prodotti di ossidazione
casuale dei fosfolipidi di membrana normalmente presenti in sangue e urine ma in maggiori
quantità se l’individuo a un elevato stress ossidativo,e dell’8 OHdG che è un marcatore
biologico di stress ossidativo poiché risponde proporzionalmente all’azione dei radicali
liberi. La deossiguanosina (dG), una delle basi costituenti del DNA, se ossidata si trasforma
in: 8-idrossi-2’-deossiguanosina (8-OHdG). La 8-OHdG tagliata da enzimi del sistema di
riparazione del DNA, viene rilasciata in circolo ed eliminata attraverso le urine. Sono stati
presi in esame i campioni di urine di 12 su 23 volontari, quelli, cioè che ci hanno garantito
una raccolta del campione per ogni prelievo effettuato.
9 soggetti su 23 hanno partecipato ad uno studio pilota per la valutazione di una eventuale
attivazione piastrinica; evento che si era messo in evidenza in studi precedenti.
Le cultivar utilizzate in questi studi sono state precedentemente caratterizzate dal punto di
vista nutrizionale con le tecniche TEAC e FRAP per quanto riguarda la determinazione degli
antiossidanti totali e col metodo FOLIN CIOCALTEAU per la quantificazione dei polifenoli
totali, oltre a queste tecniche i frutti sono stati sottoposti anche al saggio per la
43
quantificazione dei flavonoidi, delle antocianine ed alla quantificazione della vitamina C
tramite HPLC-PDA
3.4.3 SAGGI SUL PLASMA: RACCOLTA DEI CAMPIONI
I campioni di sangue sono stati immediatamente raccolti in provette contenenti eparina (BD
Vacutainer, Plymouth, UK).Il plasma eparinizzato è stato isolato dopo aver centrifugato il sangue
intero a 2800 rpm per 20 minuti a 15 ° C in una centrifuga refrigerata a multivelocità (tecnologia
ALC, modello PK 121 R), e stoccato in cryovials a -80 ° C per ulteriori analisi.
3.4.3.1 Capacità antiossidante totale del plasma (CAT)
Come per i frutti, la CAT del plasma è stata determinata usando in parallelo il TEAC e il FRAP e
aggiungendo a confronto il BAP test, e l’-SHp test.
a) Saggio TEAC (Saggio di decolorazione FIA-ABTS)
Il saggio TEAC è stato effettuato con il metodo descritto in precedenza per il frutto.
I campioni di plasma non diluito (5 microlitri) sono stati iniettati in un loop da 5 microlitri
permettendo così la reazione con la soluzione di lavoro ABTS˙+ in circolo nel sistemaad un flusso di
di 1,2 ml / min. L'Entità della decolorazione, espresso in percentuale di inibizione dell'assorbanza, è
stata poi riportata graficamente in funzione delle concentrazioni di antiossidanti nel plasma. Ogni
campione è stato analizzato in quattro repliche e i risultati sono stati espressi come concentrazione
millimolare plasmatica (mM) di Trolox equivalenti.
b) Saggio FRAP
Il saggio FRAP è stato effettuato come descritto allo stesso modo per gli estratti di fragola (….),
con lievi modifiche. Prima di aggiungere il reattivo FRAP, i campioni di plasma sono stati
scongelati e diluiti di 5 volte in acqua milliQ. Diluizioni di Trolox acquoso sono stati utilizzati per
la taratura. Ogni campione è stato analizzato in quattro repliche e i risultati sono stati espressi
come concentrazione micromolare plasmatica (µm) di Trolox equivalenti.
c) Il BAP Test: Principio e performace operative
44
Le principali cause di aumentata produzione di specie chimiche ossidanti, quali ad
esempio, i radicali liberi, sono da individuarsi in fattori ambientali, situazioni
fisiologiche, stile di vita, fattori psicologici, malattie e fattori iatrogeni, ecc. Bisogna
sottolineare che il fumo di sigaretta, l’abuso di alcool ed altri fattori correlati con lo stile
di vita sono responsabili dell’aumento della produzione di specie chimiche ossidanti. Lo
stesso effetto è indotto da un’attività fisica incongrua (eccessiva o insufficiente).
Infine, è riconosciuto il ruolo dei numerose malattie, su base disreattiva o infettiva (es.
artrite reumatoide e infezioni batteriche) nel favorire l’incremento dei radicali liberi.
Una riduzione delle difese antiossidanti è da imputarsi sostanzialmente ad un deficit
assoluto o relativo di antiossidanti, comunque determinatosi. In tale contesto, alcune
malattie, quali la celiachia, possono provocare uno stress ossidativo riducendo la
disponibilità di antiossidanti assunti con l’alimentazione.
Dal punto di vista biochimico, considerando il fenomeno dello stress ossidativo
all’interno della cellula, è indubbio che all’origine delle alterazioni funzionali e
strutturali vi è un aumento della produzione di specie reattive per stimolazione parziale
o generalizzata del metabolismo, spesso sotto la spinta di fattori esogeni. Tali specie
reattive, resesi disponibili in grandi quantità, sono in grado di attaccare qualsiasi
substrato con il quale giungono a contatto, strappando ad essi l’elettrone o gli elettroni
necessari per raggiungere la propria stabilità. Ciò, a sua volta, innesca processi
radicalici a catena che, se non bloccati tempestivamente, possono provocare gravi
conseguenze sul piano, dapprima funzionale, poi anche strutturale. E’ anche attraverso
questi meccanismi che il processo dell’invecchiamento viene accelerato e si favorisce
l’insorgenza e/o l’aggravamento di patologie a decorso cromico, quali l’aterosclerosi e
le condizioni morbose ad essa correlate (es. infarto del miocardio, ictus cerebrale, etc.).
Sulla base di queste considerazioni preliminari, è opportuno che la valutazione di
laboratorio dello stress ossidativo sia “globale”, cioè tenga conto sia della componente
pro-ossidante che di quella anti-ossidante. Tale approccio si rende necessario ogni
qualvolta si sospetti una situazione di stress ossidativo (anche a fronte di valori normali
o addirittura ridotti di test relativi alla capacità ossidante) e, più in generale, ogni
qualvolta si intende monitorare una terapia antiossidante.
Il BAP test (Biological Antioxidant Potential, ossia determinazione del potenziale
biologico antiossidante) è un test fotometrico, ossia eseguibile attraverso uno strumento
analitico denominato fotometro, a partire da un campione di sangue.
45
Esso si basa sull’applicazione “in provetta” di quello che si osserva in Natura, cioè la
formazione della ruggine. Come è noto, l’ossidazione del ferro provoca il passaggio del
metallo dalla sua forma ferrosa a quella ferrica. Poiché questo metallo è anche un
elemento fisiologicamente ben rappresentato nell’organismo, nel test in questione esso è
stato prescelto come indicatore dello stato ossido-riduttivo. Pertanto, misurata
l’assorbanza di una soluzione colorata, preparata al momento dal mescolamento dei
reagenti R1 (cromogeno, tiocianato) ed R2 (cloruro ferrico), l’entità della decolorazione
- rilevata per via fotometrica come cambio di assorbanza - in seguito all’aggiunta del
campione di plasma (o di siero) sarà direttamente proporzionale alla concentrazione di
agenti in grado di riportare il ferro alla sua forma ferrosa, ossia al suo potenziale
antiossidante biologicamente attivo.
Il BAP test, quindi, consente, sostanzialmente, di determinare il livello sierico (o
plasmatico) delle sostanze/attività antiossidanti intese come complesso di agenti in
grado di ridurre il ferro dalla forma ferrica a quella ferrosa. Tra questi sono da
annoverare l’acido ascorbico (vitamina C), l’α-tocoferolo (vitamina E), il β-carotene
(pro-vitamina A), l’albumina, l’acido urico, la bilirubina etc. E’ da precisare, al
riguardo, che il BAP test non è stato progettato per fornire alcuna informazione circa la
concentrazione di ogni singolo antiossidante perché questa da sola avrebbe scarsissimo
valore clinico.
La procedura più comune impiegata per eseguire il BAP test prevede la diluizione di
una piccola quantità di plasma (ottenuto dal sangue intero mediante centrifugazione) in
una soluzione colorata preparata al momento mescolando due reagenti in fase liquida,
un sale ferrico ed un tiocianato. L’aggiunta del campione di plasma provoca una
decolorazione più o meno intensa in funzione del potenziale biologico antiossidante, che
viene misurata per via fotometrica a 505 nm per confronto con il valore di assorbanza
della soluzione colorata da sola.
I risultati del BAP test vengono espressi in micromoli (mmoli) di ferro ridotto per L di
plasma esaminato. La variazione di assorbanza (DA505/min) osservata eseguendo il
BAP test sul plasma di un campione cospicuo di soggetti clinicamente sani ha
dimostrato che la maggior parte degli individui reclutati ha valori che si posizionano al
di sopra di 2200 mmoli/L, valore che stato assunto come cut-off. Pertanto, valori al di
sotto di questo limite indicano una riduzione patologica del livello di antiossidanti
“biologicamente attivi”. In assenza di malattia, il valore del BAP test tende a ridursi,
rispetto al range di normalità, negli anziani. Per il resto, non è documentata alcuna
46
dipendenza dei valori ottenuti dal sesso, dalla razza o da altre condizioni fisioologiche o
parafisiologiche.
Sulla base dei dati finora pubblicati, il BAP test è un test affidabile, preciso, ripetibile,
con un coefficiente di variazione (CV) inter-serie ed intra-serie assolutamente
accettabile, anche con metodica manuale (<5%). L’unica interferenza finora segnalata è
legata alla concentrazione lipidica: un plasma iperlipemico può indurre una sottostima
dei valori, come del resto accade per la maggior parte degli analiti ematici.
Il test va obbligatoriamente eseguito a digiuno o, comunque, dopo un congruo intervallo
di tempo rispetto ad un pasto copioso o all’assunzione massiva di antiossidanti. Il BAP
Test viene eseguito su siero o plasma eparinato fresco in modalità differenziale, con
lettura fotometrica a 505nm e temperatura 37 °C. Per questo motivo, il BAP Test é
applicabile a fotometri e spettrofotometri manuali (o al FREE System, sistema dedicato
allo studio dello stress ossidativo, che prevede kit appositi preinfialati) o ad analizzatori
automatici, venendo quindi incontro a tutte le esigenze dei professionisti della diagnosi.
Data l' esigua quantità di campione necessaria (10 µl per l' analisi manuale) il prelievo
può essere venoso o capillare. Il range stimato del BAP test negli individui normali è
2200–4000 mmoli/L. E’ buona prassi, comunque, che ogni laboratorio determini
l’ampiezza di oscillazione della variabilità biologica eseguendo un congruo numero di
test su soggetti normali. In ogni caso, una riduzione dei valori del test al di sotto
dell’intervallo indicato appare direttamente correlata con una ridotta efficienza della
barriera antiossidante plasmatica.
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d) L' -SHp Test: La valutazione fotometrica dei gruppi tiolici
I tioli rappresentano una componente qualitativamente significativa della barriera
antiossidante plasmatica.
Infatti, i gruppi sulfidrilici delle molecole dei componenti plasmatici (quali, ad esempio,
le proteine, P-SH) possono opporsi alla fase di propagazione dei processi perossidativi
inattivando i radicali sia alcossilici (RO•) che idrossilici (HO•), rispettivamente, secondo
le reazioni:
2 P-SH + 2 RO• -> 2 PS• + 2 ROH -> P-S-S-P + 2 ROH
2 P-SH + 2 HO• -> 2 PS• + 2 H2O -> P-S-S-P + 2 H2O
In pratica, considerando l’evento dal punto di vista stechiometrico, una coppia di gruppi
tiolici può ossidare una coppia di radicali alcossililici (RO•) o idrossilici (HO•), cedendo
ad essa due elettroni (sotto forma di due atomi di idrogeno). In questo modo ambedue i
tipi di radicali vengono inattivati: i radicali alcossilici sono rilasciati come molecole di
alcool mentre i radicali idrossilici diventano innocue molecole d’acqua. I gruppi tiolici
ormai ossidati, invece, reagiscono tra loro, generando ponti disolfuro.
Va ricordato, in tale contesto, che i gruppi sulfidrilici ossidandosi contrastano l’attacco
di alcuni radicali liberi istolesivi, ma, quando si formano nel contesto di molecole
proteiche, possono avere conseguenze indesiderate. Per esempio la formazione di un
ponte disolfuro fra i residui di cisteina di due diverse proteine può portare ad una sorta
di “polimerizzazione”. Se il ponte disolfuro, invece, si crea nell’ambito della stessa
catena, la proteina può modificare stabilmente la sua conformazione. In ambedue i casi
è possibile che le proteine coinvolte nella formazione di legami –S–S– subiscano
un’alterazione delle proprie capacità funzionali.
L’ –SHp test si basa sulla capacità dei gruppi –SH di sviluppare un complesso colorato
determinabile fotometricamente (picco di massima assorbanza, 405 nm) quando
reagiscono con l’acido 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) secondo il metodo
inizialmente proposto da Ellman nel 1959 e poi adattato da Carratelli (41). Il “titolo” di
tioli è direttamente proporzionale all’intensità del colore rilevato strumentalmente.
Il test ha mostrato un grado accettabile di imprecisione analitica. Infatti, il CV intraserie
su 20 aliquote di siero fresco è stato pari a 1.7%, quello interserie su 20 aliquote di siero
congelato 3.3% (41). L’ –SHp test va eseguito su siero o plasma freschi nelle seguenti
condizioni di lavoro: lunghezza d’onda 405 nm, cammino ottico 1 cm, temperatura
48
ambiente. Si può eseguire l’analisi solo con la modalità end point. Prima di procedere
all’esecuzione del test bisogna preparare anzitutto lo standard, fornito col kit sotto
forma di siero liofilo a matrice umana a titolo noto, indicato sull’etichetta.
A questo scopo è sufficiente aggiungere al liofilizzato il volume di acqua distillata
previsto (indicato dal produttore) e mescolare la soluzione così ottenuta con delicatezza,
avendo cura di attenersi alle indicazioni di carattere generale descritte in dettaglio a
proposito del d-ROMs test.
Dopo aver portato i reagenti alla temperatura di lavoro, si prepara, quindi, la soluzione
del calibratore per i gruppi tiolici (L-cisteina). In pratica si scioglie la L-cisteina in
polvere (R3) in 25 mL di acqua distillata e si prepara da essa, per diluizione, una
soluzione 496 mM di gruppi tiolici. Tale soluzione è stabile per 2-3 ore e 2-3 giorni, a
temperatura ambiente o +4°C, rispettivamente. A questo punto avendo pronti lo
standard di siero e il calibratore “chimico”, si preparano cinque soluzioni. Le soluzioni
così preparate vanno mescolate delicatamente e lasciate ad incubare a temperatura
ambiente per 3-4 minuti. Terminata l’incubazione, esse vanno sottoposte a lettura
fotometrica, misurando l’assorbanza a 405 nm.
I risultati del test, ovvero la capacità antiossidante o titolo tiolico del campione
analizzato, saranno espressi in µmoli di –SH/L di campione. Il range negli individui
normali è 450–650 µmoli/L. Una riduzione dei valori del test al di sotto di questo
intervallo si correla direttamente con una ridotta efficienza della barriera antiossidante
tiolica. In ogni caso è consigliabile che ciascun laboratorio determini i propri valori di
riferimento. Il titolo dei tioli, determinato mediante l’–SHp test, è risultato più basso
rispetto ai controlli nella sindrome di Down, ove anche l’ OXY-Adsorbent fornisce
valori inferiori alla norma, contro il palese incremento del d-ROMs test. In generale, l’–
SHp test si è dimostrato molto affidabile nella valutazione della componente tiolica
della barriera antiossidante plasmatica in diversi studi clinici, integrando egregiamente i
risultati dell’OXY-Adsorbent test e del d-ROMs test nella valutazione globale dello
stress ossidativo, in particolare nei fumatori, nei nefro-trapiantati, nei dializzati, negli
uremici e nel monitoraggio dell’efficacia dell’integrazione alimentare dei pazienti
cancerosi. Interessanti anche i risultati in medicina veterinaria, su bovini. L’ –SHp test,
infine, trova particolare indicazione quando vi è ragionevole sospetto di una situazione
di stress ossidativo ed i valori del d-ROMs test risultano bassi. Una situazione del
genere può riscontrarsi, per esempio, in soggetti con neoplasie solide. In queste
condizioni, il viraggio del metabolismo cellulare in senso anaerobio genera la
49
produzione, nell’intorno della massa tumorale, di cataboliti acidi. Questi ultimi,
riducendo localmente il pH possono favorire il rilascio di ferro che catalizza la
formazione del radicale alcossile dagli idroperossidi circolanti. I gruppi tiolici, a questo
punto, possono reagire con i radicali alcossilici prodotti riducendo, di fatto, il livello di
idroperossidi circolanti. In questa condizione il d-ROMs test darà valori bassi non
perché non vengano prodotti idroperossidi, ma perché essi vengono neutralizzati dai
gruppi sulfidrilici. Solo il riscontro di una riduzione concomitante dei gruppi tiolici
consentirà di interpretare questo singolare quadro di laboratorio.
3.4.3.2 Valutazione dell'attacco radicalico:
La conseguenza dell'attacco radicalico è individuabile attraverso varie tecniche tra cui:
• I RESIDUI CARBONILICI DELLE PROTEINE
• dROMs
a)
Residui carbonilici delle proteine
L'importanza della Valutazione del danno ossidativo coinvolto nei vari processi
patologici richiede test affidabili e sensibili su prodotti modificati dall'ossidazione.
Lo stress ossidativo può dare origine a derivati carbonilici delle proteine, attraverso una
varietà di meccanismi che includono la frammentazione e l'ossidazione amminica a
causa di catalisi metallica o da acido ipocloroso e proprio per questo la misura dei
carbonili proteici è diventata un marcatore popolare di danno ossidativo.
Il saggio sui carbonili è stato applicato a studi sperimentali e campioni clinici, ed è stato
dimostrato che i livelli di carbonili sono elevati in alcune patologie e tende ad
aumentare con l'età. Tuttavia, sono state sollevate numerose questioni circa la validità di
alcuni di questi risultati e la specificità del test.
Diversi approcci sono stati adottati per rilevare e quantificare il contenuto carbonile
nelle preparazioni delle proteine. La procedura più conveniente è la reazione tra 2,4dinitrofenilidrazina (DNPH) e i carbonili proteici. La DNPH reagisce con i carbonili
proteici, formando una base di Schiff per produrre l'idrazone corrispondente che può
essere analizzato con uno spettrofotometro.
Per questo saggio abbiamo utilizzato il kit per i carbonili proteici della Cayman che
utilizza la reazione con DNPH per misurare il contenuto di proteine carbonili contenute
50
in plasma, siero, lisato cellulare, o tessuti omogenati in formato micropiastre. La
quantità di proteina-idrazone prodotta è quantificata spettrofotometricamente ad
un'assorbanza tra 360-385 nm.
Questa procedura deve essere attuata per ogni campione da analizzare:
• Si trasferiscono 200µl di campione in 2 provette di plastica. Una provetta sarà la
provetta del campione(S#) e l'altra provetta sarà il controllo(C#).
• Si aggiungono 800µl di DNPH alla provetta con il campione e altri 800µl di 2,5M di
Hcl alla provetta del controllo.
• Mettere ad incubare le due provette (S#,C#) al buio a temperatura ambiente per 1 ora.
Vortexare poi entrambe le provette brevemente ogni 15min durante l'incubazione.
• Si aggiunge poi 1 ml di TCA 20% in entrambe le provette e vortexare. Mettere le
provette in ghiaccio e porre in incubazione per 5 min.
• A questo punto si centrifugano le provette a 10000 x g per 10 min a 4°C in una
microcentrifuga.
• Si scarta il surnatante e si risospende il pellet in 1 ml di TCA 10%. Mettere le provette
in ghiaccio e porre in incubazione per 5 min.
• A questo punto si procede ad un'ulteriore centrifuga delle provette a 10000 x g per 10
min a 4°C in una microcentrifuga.
• Si scarta il surnatante e si risospende il pellet in 1 ml di miscela costituita da etanolo e
etil acetato in rapporto 1/1. Risospendere manualmente con una spatola il pellet,
vortexare accuratamente, e centrifugare le provette a 10000 x g per 10 min. a 4°C nella
microcentrifuga.
• Ripetere il punto precedente per due o più volte.
• Dopo il lavaggio finale, si risospende il pellet proteico in 500µl di guanidina
idrocloride e vortexare.
• Centrifugare le provette a 10000 x g per 10 min a 4°C nella microcentrifuga per
rimuovere per rimuovere eventuali detriti rimasti.
• A conclusione trasferire 200ml del surnatante della provetta del campione (S#) su due
celle della micropiastra.
• Trasferire poi 220ml del surnatante del controllo(C#) in altre due celle della
micropiastra.
• E al termine misurare l'assorbanza a lunghezza d'onda tra 360-385 nm attraverso un
lettore di piastre.
51
E procedere al calcolo dei residui carbonilici delle proteine.
contenuto in carbonili(nmol/mg)= (carbonili nmol/ml)/(proteine mg/ml)
questo saggio è ottimale per campioni aventi concentrazione proteica compresa tra 1 e
10mg/ml
b)
Il d-ROMs Test: Valutazione fotometrica dei metaboliti reattivi dell'
ossigeno
Il d-ROMs test è un test spettrofotometrico che consente di determinare, in un campione
biologico, la concentrazione degli idroperossidi (ROOH), generati nelle cellule
dall’attacco ossidativo dei ROS su svariati substrati biochimici (glicidi, lipidi,
amminoacidi, proteine, nucleotidi ecc.).
La sigla ROM vuole sottolineare che gli analiti misurati dal test, gli idroperossidi, sono
dei metaboliti reattivi dell’ossigeno (Reactive Oxygen Metabolites, ROM).
Attraverso il d-ROMs test gli idroperossidi di un campione biologico, quale, ad
esempio, il siero, dopo aver reagito con un apposito cromogeno sviluppano un derivato
colorato (dal rosa al rosso) rilevabile e quantificabile per via spettrofotometrica. La
concentrazione degli idroperossidi, che correla direttamente con l’intensità del colore
rilevato, viene espressa in unità di concentrazione di facile impiego nella pratica clinica.
Tali unità sono indicate con la sigla U CARR dal cognome dell' inventore Mauro
Carratelli (dove 1 U CARR equivale a 0.08 mg H2O2/dL), a causa dell’eterogeneità
delle specie chimiche presenti inizialmente nel campione biologico da testare.
Il principio alla base del d-ROMs test è quello del la reazione di Fenton, verificato per il
perossido di idrogeno e successivamente ampliato da Haber e Weiss, secondo cui un
metallo di transizione in forma ionica (es. ferro o rame) catalizza la scissione di un
idroperossido (ROOH), generando nuove specie radicaliche, l’idroperossile (ROO*) o
l’alcossile (RO*), a seconda che, rispettivamente, lo ione catalizzante si ossidi (Fe2+->
Fe3+o Cu+ -> Cu2+) oppure si riduca.
Nel d-ROMs test, dunque, gli idroperossidi contenuti in un campione biologico – per
52
comodità espositiva, nel siero – vengono messi nelle condizioni previste dalla reazione
di Fenton per generare in vitro radicali idroperossilici ed alcossilici.
1A) R-OOH + Fe2+ -> R-O* + Fe3++ OH1B) R-O* + A-NH2 -> R-O- + [A-NH2*]+
2A) R-OOH + Fe3+-> R-OO* + Fe2+ (Cu+) + H+
2B) R-OO* + A-NH2 -> R-OO- + [A-NH2*]+
Il d-ROMs test può essere eseguito sia in cinetica che in endpoint. In ambedue i casi,
prima di procedere all’esecuzione dell’analisi, bisogna preparare lo standard (o
calibratore), fornito all' interno del kit sotto forma di siero liofilo a matrice umana a
titolo noto (U CARR), indicato sull’etichetta.
Nella procedura cinetica standard si parte preparando tre soluzioni: il bianco reagente, il
campione (preferibilmente siero fresco) ed il calibratore. Tali soluzioni vanno incubate
per 1 minuto a 37 °C, quindi, terminata l’incubazione, esse vanno sottoposte a lettura
fotometrica, misurando l’assorbanza a 505 nm (A505) o 546 nm (A505) immediatamente
e successivamente, nelle stesse condizioni di lavoro (37°C), dopo 1, 2 e 3 min. Ai valori
di assorbanza ottenuti per il campione e per il calibratore si sottrae, quindi, il valore di
assorbanza del bianco reagente.
Nella procedura endpoint si parte preparando tre soluzioni: il bianco reagente, il
campione (siero o plasma eparinato) ed il calibratore. Le soluzioni vanno lasciate ad
incubare a 37°C per 75 minuti. Appena terminata l’incubazione, vanno sottoposte a
lettura fotometrica, misurando l’assorbanza a 505 nm o 546 nm. Ai valori di assorbanza
ottenuti per il campione e per il calibratore si sottrae, quindi, il valore di assorbanza del
bianco reagente (azzeramento con bianco reagente).
Tali metodi permettono quindi di applicare il d-ROMs Test sia a fotometri e
spettrofotometri manuali (o al FREE System, sistema dedicato allo studio dello stress
ossidativo, che ha kit appositi preinfialati), a lettori di micropiatre o ad analizzatori
automatici, venendo quindi incontro a tutte le esigenze dei professionisti della diagnosi.
La disponibilità di una metodica precisa ed affidabile ha consentito di stabilire i livelli
ematici di riferimento del d-ROMs nella popolazione normale.
Si è potuto dimostrare, su un campione di circa 5.000 soggetti clinicamente sani, che il
53
livello di idroperossidi circolanti determinati con il d-ROMs test segue nella
popolazione una distribuzione unimodale con un picco tra 250 e 300 U CARR (pari a
20.08-24.00 mg/dL di H2O2), individuato come il valore di riferimento del test.
Valori superiori a 300 U CARR configurano, dopo una fascia borderline
(301 - 320 U CARR), livelli progressivamente crescenti di stress
ossidativo, come indicato in tabella:
Si è anche osservato che i risultati del d-ROMs test non sono significativamente
influenzati né dal sesso né dall’età, tuttavia, i neonati presentano valori sensibilmente
più bassi, le gravide più alti.
Inoltre, i risultati del d-ROMs test eseguito ripetutamente nello stesso soggetto nell’arco
della giornata non mostrano differenze degne di nota, a meno che non intervengano
fattori in grado di indurre una brusca produzione di perossidi (es. uno sforzo muscolare
intenso).
E’ consigliabile, comunque, che ogni laboratorio determini i propri valori di
riferimento.
3.4.4 ANALISI DEI CAMPIONI DI URINE DEI SOGGETTI DELLO
STUDIO ATTRAVERSO SAGGI ELISA
3.4.4.1 L’8OHdG
Vi è ampia evidenza sperimentale che il danno ossidativo si verifica in modo
permanente
nei lipidi della membrana cellulare, nelle proteine e nel DNA. Nel DNA nucleare e
54
mitocondriale, l’8-idrossi-2’-Deossiguanosina (8-OHdG) o l’8-oxo-7 ,8-diidro-2’Deossiguanosina (8-oxodG) è una delle forme predominanti di radicale libero indotto da
lesioni ossidative, e pertanto è stato ampiamente utilizzato come biomarker dello stress
ossidativo e della carcinogenesi.
Studi hanno dimostrato che l’8-OHdG urinario è un buon biomarker per la valutazione
del rischio di vari tipi di cancro e malattie degenerative. Il metodo più diffuso di analisi
quantitativa è l’HPLC con rilevamento elettrochimico, gas cromatografia / spettrometria
di massa (GC-MS), e HPLC con spettrometria di massa in tandem.
Al fine di risolvere i problemi metodologici riscontrati nella misura quantitativa dell’ 8OHdG, è stato istituito nel 1997 il comitato per le Norme Europee sul danno ossidativo
al DNA, al fine di risolvere i problemi di ossidazione artefatta durante le procedure di
isolamento e purificazione dei prodotti di ossidazione del DNA.
Il biomarker 8-OHdG o 8-oxodG è un indicatore fondamentale per misurare l'effetto
endogeno del danno ossidativo al DNA e come fattore di iniziazione e di promozione
di carcinogenesi. Il biomarcatore è stato utilizzato per stimare il danno al DNA negli
esseri umani dopo l'esposizione ad agenti cancerogeni, come il fumo di tabacco, le fibre
di amianto, i metalli pesanti e gli idrocarburi policiclici aromatici. Negli ultimi anni, l’8OHdG
è stato utilizzato ampiamente in molti studi non solo come biomarker per la misurazione
endogena del danno ossidativo al DNA, ma anche come fattore di rischio per molte
malattie tra cui il cancro.
L’8OHdG è un saggio che si basa sulla tecnica ELISA in vitro per l’individuazione
quantitativa del prodotto di ossidazione del DNA: l’ 8hydroxy2
'deossiguanosina(8OHdG).
Qesto test è stato appurato per vari campioni biologici come: l'urina, il siero, il plasma,
i tessuti e altri campioni biologici. Noi abbiamo applicato questa metodica alle urine dei
volontari dello studio sul consumo di fragole.
Il necessario per intraprendere questa metodica è:
• 8OHdG Micropiastra: Piastra precedentemente rivestita con 8OHdG (8 × 12wells, tipo
split)
• anticorpo primario: anticorpo monoclonale Anti 8OHdG (clone N45.1)
• Soluzione di anticorpo primario: Soluzione tampone salina
• anticorpi secondari: HRPconjugated anti mouse antibody
• soluzione di anticorpo secondario: Soluzione tampone salina
55
• Soluzione cromatica: 3,3 ', 5,5' tetrametilbenzidina
• Soluzione di diluizione: perossido di idrogeno / tampone citrato fosfato salino
• Soluzione di lavaggio (5x): 5 volte, tampone fosfato isotonico concentrato
• Soluzione per reazione di terminazione: 1M di acido fosforico
• Soluzione standard 8OHdG: 8OHdG purificato (0,5, 2, 8, 20, 80, 200 ng / mL)
• piastra di tenuta
..oltre alle normali dotazioni dei laboratori quali:
• Acqua distillata.
• micro pipetta da 50µL e puntali per pipette
• Micropipetta multicanale (50 ~ 200µL) e puntali
• vassoi di reagente per la micropipetta multicanale
• un incubatore a 37 ° C
• lettore di micropiastre (lunghezza d'onda 450 nm = misura)
Principi della procedura
L’anticorpo monoclonale anti-8OHdG, il campione o lo standard vengono aggiunti alla
micropiastra già ricoperta di 8OHdG.
L’anticorpo monoclonale anti-8OHdG reagisce in modo competitivo con la 8OHdG
vincolato sulla piastra e l’8OHdG nella soluzione campione. Pertanto le concentrazioni
maggiori di 8OHdG nella soluzione campione portano ad un ridotto legame dell'anticorpo
alla 8OHdG sulla piastra.
Gli anticorpi che sono legati alla 8OHdG nel campione sono stati lavati via da anticorpi
che sono legati alla 8OHdG rivestito sulla piastra.
Un anticorpo secondario legato ad un enzima si aggiunge alla piastra, si lega
all’anticorpo monoclonale che è legato all’8OHdG di rivestimento sulla piastra.
L’anticorpo secondario HRPconiugato viene rimosso mediante lavaggio.
L'aggiunta della soluzione substrato risulta nello svilupparsi del colore in proporzione alla
quantità di anticorpo anti 8OHdG legato alla piastra.
La reazione è terminata dall’acido fosforico, ed è misurata ad una assorbanza di 450 nm.
56
3.4.4.2 Isoprostani urinari
Gli Isoprostani sono composti simili alle prostaglandine che sono prodotte
dalla perossidazione delle lipoproteine mediata dai radicali liberi. C'è una forte evidenza
che gli isoprostani sono eccellenti biomarcatori molecolari per lo stress ossidativo. Infatti,
il 15- F2t Isoprostano è già ampiamente riconosciuto come il "gold standard" dello stato
ossidante. Questo kit ELISA è stato sviluppato per la misurazione rapida e accurata di 15Isoprostane-F2t in campioni di urina. Non è necessaria nessuna estrazione in fase solida. I
risultati ottenuti usando questo kit sono stati convalidati da GC / MS dopo estrazione in
fase solida di aliquote separate e mostrano un elevato grado di correlazione (r> 0,8).
Il kit che abbiamo utilizzato è per la quantificazione del 15-isoprostano F2t (conosciuto
anche come 8-epi-PGF2a, 8-iso-PGF2a o 8-isoprostano) nei campioni di urine. Livelli
di 15-isoprostano F2t nei fluidi biologici hanno dimostrato essere utili per la
valutazione dello stress ossidativo in vivo. Il 15-isoprostano F2t è stato anche
dimostrato essere un potente vasocostrittore nei reni del ratto e nei polmoni del coniglio.
Elevati livelli di isoprostani sono associati a sindrome epato-renale, reumatoide l'artrite,
l'aterosclerosi, e la carcinogenesi.
Materiale fornito dal kit:
• Micropiastra a 96 celle Precedentemente rivestita con Anti-15-isoprostano F2t
• 15-isoprostano F2t Standard
• Tampone di diluizione avanzata (E.D.B.)
• Tampone di lavaggio (5x)
• Substrato K BLUE (TMB)
• 15-isoprostano F2t coniugato HRP
• Vassoio di reagente per pipetta Multicanale
Questa tecnica utilizza il metodo ELISA per determinare i livelli di 15-F2t-isoprostano in
campioni biologici. Andiamo a descrivere brevemente la procedura, l’F2t 15-isoprostano
nei campioni o dello standard compete con l’F2t 15-isoprostano coniugato con HRP per
l'associazione con l’ anticorpo policlonale specifico per F2t 15-isoprostano di rivestimento
della micropiastra. I risultati dell'attività HRP sviluppano colore quando è aggiunto il
substrato TMB, con l'intensità del colore proporzionale alla quantità di 15-F2t-isoprostano
57
coniugato e inversamente proporzionale alla quantità di 15-F2t-isoprostano coniugato nei
campioni o standard. L'aggiunta di una soluzione di arresto acida provoca un cambiamento
di colore giallo in cui l’assorbanza viene letta a 450 nm.
3.4.5 ANALISI DEGLI ERITROCITI
3.4.5.1 I globuli rossi:
Dopo la centrifugazione del sangue intero, sono stati ottenuti e utilizzati per ulteriori
analisi i globuli rossi (RBC). Dopo aver stoccato il plasma e aver rigettato il buffy coat
per aspirazione, il pellet di globuli rossi è stato lavato una volta con NaCl 0.9%, poi tre
volte con tampone fosfato (PBS, contenente 150 mM NaCl, 1.9 mM di sodio fosfato Na2HPO4 - e 8.1 mM sodio diidrogeno fosfato - NaH2PO4 -, pH 7.4) a temperatura
ambiente, per le analisi successive.
3.4.5.2 Studio sulla resistenza all’emolisi
Dopo i lavaggi in serie, i globuli rossi sono stati risospesi in tampone PBS (controllo) e in una
soluzione contenente AAPH in soluzione tampone a pH 7.4 (ematocrito all’8%, Hct), ed
incubati per 5 ore a 37 ° C, agitando delicatamente. La % d’emolisi è stata registrata dopo 1, 3 e
5 ore di incubazione (Cesquini et al, 2003; Suwalsky et al, 2007). La concentrazione dell’AAPH
è stata stabilita dopo alcune prove a 50mM e.5 mM, al fine di aumentare il danno ossidativo e di
esacerbare un’eventuale differenza nella risposta allo stress ossidativo.
3.5 STUDIO SULL’ATTIVAZIONE PIASTRINICA
In uno studio sul consumo di fragole a medio termine effettuato dal nostro gruppo in
anni precedenti, si è visto che dopo un consumo di 500 g giornalieri di fragole
appartenenti alla cultivar Sveva il numero di piastrine circolanti diminuiva, lasciando
ipotizzare delle valutazioni in studi futuri sui cambiamenti nelle funzioni delle piastrine
o una determinata suscettibilità all’attivazione delle stesse.
58
Nel 2009 abbiamo effettuato uno studio su un consumo acuto di fragole della cultivar
Alba (500g/die per 15 gg) ed uno consecutivo su un consumo prolungato utilizzando la
cultivar Sveva (300g/die per 30gg con alternanza tra Adria e Sveva) di cui ci siamo
serviti negli anni precedenti per lo studio a medio termine, affiancata dalla cultivar
Adria e in collaborazione con il Polo Scientifico Tecnologico dell’Inrca di Ancona
abbiamo scelto in maniera del tutto casuale 9 tra i 23 volontari partecipanti allo studio,
di età compresa tra i 20 e i 30 anni, e abbiamo condotto uno studio sull’attivazione delle
piastrine.
3.5.1 ISOLAMENTO DELLE PIASTRINE
I 23 volontari dello studio hanno dato il consenso informato per utilizzare il loro sangue
nello studio proposto. Sono stati presi in considerazione 9 diversi campioni. Il sangue
venoso ottenuto dal prelievo è stato messo in provette contenenti eparina e trasportato in
tempi brevissimi ai laboratori dell’Inrca.
Appena giunti i campioni di sangue sono stati centrifugati per 10 min a 200 g a
temperatura ambiente (22°C) per ottenere un plasma ricco in piastrine (PRP). Il PRP è
stato centrifugato a 1000g per 20 min a temperatura ambiente. Si è ottenuto un pellet
piastrinico.
3.5.2 PROCEDURA DI MICROSCOPIA ELETTRONICA
Il pellet è stato fissato in glutaraldeide 2,5% in tampone cacodilato di sodio pH 7,3
overnight a 4°C. Successivamente il pellet è stato staccato dalla provetta e lavato per
due volte nello stesso tampone utilizzato per la fissazione.
Le piastrine sono state quindi post fissate in osmio 1% diluito in cacodilato di sodio pH
7,3 per 2 h a 4°C dopodichè sono stati effettuati altri 2 lavaggi di 5 min in tampone. I
campioni di piastrine sono stati sottoposti quindi a disidratazione in alcool etilico al
70%, 80%, 90% per 15 min per ogni diluizione e in alcool etilico 100% 3 volte per 20
min. Sono stati poi esposti al solvente di transizione ossido di propilene 2 volte per 30
min. Le piastrine sono state poi infiltrate con soluzioni crescenti di resina epossidica e
decrescenti di ossido di propilene fino all’inclusione in resina assoluta a 60°C per 48 h.
La procedura si è ripetuta ad ogni tempo dello studio. I blocchetti sono stati poi
59
sezionati all’ultramicrotomo in fettine ultrasottili di 60 nm e osservati al microscopio
elettronico Zeiss EM 109.
3.5.3 INDAGINE QUANTITATIVA
Al fine di definire l’effetto del trattamento con le 3 varietà di fragole presein
considerazione ma soprattutto i diversi dosaggi in diversi periodi sull’attivazione
piastrinica, per ogni soggetto ad ogni prelievo sono state contate circa 100 piastrine che
sono state classificate in resting, central clustered e degranulated (vd immagini sotto),
utilizzando il software di analisi d’immagine Kontron KS300. Questi tre profili
morfologici sono caratteristici rispettivamente di piastrine non attivate, nella fase di
attivazione e nella fase post-attivazione.
a)
resting
b)
central clustered
60
c)
degranulated
Fig. 10 a, b, c, profili morfologici caratteristici rispettivamente di piastrine non attivate
(resting), nella fase di attivazione (central clustered) e nella fase post-attivazione
(degranulated).
Nell’ultima immagine la piastrina degranulated si trova in basso ed è caratterizzata
dall’assenza di granuli e strutture interne riconoscibili.
61
RISULTATI E DISCUSSIONE
4.1 CARATTERIZZAZIONE NUTRIZIONALE DEL FRUTTO
La parte introduttiva di questo progetto di dottorato di ricerca consiste nella valutazione delle
caratteristiche nutrizionali di cultivars di fragola (Fragaria x ananassa) scelte come frutti
modello di questo progetto per l’elevato contenuto in antiossidanti e trattandosi di un frutto
importante sia per il consumo fresco sia per l'industria alimentare. Le fragole sono il frutto più
coltivato ad ogni latitudine, dal Mar Artico fino ai tropici, con una produzione mondiale
stimata di 2,5 milioni di tonnellate nel 1997 (Hancock, 1999); in realtà si tratta probabilmente
di una sottostima perché questo dato non considera le grandi quantità di prodotto vendute sul
mercato privato.
Ad oggi molti studi pubblicati mostrano che le fragole contengono un elevato contenuto
di acido ascorbico, antociani e composti fenolici (Kalt et al, 1999; Olsson et al, 2004) e
per tutte queste caratteristiche quindi possiedono una elevata capacità antiossidante
(Wang & Hsin-Shan, 2000; Wang et al, 2002; Scalzo et al, 2005a; Scalzo et al, 2005b).
Le cinque cultivar di fragola selezionate per questo progetto sono ben note sul sistema
produttivo italiano per i loro diversi tempi di maturazione (cfr materiali e metodi). Tra le
cultivar caratterizzate nutrizionalmente c’è una linea OGM, la cultivar parentale è Calypso,
pianta rifiorente perenne di media pezzatura e medio periodo di maturazione.
La cultivar Calypso OGM è frutto di un programma di miglioramento genetico, effettuato dal
SAPROV dell’Università Politecnica delle Marche, sul contenuto degli antiossidanti in
particolare delle antocianine.
Le differenze fra le varietà sono state delineate utilizzando diversi saggi ( cfr 3.2.3.1
Materiali e metodi) come il TEAC e il FRAP per la capacità antiossidante totale, il FOLIN
CIOCALTEAU per i polifenoli totali, affiancati da saggi per la valutazzione dei flavonoidi,
una classe specifica di polifenoli, e antocianine a cui abbiamo affiancato una valutazione con
HPLC del contenuto di vitamina C. I grafici riportati sotto mostrano i valori di CAT a
confronto tra metodo TEAC e FRAP con una correlazione maggiore di 0,9, (Figura 1), i
micronutrienti come la vitamina C (Figura 2) e i polifenoli (Figura 3). Le concentrazioni sono
espresse come valori medi± SD.
62
Fig.1 Capacità antiossidante totale, misurata con test TEAC e FRAP, delle cinque cultivar testate. I dati sono
espressi come valori medi ± SD. Le colonne appartenenti alla stessa serie di dati con lettere differenti sono
significativamente differenti (p <0,05).
Fig. 2 Contenuto in vitamina C, misurata con tecnica in HPLC, delle cinque cultivar testate. I dati sono espressi
come valori medi ± SD. I dati con lettere differenti sono significativamente differenti
(p <0,05).
63
Fig. 3 Contenuto di polifenoli,flavonoidi ed antocianine, delle cinque cultivar testate. I dati sono espressi come
valori medi ± SD. Le colonne appartenenti alla stessa serie di dati con lettere differenti sono significativamente
differenti (p <0,05).
Negli ultimi decenni è stata data molta attenzione al potere antiossidante della frutta come
parametro per determinare un prodotto di qualità. Questo parametro è strettamente correlato
alla presenza di efficienti composti che combattono l’azione dei radicali liberi, come la
vitamina C e i composti fenolici. Ad esempio, i polifenoli nelle piante agiscono come
antiossidanti e proteggono contro varie fonti di danno (UV, agenti patogeni, ecc.). Pertanto è
ipotizzabile verosimilmente che questi composti possano svolgere un ruolo importante nel
controllo delle reazioni ossidative anche nel corpo umano, ed esibire le loro attività
antitumorali e antiaterogeniche da effetti diretti, indiretti e mediati.
La capacità antiossidante di per sé non è in ogni caso correlata agli effetti benefici osservati
sulla salute (Lotito & Frei,), ma molte delle funzioni biologiche di queste sostanze sono state
attribuite a questa proprietà. I risultati del TEAC e del saggio FRAP per l'attività
antiossidante totale sono stati molto simili, suggerendo che i due saggi sono quasi comparabili
e intercambiabili (coefficiente di correlazione >0,88), nel caso della fragola e, in generale, per
l'analisi della frutta. Il saggio FRAP ha dato valori più bassi rispetto ai valori corrispondenti
del TEAC, e tendono a mettere in evidenza differenze significative tra i genotipi
64
maggiormente rispetto ad altri test. La più alta capacità antiossidante totale, espressa sia dal
TEAC sia dal FRAP, rispettivamente, è stata osservata per la varietà Sveva (una media di
25,165 e 12,2253 µmoles TE / g FW), immediatamente seguita dalla cultivar Calypso e dalla
sua OGM (in media 19,798 e 11,8167; 20,008 e 10,5226 µmoles TE / g FW rispettivamente).
I valori più bassi di CAT sono stati riscontrati nella cultivar Alba (13,249 e 8,7097 µmoles TE
/ g FW).
Quando si considera il contenuto di vit C nella fragola, è importante ricordare che la
molecola è molto labile e subisce ossidazione in conseguenza a condizioni avverse. Il tasso di
degradazione dell'acido ascorbico nelle fragole dipende da diversi fattori quali la temperatura,
l'acqua e il pH. La metodologia utilizzata in questo lavoro di quantificazione del contenuto di
Vit C nella frutta è stata particolarmente ottimizzata per prevenire e limitare qualsiasi
processo di degradazione.
Il contenuto di vitamina C (Figura 2) varia fortemente tra le 5 cultivar di fragole, e una
differenza di 2,4 volte è stata riscontrata tra i valori della fragola con il più basso contenuto e
(Sveva con una media di 0,231725 mg di vitamina C / g FW) e quella con il più alto
contenuto (Adria, una media di 0,57 mg di vitamina C / g FW). In studi precedenti la cultivar
Sveva risultava essere tra le più ricche in vitamina C ma proprio per quanto precedentemente
detto sui parametri che influiscono sul contenuto in vit C, quali temperatura, acqua e PH,c’è
da considerare che nel periodo pre-raccolta di questa cultivar, si sono avute delle condizioni
metereologiche particolarmente avverse, tali da mettere a rischio la raccolta, che è stata
comunque portata a termine a scapito della resa che ha subito forti riduzioni e il prodotto è
andato in corso di decomposizione in brevissimo periodo a causa dell’enorme quantità di
acqua subita.
Tutti concordano sul fatto che questa sostanza è uno dei più importanti antiossidanti nelle
piante, negli animali ed negli esseri umani. Quindi, ulteriori indagini sulla variazione del
contenuto in vitamina C di fragole è fortemente auspicato per il prossimo futuro.
Per quanto riguarda in generale il contenuto di questo frutto in polifenoli, nel grafico abbiamo
rappresentato i valori ottenuti col metodo Folin Ciocalteau.
Il valore più elevato per quanto riguarda questo parametro è stato osservato nella cultivar
Sveva (3,86 GAE / g FW), seguita da Adria ( 3,50 GAE / g FW), mentre il contenuto più
basso è stato misurato in Alba (2,87 GAE / g FW). Pertanto, la differenza tra la cultivar più
ricca e la più povera è di 1,3 volte.
I risultati ottenuti hanno confermato i valori noti in letteratura.
65
La cultivar sveva risulta essere di gran lunga la più ricca anche in flavonoidi con un valore
medio di 4,18 CE/g FW) mentre Alba risulta essere la più povera anche in questo caso (2,16
CE/g FW).
Per quanto riguarda le antocianine, dobbiamo fare una precisazione, abbiamo infatti parlato
finora di queste 5 cultivar di cui una OGM, c’è da specificare che il miglioramento genetico
effettuato dal SAPROV dell’Università Politecnica delle Marche sulla cultivar Calypso, è
stato indirizzato al contenuto di antiossidanti, in particolare la cultivar Calypso OGM è
geneticamente modificata riguardo al contenuto in antocianine, questa caratteristica è
supportata dai dati ottenuti dalle nostre analisi,dove la varietà più ricca in antocianine è Adria,
con 1,18 mg PgE/g FW , seguita da Alba con un contenuto medio di 0,99 mg PgE/g FW, e da
Sveva e Calypso con un contenuto medio di 0,968 e 0,965 mg PgE/g FW rispettivamente. La
cultivar a più basso contenuto è Calypso parentale con 0,74 mg PgE/g FW. La cultivar OGM
quindi ha subito sì una modifica genetica nel contenuto di antocianine che si rileva
confrontandola con la sua parentale, ma a confronto con le altre cultivar prese in esame non
eccelle nei contenuti di questi composti.
4.2 EFFETTO GASTRO-PROTETTIVO DEGLI ESTRATTI DI
FRAGOLE
4.2.1 I PARTE
La somministrazione di etanolo assoluto ai topi a digiuno ha portato a un grave danno gastrico
visibile dall'esterno dello stomaco come spesse linee di colore rosso-nero. Dopo aver aperto lo
stomaco le lesioni sono state individuate nella mucosa e apparivano come bande di forma
allungata,di 1-10 mm di lunghezza, di solito parallele all'asse lungo dello stomaco. Si trovano
nel corpo (la porzione di stomaco che secerne acido e pepsina). Non ci sono lesioni visibili
sviluppate nella parte non secretoria dello stomaco. La somministrazione d'etanolo assoluto ha
causato una emorragia della mucosa gastrica meno grave nei ratti pretrattati con estratto di
fragole (Fig. 12-16) e con quercitina (Fig. 17).
Le Figure 12-16 mostrano l'effetto del pretrattamento con i diversi estratti di fragole applicati
per via intragastrica (I.G.), sull'indice ulcerativo (U.I.). Come è elencato nella tabella 5
l'etanolo ha causato tipiche lesioni gastriche diffuse al 22,33% del totale dell'area dello
stomaco nel controllo, 8,35% nel gruppo a cui è stato somministrato l'estratto della cultivar
sveva, 4,89% nel gruppo con somministrazione dell'estratto di Calypso OGM, 7,07% nel
66
gruppo alimentato con Calypso parentale, 7,03% nel gruppo trattato conl'estratto della cultivar
Alba, 3,01% nel gruppo trattato con Adria e 4,69% nel gruppo a cui è stata somministrata la
quercitina. . Il pretrattamento con estratti di fragole ha significativamente (p <0,001) attenuato
le lesioni gastriche indotte dall'etanolo assoluto.
Per l'estrapolazione delle dosaggio da esseri umani ai ratti, abbiamo usato le condizioni dello
stato metabolico del corpo o l'assunzione di cibo, piuttosto che il peso corporeo come criterio
(Rucker et al.2002, Rucker et al. 2007).
E' stato visto che alimenti ricchi di polifenoli possiedono un'attività anti-ulcerativa (in particolare
da studi di etnofarmacologia) e la letteratura documentata si è concentrata principalmente
sull'azione farmacologica in animali da laboratorio.
Noi crediamo che un regime combinato sia di antiossidanti sia di farmaci antisecretori, può
essere utile nel prevenire danni diretti alle cellule della mucosa o di integrazione della capacità
di rigenerazione.
6 ratti
per gruppo
Alimentazione
ricevuta una volta
% UI
PH
al giorno x 10gg
% di inibizione dell’UI
(ulcer index)
rispetto al gruppo di
MEDIA±SD
controllo
CONTROLLO
10%PEG 400
5,61±1,03
22,33±12,34 /
SVEVA
0,3ml/kg
5,23±1,58
8,35±5,25* 63
CALIPSO OGM
0,3ml/kg
4,69±1,19
4,89±3,64* 78
CALIPSO
0,3ml/kg
5,42±0,62
7,07±3,96* 68
ALBA
0,3ml/kg
5,11±1,66
7,03±4,69* 69
ADRIA
0,3ml/kg
4,66±1,61
3,01±2,24** 87
QUERCITINA
100mg/kg
5,03±1,40
4,69±3,81* 79
CONTROLLO
Tab.5 % di inibizione dell’UI
* differenze significative in relazione al gruppo di controllo
** differenze significative in relazione al gruppo alimentato con Sveva
4.2.2 PARTE II
Dal momento che la perossidazione lipidica è un meccanismo consolidato di lesioni della
mucosa gastrica, abbiamo misurato i cambiamenti nelle concentrazioni di Malondialdeide
(MDA) come indicatore di perossidazione lipidica nella mucosa gastrica. La
67
somministrazione di etanolo assoluto aumenta in modo significativo la perossidazione lipidica
nella mucosa gastrica, valutata come formazione di MDA dal gruppo 00 al controllo ( 323,10
± 38,43 Vs 478,70 ± 64,70 nmol / mg prot. del controllo (p <0.05), il gruppo 00 era composto
da animali normali, sani senza alcun pretrattamento o induzione di lesioni gastriche ).
L'MDA è stata ridotta significativamente rispetto al gruppo di controllo dal pretrattamento
con 0,3 ml di estratto di fragola / kg di ratto.
La tabella 6 mostra la concentrazione di MDA in una normale mucosa gastrica (gruppo 00),
nella mucosa gastrica di ratti non pretrattati con estratti di fragole e concentrazioni di MDA in
mucose gastriche pretrattate.
Come mostrato nella medesima tabella, l'attività SOD (SuperOssidoDismutasica) media è di
38,77 ± 7,45 U /mg prot. in mucose gastriche intatte. Dopo la somministrazione di etanolo
assoluto, è stata osservata una notevole diminuzione della attività SOD al valore di 23,08 ±
5,58 U / mg prot. risultata significativa rispetto al gruppo 00. La somministrazione di estratti
ha ridotto i livelli di attività della SOD rispetto al controllo in maniera significativa sia dopo
somministrazione dell'estratto di Alba sia dopo Adria. In particolare la somministrazione di
Alba ha dato risultati significativi anche rispetto alla cultivar OGM e a Sveva.
L'attività CAT (Catalasica) nella mucosa gastrica è diminuita in modo significativo dopo
l'etanolo (41,83 ± 8,44 U / mg prot. nel gruppo 00 vs 26,6 ± 7,32 U / mg prot. nel gruppo di
controllo).
Gli enzimi antiossidanti SOD e CAT, importanti antiossidanti cellulari, contribuiscono
all'equilibrio gastrico ossidante-antiossidante. Una diminuzione di entrambe le attività nella
mucosa gastrica, SOD e CAT, in ratti esposti ad etanolo assoluto comporta l'accumulo di ROS
e di conseguenza ad un aumento della concentrazione di MDA. Nella nostra indagine,
l'etanolo ha indotto l'inibizione dell'attività della SOD e della CAT, suggerendo un ruolo
importante di questi enzimi nella patogenesi della lesione gastrica.
Nel presente studio, gli estratti somministrati ai ratti prima dell'induzione dello stress da
etanolo hanno attenuato l'inibizione dell'attività della SOD e della CAT, e quindi sono
coinvolti nel ruolo di modulazione dell'equilibrio ossidativo in difesa della mucosa gastrica.
Ulteriori studi sono necessari al fine di verificare le eventuali influenze degli estratti
sull'espressione genica degli enzimi antiossidanti.
L'effetto antiossidante degli estratti, molto probabilmente risulta dalla capacità dei suoi
costituenti di debellare le specie reattive dell'ossigeno, prodotte in lesioni etanolo-indotte della
mucosa, che iniziano la perossidazione lipidica. I risultati ottenuti indicano che i potenziali
effetti gastroprotettivi degli estratti sono probabilmente legati alla loro capacità di mantenere
68
integra la membrana delle cellule, alla loro attività contrastante la perossidazione lipidica per
protegge la mucosa gastrica contro il danno ossidativo e alla loro capacità di rafforzare la
barriera mucosa, la prima linea di difesa contro danni da agenti esogeni.
Al fine di chiarire ulteriormente i meccanismi della gastroprotezione, la nostra indagine in
futuro potrà essere focalizzata su altri modelli sperimentali di lesioni gastriche e ulteriori
meccanismi di difesa della mucosa gastrica.
6 ratti per gruppo
MDA(nmol/mg prot) SOD (U/mg prot)
Cat (U/mg prot)
00
323,10±38,43
38,77±7,45
41,83±8,44
Controllo
478,70±64,70*
23,08±5,58*
26,6±7,32*
Sveva
343,08±26,13**
25,22±5,40
38,75±5,57
Calipso OGM
271,03±32,24**
24,23±6,22
29,08±7,73
Calipso Controllo
306,80±63,52**
31,12±6,26
41,08±6,45**
Alba
321,72±31,23**
37,28±5,08**,#,##
39,6±6,94**
Adria
285,62±36,43**
34,55±4,61**
34,4±5,38
Quercetina
272,05±29,13**
28,58±5,84
32,4±7,60
Tab.6 MDA, SOD, CAT.
* differenze significative in relazione al gruppo 00
** differenze significative in relazione al controllo
# differenze significative in relazione al gruppo alimentato con calipso ogm
## differenze significative in relazione al gruppo alimentato con sveva
il gruppo 00 era composto da animali normali, sani senza alcun pretrattamento o induzione di lesioni gastriche
69
Fig. 11 Ratti con ulcere indotte da etanolo assoluto
70
Fig. 12 Ratti trattati con estratto della cultivar Adria
71
Fig. 13 Ratti trattati con estratto della cultivar Alba
72
Fig. 14 Ratti trattati con estratto della cultivar Calypso OGM
73
Fig. 15 Ratti trattati con estratto della cultivar Calypso parentale
74
Fig. 16 Ratti trattati con estratto della cultivar Sveva
75
Fig. 17 Ratti trattati con quercitina
76
4.3 Studio sul consumo acuto e prolungato di fragole
4.3.1 Effetti sul plasma
Tutti i partecipanti selezionati per lo studio sono risultati essere in buona salute, come
confermato dalle analisi di laboratorio chimico-cliniche effettuate di routine ad ogni prelievo
(vd. Tabelle 7-8), presso il Laboratorio Analisi dell’Inrca di Ancona, e tutti i parametri
biochimici alla baseline erano nel range di riferimento di normalità.
VALORI DI
DOPO
RIFERIMENTO
DOPO
DOPO
BASELINE
ALBA
WASHOUT1
7,0
6,5
6,6
6,8
6,8
6,6
ul
4,8
4,7
4,7
4,8
4,8
4,6
EMOGLOBINA
(11,5-15,5) g/dl
14,3
14,1
13,9
14,1
14,1
13,8
EMATOCRITO
(36,0-48,0) %
41,5
41,2
40,3
41,0
41,3
40,3
VOLUME GR MEDIO
(82,0-95,0) fl
86,3
86,9
86,0
86,4
86,2
87,1
(27,0-34,0) pg
29,7
29,8
29,7
29,5
29,4
29,8
%
34,4
34,3
34,5
34,2
34,1
34,2
(38-48) fl
40,0
41,6
40,3
40,5
40,2
41,7
12,9
13,3
13,0
12,9
12,8
13,2
ul
230,2
228,7
220,8
218,1
233,0
217,6
(10-16) fl
14,0
14,6
13,8
14,2
13,9
14,3
(9,1-12,3) %
11,5
11,7
11,5
11,6
11,4
11,6
PIASTRINE
(16,0-44,0) %
37,1
39,1
36,6
37,9
36,7
37,7
NEUTROFILI %
60-70
55,6
55,6
56,3
54,6
55,3
54,7
LINFOCITI%
20-40
34,8
33,7
33,3
34,7
34,3
34,3
BASOFILI%
0,5-1,0
0,4
0,5
0,5
0,5
0,4
0,4
EOSINOFILI%
1-4
2,5
2,9
3,3
3,4
3,2
3,3
MONOCITI%
2-8
6,7
7,3
6,6
6,9
6,8
7,3
NEUTROFILI val ass
2,00-7,50
3,9
3,7
3,8
3,8
3,8
3,7
LINFOCITIval ass
1,50-4,00
2,4
2,1
2,2
2,3
2,3
2,2
BASOFILIval ass
fino a 0,10
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
EOSINOFILIval ass
fino a 0,70
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
MONOCITIval ass
0,20-0,80
0,5
0,5
0,4
0,5
0,5
0,5
PARAMETRI EMATOLOGICI
ADRIA SVEVA WASHOUT2
(4,00-9,00) x 103
GB
ul
6
(3,90-5,60) x 10
GR
CONT.EMOGLOBINICO
CORP.MEDIO
(32,0-35,0) g/dl
CONC.EMOGLOB.CORP.MED
DISTRIBUZIONE
ERITROCITARIA IN SD
DISTR.VOLUMETRICA
ERITROCITARIO IN CV
(10,0-15,0) %
3
(140-400) x 10
PIASTRINE
AMPIEZZA ASSOLUTA
DISTRIBUZIONE
PIASTRINICA IN SD
VOLUME PIASTRINICO
MEDIO
PERCENTUALE GRANDI
77
PARAMETRI
VALORI DI
BIOCHIMICI
RIFERIMENTO
BASELINE
DOPO
ALBA
DOPO
DOPO
BILIRUBINA TOT.
fino a 1 mg/dl
0,7
0,6
0,7
0,7
0,7
0,7
GLICEMIA
(70-110) mg/dl
84,8
85,8
84,9
85,3
84,5
81,0
SIERO
(0,5-0,9) mg/dl
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,9
AC.URICO SIERO
(2,4-5,7) mg/dl
4,8
4,7
4,6
4,7
4,6
4,7
TOTALI SIERO
(6,6-8,7) g/dl
7,7
7,5
7,4
7,5
7,5
7,4
ALBUMINA SIERO
(3,4-4,8) g/dl
5,0
4,9
4,9
4,8
4,9
4,7
< 200 mg/dl
177,7
167,8
169,8
167,0
171,3
168,5
(40-60) mg/dl
59,7
61,0
58,1
58,0
59,6
57,9
< 150 mg/dl
70,0
69,7
67,4
77,9
87,8
71,6
< 100 mg/dl
100,2
98,8
100,6
98,4
101,0
103,4
WASHOUT1 ADRIA SVEVA WASHOUT2
CREATININA
PROTEINE
COLESTEROLO
TOT.
COLESTEROLO
HDL
TRIGLICERIDI
COLESTEROLO
LDL
Tab. 8 Parametri biochimici dei sogetti in studio
4.3.2 CAT nel plasma
Nel valutare i risultati ottenuti in seguito allo studio, non abbiamo osservato un
significativo aumento della CAT plasmatica né nel periodo di consumo acuto né nel
periodo a lungo termine, ma un significativo aumento si è verificato nel prelievo
effettuato dopo l’ultimo washout per quanto riguarda i valori del Frap.
BASELINE
DOPO
WASHOUT1
ALBA
FRAP µmol
DOPO
DOPO
ADRIA
SVEVA
WASHOUT2
24,25±5,37
24,25±5,52
23,77±4,35
24,05±5,75
23,75±5,60
25,79±6,06
2,63±0,54
2,09±0,18
2,15±0,16
2,8±0,59
2,2±0,17
2,61±0,2
TE/L
TEAC
Mmol TE/L
78
Fig. 11
Frap del plasma espresso come media ± SD, e in µmol TE/gFW
Nessuna variazione significativa è stata osservata anche nel caso del test TEAC.
Fig. 12 Teac del plasma espresso come media ± SD, e in mmol TE/gFW
In passato, l'aumento osservato nella CAT del plasma dopo il consumo di frutta e
succhi di frutti di bosco è stato generalmente attribuito agli alti livelli di antiossidanti
polifenolici forniti dalle bacche. Tuttavia, molti studi recenti di breve durata sugli
umani, hanno riferito che i composti flavonoidi, quali antociani, che sono fra i fenoli
più rappresentati nelle fragole, mostrano un assorbimento rapido ma molto povero
(Mazza et al, 2002; Rechner et al, 2002; Manach et al, 2005). Queste sostanze
sembrano arrivare a concentrazioni molto basse nel plasma umano e solo
79
immediatamente dopo il consumo di cibi ricchi di flavonoidi.
4.3.2.1 BAP test vs SHp test
Ai saggi classici come Teac e Frap abbiamo affiancato per il plasma una valutazione
con il Bap test e l’SHp test.
Il range stimato del BAP test negli individui normali è 2200–4000 mmoli/L. In ogni
caso, una riduzione dei valori del test al di sotto dell’intervallo indicato appare
direttamente correlata con una ridotta efficienza della barriera antiossidante
plasmatica. Ritroviamo questa condizione nei valori della baseline (1568,4 µmol/L), i
valori di Cat comunque aumentano significativamente dopo l’integrazione con la
cultivar Alba e continua ad aumentare significativamente anche dopo il primo
washout, ma tocca il valore più elevato dopo la cultivar Adria con un valore pari a
4811,739 µmol/L, cala leggermente dopo l’integrazione con Sveva ma dopo l’ultimo
washout torna ad aumentare(3967,52 µmol/L). Questi valori indicano un beneficio
apportato da ogni somministrazione che si prolunga al periodo di astinenza, e
comunque il beneficio è dato dal ristabilirsi dei valori nel range di normalità.
Mentre andando a valutare l’–SHp test, il range negli individui normali è 450–650
µmoli/L. Una riduzione dei valori del test al di sotto di questo intervallo si correla
direttamente con una ridotta efficienza della barriera antiossidante tiolica.
In generale, l’–SHp test si è dimostrato molto affidabile nella valutazione della
componente tiolica della barriera antiossidante plasmatica in diversi studi clinici,
integrando egregiamente i risultati del d-ROMs test nella valutazione globale dello
stress ossidativo, in particolare nei fumatori, nei nefro-trapiantati, nei dializzati, negli
uremici e nel monitoraggio dell’efficacia dell’integrazione alimentare dei pazienti
cancerosi.
Nel nostro lavoro non c’è una variazione pressochè significativa tra le varie
integrazioni se non nella riduzione dopo Alba (577 µmoli/L) che comunque rimane nel
range di valori corrispondenti alla normalità, e dopo il 2° washout in cui il valore
scende sotto il range di normalità (393,7 µmoli/L).
80
Fig. 13 Bap test vs SHp test
4.3.3 VALUTAZIONE DELL’ATTACCO DEI RADICALI LIBERI
4.3.3.1 Residui carbonilici delle proteine:
Come precedentemente descritto nella sezione d’introduzione, lo stress ossidativo può
dare origine a derivati carbonilici delle proteine, attraverso una varietà di meccanismi
che includono la frammentazione e l'ossidazione amminica a causa di catalisi metallica
o da acido ipocloroso e proprio per questo la misura dei carbonili proteici è diventata
un marcatore popolare di danno ossidativo.
Il saggio sui carbonili è stato applicato a studi sperimentali e campioni clinici, ed è
stato dimostrato che i livelli di carbonili sono elevati in alcune patologie e tende ad
aumentare con l'età.
Le nostre analisi hanno dimostrato la quasi assenza di un effetto protettivo
dell’integrazione di fragole sui livelli dei carbonili, notiamo infatti nella fig 14 come i
livelli di gruppi carbonili aumentino significativamente (p>0,001) rispetto alla baseline
sia dopo l’assunzione di Alba (4,35 nmol/ml), sia dopo il 1° washout (4,27 nmol/ml),
ancor più dopo Adria (5,17 nmol/ml), ma successivamente si assiste ad un crollo
81
significativo della quantità di carbonili (1,80 nmol/ml dopo Sveva e 1,38 nmol/ml
dopo l’ultimo washout).
Questi risultati fanno pensare ad un effetto che si manifesta dopo l’integrazione
prolungata nel tempo di fragole, si vede infatti nella Fig.14 come c’è un aumento dei
carbonili fino ad un mese di integrazione con fragole, per poi vedere una diminuzione
significativa dopo l’assunzione di sveva e dopo il 2°washout. Questo risultato
andrebbe confermato da studi futuri.
Fig. 14 residui carbonilici nello studio sul consumo acuto e prolungato di fragole
appartenenti a cultivar diverse.
4.3.3.2 Il dROMs
Il livello di idroperossidi circolanti determinati con il d-ROMs test segue nella
popolazione una distribuzione unimodale con un picco tra 250 e 300 U CARR (pari a
20.08-24.00 mg/dL di H2O2), individuato come il valore di riferimento del test.
82
Fig. 15 Test dROMs
Possiamo vedere dal grafico precedente (Fig. 15) come inizialmente i valori, dalla
baseline fino al 1° washout, passando per l’integrazione con ALBA risultano
pressochè costanti ( 312 U CARR, 349 U CARR e 339 UCARR rispettivamente), ed è
dopo l’assunzione con Adria che otteniamo la prima riduzione significativa (240 U
CARR) fino ad arrivare al valore più basso dopo il 2° washout (227 U CARR).
Nel valutare i risultati ottenuti in questi test non può non risaltare il crollo significativo
dei livelli di stress ossidativo nel plasma dei soggetti in studio. E’ facile ipotizzare che
ci sia un effetto ritardato della protezione ad opera degli antiossidanti sui parametri di
stress ossidativo. Questo aspetto potrebbe essere un buon trampolino di lancio per
indagini future, atte a individuare il meccanismo di un tale effetto.
4.3.4 ANALISI DELLE URINE:
4.3.4.1. 8OhdG
Il biomarker 8-OHdG o 8-oxodG è un indicatore fondamentale per misurare l'effetto
endogeno del danno ossidativo al DNA e come fattore di iniziazione e di promozione
di carcinogenesi.
83
Il range di normalità va da 0 a 20 ng/ml, quindi come possiamo verificare dalla fig.16
i nostri soggetti sono in buone condizioni di salute, poichè i valori si presentano tutti
nel range di normalità, e non si evidenziano differenze significative imputabili al
consumo di fragole.
4.3.4.2 F2-ISOPROSTANI
C'è una forte evidenza che gli isoprostani sono eccellenti biomarcatori molecolari per
lo stress ossidativo. Infatti, il 15- F2t Isoprostano è già ampiamente riconosciuto come
il "gold standard" dello stato ossidante.
I risultati ottenuti usando questo kit sono stati convalidati da GC / MS dopo estrazione in
fase solida di aliquote separate e mostrano un elevato grado di correlazione (r> 0,8).
Il 15- F2t isoprostano è stato anche dimostrato essere un potente vasocostrittore nei
reni del ratto e nei polmoni del coniglio. Elevati livelli di isoprostani sono associati a
sindrome epato-renale, l'artrite reumatoide, l'aterosclerosi, e la carcinogenesi.
Nel nostro studio quindi abbiamo dimostrato che il livello di isoprostani nelle urine dei
soggetti in studio, diminuisce significativamente rispetto alla baseline, il valore più basso
lo riscontriamo dopo l’assunzione di sveva (0,33ng/ml), ma buoni valori si sono ottenuti
anche dopo Alba, dopo il 1°washout, e dopo il 2°washout(0,520833 ng/ml, 0,520833
ng/ml, 0,500833ng/ml rispettivamente), confermando a grandi linee l’ipotesi di un effetto
di protezione che l’integrazione di fragole dà oltre il periodo dell’assunzione stessa.
84
Fig.17 isoprostani nelle urine dei soggetti in studio
4.4 STUDIO SULL'EMOLISI NEI GLOBULI ROSSI
Molti dati in letteratura trattano delle proprietà antiossidanti dei polifenoli, in
particolare dei flavonoidi, su sistemi di membrane. Queste conoscenze ci hanno
portato a valutare la possibilità di studiare possibili effetti di un consumo notevole di
fragole ricche in flavonoidi.
Lo studio sull’effetto di questa integrazione è stata effettuata sulla resistenza
all’emolisi spontanea o indotta nei globuli rossi. La scelta è stata motivata da diverse
considerazioni, in primo luogo, gli eritrociti sono le cellule più abbondanti nel corpo
umano e sono facilmente ottenibili attraverso un semplice prelievo del sangue. In
secondo luogo, a causa delle loro caratteristiche strutturali e funzionali, sono destinati
ad essere vittime di un continuo stress ossidativo, in possesso quindi di caratteristiche
fisiologiche tali da essere scelti come modello di cellule per studiare gli effetti e
l'entità del danno ossidativo. Infatti, poiché l'apporto di ossigeno ai vari organi in tutto
85
il corpo è espletato esclusivamente dai globuli rossi, queste cellule sono costantemente
esposte a radicali liberi durante la circolazione del sangue.
Nelle Figure 18 e 19, sono riportate le % d’emolisi degli eritrociti dopo 1 ora, 3 ore e
5 ore di incubazione in tampone PBS (% emolisi spontanea) e in soluzione AAPH (%
emolisi indotta da AAPH).
Durante il periodo di maggiore supplementazione di fragola (DOPO ALBA 500gr/die)
la resistenza all’emolisi è stata osservata sia nel controllo (eritrociti in tampone PBS)
sia in cellule trattate con AAPH (50 mM). Se si guarda il grafico dell’emolisi
spontanea, (Fig.18), l’assunzione di un elevata quantità di fragole dà una riduzione
significativa (p <0.001) della % di emolisi rispetto alla BASELINE. In tutti gli
intervalli in studio la riduzione della % d’emolisi spontanea persiste anche per un
tempo più lungo (3 h, 5 h), in relazione alla Baseline. È interessante notare che
l'aumento significativo della resistenza eritrocitaria all’emolisi spontanea rimanga
pressochè costante anche dopo 15gg dalla fine del periodo di consumo di fragole.
Anche gli eritrociti trattati con AAPH a diverse concentrazioni nelle due fasi dello
studio, hanno risposto al danno ossidativo in modo diverso dalla BASELINE. In
particolare, alla 1 e 3 ora DOPO ALBA, si ha una riduzione significativa della %
d’emolisi indotta che poi torna ad aumentare alla 5 ora fino a rangiungere un valore
che non è significativo rispetto alla baseline. Le differenze significative della %
d’emolisi indotta si mantengono anche dopo tutti gli altri tempi (washout1,dopo
adria,dopo sveva,washout2), anche se vi è un piccolo aumento alla 5 ora di ogni tempo
ma non tale da tornare ai livelli baseline.
Gli effetti sopra riportati dovuti all’integrazione con fragole di differenti cultivar sulla
capacità di risposta al danno ossidativo degli eritrociti e la tendenza all’emolisi sono
state confermate anche in questo progetto come in quello degli anni precedenti per
periodi di integrazione diversi.
86
Fig. 18 % di emolisi spontanea nello studio acuto e a lungo termine
Fig. 19 % di emolisi indotta da AAPH nello studio acuto (50mM) e a lungo termine
(10mM)
87
4.5 ATTIVAZIONE PIASTRINICA
Le immagini sotto e le tabelle che seguono danno indicazione dell'effetto di un consumo
acuto e prolungato di fragole sull'attivazione piastrinica.
Le piastrine hanno subito una minima manipolazione sperimentale e si presentano con la
classica morfologia discoidale con alcuni pseudopodi. Nei nostri preparati le piastrine
possono presentarsi più o meno stipate. Questo è dovuto all'effetto compattante della
centrifugata a 1000 x g e alla zona di taglio del pellet all’ultramicrotomo (centro o
periferia).
I dati ottenuti sono riassunti nelle tabelle 9 e 10, dove sono descritte le percentuali delle
varie classi di piastrine nei vari prelievi, e i dati normalizzati per il numero totale di
piastrine contate in ogni gruppo con le relative deviazioni standard. Abbiamo applicato
l’analisi della varianza all’interno di ciascuna classe di piastrine (resting, central clustered
e degranulated) per vedere se vi fosse un’attivazione piastrinica significativa durante le
varie fasi di somministrazione delle varietà di fragole. Se il trattamento non avesse
influenzato lo stato delle piastrine non avremmo dovuto avere variazioni delle piastrine
resting, central clustered e degranulated durante tutti i prelievi. L’analisi ha dimostrato
che, pur essendoci nei prelievi post-washout1 e post-adria un notevole aumento delle
piastrine con central clustering, le differenze non erano significative a causa della grossa
variabilità tra i soggetti, identificabile dai valori della deviazione standard. Anche per il
prelievo post-washout2 si ha un incremento rispetto al prelievo baseline e post-alba sia di
central clustering che di degranulation ma anche in questo caso non significativo. E’ stato
osservato che alcuni pazienti presentavano un’attivazione ai prelievi post-washout1 e
post-adria rispetto agli altri e precisamente il volontario numero 7 e il numero 11 i quali
hanno contribuito fortemente all’incremento del numero di piastrine attivate in quel
gruppo di prelievi. (Fig20-23)
88
Fig. 18 Immagine del campione di piastrine del soggetto n 7 riferito al prelievo post-washout1
.
Fig. 19 Immagine del campione di piastrine del soggetto n 7 riferito al prelievo post-Adria
Fig. 20 Immagine del campione di piastrine del soggetto n11 riferito al prelievo post-washout1
89
Fig. 21 Immagine del campione di piastrine del soggetto n 11 riferito al prelievo post-Adria.
Questi dati dimostrano che l’assunzione di fragole, in questa categoria di soggetti, non
interferisce con l’attività piastrinica e quindi non aumenta il rischio trombogenico. La
risposta al trattamento in 2 soggetti su 9 (7 e 11) è stata caratterizzata invece da un
incremento significativo di attivazione piastrinica.
DOPO
N°
BASELINE DOPO ALBA WASHOUT1
PIASTRINE
DOPO
DOPO ADRIA DOPO SVEVA WASHOUT2
1364
892
1302
1241
1191
1180
1353
878
1234
1193
1175
1130
Centralizzate
4
1
40
25
0
15
De granulate
9
13
28
22
16
35
N° piastrine
Totali
Normali
Tab. 9 N° di piastrine normali,centralizzate, degranulate
DOPO
%
BASELINE DOPO ALBA WASHOUT1
DOPO
DOPO ADRIA DOPO SVEVA WASHOUT2
PIASTRINE
Normali
99,19
98.43
94.78
96.13
98.66
95.76
Centralizzate
0.29
0.11
3.07
2.01
0
1.27
De granulate
0.66
1.46
2.15
1.77
1.34
2.97
Tab.10 % di piastrine normali,centralizzate, e degranulate nelle diverse fasi dello studio.
90
5. CONCLUSIONI E PROSPETTIVE FUTURE
Alimentazione. Non se n’è mai parlato così tanto: giornali, televisione, la rete internet, perfino
a scuola si illustrano, più o meno correttamente, i vantaggi e i principi di una sana e corretta
alimentazione. Eppure le patologie in maggiore aumento sono proprio quelle metaboliche o
comunque legate ad una cattiva alimentazione, come riportano i dati statistici su scala
mondiale. Si parla sempre di più di alimentazione corretta come “terapia”. Un'alimentazione
sana è quella che fornisce tramite gli alimenti assunti quotidianamente la quantità di nutrienti
che corrisponde al proprio fabbisogno. Ma l’alimentazione corretta permette anche alle
persone sane di prevenire le malattie e migliorare il loro stato di salute. Nell’ambito della
vasta gamma di prodotti alimentari di largo consumo, frutta e verdura ricoprono un ruolo di
fondamentale importanza, grazie al loro notevole contenuto di composti benefici per la salute.
La nostra attenzione si è focalizzata sul frutto della Fragola, tra i più ricchi in composti
antiossidanti, composti specifici che costituiscono la barriera protettiva contro alte
concentrazioni di radicali liberi responsabili dello stress ossidativo. Scopo di questo progetto
di tesi è stato quello di valutare le caratteristiche nutrizionali di differenti varietà di fragola(in
vitro) e gli effetti di un consumo acuto o cronico di questi frutti sulla salute umana (in vivo). I
risultati complessivi hanno indicato che le differenti cultivar analizzate possono essere adatte
al consumo fresco in termini di qualità nutrizionale (NQ), tra le varietà studiate la cultivar
Sveva ha mostrato i più alti attibuti nutrizionali, confermandosi la più adatta agli studi in vivo.
L’interesse di osservare l’effetto in vivo di un’assunzione di fragole ci è venuta da diverse
considerazioni, la caratteristica ricchezza delle fragole in antiossidanti è ormai ben nota, e
avvalorata da studi in vitro, tuttavia vi è una crescente consapevolezza che i dati in vitro sono
spesso in contrasto con i risultati ottenuti da studi in vivo. Probabilmente questi effetti sono
dovuti al lungo metabolismo dei flavonoidi negli esseri umani e alla biodisponibilità di questi
nella dieta. Ci sono pochi lavori in letteratura che trattano gli effetti di queste sostanze sulla
nostra salute una volta che vengono assorbite e metabolizzate. Recenti studi hanno concluso
che il consistente aumento della CAT plasmatica osservata a seguito di un consumo di cibi
ricchi in flavonoidi non è causato solo da questi, ma può essere frutto dell’effetto combinato
di sostanze prodotte in risposta ad un largo consumo di frutta ricca in fruttosio. Malgrado ciò
molti degli studi che trattano degli effetti benefici dei piccoli frutti a bacca sulla salute umana
hanno usato come modello per la valutazione del danno ossidativo cellulare i globuli rossi, e
la loro naturale tendenza all’emolisi, questo perché c’è motivo di credere che le proprietà
antiossidanti ed antiemolitiche dei flavonoidi potrebbero essere localizzate nella doppia
91
membrana cellulare dei globuli rossi. Quando sono all’interno della membrana queste
sostanze potrebbero inibire la perossidazione lipidica. Per confermare queste ipotesi in vivo
abbiamo svolto anche noi uno studio sugli effetti di un consumo acuto e prolungato di fragole
sulla % di emolisi spontanea e indotta da una sostanza ossidante. Abbiamo valutato gli
eventuali cambiamenti nello status antiossidante del plasma dei soggetti dello studio e i
cambiamenti dei livelli di danno ossidativo. Abbiamo anche valutato l’eventuale attivazione
delle piastrine in risposta al consumo di fragole come possibile indice di infiammazione in
vari stadi, caratteristica base di molte condizioni patologiche.
Nella nostra indagine, abbiamo voluto anche aggiungere una valutazione sulla capacità degli
estratti di fragole di diminuire le lesioni gastriche indotte dall’etanolo nello stomaco dei ratti,
l'etanolo ha indotto l'inibizione dell'attività della SOD e della CAT, (antiossidanti endogeni)
suggerendo un ruolo importante di questi enzimi nella patogenesi della lesione gastrica. Una
diminuzione di entrambe le attività nella mucosa gastrica, SOD e CAT, in ratti esposti ad
etanolo assoluto comporta l'accumulo di ROS e di conseguenza ad un aumento della
concentrazione di MDA. Al fine di chiarire ulteriormente i meccanismi della
gastroprotezione, la nostra indagine in futuro potrà essere focalizzata su altri modelli
sperimentali di lesioni gastriche e ulteriori meccanismi di difesa della mucosa gastrica.
I risultati preliminari ottenuti in questo lavoro hanno fornito un buon punto di partenza per
continuare l’indagine sui meccanismi legati allo stress ossidativo. Sarebbe interessante in
futuro valutare l’effetto diretto di questi prodotti di ossidazione su organi maggiormente
esposti allo stress ossidativo e pianificare magari studi su categorie di persone con malattie
cronico-degenerative ad esso correlate o su gruppi di persone sane ma sottoposte a forte stress
ossidativo,come possono essere gli sportivi.
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