12 MED LAB 8D - tubercolosi - Università degli Studi "G. d

C.I. MEDICINA DI LABORATORIO
Microbiologia Clinica
CL Medicina e Chirurgia – AA 2014-2015
Modulo 8: TUBERCOLOSI
Giovanni Di Bonaventura, PhD
Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara
Dipartimento di Scienze Mediche, Orali e Biotecnologiche
Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel 0871 3554812)
Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel 0871 541519)
E-mail: [email protected]
Tubercolosi
 Infezione batterica
– Mycobacterium tuberculosis
– Mycobacterium avian
• tubercolosi “disseminata” nei pazienti con AIDS
 Tipologie
– Primaria
– Secondaria
– Disseminata
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M. tuberculosis
 Lenta crescita (tempo di generazione medio: 15-20 h)
 Acidi micolici e superficie cerosa
 Primaria
– Tubercoli, caseosa, reazione alla tubercolina
 Secondaria (riattivazione)
– Consolidamento
 Disseminazione
– TB extrapolmonare (linfonodi, rene, ossa, tratto genitale, cervello, meningi)
Il tubercolo polmonare consiste in un
granuloma formato da un nucleo centrale
di necrosi caseosa contenente batteri
all’interno di macrofagi giganti, e da una
parete esterna formata da fibroblasti,
linfociti e neutrofili.
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Tubercolosi
Epidemiologia
Le infezioni causate da Mycobacterium tuberculosis complex rappresentano uno dei più
importanti argomenti di salute pubblica mondiale:
 prevalenza: 14 milioni di casi di TB
 incidenza: 9.4 milioni di casi di TB (soprattutto Africa sub-sahariana e sud-est asiatico per
elevato numero HIV e scarso accesso ai servizi sanitari)
 1.7 milioni di morti
World Health Organization. Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planning, Financing: WHO Report 2010. Geneva, Switzerland: WHO Press; 2011.
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Tubercolosi
Importanza della diagnostica
Resistenza alla terapia:
 Nel 2008 notificati 440.000 casi di multidrug-resistant TB (MDRTB), ossia il 3.3% dei nuovi
casi, causando 150.000 morti.
 Paesi a più alta incidenza di MDRTB sono distribuiti su tutto il globo (Europa, Asia, Africa).
 1995-2005: 49 milioni di pazienti trattati, salvate oltre 6 milioni di vite.
Necessità di una diagnosi “improved”:
 detection rate globale: 63%.
 L’adozione di programmi di controllo sanitario richiede una diagnostica rapida ed
accurate, soprattutto in quei Paesi dove difficile è l’accesso ai servizi sanitari e dove non è
possibile attendere i risultati dai laboratory di riferimento prima di avviare una terapia
anti-TB.
 Spesso la diagnostica si basa soltanto sull’osservazione microscopica, senza ottenere
alcun dato sulle resistenze.
 I tests di sensibilità (AST) sono alquanto problematici: difficile esecuzione, elevato TAT
(mesi), risultati discordanti per alcune molecule (etambutolo), mancanza di
standardizzazione per i farmaci di “seconda linea”.
E’ assolutamente indispensabile sviluppare strategie diagnostiche “rapide”, al fine di
individuare nuovi casi di TB ed i pazienti infettati con ceppi MDR.
World Health Organization. Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planning, Financing: WHO Report 2010. Geneva, Switzerland: WHO Press; 2011.
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Tubercolosi
AST: tecniche rapide
MDR-XDRTB Colour Test.
 Utilizza una tecnologia “thin-layer agar” inuna capsula Petri divisa in 4 quadranti: 1 (senza
antibiotico, quale controllo di crescita batterica); 2 (contenente isoniazide), 3
(contenente rifampicina), 4 (contenente ciprofloxacina).
 Il campione di espettorato viene collezionato in un contenitore contenente un terreno di
trasporto con disinfettante (per limitare la crescita della flora accessoria).
 La miscela viene seminata in ogni quadrante.
 Concettualmente semplice ed a basso costo, l’utilizzo richiede un laboratorio con
infrastrutture “dedicate”.
http://www.finddiagnostics.org/programs/tb/find_activities/rapid_colorimetric_dst.html
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Tubercolosi
Sintomatologia
Non tutti i pazienti con TB sono sintomatici; tuttavia, la maggior parte dei pazienti TB
presenta uno o più sintomi.
Tutti i soggetti sintomatici per TB o risultati positivi ad un test indicativo di infezione da M.
tuberculosis (tuberculin skin test, TST; interferon-gamma release assay, IGRA), dovrebbero
essere soggetti a valutazione medica per escludere la malattia TB.
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Tubercolosi
Valutazione medica
La valutazione medica della malattia tubercolare si articola nelle seguenti fasi:
1. Valutazione anamnestica
2. Esame fisico
3. Test per rilevare la presenza dell’infezione da M. tuberculosis
4. Radiografia del torace
5. Esame batteriologico di campioni clinici
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Tubercolosi
Anamnesi




Presenza di uno o più sintomi suggestivi per TB; nel caso, da quanto tempo persistono.
Esposizione ad un soggetto con TB.
Diagnosi pregressa di infezione tubercolare latente (LTBI) or malattia TB.
In caso di trattamenti inadeguati o per scarsa compliance del paziente, TB può ricorrere
con emergenza di isolati multi-resistenti. Considerare I fattori demografici (paese di
origine, età, etnia, gruppo razziale, occupazione) che possono rappresentare fattori di
rischio per l’infezione tubercolare.
 Considerare la presenza di malattie concomitanti (HIV, diabete) che aumentino il rischio
di progressione della malattia nei soggetti con infezione latente da M. tuberculosis.
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Tubercolosi
Tests per l’infezione da M. tuberculosis
La scelta del test più adatto per la ricerca dell’infezione da M. tuberculosis deve tener conto di:
 motivi e contesto clinico
 disponibilità
 rapporto costo-efficacia
Attualmente, esistono due metodi disponibili per la ricerca del microrganismo:
 Mantoux tuberculin skin test (TST)
 Interferon-gamma release assays (IGRAs)
 QuantiFERON-TB Gold In-Tube test (QFT-GIT)
 T-SPOT®.TB test
Questi tests consentono di differenziare i soggetti infetti con M. tuberculosis da quelli non infetti.
Tuttavia, un risultato negativo non esclude la diagnosi di malattia tubercolare o infezione latente
(Latent Tuberculosis Infection, LTBI).
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Tubercolosi
Test cutaneo per la tubercolosi: reazione alla tubercolina
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Tubercolosi
Esame radiografico
Le alterazioni osservate all’esame radiografico del torace potrebbero essere suggestive, ma mai
diagnostiche, per TB.
RX può essere utilizzato per escludere la TB polmonare in un soggetto normoreattivo, positivo a
TST o IGRA, ed asintomatico per TB.
Presenti soprattutto nei segmenti apicale e posteriore del lobo superiore o dei segmenti
superiori del lobo inferiore, le lesioni potrebbero essere localizzate ovunque e differire per
dimensioni, forma e cavitazione, soprattutto nell’immunocompromesso (es. HIV).
Soprattutto nei ragazzi, le alterazioni radiografiche sono minime;
indicato un RX laterale per diagnosi differenziale con linfoadenopatia.
La tomografia computerizzata può fornire informazioni aggiuntive,
sebbene più costosa.
 Lesioni fibrotiche: possibile presenza di bacilli tubercolari in
divisione con un alto potenziale per la progressione verso la
malattia TB. Poichè RX non può differenziare una pregressa TB da
una forma attiva, i soggetti con un quadro radiografico suggestivo
per una TB pregressa e TST+ oppure IGRA+ dovrebbero essere
sottoposti a terapia per LTBI soltanto dopo aver escluso una
infezione in atto previa indagine colturale.
 Al contrario, lesioni nodulari non fibrotiche, pienamente
calcificate e discrete, suggestive per la presenza di granuloma,
indicano un basso rischio per la progressione verso la malattia TB.
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Tubercolosi
Esame batteriologico
E’ necessario che tutti i soggetti sospetti per TB debbano essere sottoposti ad indagine
batteriologica.
L’indagine, effettuata su campioni di differente tipologia (escreato, urine, liquor), si articola nelle
seguenti fasi:
 Prelievo del campione
 Osservazione microscopica per la presenza di micobatteri (AFB, Acid-Fast Bacilli)
 Ricerca diretta di M. tuberculosis utilizzando tests di amplificazione degli acidi nucleici
(Nucleic Acid Amplification, NAA tests)
 Indagine colturale ed identificazione
 Tests di sensibilità agli antibiotici
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Tubercolosi
Prelievo dei campioni – TB polmonare
La tecnica più frequentemente utilizzata prevede la raccolta di espettorato a seguito di colpi di tosse.
E’ necessario prelevare almeno 3 campioni consecutivi di espettorato ad intervalli di 24 h; il campione
deve essere raccolto al mattino, a digiuno, perché le secrezioni durante la notte si accumulano nelle vie
respiratorie.
PREPARAZIONE DEL PAZIENTE
 istruire il paziente su come espettorare, facendo precedere tre respiri profondi ad un energico colpo
di tosse;
 sottolineare il fatto che escreato non è sinonimo di saliva o secrezioni mucose nasali o faringee.
MODALITA’ DI PRELIEVO.
 praticare la pulizia del cavo orale (denti, gengive, lingua e parte interna delle guance) con acqua
distillata sterile; sciacquare il cavo orale sempre con acqua distillata sterile, per limitare
contaminazioni;
 raccogliere 5-10 ml di materiale di provenienza polmonare dopo un energico colpo di tosse;
 utilizzare un contenitore sterile, a bocca larga, in plastica, con tappo a vite;
In caso di tosse non produttiva, si può ricorrere ad induzione con aerosol, facendo inalare una
soluzione salina ipertonica (3-5%), sterile e riscaldata. Contrassegnare il campione come “indotto”, in
quanto la secrezione in questo caso è altamente idratata e potrebbe pertanto essere scambiata come
saliva.
Qualora non fosse possibile produrre un campione di espettorato, è possible ricorrere alla
broncoscopia o effettuare un aspirato gastrico per ottenere un campione adeguato.
TRASPORTO: entro 1 ora dalla raccolta.
CONSERVAZIONE: fino a 48 ore in frigorifero. Non congelare.
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Tubercolosi
Prelievo dei campioni – TB polmonare
Durante la raccolta del campione, il paziente produce un aerosol altamente contagioso per operatori sanitari/pazienti in
prossimità. La raccolta andrebbe pertanto effettuata in un ambiente dedicato dotato di ventilazione controllata (stanza di
isolamento AII), in grado di contenere il rischio biologico aerogeno. Il personale sanitario deve dotarsi di mascherina.
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Tubercolosi
Prelievo dei campioni – TB extra-polmonare
Nel caso si sospetti una TB extra-polmonare, debbono essere considerate altre tipologie di campione.
campione
condizioni
modalità
contenitore
Urine
Raccogliere 3
campioni in
giorni
consecutivi.
raccogliere la prima minzione completa del mattino,
preferibilmente scartando il primo getto.
sterile, a bocca
larga, in plastica,
con tappo a vite.
Liquor
prelevare, mediante rachicentesi, la maggior quantità
possibile di liquor (minimo 2 ml).
Provetta sterile
Pus
 disinfettare la cute con alcool prima della raccolta
 utilizzare per la raccolta una siringa; se non è
possibile il prelievo con siringa, usare un tampone
con terreno di trasporto Amies o Stuart.
 sterile, a bocca
larga, in plastica,
con tappo a vite.
 tampone in
terreno di
trasporto
Biopsia
 raccogliere, asetticamente, almeno 1 gr di tessuto.
 non avvolgere in garza, immergere in fissativi o
conservanti.
 aggiungere una minima quantità di soluzione salina
sterile, per evitare l’essicamento.
sterile, a bocca
larga, in plastica,
con tappo a vite.
(In alternativa, è
possibile prelevare
l’urina direttamente
da catetere)
Trasporto: entro 1 ora dalla raccolta.
Conservazione: fino a 48 ore in frigorifero. Non congelare.
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Tubercolosi
Osservazione microscopica per AFB
 I Micobatteri, una volta colorati, resistono alla decolorazione con
alcol/acido. Per questo motivo vengono anche denominati Acid-Fast Bacilli
(AFB).
 La ricerca microscopica di AFB nello striscio colorato allestito da un
campione può fornire una iniziale e rapida evidenza batteriologica della
presenza di Micobatteri in un campione clinico.
 Due sono le tecniche più frequentemente impiegate a tal fine:
– microscopia diretta, previa colorazione con carbolfucsina (ZiehlNeelsen, Kinyoun);
– microscopia in fluorescenza, previa colorazione con auramina-O
oppure auramina-rodamina.
 La sensibilità dell’indagine microscopica è scarsa (5.000 – 10.000 bacilli/ml
di campione), significativamente minore rispetto a quella dell’isolamento
colturale (10 - 100 bacilli/ml).
 Di contro, la ricerca di AFB è tecnica rapida (risultati disponibili entro le 24h
dal prelievo).
 Tale tecnica consente soltanto una identificazione presuntiva della malattia
TB poichè M. tuberculosis non è l’unica specie AFB.
 Inoltre, alcuni pazienti possono avere uno striscio AFB- ma essere positivi
all’indagine colturale. Una osservazione microscopica negativa per AFB non
esclude, pertanto, la malattia TB.
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Tubercolosi
Osservazione microscopica per AFB
 Nei campioni AFB+ si procede alla conta cellulare (ottenuta ad un determinato ingrandimento)
refertando il risultato in maniera semi-quantitativa mediante l’adozione di uno score: 4+, 3+, 2+,
or 1+. Lo score è direttamente proporzionale alla presenza di AFB e, conseguentemente, alla
contagiosità del paziente.
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Tubercolosi
Ricerca diretta mediante amplificazione degli acidi nucleici
 Questa metodica si basa sulla amplificazione di specifiche sequenze contenute nel DNA/RNA
di M. tuberculosis (NAA, Nucleic Acid Amplification).
 Molto più rapida rispetto all’esame colturale (ore vs settimane).
 Possibili vantaggi associate all’utilizzo della NAA:
– precoce conferma di malattia TB;
– rapido avvio della terapia antibiotica;
– migliore outcome del paziente;
– interruzione della trasmissione (per precoce diagnosi, messa in isolamento respiratorio
ed avvio di una terapia appropriate);
– precoce e più efficiente utilizzo dell’isolamento respiratorio;
– precoce inizio della individuazione dei “contatti”;
– maggiore efficacia degli interventi di salute pubblica.
 CDC raccomanda l’utilizzo di questi tests nei pazienti:
– sintomatici con sospetta TB polmonare
– in cui il risultato potrebbe influire significativamente sul management del caso o sulle
attività di controllo (es. ricerca dei “contatti”).
 Un test negativo non può escludere la malattia, soprattutto in presenza di un fondato sospetto
clinico. Tuttavia, se considerato unitamente ad altre evidenze può essere utile per velocizzare
l’iter diagnostico, o per evitare l’adozione di una terapia non necessaria.
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Tubercolosi
Isolamento ed identificazione
 L’indagine colturale rimane il “gold standard” per la conferma della malattia, oltre che necessaria
per valutare il genotipo dell’isolato, nonchè la sua sensibilità agli antibiotici.
 L’esame va effettuato su tutti i campioni diagnostici, indipendentemente dall’esito per AFB o NAA.
 Un risultato positivo per M. tuberculosis conferma la diagnosi di malattia.
 Nel caso di negatività, la diagnosi può essere posta soltanto su base clinica. Bacilli vitali potrebbero
essere infatti presenti in altri campioni/siti.
 I sistemi automatizzati attualmente in commercio (BACTEC, MGIT, VersaTREK, MBBACT) sono in
grado di evidenziare la crescita in terreno liquid della maggior parte dei micobatteri in 4 - 14 giorni,
mentre 3 - 6 settimane sono necessarie per la crescita su agar.
 L’indagine colturale è importante nel monitoraggio della efficacia
della terapia e, conseguentemente, della contagiosità del paziente.
– i campioni vengono prelevati ad intervalli mensili fino a che
non si ottengano 2 campioni consecutivi NEGATIVI. La
“conversione” del colturale rappresenta la prova dell’efficacia
terapeutica.
– negativizzazione di tutti i campioni: avvenuta eradicazione.
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