Variabilità del genoma

 Polimorfismo: la presenza di due o più forme
alleliche in una specie; ovvero la presenza di alleli che
mostrano variazioni in una data posizione.
 Polimorfismi della lunghezza dei frammenti di
restrizione (RFLP): i primi marcatori genetici
utilizzati.
 Il marcatore genetico
è la lunghezza dei
frammenti di
restrizione che
contengono al loro
interno una particolare
sequenza.
 Altri marcatori genetici:
 Ripetizioni in tanden in numero variabile (VNTR) o
minisatelliti  contengono regioni lunghe 10 ÷ 100 bp,
ripetute in numero variabile di volte: stessa sequenza,
differente numero di ripetizioni. In ogni individuo,
VNTR basate sullo stesso motivo ripetuto possono
comparire soltanto una volta o più volte nel genoma,
con differente lunghezze su differenti cromosomi.
 La distribuzione delle lunghezze delle ripetizioni è il
marcatore.
 Alec Jeffrey sviluppò il “DNA finger-printing” basato
sui minisatelliti.
 DNA finger-printing
 Polimorfismi di brevi ripetizioni in tandem (STRP) o
microsatelliti: sono regioni lunghe soltanto 2 ÷ 5 bp, ma
ripetute molte volte, tipicamente 10 ÷ 30 copie consecutive.
Come marcatori, gli STRP hanno sulle VNTR parecchi
vantaggi, uno dei quali è la distribuzione più uniforme nel
genoma umano.
 Rilevazione mediante amplificazione con la PCR seguita
dal sequenziamento dell’amplicone.
 Il “profiling” del DNA basato sugli STRP ha rimpiazzato il
“DNA finger-printing”.
 Questi marcatori genetici non sono comunemente
localizzati entro geni codificanti per proteine, ma ci
sono alcune eccezioni, come le ripetizioni CAG nel
gene per la corea di Huntington ed alcuni altri geni
patologici.
 Applicazioni mediche dei marcatori genetici:
a. nella tipizzazione per identificare i donatori
compatibili per trapianti;
b. nell’ identificazione della suscettibilità ad una
malattia;
c. nella previsione della variabilità individuale nella
risposta ai farmaci (farmacogenomica).
 Polimorfismo a singolo nucleotide (SNP): un
polimorfismo provocato dal cambiamento di un
singolo nucleotide e responsabile della maggior parte
della variazione genetica tra individui.
 Tutte le persone, eccetto i fratelli o le sorelle identici,
hanno sequenze di DNA esclusive. Le differenze
complessive tra le sequenze genomiche di individui
non imparentati corrispondono a circa 0,1%. Molte
delle differenze tra individui hanno la forma di SNP.
Esistono anche molte corte delezioni.
 Ciascuno di noi ha un insieme accumulato di SNP che
rispecchia mutazioni avvenute nei nostri progenitori.
 Alcuni gruppi di SNP vengono coereditati come
blocchi, mentre altri no. Le mutazioni in differenti
molecole di DNA di cromosomi diploidi si separano
entro una singola generazione, per assortimento. Le
mutazioni sullo stesso cromosoma si separano più
lentamente, per ricombinazione.
 Le mutazioni nella stessa molecola di DNA nei
cromosomi diploidi si dissocieranno per effetto di
eventi di ricombinazione che avvengono tra i loro loci.
Maggiore è la distanza tra due siti, maggiore è la
frequenza di ricombinazione.
 Gli aplotipi sono combinazioni locali di polimorfismi
genetici che tendono ad essere coereditati.
 Combinazioni discrete di SNP nelle regioni povere di
ricombinazione definiscono l’aplotipo o “genotipo
aploide” di un individuo.
 Gli aplotipi permettono una caratterizzazione molto
economica di interi genomi. Semplificano la ricerca
dei geni responsabili di malattie o di altre correlazioni
fenotipo-genotipo.
 Nel genoma umano, le proteine del MHC, noto nella
specie umana come sistema HLA(Human Leucocyte
Antigen), sono codificate in una regione di  4 Mb sul
cromosoma 6p21.31.
 Il sitema è altamente polimorfico con 50 ÷ 150 alleli per
ogni locus.
 La serie delle proteine MHC espresse definisce un
aplotipo parziale di un individuo. Rispetto ad altri blocchi
aplotipici, la regione MHC presenta una variabilità
individuale insolitamente ampia.
 Le regione MHC contiene oltre 120 geni espressi che
codificano per proteine che:
 forniscono il meccanismo con cui il sistema
immunitario distingue le molecole “self” dalle
molecole “non-self”;
 determinano i profili individuali di competenza per la
resistenza alle malattie;
 sono utili marcatori per la determinazione delle
affinità tra popolazioni umane ed animali e per la
ricostruzione delle migrazioni su grande scala delle
popolazioni e delle interazioni tra queste.
 Gli aplotipi MHC controllano la compatibilità
donatore-ricevente nei trapianti;
 Gli aplotipi MHC influenzano la suscettibilità allo
sviluppo di patologie autoimmuni;
 Gli aplotipi MHC determinano i “pattern” di resistenza
alla malattia;
 Gli aplotipi MHC influenzano la scelta del partner
sessuale, attraverso l’associazione tra l’aplotipo MHC e
l’odore corporeo.
 Delezioni e duplicazioni di segmenti cromosomici
(CNVs) sono i maggiori responsabili della variazione
tra gli individui e sono un fattore fondamentale
nell’evoluzione umana ed in molte malattie, come le
malattie mentali, i disordini dello sviluppo e le
neoplasie. I CNVs si formano ad una più alta velocità
di altri tipi di mutazioni e ciò avviene con meccanismi
simili sia nei batteri, nei lieviti che negli esseri umani.
 Alcuni esempi che mostrano come la variabilità del numero
di copie di geni specifici può offrire un vantaggio selettivo:
 Il gene dell’amilasi salivare, AMY1, mostra variazione del
numero di copie nelle popolazioni umane e la quantità di
amilasi salivare è direttamente proporzionale al numero di
copie del gene AMY1. Il numero medio di copie di AMY1 è
più alto nelle culture che consumano un alto livello di
amido rispetto a quelle che ne consumano poco.
 Esiste una correlazione tra il il numero di copie del gene
della chemochina CCL3La e la suscettibilità all’HIV/AIDS.
 Tuttavia la maggior parte delle CNVs negli esseri umani
sembra essere non adattativo o svataggioso, ed è presente
perché non è stato ancora epurato. Approssimativamente
il 75% del CNV viene ritrovato con una frequenza di meno
del 3% nelle popolazioni umane, suggerendo un origine
stocastica ed una manutenzione della maggior parte di
queste variazioni.
 I polimorfismi genetici ci forniscono la possibilità di
predire le differenze tra individui nella suscettibilità
alle malattie.
 I “biomarkers” di suscettibilità includono:
polimorfismi nel metabolismo di farmaci/carcinogeni,
nella capacità di riparare il DNA e nei geni che
controllano la crescita cellulare.
 I polimorfismi negli enzimi che metabolizzano
farmaci/carcinogeni sono un determinante importante
nella suscettibilità individuale alle neoplasie ed alle
reazioni avverse ai farmaci. Tali polimorfismi possono
essere dovuti a fattori ereditabili e/o fattori ambientali.
 Metabolismo dei farmaci: 1) reazioni di ossidazione
mediate dagli enzimi citocromi P450 nel fegato  2)
coniugazioni come glucorinidazione, sulfazione ed
acetilazione.
 Uno dei citocromi P450, CYP2D6 è molto importante nel
metabolismo di farmaci usati in clinica con circa il 25-50 %
di questi che vengono metabolizzati da questo enzima.
 Il polimorfismo dell’enzima CYP2D6 risulta in
metabolizzatori modesti, intermedi, efficienti ed
ultrarapidi (UM) dei farmaci substrati di questo enzima.
 E’ plausibile che il genotipo ultrarapido, dove esiste più di
gene attivo su di un allele, sia il risultato di una selezione
dovuto ad una dieta selettiva in certe popolazioni del nord
est dell’Africa. Il fenotipo UM si ritrova nel 5,5% della
popolazione dell’ovest europeo.
 Il polimorfismo di CYP2D6 ha un’influenza significativa
sulla farmacocinetica di circa il 50% dei farmaci in uso
clinico.
 Le conseguenze del polimorfismo alle dosi ordinarie dei
farmaci possono essere o reazioni avverse o nessuna
risposta al farmaco.
 Polimorfismi nella riparazione del DNA o nel
processamento del DNA danneggiato sono noti da
lungo tempo per quanto riguarda rari disordini
ereditari che coinvolgono difetti della riparazione del
DNA o della stabilità cromosomica.
 Circa 130 geni diversi sono coinvolti nella
nell’escissione del DNA o nella riparazione delle basi.
 Inoltre, una bassa efficienza nella riparazione del DNA
è stata associata con un’aumentata suscettibilità a
neoplasie della pelle, del cervello, del polmone, dello
stomaco, del seno, della vescica, del collo/testa e del
colon.
 Più di 100 geni sono coinvolti come regolatori positivi
(proto-oncogeni) o negativi (geni onco-soppressori)
della crescita cellullare, così come il ciclo cellulare e
l’apoptosi.
 Polimorfismi di questi geni che includono p53, p21,
Her/neu, ras, APC, IL-10 e ciclina D1, possono essere
associati allo sviluppo di neoplasie.
 Si definisce associazione genetica il caso di due o più
tratti in una popolazione di individui, di cui almeno un
tratto è chiaramente noto essere di origine genetica.
 Gli studi di associazione genetica hanno lo scopo di
saggiare se alleli di un singolo locus o frequenze di
genotipi (o più generalmente, frequenze di aplotipi
multilocus) differiscono tra due gruppi di individui
(controlli sani e pazienti).
 L’associazione genetica può essere tra fenotipi, tra un
fenotipo ed un polimorfismo genetico, come un SNP, o tra
due polimorfismi genetici. L’associazione tra due
polimorfismi genetici avviene quando non c’è
un’associazione “random” dei loro alleli; ciò risulta dalla
loro prossimità nello stesso cromosoma – linkage
genetico.
 Tuttavia il “linkage” può essere incompleto per effetto
del “crossing-over” durante la meiosi. La frequenza del
“crossing-over” non è uguale in tutte le porzioni del
cromosoma (minore in regione pericentromerica). E’
stato stimato che  80% della ricombinazione
genomica avvenga in non più di  25% del genoma
umano.
 Quando la distanza tra due loci cromosomici è molto
ridotta, idealmente 0 cM, c’è solo uno stato possibile –
“linkage”- così l’equilibrio è formalmente impossibile.
Perciò, quando il “crossing-over” non avviene mai tra i
loci, sono detti essere nel disequilibrio di “linkage”.
Tipi di approcci per gli studi di associazione:
Studi caso - controllo  confronto tra
pazienti e soggetti sani per la frequenza del
genotipo o dell’aplotipo.
Studio di famiglie  i genitori dei pazienti
sono usati come controlli.
 Malattie causate da una combinazione di multipli
fattori genetici e fattori ambientali.
 Numerosi studi di associazione hanno permesso di
identificare i fattori di rischio genetico per alcune
comuni malattie:
 Diabete mellito di tipo I  HLA, gene dell’insulina,
gene CTLA4;
 Mallattia di Alzheimer  gene dell’APOE;
 Trombosi venosa profonda  mutazione del fattore V;
 Morbo di Crohn  mutazione di NOD2, variazione
genetica nel cromosoma 5q31.
 Nel genoma umano ci sono probabilmente tra 10 ed i
30 milioni di SNPs, circa uno ogni 100 – 300 basi. Di
questi SNP, circa 4 milioni sono SNPs comuni, con
entrambi gli alleli di ogni SNP che ha una frequenza
sopra il 20%.
 La presenza di un particolare allele di SNP in un
individuo viene determinata con il saggio
(tipizzazione genetica) di un campione di DNA
genomico.
 La coeredità di alleli SNP degli aplotipi produce
associazioni tra tali alleli nella popolazione.
 Lo scopo del “Internatinal HapMap Project” è stato quello
di determinare i “patterns” comuni della variazione di
sequenza del DNA nel genoma umano, caratterizzando le
varianti di sequenza, le loro frequenze e le correlazioni tra
esse, in campioni di DNA da popolazioni con antenati da
parti dell’Africa, dell’Asia e dell’Europa.
 Lo scopo finale di questo progetto internazionale è quello
di sviluppare uno strumento di ricerca che possa aiutare i
ricercatori a scoprire i fattori genetici che contribuiscono
alla suscettibilità alle malattie, alla protezione contro le
malattie ed alla risposta ai farmaci.
 Il “1000 Genomes project”, iniziato nel 2008, è una ricerca
internazionale che ha lo scopo di creare un catalogo molto
dettagliato della variazione genetica umana. Gli scienziati
hanno pianificato di sequenziare i genomi di almeno 1000
partecipanti anonimi di diversi gruppi etnici.
 Nel 2010 il progetto ha terminato la fase preliminare,
mentre il sequenziamento di 1092 genomi è stato riportato
in una pubblicazione su Nature dell’ottobre 2012.
 Il progetto ha coinvolto numerosi gruppi di ricerca
interdisciplinari in tutto il mondo (Cina, Italia, Giappone,
Kenia, Nigeria, Perù, Gran Bretagna e Stati Uniti).
Cambiamenti nel numero e nell’ordine dei geni crea la diversità genetica
entro le popolazioni e tra le popolazioni.
 I genomi di tutti gli individui, eccetto i gemelli monozigoti,
sono unici. Come le impronte digitali , i genomi forniscono
un’identificazione personale unica.
 I genomi di ogni persona combina i genomi derivati dai due
genitori. Perciò, i genomi sono anche capaci di indicare le
parentele, in particolare , di identificare la paternità.
 Il genoma di ogni persona contiene geni che influenzano,
caratteri riconoscibili, come il colore degli occhi.
 A differenza delle impronte digitali i genomi contengono
molte più informazioni su una persona rispetto alla
semplice identificazione. Problemi etici e giuridici.
 Le caratteristiche molecolari sono impiegate da 100
anni per identificare le persone e le parentele:
 1) Gruppi sanguigni A, B, AB e O  dimostra solo
l’innocenza, non la colpevolezza.
 2)Le sequenze del DNA sono invece in grado di fornire
una prova positiva di colpevolezza o paternità  a)
RFLP; b) VNTR (“DNA fingerprinting”, Alec Jeffreys
1984)  tuttavia per questa identificazione si
richiedono grandi quantità di DNA non degradato (10
÷ 50 ng di DNA di lunghezza non inferiore a 20000 ÷
25000 bp); c) con lo sviluppo della PCR si sono
amplificate e poi saggiate (sequenziamento del DNA)
corte regioni notoriamente variabili nella popolazione.
 L’amplificazione mediante PCR ha portato ad un notevole
miglioramento della sensibilità (basta 1 ng di DNA per
identificare regioni di 100 bp).
 Il metodo prevede:
 1) amplificazione mediante PCR di un STR contenente 2
÷ 5 bp, ripetuta tra qualche volta ad una dozzina di volte.
Si producono ampliconi di 200 ÷ 500 bp. I loci usati
comunemente presentano 5 ÷ 20 alleli comuni, e vengono
saggiati 8 ÷ 15 loci.
 2) sequenziamento degli ampliconi.
 DNA mitocondriale umano (16569 bp): contiene
una regione ipervariabile di 100 bp, che varia dell’1 ÷
2% tra individui non imparentati (differenze in 8
posizioni). Vantaggi dell’uso del DNA mitocondiale:
molto abbondante e stabile.
 Identificazione del genere: identificazione di qualsiasi
sequenza che sia peculiare del cromosoma Y per
dimostrare l’origine maschile. In alternativa, ricerca della
versione corta (cromosoma X; - 6bp) e versione lunga
(cromosoma Y) del gene per l’angiotensina. ♂, due
bande; ♀, una banda.
 “Forensic DNA phenotyping” (FDP) è un campo giovane
della genetica forense ed include, nel senso più ampio,
l’estrazione dell’informazione sui fenotipi umani attraverso
l’analisi molecolare di campioni biologici di una scena del
crimine.
 Attualmente, FDP coinvolge principalmente la predizione
dal DNA delle caratteristiche esternamente visibili (EVCs)
dell’uomo ed alcune volte la deduzione dal DNA
dell’etnicità degli antenati.
 Con il progresso delle conoscenze di genetica umana, si è
cominciato a capire quali geni sono coinvolti nel EVCs
come la pigmentazione della pelle, il tipo dei capelli od il
peso corporeo.
Per quei EVCs, come il colore degli occhi e dei
capelli, un numero ragionevolmente piccolo di
marcatori (varianti del DNA o SNPs) sono stati
identificati, così da permettere una larga
proporzione di variazione delle caratteristiche e
pertanto fornire una forte accuratezza della
predizione.
E’ stato già prodotto un saggio del DNA, validato
per uso forense, che permette di predire il colore
degli occhi del sospettato.