Biologia e genetica di popolazioni in ambito Biologia e

“Biologia e genetica di popolazioni in ambito
forense, dalla traccia
biologica allo studio dei polimorfismi STR's”
STR's”
Dott. Giorgio Portera
Dip.
Dip. di Biologia e Genetica per le
Scienze Mediche
Università
Università degli Studi di Milano
Laboratorio di Biologia Forense
•
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•
Ispezione: ricerca tracce (sangue, saliva, sperma,capelli
sperma,capelli…
capelli….)
Estrazione (resine magnetiche, colonnine, fenolo/cloroformio)
Quantificazione (rt
(rtrt-pcr)
pcr)
Amplificazione (multiplex
(multiplex)
multiplex)
Tipizzazione (310(310-3130XL)
PROFILI GENOTIPICI PER LA RICOSTRUZIONE DELLA
DINAMICA DELITTUOSA
Tipologia dei reperti
Vestiti con evidenti
tracce ematiche
Vestiti con minime
tracce ematiche
Ricerca di tracce ematiche da reperti
ripuliti dopo il crimine
Indumenti usati per
travisare il viso,investigati
per la ricerca di saliva e
residui epiteliali
Ricostruzioni parentali da
resti cadaverici o ossei
TEST GENERICI E DI SPECIE
Utili nell’
nell’identificazione del tipo di fluido biologico in fase di
ispezione
TEST GENERICI
• combur test sangue (test colorimetrico)
• amilasi saliva (test colorimetrico)
• psa sperma (immunocromatografico
(immunocromatografico)
immunocromatografico)
TEST DI SPECIE
• obti test: specifico per sangue di primate (immunocromatografico)
immunocromatografico)
• semelogenina:
semelogenina: specifico per sperma umano (proteina secreta in
vescicole seminali, immunocromatografico)
immunocromatografico)
COMBUR TEST - Combur3 Test
Test®
®E (ROCHE)
Commercializzato per la diagnosi clinica delle urine,
saggio colorimetrico per il livello di glucosio, proteine
e eritrociti
sostanza: tetrametilbenzidina
il tampone reagisce colorandosi di verde in presenza
di attività
attività perossidasica dell’
dell’emoglobina
FALSI POSITIVI: perossidasi vegetali,
ruggine, ossidanti vari, ecc.
COMBUR TEST - Combur3
Combur3 Test®
Test®E (ROCHE)
AMILASI TEST
test per diagnosi clinica della pancreatite acuta
• sostanza:
22-clorocloro-4-nitrofenolo
legato
a
maltotrioso indicatore colorimetrico che reagisce
con l’
l’α--amilasi della saliva,in presenza di saliva si
colora di giallo
• FALSI POSITIVI: sudore, urina, altri fluidi corporei
AMILASI TEST
PSA TEST
• test per diagnosi clinica del tumore alla prostata, dell’
dell’iperplasia
prostatica benigna (bph
(bph)
bph) e delle infezioni alla prostata; saggio
dell’’antigene
immunologico semiquantitativo per la determinazione dell
specifico prostatico nel sangue, siero e plasma
•sostanza:
sostanza: anticorpi anti antigene psa coniugati a oro colloidale
utilizzato per identificare tracce di sperma
•falsi
anticoncezionali
li
falsi positivi: in donne utilizzatrici di pillole anticonceziona
TEST SPECIFICI
OBTI TEST - HEXAGON OBTI (HUMAN) : anticorpi anti hb umani
coniugati a particelle cromogene (blu)
utilizzato per la diagnosi specie - specifico per il sangue dei primati
superiori.
TEST PER SEMELOGENINA: specifico per sperma umano (α(
semelogenina ,proteina
proteina secreta in vescicole seminali)
LAMPADA CRIMESCOPE
lampada con luce monocromatica a lunghezza d’
d’
onda variabile (415(415-650 nm)
Principio: differente emissione assorbimento tra
fluidi biologici e substrati
SLIP con tracce di
sperma
FODERA di una giacca
con tracce di sudore
Aree luminescenti
Crimescope C16
Aree positive al
test dell’
dell’Amilasi
Esempio di un reperto con numerose aree
luminescenti
22R
22 O
22Q
22N
22P
22I
22L
22M
ESTRAZIONE DEL DNA
• FENOLOFENOLO-CLOROFORMIO – solventi organici immiscibili con acqua:
si formano 2 fasi, DNA in quella acquosa, proteine in quella
organica
• RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU COLONNA – DNA affine alla
resina, rimane legato nella membrana della colonna,
successivamente viene eluito
• RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU BIGLIE MAGNETICHE – stessa
chimica del precedente metodo, ma la resina è libera in soluzione.
Viene poi recuperata con un magnete e il DNA eluito
• RESINE
SINTETICHE
AFFINI
AL
DNA
PER
CARICA
ELETTROSTATICA: il DNA si lega alla resina al variare del pH della
soluzione
ESTRAZIONE CON
RESINA MAGNETICA
resina +
• metodo di estrazione del DNA che
ne sfrutta la carica negativa
• metodica veloce e modulabile a
seconda del tipo di traccia
(possibilità
possibilità di aumentare il numero
dei lavaggi, estrazione da diversi
volumi)
volumi)
DNA -
• estrazione automatizzabile
DNA -
resina -
AUTOMAZIONE
ESTRAZIONE AUTOMATIZZATA
ATTRAVERSO L’
L’UTILIZZO DI ROBOT
(MICRO(MICRO-PIPETTATORI)
uniche fasi compiute dall’
dall’operatore:
posizionamento dei campioni e reagenti
VANTAGGI
• possibilità
possibilità di estrarre in meno di 2h
fino a 96 tracce
•riduzione
riduzione rischio di errori
dell’
dell’operatore
•alta
alta precisione nel dosaggio dei
reagenti
CODICE A BARRE
TRACCIABILITÀ
TRACCIABILITÀ DEI CAMPIONI
• possibilità
possibilità di poter attribuire un
indicativo (codice a barre classico o
bidimensionale) dalla prima fase del
prelievo della traccia alla
conservazione dell’
dell’estratto
• i codici delle diverse fasi di lavorazione
(ispezione, estrazione …) vengono
collegati attraverso lettori ottici
COLLEGAMENTO CON LETTORE
OTTICO
QUANTIFICAZIONE CON REAL TIME
• I campioni vengono quantificati
con STANDARD con DNA noto e
privo di inibizione (da 50ng/µl a 23
pg/µl)
• importanza dell’IPC nella lettura
della quantificazione dei campioni
per valutare la qualità del DNA
estratto (eventuale
PURIFICAZIONE)
INIBIZIONE: non è possibile
valutare la presenza o
assenza di DNA
PURIFICAZIONE
Real -Time
IPC campioni + standard,
curva molto simile
IPC inibito
POSSIBILITÀ
POSSIBILITÀ DI QUANTIFICARE NELLA STESSA
REAZIONE DNA GENOMICO UMANO E DNA MASCHILE
REPERTO
Umano (pg/ul)
Y Maschile
(pg/ul)
Ratio H/Y
Condom1-ext
91± 20%
60 ± 20%
1.5 ± 20%
Condom1-int
44 ± 30%
69 ± 20%
0.6 ± 30%
Condom2-ext
44 ± 30%
15 ± 30%
3 ± 30%
Condom2-int
10 ± 30%
10 ± 30%
1
Condom3-ext
180 ± 10%
348 ± 10%
0.5 ± 10%
Condom3-int
21364 ± 10%
18572 ± 10%
1.2 ± 10%
Condom4-ext
59 ± 20%
13 ± 30%
4.5 ± 30%
Condom4-int
4239 ± 10%
12060 ± 10%
0.4 ± 10%
Condom5-ext
390 ± 10%
201 ± 10%
1.9 ± 10%
Condom5-int
1534 ± 10%
1633 ± 10%
0.9 ± 10%
Condom6-ext
124 ± 10%
-
-
Condom6-int
25 ± 30%
45 ± 30%
0.9 ± 30%
AMPLIFICAZIONE
caratteristiche di un marcatore forense
• Amplificare e tipizzare l’
l’intero genoma sarebbe improponibile
per costi e tempo
• Studi di popolazioni hanno permesso di individuare marcatori
con le seguenti caratteristiche:
1. POLIMORFICI anche in popolazioni isolate (lo stesso
marcatore
deve
presentare
diverse varianti nella
popolazione)
2. STABILI alle mutazioni (importanza della scelta dei primers)
3. EQUILIBRIO con la legge di Hardy-Weinberg
4. INDIPENDENTI
Microsatelliti STR (Short Tandem Repeat)
STRUTTURA DI UN STR
...ACAGATGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATGT..
•GATA è la sequenza del core-repeat
•Il microsatellite in questione è un tetranucleotidico
•Le varianti (alleli
alleli)
alleli hanno un numero diverso di repeat
8 ripetizioni
...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...
9 ripetizioni
...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...
10 ripetizioni
...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...
Per convenzione gli alleli degli STR vengono chiamati in base
al numero di repeat
NOME DEL MARCATORE
POTENZIALI ALLELI; IDENTIFICATI CON IL
NUMERO DI RIPETIZIONI DEL CORE REPEAT
SCELTA DEGLI STR
Studi di genetica di popolazione hanno permesso di isolare 13
specifici marcatori STR, denominati Loci Codis
TPOX
D3S1358
D8S1179
D5S818
FGA
CSF1PO
TH01
VWA
D7S820
AMEL
D13S317
D16S539
D18S51
D21S11
AMEL
Studi di popolazione 13 Loci Codis
MULTIPLEX
• I 13 loci Codis vengono amplificati in un’unica reazione di PCR,
spesso con aggiunta di altri loci per aumentarne il potere
discriminante
• gli attuali kit di amplificazione caratterizzano
contemporaneamente 15 loci STR (Multiplex)
• le attuali multiplex permettono di amplificare concentrazioni di
estratto inferiori ai 50 pg/µl
• DNA nucleare cellula diploide ~ 6 pg, 50/6= 8 cellule/µl
20 cellule x reazione!!!
TIPIZZAZIONE
I frammenti vengono separati e caratterizzati tramite
elettroforesi capillare utilizzando un sequenziatore automatico
(310, 3100, 3130XL), leggendo i segnali dei diversi DYE che
discriminano i frammenti overlappanti
RAW DATA – DATO GREZZO
PROFILO GENETICO ELABORATO
DIMOSTRAZIONE D’IDENTITA’’
•un profilo secondo gli standard FBI (codis) e’ formato da 13 marcatori
•poniamo che ogni marcatore presenti alleli la cui frequenza e’ pari a 0,1
nella popolazione di riferimento
•poniamo che ogni marcatore presenti lo stesso allele su entrambi i
cromosomi (omozigosi)
•la probabilita’ di ottenere la combinazione data per ogni marcatore e’ pari a
0,1*0,1=0,01
•la probabilita’ di ottenere la combinazione data per tutto il profilo e’
0,01*0,01*…0,01 (13 volte) ovvero 10-26, 1 su miliardi di miliardi di
individui……..
IL PROFILO PUO’ ESSERE RITENUTO UNICO
VIOLENZA SESSUALE
Reperti
Foto vetrino
indiziato
tampone vaginale
vittima
sperma
vestaglia
indiziato
tampone vaginale
vittima
vestaglia
indiziato
tampone vaginale
vittima
vestaglia
indiziato
tampone vaginale
vittima
vestaglia
Nuove applicazioni e possibilità
possibilità di sviluppo in
biologia forense
• Studio DNA degradato (“tracce stressate” e residui epiteliali)
• Ricerca mRNA su tracce forensi
DNA DEGRADATO
La caratterizzazione
di ampliconi più corti (loci Mini-STR),
c
permette di analizzare estratti molto degradati come quelli
di sudore e residui epiteliali
Tracce attaccate da batteri, muffe, stress ambientale
miniSTR
Primers per STR
Locus
Primers per
miniSTR
Degradazione
Degradazione
250<x<300
Amplificazione
con kit Identifiler
(16 sistemi STR)
25pg/ul
250<x<300
10 cellule
140<x<190
Amplificazione con kit
Minifiler (9 sistemi
mini-STR)
110<x<180
70<x<120
80<x<130
300<x<350
300<x<350
RICERCA RNA MESSAGGERO SU TRACCE FORENSI
Possibilità di DATARE la traccia in base alla quantità di
messaggero ancora presente, ma soprattutto stabilire
l’ORIGINE TISSUTALE, in modo da eliminare i limiti delle
diagnosi specifiche e generiche e valutazioni ispettive.
Esempio: luminescenza alla crimescope di urina molto
simile a secrezioni vaginali, distinzione tra perdite ematiche
da trauma o perdite sangue mestruale
INDAGINI SU SANGUE MESTRUALE
In passato la diagnosi di sangue mestruale veniva fatta attraverso
la ricerca microscopica di cellule dell’endometrio, dosaggio
ormonale o rapporto tra degradazione fibrina/fibrinogeno.
SVANTAGGI
• necessità di elevate tracce di sangue
• non applicabilità in tracce forensi (sporche e non sempre ben
repertate)
• in alcuni casi di violenza sessuale o omicidio è importante
determinare l’origine delle tracce ematiche
PERDITE DA TRAUMA O FISIOLOGICHE?
CASEWORK
scomparsa e rinvenimento cadavere di una donna di circa 30 anni
• il sopralluogo dell’abitazione consente di rinvenire un lenzuolo
con consistenti tracce ematiche, poi tipizzate ed appartenenti alla
donna
• viene accusato di omicidio il marito, che giustifica le abbondanti
tracce ematiche del lenzuolo come perdite mestruali
RICERCA DI UN TRASCRITTO SPECIFICO
PER SANGUE MESTRUALE
…. vengono raccolti vari campioni:
• campioni autoptici di vari tessuti, tra cui cellule della mucosa
dell’endometrio
• sangue mestruale di volontarie
• sangue da traumi vari
• ESTRAZIONE RNA MESSAGGERO
•RETROTRASCRIZIONE
•PCR
Dott. Giorgio Portera
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