Dosaggio CEDIA® per benzodiazepine

Dosaggio CEDIA® per benzodiazepine
Per uso diagnostico in vitro
10016409 (Kit Indiko da 3 x 17 mL)
100085 (Kit da 3 x 17 mL)
100094 (Kit da 65 mL)
1775561 (Kit da 495 mL)
Uso previsto
Preparazione e conservazione dei reagenti
Il dosaggio CEDIA® per benzodiazepine è uno strumento diagnostico in vitro previsto per la
determinazione qualitativa e semiquantitativa delle benzodiazepine nell’urina umana.
Per la preparazione delle soluzioni per gli analizzatori Hitachi, vedere più avanti. Per tutti gli
altri analizzatori, consultare il foglio delle applicazioni specifico per l’analizzatore in dotazione.
Estrarre il kit dal frigorifero appena prima della preparazione delle soluzioni.
Questo dosaggio fornisce unicamente un risultato analitico preliminare. Per ottenere un risultato
analitico di conferma, è necessario utilizzare un metodo chimico alternativo a specificità più elevata.
Il metodo di conferma più idoneo è la gascromatografia/spettrometria di massa (GC/MS).1 Qualsiasi
risultato di analisi riguardante sostanze di abuso, soprattutto nel caso di un risultato preliminare
positivo, va trattato con la considerazione clinica e la discrezione professionale opportune.
Sommario e spiegazione del metodo
Le benzodiazepine appartengono ad un’ampia categoria di farmaci depressivi in grado di agire sul
SNC, conosciuti col nome di sedativi/ipnotici.2 Vengono prescritti come ansiolitici, agenti per indurre
il sonno, anticonvulsivanti e rilassanti per muscoli, e vengono anche usati largamente come medicinali
preanestetici e come coadiuvanti nell’induzione e nel mantenimento dello stato anestetico.2,3,4
Sebbene ampiamente prescritte, le benzodiazepine vengono anche usate come droghe da
abuso.3-5 L’uso cronico delle benzodiazepine può portare alla dipendenza fisica con sintomi
da astinenza quali insonnia, agitazione, irritabilità, tensione muscolare e, in casi più gravi,
allucinazioni, psicosi e convulsioni.2,3
Il dosaggio CEDIA per benzodiazepine è un immunodosaggio enzimatico omogeneo che si avvale
della tecnologia del DNA ricombinante (brevetto USA n. 4708929).6 Questo dosaggio è basato
sull’enzima batterico -galattosidasi, geneticamente suddiviso in due frammenti inattivi. Questi
frammenti si riassociano spontaneamente per formare un enzima pienamente attivo in grado
di scindere, nel formato del dosaggio, un substrato, dando luogo ad una variazione cromatica
misurabile spettrofotometricamente.
Nel dosaggio, il farmaco nel campione compete con il farmaco coniugato con un frammento inattivo
di -galattosidasi per i siti di legame degli anticorpi. Se il farmaco è presente nel campione, si legherà
all’anticorpo, lasciando i frammenti enzimatici inattivi liberi di formare enzimi attivi. Se il farmaco non
è presente nel campione, l’anticorpo si legherà al farmaco coniugato con il frammento enzimatico
inattivo, inibendo la riassociazione dei frammenti inattivi di -galattosidasi, e non si verificherà la
formazione di alcun enzima attivo. La quantità di enzima attivo formata ed il risultante cambiamento
dell’assorbanza sono proporzionali alla concentrazione del farmaco presente nel campione.
Per aumentare la sensibilità del dosaggio, un enzima opzionale viene aggiunto per idrolizzare
i metaboliti di glucuronide nella benzodiazepina, aumentando in tal modo il riconoscimento di
quei campioni che contengono metaboliti di benzodiazepina.7,8
Reagenti
1 Tampone di ricostituzione EA: contiene piperazina-N, N-bis [acido 2-etansulfonico],
13,6 μg/mL di anticorpi policlonali di pecora contro la benzodiazepina, sali tampone,
stabilizzante e conservante.
1a Reagente EA: contiene 0,171 g/L di accettore enzimatico, sali tampone, detergente
e conservante.
2 Tampone di ricostituzione per ED: contiene piperazina-N, N-bis [acido 2-etansulfonico],
sali tampone e conservante.
2a Reagente ED: contiene 9,7 μg/L di donatore enzimatico coniugato con un derivato della
benzodiazepina, 1,67 g/L di rosso di clorofenolo- -D-galattopiranoside, stabilizzante
e conservante.
Ulteriori materiali: etichette alternative con codici a barre (per i n. di cat. 100085 e 100094. Per
le istruzioni per l’uso, consultare il foglio delle applicazioni relativo all’analizzatore in dotazione).
Flaconi vuoti per analizzatore per il travaso delle soluzioni EA/ED (n. di cat. 100094).
Ulteriori materiali necessari (venduti separatamente):
Calibratore negativo CEDIA
Calibratore multi-farmaco CEDIA, valori limite primari o valori limite clinici primari, (300 ng/mL)
Calibratore multi-farmaco CEDIA, valori limite secondari o valori limite opzionali, (200 ng/mL)
Calibratore multi-farmaco intermedio CEDIA
Calibratore multi-farmaco alto CEDIA
Set di controlli speciali, o set di controlli opzionali, (per valore limite 200 ng/mL)
Set di controlli multi-farmaco, o set di controlli clinici, (per valore limite 300 ng/mL)
Reagente -glucuronidasi (per il dosaggio ad alta sensibilità)
Codice a barre alternativo per l’applicazione ad alta sensibilita:
Per l’uso con gli analizzatori Hitachi 911, 912 e 917
Avvertenze e precauzioni
I reagenti contengono azoturo di sodio. Evitarne il contatto con la pelle e le mucose. In caso di
contatto, sciacquare le aree interessate con abbondanti quantità di acqua. In caso di contatto con
gli occhi o di ingestione, rivolgersi immediatamente a un medico. L’azoturo di sodio può reagire
con il rame o il piombo delle tubature di scarico generando azidi metallici potenzialmente esplosivi.
Per lo smaltimento dei reagenti, usare abbondanti quantità di acqua per evitare l’accumulo di
azidi metallici. Pulire le superfici metalliche esposte con idrossido di sodio al 10%.
Preparare le soluzioni nel seguente ordine per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione.
Soluzione R2 di donatore enzimatico: collegare il flacone 2a (reagente per ED) al flacone 2
(tampone di ricostituzione per ED) usando uno degli adattatori forniti. Mescolare capovolgendo
delicatamente, assicurandosi che tutto il materiale liofilizzato del flacone 2a si trasferisca nel
flacone 2. Evitare la formazione di schiuma. Staccare il flacone 2a e l’adattatore dal flacone 2
e gettarli. Tappare il flacone 2 e lasciarlo riposare per circa 5 minuti a temperatura ambiente
(15-25°C). Mescolare nuovamente. Annotare la data di ricostituzione sull’etichetta del flacone.
Soluzione R1 di accettore enzimatico: collegare il flacone 1a (reagente per EA) al flacone 1
(tampone di ricostituzione per EA) usando uno degli adattatori forniti. Mescolare capovolgendo
delicatamente, assicurandosi che tutto il materiale liofilizzato del flacone 1a si trasferisca nel
flacone 1. Evitare la formazione di schiuma. Staccare il flacone 1a e l’adattatore dal flacone 1
e gettarli. Tappare il flacone 1 e lasciarlo riposare per circa 5 minuti a temperatura ambiente
(15-25°C). Mescolare nuovamente. Annotare la data di ricostituzione sull’etichetta del flacone.
N. di cat. 100094 - Analizzatore Hitachi 717, 911, 912 o 914: travasare i reagenti ricostituiti nei
corrispondenti flaconi vuoti da 100 mL R1 e R2 forniti con il kit. Hitachi 917/Sistema Modular
Analytics P: usare i reagenti ricostituiti senza travasarli. Gettare i flaconi da 100 mL vuoti.
N. di cat. 1775561 - Analizzatore Hitachi 747/Sistema Modular Analytics D: usare l’imbuto fornito
per trasferire una parte della soluzione R2 nel flacone vuoto R2 fornito opportunamente etichettato.
Dosaggio ad alta sensibilità delle benzodiazepine: per utilizzare il reagente opzionale
-glucuronidasi, aggiungere 0,09 mL di -glucuronidasi per il n. di catalogo 100085 e il
n. di catalogo 10016409; 0,325 mL per il n. di catalogo 100094 e 2,5 mL per il n. di catalogo 1775561
alla soluzione EA ricostituita. Mescolare capovolgendo delicatamente. Annotare sull’etichetta
del flacone che la -glucuronidasi è stata aggiunta.
NOTA 1: i componenti forniti in questo kit sono previsti per l’uso congiunto. Non mescolare tra
loro componenti di lotti diversi.
NOTA 2: per evitare la contaminazione crociata dei reagenti, non scambiare tra loro i tappi dei
diversi flaconi. La soluzione R2 deve essere di colore giallo arancio. La comparsa di un colore
rosso scuro o rosso porpora indica la contaminazione del reagente, che va quindi eliminato.
NOTA 3: prima dell’esecuzione del dosaggio, le soluzioni R1 e R2 vanno portate alla temperatura
dello scomparto dei reagenti dell’analizzatore. Per ulteriori informazioni, consultare il foglio delle
applicazioni relativo all’analizzatore in dotazione.
NOTA 4: per garantire la stabilità del reagente EA ricostituito, non esporlo per un periodo
prolungato all’azione diretta di forti sorgenti luminose.
Conservare i reagenti a 2-8°C. NON CONGELARLI. Per il periodo di stabilità dei componenti non
aperti, vedere la data di scadenza sulla confezione o sulle etichette dei flaconi.
Soluzione R1: 60 giorni nello scomparto refrigerato dell’analizzatore oppure in frigorifero a 2-8°C.
Soluzione R2: 60 giorni nello scomparto refrigerato dell’analizzatore oppure in frigorifero a 2-8°C.
Prelievo e trattamento dei campioni
Raccogliere il campione di urina in un recipiente pulito di vetro o plastica. In presenza di alta
torbidità, il campione va centrifugato prima di sottoporlo all’analisi. Trattare il campione di
urina umana come potenzialmente infettivo. Se si sospetta la contaminazione del campione,
ottenere un nuovo campione per l’analisi. La contaminazione del campione di urina può influire
negativamente sui risultati dell’analisi.
Ai sensi delle direttive The Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Programs:
Final Guidelines: Notice, i campioni non analizzati entro 7 giorni dal loro arrivo al laboratorio vanno
conservati in frigoriferi di sicurezza.9
Procedura di analisi
Ai fini del presente dosaggio è possibile utilizzare gli analizzatori chimici in grado di mantenere
una temperatura costante, pipettare i campioni, miscelare i reagenti, misurare i tassi
enzimatici e regolare con precisione i tempi di reazione. Fogli applicativi riportanti i parametri
specifici per ciascun analizzatore sono disponibili presso la Microgenics, che fa parte della
Thermo Fisher Scientific.
Solo con i kit da 17 mL e da 65 mL vengono fornite etichette con codice a barre supplementari
per la determinazione semiquantitativa. A tal fine, apporre l’etichetta corretta sopra l’etichetta
già presente sul flacone.
Controllo di qualità e calibrazione10
Accuratezza
Seicento quarantotto campioni di urina sono stati analizzati con il dosaggio CEDIA per
benzodiazepine, usando l’analizzatore Hitachi 717 e un metodo EIA per le benzodiazepine come
riferimento (A e B). Sono stati dosati altri duecento campioni clinici e dieci campioni arricchiti
(nitrazepam arricchito fino a un valore di +25% del valore limite di 200 in urina negativa) con
e senza enzima, -glucuronidasi, utilizzando un analizzatore Hitachi 717 (C). Sono stati ottenuti
i seguenti risultati.11
Analisi qualitativa
Per l’analisi qualitativa dei campioni, usare il calibratore multi-farmaco CEDIA, i valori limite
primari, i valori limite clinici primari, i valori limite opzionali o i valori limite secondari (a seconda
dei valori limite selezionati). (Per applicazioni ad alta sensibilità, usare soltanto il valore limite
secondario.) Consultare il foglio applicativo specifico per l’analizzatore in dotazione.
Analisi semiquantitativa
Per l’analisi semiquantitativa dei campioni, usare il calibratore multi-farmaco CEDIA, i valori limite
primari, i valori limite clinici primari, i valori limite opzionali o i valori limite secondari (a seconda dei
valori limite selezionati) insieme al calibratore negativo e ai calibratori multi-farmaco intermedio
e alto. Consultare il foglio applicativo specifico per l’analizzatore in dotazione.
A. Valore
limite 200 ng/mL
CEDIA
+
-
Una buona prassi di laboratorio prevede l’analisi dei controlli ogni giorno in cui viene effettuata
l’analisi dei campioni dei pazienti e ad ogni calibrazione. Si raccomandano due livelli di controllo:
uno 25% al di sopra del limite selezionato e l’altro 25% al di sotto del limite selezionato. Per il
controllo di qualità, usare il set di controlli multi-farmaco CEDIA o il set di controlli clinici, (valore
limite 300) o il set di controlli speciali o il set di controlli opzionali, (valore limite 200). Ripetere la
calibrazione se ci fosse un cambiamento nei reagenti oppure se i risultati di controllo si trovassero
al di fuori dei limiti stabiliti. Ogni laboratorio deve determinare indipendentemente la frequenza
dei suoi controlli. Basare la valutazione del controllo di qualità sui valori ottenuti dai controlli, che
devono rientrare entro limiti specifici. Se si riscontrano tendenze marcate o deviazioni improvvise
nei valori, riesaminare tutti i parametri operativi. Per ulteriore assistenza, rivolgersi al servizio di
assistenza tecnica. Tutti i requisiti di controllo della qualità vanno soddisfatti in conformità alle
normative vigenti o ai requisiti per l’accreditamento.
+
5
530
1. Un risultato di analisi positivo indica la presenza di benzodiazepine; non indica o misura
il livello di intossicazione.
2. Esiste la possibilità che altre sostanze e/o fattori non elencati (come gli errori tecnici
o procedurali) possano interferire con l’analisi e dar luogo a risultati falsi.
I dati specifici delle prestazioni ottenibili mediante l’analizzatore Hitachi 717 sono riportati qui
di seguito.11 I valori ottenuti nei diversi laboratori possono essere differenti da quelli riportati in
questa sede.
Precisione
Lo studio riportato di seguito è stato eseguito usando l’applicazione senza -glucuronidasi. I dati
rappresentano sia l’una che l’altra applicazione.
Studi sulla precisione misurata, condotti usando reagenti, calibratori e controlli confezionati,
hanno dato i seguenti risultati in mA/min con un analizzatore Hitachi 717 mediante la metodica
di replicazione NCCLS modificata (6 replicati due volte al giorno per 10 giorni).
300
375
n
120
120
120
120
120
120
120
120
6
117
Analizzato
(ng/mL)
Reattività
crociata%
Con -glucuronidasi
Analizzato
(ng/mL)
Reattività
crociata%
-
200
96
-
-
200
99
7-amino-nitrazepam
-
-
250
83
-idrossi-alprazolam
163
188
115
167
-idrossi-triazolam
150
193
125
155
Alazepam
200
145
200
101
Alprazolam
138
205
100
220
-
-
200
100
Bromazepam
300
110
190
104
Clobazam
400
62
300
59
Clonazepam
188
140
225
71
Clorazepate
325
84
300
75
2083
13
1200
16
Delorazepam
150
184
100
197
Demoxepam
1900
14
1000
19
Desalkylflurazepam
138
210
115
173
Diazepam
110
247
125
154
Estazolam
125
220
95
239
Flunitrazepam
188
135
175
109
Flurazepam
150
189
100
195
208
122
175
115
10000
1
400
45
Lormetazepam
163
165
150
137
Medazepam
200
135
150
118
Nitrazepam
300
100
200
100
Lorazepam glucuronide
225
539
0
-
Lorazepam
Precisione totale
200
14
87
7-amino-flunitrazepam
Clordiazepossido
Caratteristiche specifiche del rendimento del test
375
-
CEDIA
Valore +
limite
senza enzima
7-amino-clonazepam
Alprazolam glucuronide
Limitazioni
300
2
Senza -glucuronidasi
Prestare attenzione quando si annotano i risultati delle concentrazioni in quanto esistono molti
altri fattori che possono alterare il risultato del test dell’urina, come l’assorbimento di liquidi
e altri fattori biologici.
225
93
Specificità
I seguenti composti progenitori e metaboliti, analizzati con il dosaggio CEDIA per benzodiazepine
(senza -glucuronidasi) e il dosaggio ad alta sensibilità (con -glucuronidasi), hanno dato
i seguenti risultati di reattività crociata:
Risultati semiquantitativi
Il calibratore multi-farmaco CEDIA, i valori limite primari, i valori limite clinici primari, i valori
limite opzionali o i valori limite secondari, usati insieme al calibratore negativo e ai calibratori
multi-farmaco intermedio e alto, possono essere usati per stimare le concentrazioni relative di
benzodiazepine.
200
+
CEDIA
+
-
EIA
-
Risultati qualitativi
I calibratori multi-farmaco CEDIA, i valori limite primari, i valori limite clinici primari, i valori limite
opzionali o i valori limite secondari vengono usati come riferimento per distinguere i campioni
positivi da quelli negativi. I campioni che generano un valore di risposta uguale o maggiore
rispetto al valore di risposta del calibratore sono considerati positivi. I campioni che generano un
valore di risposta inferiore rispetto a quello del calibratore sono considerati negativi. Per ulteriori
informazioni, consultare il foglio applicativo relativo all’analizzatore in dotazione.
ng/mL
C. Valore limite con
enzima 200 ng/mL
CEDIA
+
-
2
EIA
Risultati e valori attesi
x¯
111
Composto
Precisione intra-analisi
B. Valore
limite 300 ng/mL
324,3
340,6
366,1
402,0
324,3
340,6
366,1
402,0
150
211
120
173
SD
2,4
2,7
2,8
3,7
11,4
12,5
13,2
14,6
Oxaprozin
10000
2
10000
2
CV%
0,8
0,8
0,8
0,9
3,5
3,7
3,6
3,6
Oxazepam
275
107
165
125
10000
1
800
25
150
184
160
116
Nordiazepam
Oxazepam glucuronide
Prazepam
Temazepam
Temazepam glucuronide
Triazolam
2
175
144
180
93
10000
1
750
25
138
191
90
217
Bibliografia
Si sono analizzati con il dosaggio CEDIA per benzodiazepine, protocollo per valore limite
300 ng/mL, anche composti non strutturalmente correlati che, alle concentrazioni qui di seguito
elencate, hanno dato risultati negativi. Un risultato simile si è notato utilizzando il dosaggio ad
alta sensibilità, protocollo per valore limite 200 ng/mL.
Composto
ng/mL
Composto
ng/mL
11-nor-∆9-THC-COOH
10.000
Fenobarbitale
500.000
Acetamminofene
500.000
Fluossetina
500.000
Acido acetilsalicílico
500.000
Ibuprofene
500.000
Acido salicilurico
500.000
Levotiroxina
50.000
Amfetamina
500.000
Metadone
100.000
Amossicilina
100.000
Metamfetamina
500.000
Benzoilecgonina
500.000
Morfina
100.000
Captoprile
500.000
Nifedipina
500.000
Cimetidina
500.000
Propossifene
500.000
Codeina
500.000
Ranitidina
500.000
Digossina
100.000
Secobarbitale
500.000
EDDP
500.000
Sertralina
250.000
EMDP
100.000
Tolmetin
500.000
Enalaprile
500.000
Verapamil
500.000
Fenciclidina
250.000
1. Hawks RL. Analytical methodology. In: Hawks RL, Chiang CN, eds. Urine Testing for
Drugs of Abuse. NIDA Research Monograph. 1986; 73: 30-41.
2. Katzung BG, ed. Basic and clinical pharmacology. 5th ed. Norwalk, Conn: Appleton &
Lange, 1992.
3. Julien RM. A primer of drug action. 6th ed. New York, NY: W.H. Freeman & Co; 1992.
4. Goodman and Gilman’s The Pharmacological basis of therapeutics. 8th ed. New York,
NY: Pergamon Press, 1990.
5. Adams EH. Prevalence of prescription drug abuse: Data from the National Institute on
Drug Abuse. NY State J Med 199; 91 (suppl 11): 32s-36s.
6. Henderson DR, Friedman SB, Harris JD et al. CEDIA™, a new homogeneous immunoassay
system. Clin Chem. 1986; 32: 1637-1641.
7. Beck O, Lafolle P, Hjemdahl P et al. Detection of Benzodiazepine Intake in Therapeutic
Doses by Immunoanalysis of Urine: Two Techniques Evaluated and Modified for
Improved Performance. Clin Chem. 1992; 38: 271-275
8. Simonsson P, Liden A, Lindberg S. Effect of a-Glucuronidase on Urinary Benzodiazepine
Concentrations Determined by Flourescence Polarization Immunossay. Clin Chem.
1995; 41: 920-923
9. Notice of Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Program: Final
guidelines. Federal Register. 1994; 110 (June 9): 11983. (le direttive rivalutate sono attese
nel 2002).
10. Dati sulla tracciabilità sono disponibili presso la Microgenics Corporation, che fa parte
della Thermo Fisher Scientific.
11. Dati disponibili presso la Microgenics Corporation, che fa parte della Thermo Fisher
Scientific.
Non è stata osservata alcuna interferenza dovuta all’aggiunta delle seguenti sostanze alle
normali concentrazioni endogene ritrovate nelle urine con il dosaggio CEDIA per benzodiazepina.
Sostanza
Concentrazione
Sostanza
Concentrazione
Acetone
< 1,0 g/dL
Galattosi
< 10 mg/dL
Acido ascorbico
< 0,15 g/dL
−globulina
< 0,5 g/dL
< 3,0 g/dL
Acido ossalico
< 0,1 g/dL
Glucosio
Cloruro di sodio
< 6,0 g/dL
Riboflavina
< 7,5 mg/dL
Creatinina
< 0,5 g/dL
Sieroalbumina umana
< 0,5 g/dL
Emoglobina
< 0,3 g/dL
Urea
< 4,0 g/dL
Etanolo
< 1,0 g/dL
Sensibilità
Applicazione standard
Per l’applicazione qualitativa, il limite di rilevamento (LOD) è stato rispettivamente di
10,8 ng/mL e di 12,8 ng/mL per i protocolli per valore limite 200 ng/mL e 300 ng/mL. Per l’applicazione
semiquantitativa, l’LOD è stato rispettivamente di 6,4 ng/mL e di 8,3 ng/mL per i protocolli valore
limite 200 ng/mL e 300 ng/mL.
Applicazione ad alta sensibilità per benzodiazepine
Per l’applicazione qualitativa, l’LOD è stato di 12,3 ng/mL. Per l’applicazione semiquantitativa,
l’LOD è stato di 7,3 ng/mL.
Microgenics Corporation
46500 Kato Road
Fremont, CA 94538 USA
Assistenza tecnica e assistenza
alla clientela negli USA:
1-800-232-3342
Per gli aggiornamenti del foglietto illustrativo, visitare:
www.thermoscientific.com/diagnostics
Negli altri Paesi:
Consultare il rappresentante Thermo Fisher Scientific di zona.
CEDIA è un marchio depositato della Roche Diagnostics.
10006458-4-IT
2014 06
3
Thermo Fisher Scientific Oy
Ratastie 2, P.O. Box 100
01621 Vantaa, Finland
Tel: +358-9-329100
Fax: +358-9-32910300