Use of Biotechnologies of Reproduction for the Safeguard of

3) Comunicazioni libere
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Società Italiana Veterinari per Equini - SIVE - XII Congresso Multisala, Bologna, Italy 2006
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IMPIEGO DELLE BIOTECNOLOGIE DELLA RIPRODUZIONE
PER LA SALVAGUARDIA DI RAZZE AUTOCTONE EQUINE DELLA SARDEGNA:
STUDIO PRELIMINARE
USE OF BIOTECHNOLOGIES OF REPRODUCTION FOR THE SAFEGUARD
OF SARDINIA EQUINE NATIVE BREED PRELIMINARY STUDY
Antonio Corona* Med Vet, PhD; Maria Dattena§ Med Vet; Laura Mara§ Biol.; Ignazio Cossu*
Med Vet PhD; Fabrizio Chessa§ Tec Lab; Raffaele Cherchi* Med Vet; Pietro Cappai§ Med Vet
*Centro di Riproduzione Equina - Istituto Incremento Ippico della Sardegna - Ozieri - Italia
§Istituto Zootecnico e Caseario per la Sardegna - Olmedo - Italia
Introduzione - In Sardegna sono rappresentate quattro razze equine ed asinine tra quelle riconducibili a gruppi etnici locali: il cavallino della Giara, il cavallo del Sarcidano, l’asino sardo e l’asino
dell’Asinara. Tutte sono iscritte al Registro Anagrafico e classificate in base alla loro consistenza in
“minacciate” (cavallino della Giara, cavallo del Sarcidano e asino sardo) e “critiche” (asino dell’Asinara). Le difficili condizioni ambientali, la scarsa fertilità e la mortalità neonatale di alcune delle
razze citate, sono solo alcune delle tante cause del loro continuo decremento. Per questa ragione e
in base all’esperienza acquisita in Sardegna nel settore delle biotecnologie riproduttive applicate ai
piccoli ruminanti, si è cercato di standardizzare un sistema di produzione di embrioni in vitro-in vivo da poter applicare, in futuro, alle razze in oggetto. Più precisamente, le prime fasi della produzione embrionale sono effettuate in vitro (maturazione e fertilizzazione degli ovociti) mentre la coltura viene realizzata in vivo, trasferendo gli oociti fertilizzati nelle tube di una pecora definita “ricevente temporanea”. Tale scelta sembrerebbe, al momento, la più adeguata in quanto la specie
equina mal si presta alla sola produzione in vitro, come dimostrato da diverse ricerche (Squires et
al., 2003).
Materiali e metodi - A seguito della macellazione di fattrici di razza da tiro pesante provenienti dell’est europeo, sono state recuperate in mattatoio le ovaie trasportate, in soluzione fisiologica, in laboratorio entro 3h, alla temperatura di circa 26°C in valigia termostatata. I follicoli ovarici erano incisi con una lama di bisturi e il loro interno raschiato con cucchiaio di Volkman, e il contenuto risciacquato in Hepes-buffer TCM199 + 0,4 mg/ml BSA ed eparina. Dopo un successivo lavaggio,
gli oociti erano messi in pozzetti (Nunc) con 400 µl di medium di maturazione (TCM199 al 10% di
FCS, 1 mM sodio piruvato, 100 ng/ml IGF-I, 50 ng/ml EGF, 5 µl/ml ITS, 15 µg/ml LH e 10 µg/ml
FSH) e ricoperti con 200 µl di olio minerale. Dopo 22-24h d’incubazione a 38°C in atmosfera al 5%
di CO2, gli oociti venivano ripuliti dalla granulosa con 600 IU/ml di ialuronidasi in H-TCM199 e
l’ausilio di una sottile pipetta di vetro. Solo gli oociti allo stadio di metafase seconda (MII) venivano fertilizzati con seme fresco, utilizzando la metodica dell’iniezione intra-citoplasmatica dello
spermatozoo (ICSI) e quindi posti in medium di coltura SOF supplementato con BSA e amminoacidi per 14h, in incubatore a bassa tensione di O2. Il giorno successivo i presunti zigoti erano inclusi in un doppio strato di agar (PBS-Ca free + 1% - 1,2% agarose) e trasferiti chirurgicamente nelle
tube di una pecora in fase non estrale, trattata con una spugna intravaginale di FGA da 40mg. Gli
embrioni erano quindi recuperati al 7°gg dal trasferimento, tramite lavaggio intra-tubarico (flushing), con medium TCM199 + BSA.
Risultati - Su n.162 oociti maturati in vitro, n.122 hanno raggiunto lo stadio MII (75.3%). Di questi n.42 sono stati sottoposti ad ICSI, n.39 (92.8%) trasferiti in tube di pecora e n.38 (97.0%) recuperati tramite flushing. Dei n.38 oociti fertilizzati e recuperati, n.9 si trovavano allo stadio di morula (23.6%) e n.2 di blastocisti (5.2%) di buona qualità. Il resto degli oociti (n.27; 71.0%) apparivano, dopo il recupero, indivisi o degenerati (membrana citoplasmatica rotta e/o citoplasma frammentato). La morula compatta e le due blastocisti sono state trasferite, con catetere intra-uterino, in
due diverse fattrici (razza Giarab), al 5°-6°gg dall’ovulazione. Le rimanenti morule (n.8) erano vitrificate secondo il protocollo utilizzato per le blastocisti di pecora da Dattena e coll, 2004. Al 7°gg
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e al 14°gg dal trasferimento nella fattrice è stata eseguita la diagnosi di gravidanza mediante ecografia trans-rettale, con esito negativo in entrambi gli animali.
Conclusioni - La percentuale degli oociti che raggiunge lo stadio di maturazione in vitro (75.3%
MII) e quella dei presunti zigoti recuperati dopo flushing (97.0%) è risultata simile a quella riportata in altri lavori (Choi et al., 2002; Lazzari et al., 2002). Al contrario l’efficienza nella produzione di embrioni dopo ICSI (28.9%) è risultata bassa se si fa riferimento ad autori che utilizzano la
tecnica dell’ICSI coadiuvata dal piezo-stepper (Lazzari et al., 2002; Galli et al., 2002), ma è simile se ci si raffronta con i dati ottenuti dagli stessi senza il sistema piezo (circa 24%). Tale tecnica,
infatti, controlla l’intensità d’iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo e risulterebbe quindi
meno traumatica per gli ovociti, aumentando le probabilità di sopravvivenza dei futuri embrioni.
Bibliografia
Squires et al., Theriogenology 59, 151-170, 2003; Lazzari et al., Theriogenology 58, 709-712, 2002; Galli et al., Theriogenology 58, 705-708, 2002; Galli et al., Proceed Int Symp on Eq Embryo Transf, 2000; Choi et al., Reproduction 123,
455-465, 2002.
Indirizzo per la corrispondenza/Address for correspondence:
Antonio Corona
Centro di Riproduzione Equina – Istituto Incremento Ippico della Sardegna
P.zza D. Borgia 4 - 07014 Ozieri
Tel.: 079 783027 - 781613 - Fax: 079 783380
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