Rita Tognellini

Perugia, 08.10.13
Il RISCHIO CLINICO
nel PROCESSO di DONAZIONE PRELIEVO
e TRAPIANTO di ORGANI e TESSUTI
HLA: RILEVANZA NEL TRAPIANTO DI ORGANI SOLIDI
Rita Tognellini
1
In ogni discussione sulla rilevanza clinica del sistema
HLA nel trapianto di organi devono essere valutati
alcuni aspetti:
Compatibiltà HLA, Human Leukocyte Antigen: quale è il ruolo della
compatibilità HLA , rispetto al verificarsi di rigetto acuto o cronico , in termini di
sopravvivenza al primo trapianto o ad un ritrapianto?
Alloreattività:Qual è il ruolo della risposta umorale e cellulare nel rigetto acuto
e cronico?
Diagnostica:quali sono di fatto le implicazioni del sistema HLA per la
diagnostica di laboratorio nel trapianto di organi?
Allocazione di organi: Quali sono le conseguenze del ruolo immunologico del
sistema HLA per la allocazione degli organi?
2
Il laboratorio HLA nel trapianto di rene
Tre test chiave:
Tipizzazione HLA su ricevente e donatore
Ricerca anticorpi anti-HLA pre e postTrapianto
Crossmatch, cellule T e B
3
Nell’uomo il Complesso Maggiore di Istocompatibilità, Major
Hitocompatibility Complex, MHC, è localizzato nel braccio corto del
cromosoma 6
Questi sono i nostri HLA (Human Leukocyte Antigen)
I primi tre geni definiti sono HLA-A, HLA-B, HLA-C: identificati come geni MHC di classe I responsabili del
rigetto nel trapianto(non-self).
I geni geni MHC di classe II responsabili della produzione di anticorpi sono HLA-DR, HLA-DP, HLA- DQ.
1
4
Funzioni MHC I
Nell’ambito della sorveglianza immunitaria, le molecole MHC
di classe I(HLA-A,B,C) , espresse sulla maggior parte delle
cellule nucleate, hanno la funzione di presentare antigeni
endogeni, es. peptidi virali o antigeni tumorali, alle cellule T
CD8+ che hanno azione citolitica.
5
Le molecole MHC di classe II(HLA-DR,DQ) sono espresse sulle
APC (macrofagi, linfociti B e cellule dendritiche) e presentano
proteine esogene, es. proteine batteriche o capsidi virali, alle
cellule T helper CD4+ che a loro volta tramite citochine attivano i
linfociti CD8 (citotossici) e i linfociti B (attivati a plasmacellule
sintetizzanti Ab).
6
Il fine ultimo dell’MHC (Major Histocompatibility
Complex) è quindi la “difesa” dell’integrità
individuale di ogni organismo vivente da possibili
agenti nocivi (patogeni).
Poiché tutto ciò che è “altro da sé” (not self) è
potenzialmente nocivo, le molecole MHC devono
essere in grado di riconoscere e mediare la
distruzione di un numero elevatissimo di patogeni.
A questo provvede il polimorfismo.
7
P
O
L
I
M
O
R
F
I
S
M
O
MHC: il sistema più polimorfico tra
quelli conosciuti:
•POLIGENIA
molti geni, raggruppati in loci
•POLIALLELIA
geni con molte varianti dovute a
differenze nella sequenza di DNA
8
TIPIZZAZIONE HLA SIEROLOGICA mediante CDC:
TEST DI MICROLINFOTOSSICITA ’COMPLEMENT DIPENDENTE:
Principio del Test:Reazione di linfocitotossicità mediata da anticorpi specifici in
presenza di complemento
Miniaturizzazione del test
- uso di micropiastre e microsiringhe
- uso di piccole quantità di reagenti rari
Riproducibilità
FATTORI CRITICI:
Cellule:
- Vitalità >80%
- Purezza
- Bassa espressione degli antigeni sulla superficie dei linfociti (Blank), quindi..
Complemento:
- Citotossicità aspecifica
- Attività specifica contro i linfociti T e B
Sieri:
- Deve essere ben conosciuta la specificità ed il titolo anticorpale
- Non c’è nessuna piastra del commercio che possa essere definita ottimale
9
IMGT/HLA Database
RELEASED Luglio 2013
Allele Information
HLA Class I Alleles:
7.353
HLA Class II Alleles:
2.202
9.555
HLA Alleles:
HLA Class I
Gene
A
B
C
E
F
G
Alleles
2,365
2,365
2,365
2,365
2,365
2,365
Proteins
1,695
1,695
1,695
1,695
1,695
1,695
Nulls
133
98
49
0
0
2
DRA
DRB
DQA1
HLA Class II
Gene
DQB1
DPA1
DPB1
Alleles
7
1,456
51
416
37
190
Proteins
2
1.076
32
277
19
147
Nulls
0
33
1
10
0
6
10
• Tipizzazione molecolare:
• Low res
( studio della famiglia allelica) Permette una risoluzione ad 1 campo
(2 digits)Per es. A*01,*02; B*07; si identificano solo le specificità
“Broad”<,supertipiche
metodica SSP Reazione di polimerizzazione a catena con primers sequenza
specifica che prevede l’uso di coppie di primers sequenza specifica che
riconoscono in modo specifico un allele o un gruppo di alleli.
La più usata per la tipizzazione donatore/ricevente nel trapianto di organi solidi:se un
campione risulta omozigote (Blank sierologico) o se la tipizzazione sierologica non è chiara
metodica SSO
che prevede l'uso di oligonucleotidi sequenza specifici(sonde)in grado di ibridarsi,
in appropriate condizioni, ad un filamento di DNA complementare alla loro sequenza.
È un ottimo metodo per la tipizzazione molecolare a bassa e a media risoluzione di un grande numero di
campioni, Non può essere utilizzato per analisi individuali o urgenti.
• High Res
(studio dei singoli alleli) : Permette una risoluzione dell’allele a più
campi Es A*02:01:01 :02 : permette di suddividere ciascuno degli alleli
identificatiin alleli subtipici.
metodica SSP
Sequenziamento diretto geni HLA è la determinazione dell'ordine dei diversi nucleotidi (A,C,G,T) quindi
delle quattro basi azotche li differenziano . Il suo vantaggio principale risiede nella sua capacità di
distinguere tutte le diverse varianti di un particolare gene HLA.
11
“Rischio” nellaTipizzazione HLA
Nella fase pre analitica è importante:
•
Corretto Prelievo
•
Corretta etichettatura del campione (dati anagrafici, data di prelievo e firma del prelevatore)
•
Se viene usata più di una provetta ciascuna di essa deve riportare la stessa etichetta
Nella fase analitica è importante:
•
Uso di reagenti ( piastre tipizzanti , kit x tipizzazione molecolare L.R…) sottoposti a controlli di qualità per
garantirne la funzionalità prima del loro utilizzo routinario (Standard EFI)
•
EVITARE FALSE REAZIONI NEGATIVE(Bassa temperatura di incubazione; incubazione insufficiente; alta concentrazione
linfocitaria;lettura precoce; ) E FALSE REAZIONI POSITIVE (alta temperatura di incubazione:incubazione troppo lunga; carry over;
complemento citotossico;
•
corretta interpretazione del risultato ( possibilmente2 operatori)
Nella fase post analitica è importante:
•
corretto inserimento del risultato sia del Ricevente che del Donatore
lista di attesa
nell SFW di gestione della
…
e poi altro ancora
Come consigliato dalle linee guida del CNT è opportuno ricontrollare la tipizzazione HLA del paziente in
lista di attesa , su due prelievi diversi ; se iscritto in altro CT , confrontarla.
12
•
La compatibilità HLA rimane uno dei criteri biologici cardine , insieme
alla compatibilità AB0, alla immunizzazione ed al Cross match, per
compilare una graduatoria dei riceventi e quindi per gestire le liste di
attesa:
•
Tutti valutano il match tra donatore e ricevente per gli antigeni HLA-A,B e DR, dove la
compatibilita’ per il locus HLA-DR ha un effetto > rispetto a quella per HLA-B, che a sua
volta ha un peso> rispetto alla compatibilita’ per HLA-A
Ma non è tutto..
•
Altro criterio biologico molto rilevante nella procedura di allocazione dei reni è lo stato di
immunizzazione dei Pazienti in lista
•
Nel Paz. Trapiantato di rene, il rigetto rappresenta una delle cause principali di perdita precoce dell’organo:
in questo contesto negli ultimi anni è diventato sempre più evidente il ruolo fondamentale degli Ab nella
risposta immunitaria diretta contro l’organo trapiantato :
13
14
Una ricerca di anticorpi positiva:
Riduce la probabilità del trapianto
Allunga l’attesa
Riduce il successo del trapianto
15
Forme di rigetto mediato da anticorpi:
•
Rigetto Iperacuto (occlusione trombotica dei vasi del rene tx dopo alcuni minuti o ore dalla rivascolarizzazione): causato di
solito dalla presenza di Ab donatore specifici , DSA, diretti contro gli Ag HLA e non HLA esistenti PRIMA del tx .
Per questo motivo la presenza di Ab anti-HLA don-specifici DSA e Cross-match Positivo rappresenta
una controindicazione al TX.
•
Rigetto acuto anticorpo-mediato (AMAR)
•
Rigetto cronico anticorpo-mediato (CAMR)
si sviluppa tipicamente tra la prima e la terza sett post-tx . Per anni è stato
considerato un processo unicamente mediato dai linf. T , in realtà può provocato da Ab che si sono sviluppati a seguito del TX, ma
anche dagli Ab sia esistenti a basso titolo prima del Tx che neoformati dal ricevente
I meccanismi che portano al rigetto cronico ancora incerti anche se è noto che ne siano responsabili sia fattori immunologigici
che non immunologici.
Recenti studi hanno dimostrato che la presenza di Ab anti-HLA allospecifici in soggetti con funzionalità renale normale può
essere associata ad un danno tissutale e funzionale con prematura perdita dell’organo trapiantato .
Numerosi altri studi concordano nell’osservare che la presenza di tali Ab non è necessariamente associata ad una perdita di
funzionalità.
Gli Ab in questo caso potrebbero contribuire ad un lento e pregressivo deterioramento intimale della parete dei vasi che solo
successivamente sfocerà in una insufficienza d’organo conclamata
16
Tecniche usate per determinare anticorpi anti HLA
2 metodi principali:
Serology
Complement-dependent
cytotoxicity (CDC)
CDC-anti-human globulin (CDCAHG)
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Solid
phase
Single antigen beads
Flow
cytometry
Luminex
17
• TECNICA CDC: RICERCA ANTICORPI
• SPECIFICITA’ ANTI-HLA:diretta contro antigeni di classe I
e/o II
• TITOLO:PANEL REACTIVE ANTIBODY (PRA %)
P Panel - pannello di linfociti selezionato e random
R Reactive - % di cellule del pannello riconosciute dal siero
A Antibodies - Ab anti-HLA
• ISOTIPO: IgG - IgM
18
Livello Sensibilità →
Tecniche usate per determinare anticorpi
anti HLA
Sierologia
CDC
Fase solida
LUMINEX
19
Scala di sensibilità per tipo di prodotto usato in Luminex
Higher Sensitivity
Single Antigen
Identification
Screen
Lower Sensitivity
20
Un singolo evento di sensibilizzazione può essere
legato a specificità anticorpale multipla
Tipizzazione
Donatore:
Tipizzazione
ricevente:
A1,A2
B7,B8
A1,A3
B8, B52
+
Anti-A2
Anti-B7
21
Sensibilizzazione ad antigeni HLA multipli da
singolo trapianto
B57
A68
Anti A2
A23
A28
A69
A24
B58
+
B42
B55
B13
Anti B7
B27
B60
Causato da epitopi condivisi con il donatore
B48
B61
B47
B54 B41
22
La elevata sensibilità della tecnica luminex pone alcuni “ problemi”:
•
oltre ad evidenziare Ab anti-HLA nonDSA, ma che condividono con questi epitopi, può
mettere in evidenza anche Ab anti-HLA in soggetti maschi mai trasfusi e mai trapiantati.
Da:
“Natural”Human Leukocyte Antigen Antibodies Found in Nonalloimmunized Healty Males
L.E.Morales-Buenrostro,P.I.Terasaki,L.A.Marino-Vazquez,J.H.Lee,N.El-Awar,and J.Alberu. Transplantation 2008
Sono stati studiati 424 uomini, non alloimmunizzati , messicani
63% positivo per anticorpi anti-HLA
Sono Ab ” naturali” che presentano caratteristiche peculiari:
Diretti contro Ag presenti nell’ambiente e cross-reagenti con epitopi HLA
Cross-reattività con microrganismi, proteine ingerite, allergeni
Frequenze variabili verso specificità dei diversi loci HLA, ma comunque poco frequenti
(A*30,A33,B76,B*:0182:01,DPA1*02)
Conseguenze cliniche ?
L’esecuzione del cross-match pre-Tx è prevalentemente CDC: non allineamneto fra tecniche
di rilevaziobe di Ab al momento del Tx rispetto a quelle in uso prima di esso (LUMINEX).Per
questo se il Cross-match è eseguito in CDC, è indicato eseguire almeno una volta all’anno la
ricerca degli Ab anti-HLA dei Paz in lista con la medesima tecnica.
23
Strategia di laboratorio nei pazienti immunizzati e non
• Escludere la presenza di autoanticorpi
• Se presente alloreattività:
Definire la specificità anticorpale
Definire il profilo antigenico accettabile del donatore
(Ag proibiti)
24
PROTOCOLLO DI INVIO SIERI e RICERCA/IDENTIFICAZIONE Ab Anti-HLA
PAZIENTI IN LISTA ATTIVA
ALL’INSERIMENTO:
•
Ricerca Autoanticorpi in CDC
•
Ricerca alloanticorpi in CDC e LUMINEX
PAZIENTI
•
Nel 1°
•
Dal 2°
•
Dal 3°
MANTENIMENTO IN LISTA:
ogni 3 mesi in LUMINEX
1 volta all’anno in CDC
dopo 15gg da ogni evento immunizzante in
LUMINEX
TRAPIANTATI:
anno dal trapianto: ogni mese in LUMINEX
anno dal trapianto: ogni 6 mesi in LUMINEX
anno dal trapianto in poi: 1 volta all’anno
25
La prova di compatibilità
pre-trapianto :
Cross-Match
Metodica di riferimento;Linfocitotossicità complemento-dipendente (CDC)
Siero ricevente
vs
standard
• lunga incubazione
• siero antiglobuline
• DTT
cellule donatore
(T e B linfociti)
Anticorpi donatore specifici
26
Come tutto è cominciato ...
RIGETTO
Cross-match
POSITIVO
Cross-match
NEGATIVO
(entro le 48 h)
24
NO RIGETTO
6
(80%)
(20%)
8
187
(4%)
(96%)
27
Patel, Terasaki. New Engl J Med 1969;280:735.
Crossmatch
• Un crossmatch positivo in CDC con le cellule
T / Totali del donatore controindica
trapianto.
• Un crossmatch positivo con i linfociti B
controindica il trapianto se la reattività può
essere giustificata dalla presenza di anticorpi
antiHLA di classe I e di classe II rivelati nel
ricevente anche con tecnologie Luminex.
• In caso di secondo trapianto, un cross match
negativo con i linfociti B del donatore fornisce
maggiore sicurezza.
28
“Rischio” nello studio dei sieri e nel Cross-Match
Nella fase pre analitica è importante:
• Corretto invio dei sieri
• Corretta etichettatura del campione per la conservazione per
esecuzione Cross-match
•
•
Nella fase analitica è importante:
Uso di reagenti sottoposti a controlli di qualità per garantirne la
funzionalità prima del loro utilizzo routinario (Standard EFI)
Corretta” disposizione” dei sieri nel Cross-Match
corretta interpretazione del risultato ( possibilmente2 operatori)
•
Nella fase postanalitica è importante:
corretto inserimento del risultato nel software gestionale
•
29
:
Per concludere
Laboratorio HLA è coinvolto
nel RISCHIO PRE-PRELIEVO:
•TipizzazioneHLA ricevente
•Studio anticorpale
nel RISCHIO DOPO TRAPIANTO:
•Monitoraggio Ricerca Ab Anti-HLA
nel RISCHIO DURANTE TRAPIANTO:
•Tipizzazione HLA Donatore
•Cross-Match
30
Grazie per l’attenzione
Servizio di Immunoematologia e Trasfusionale
Primario Dr .Mauro Marchesi
Laboratorio di Immunogenetica e Biologia dei Trapianti
Responsabili:Dr.ssa Brunella Malagigi Dr.ssa Rita Tognellini
Dr.ssa Federica Alunni
Dr.ssa Paola Girardi
Dr.ssa Isabella Giubbini
Struttura di Riferimento Regionale Trapianti
Responsabile: Dr.ssa Tiziana Garzilli
Dr. Atanassios Dovas
I.P. Emanuela Salamanca
31