Cap-Plus™ Detection Kit - Thermo Fisher Scientific

Transcript

Cap-Plus™ Detection Kit
For Use with Capilliary Gap-Based Immunohistochemistry Staining Systems
CAT. NO.
87-8143
FOR PRIMARY ANTIBODY
Broad Spectrum*
CHROMOGEN
DAB
GOOD FOR
600 slides
*Will react with mouse, rabbit, guinea pig and rat primary antibodies.
INTENDED USE
For In Vitro Diagnostic Use. Interpretation must be made within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a qualified
pathologist.
Invitrogen’s Cap-Plus™ Detection Kit is intended for use on automated capillary gap-based immunohistochemistry stainers such as the Ventana®
TechMate®. This kit requires the use of the companion Cap-Plus™ Buffer Kit. Frozen or paraffin-embedded tissues, freshly prepared lymphocytes,
and fixed cultured cells can be used.
BACKGROUND
The Cap-Plus™ Detection Kit uses Invitrogen’s 2nd Generation Labeled Streptavidin-Biotin (LAB-SA) detection technology. The LAB-SA method,
also known as the Streptavidin-Peroxidase (SP) and Streptavidin-Alkaline Phosphatase (SAP) methods,(1) is illustrated in Figure 1. This method is
currently preferred in the immunohistopathology laboratory due to its high sensitivity, low background, ease-of-use, and short protocol times. The
interpretation of immunostaining results is complemented by positive and negative controls.
Tissue specimens should be pre-incubated with blocking reagents to reduce nonspecific background immunostaining. Specific immunostaining is
accomplished by localizing the antigens with a primary antibody. The antigen-antibody complex is identified using a LAB-SA biotinylated secondary
antibody detection method. When using the LAB-SA method, a biotinylated secondary antibody will bind to the primary antibody that is complexed
with the antigen. A streptavidin-enzyme conjugate is then added which binds to the biotinylated secondary antibody. A chromogen/ substrate solution
is added that forms a colored deposit in the presence of the enzyme. The Cap-Plus™ Kit uses DAB substrate (3,3’ diaminobenzidine) as the chromogen.
DAB results in the deposit of a brown insoluble precipitate at the antigenic sites containing the specific epitopes recognized by the primary antibody.
The location of the antigen is then revealed by the presence of this colored deposit that forms around it.
STORAGE AND SHELF LIFE
Store kit at 2-8°C. All performance claims are void after kit expiration date.
REAGENTS SUPPLIED
Reagent A. One bottle (110 mL) of ready-to-use serum blocking solution
Reagent B. One bottle (110 mL) of ready-to-use biotinylated secondary antibody
Reagent C. One bottle (110 mL) of ready-to-use streptavidin-HRP-conjugated tertiary antibody
Reagent D1. One dropper bottle (15 mL) of concentrated substrate buffer (20x)
Reagent D2. One dropper bottle (15 mL) of concentrated chromogen solution, DAB (20x)
Reagent D3. One dropper bottle (15 mL) of 0.6% hydrogen peroxide (20x)
*Prepare DAB by adding 1 drop each of Reagents D1, D2, and D3 to 1 mL of H2O. Mix well. Protect
from light and use within 4 hours. All other reagents are ready-to-use.
REAGENTS AND MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
– Cap-Plus™ Buffer Kit (Invitrogen Cat. No. 87-0003)
– Xylene and ethanol
– Distilled or deionized water
– HistoGrip™ (Invitrogen Cat. No. 00-8050) microscope slide adherence treatment
– Primary antibody
– Capillary Gap-based Automated Immunostainer
– Reagent Wicking Pads
– Positive and Negative Tissue Controls
– Negative Control Reagent
– Hematoxylin (Invitrogen Cat. No. 00-8001)
– Mounting Media
Clearmount™ (Invitrogen Cat. No. 00-8110) or
Histomount™ (Invitrogen Cat. No.00-8030)
Figure 1. Labeled StreptavidinBiotin (LAB-SA) Method
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these products you accept the terms and conditions of all applicable Limited Use Label Licenses.
SUGGESTED STAINING PROTOCOL
A. PRELIMINARY PREPARATION OF SLIDES
-Appropriate tissue and antigen fixation is required to obtain reproducible performance and reliable
1. SPECIMEN PREPARATION
2. SLIDE PREPARATION
interpretations. Suitable fixatives include: 10% neutral buffered formalin, B5, Bouin’s, Zinc formalin or
alcohol-base fixatives.
- Cell smears prepared from body fluids should be made to assure a monolayer of cells. Smears should be
fixed immediately after preparation. Depending on the properties of the antigen, cell smears are usually
stable for one to two weeks when stored at 4°C.
- Fixation of cytospin or frozen sections can be done with acetone (100%) at 4°C for a period of 10 minutes.
- To relax the specimens, place tissue sections into a container of deionized or distilled water preheated to
40-44oC. Then center the flat and wrinkle free sections onto a microscope slide treated with HistoGrip™.
Proper placement will assure proper capillary action when two microscope slides are placed facing each
other in the slide holder.
-Precoat slides with HistoGrip™ (Invitrogen Cat. No. 00-8050). As an alternative, precoat with 0.1% polyL-lysine in water, then air dry.
-Paraffin sections are deparaffinized with xylene and rehydrated in a graded series of ethanol. Wash cell
smears or tissue in a PBS bath for 10 minutes before starting the staining procedure.
3. DEPARAFFINIZATION AND
REHYDRATION
Note: Do not allow specimen or tissue sections to dry from this point on.
SUGGESTED STAINING PROTOCOL CONTINUED
B. PROTOCOL FOR TECHMATE® AUTOMATED IMMUNOSTAINERS
This kit is designed to be used in the same way as ChemMate® kits. In many cases, this kit can be used in your current protocol without
any changes. The following steps may be used as a guideline for running the Cap-Plus™ Detection Kit on Ventana® TechMate®
Automated Immunostainers. For complete details refer to the appropriate Ventana® TechMate® User Manuals. This Cap-Plus™
Detection Kit can also be used with other automated immunostainers using capillary gap technology. Please call Invitrogen’s Technical
Service Department at 800-874-4494 for further details.
PREPARATION FOR AUTOMATED IMMUNOSTAINING
1. Tissues should be mounted on microscope slides coated with HistoGrip™ (Invitrogen Cat. No. 00-8050) or poly-L-lysine.
2. Just prior to using the microscope slides, the tissue sections should be thoroughly dried with a conventional or microwave oven.
This will eliminate the “water spotting” phenomenon when viewing the results. In a conventional oven, dry tissue sections on the
microscope slides by heating them in an oven at 60oC for a minimum of 60 minutes. In an 800-watt microwave oven, place the
microscope slides in a plastic slide holder at the center of the turntable and dry the slides for 2-3 on high power. Note: As a safety
precaution place a separate water reservoir, at the same time, in the microwave oven. Carefully remove the slide holder and allow the
melted paraffin to congeal before proceeding.
3. Deparaffinize tissue sections according to your approved laboratory procedures. (if not available see Table 2 in Appendix A). After
deparaffinization, keep tissues wet in Buffer 2 from the Cap-Plus™ Buffer Kit. Slides should be immunostained on same day that they
are deparaffinized.
4. Perform any required tissue preparation steps such as: epitope retrieval (see Table 3 in Appendix A), avidin/biotin blocking, tissue
digestion, etc. Consult your antibody specification sheets.
5. Group microscope slides by antibody.
6. Determine the total number of slides to be run and then determine the total number of Ventana® TechMate® slide holders required.
Use one slide holder per protocol.
7. Organize microscope slides for each Ventana® TechMate® slide holder using the Ventana® Antibody Positioning Sheet that is
provided in the user’s manual.
8. Load slides according to Ventana® Antibody Positioning Sheet.
9. The microscope slides are now ready to begin automated immunostaining.
CREATING THE USER DEFINED PROTOCOL
1. Status area of Map View Screen: move the mouse cursor to the column identified as LOAD. Click the mouse once. A predefined
protocol list appears.
2. Find the MIP protocol by using the scroll bar. Move the cursor to this protocol. Click the mouse once to highlight. The MIP
protocol should now appears in the File box.
3. On the smaller Load box, just below the File box, click once. A yellow blinking box appears on the Map View Screen indicating
that this protocol is loaded. The mouse cursor can now be moved over to the position on the Map View Screen corresponding to the MIP
protocol. Click the mouse once.
4. The desired template will immediately load and the Ventana® TechMate® tile area is labeled with the reagents that are required for
each of the tiles. Also, the protocol is loaded. The RUN button should now be red to indicate successful loading of the protocol.
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Template Abbreviations for the Ventana® TechMate®
BLOK Ab:
Blocking Solution
HP BLOK:
Hydrogen Peroxide Block
AB1:
Primary Antibody or Negative Control
AB2:
Biotinylated Secondary Antibody
ABC:
Enzyme Conjugate (the Cap-Plus™ kit uses streptavidin-HRP, no pre-mixing is necessary)
DAB:
DAB chromogen/substrate (see reagent preparation)
STN:
Hematoxylin
PAD:
Wicking Pads
BUF1:
Buffer 1
BUF2:
Buffer 2
BUF3:
Buffer 3
H20
Wash Water
The reagent trays are now ready to be loaded.
LOADING THE USER DEFINED REAGENT TRAYS
1. Complete an Antibody Positioning Sheet to determine which microscope slide goes into which slide holder.
2. Insert the microscope slide pairs, previously formed in the 10-well reagent trays, into the slide holder according to the Antibody
Positioning Sheet. Note: The slide pairs will use the same primary antibody.
3. Prepare reagent trays and place them onto the “tiles” of the immunostainer’s platform. The number of trays prepared equals the
number of paired slides to be run. The computer screen will show the template for reagent placement when the immunostainer’s protocol
is loaded. Then, fill a 10-well tray with each of the following reagents according to Table 1.
Table 1. Requirements for Each Reagent Tray
Cap-Plus Reagent
Template
Abbreviation
Blocking Solution
BLOK AB
Primary Antibody or
AB1
Negative Isotype Control
Biotinylated Secondary Antibody
Hydrogen Peroxide Block
Streptavidin-HRP
DAB Chromogen/Substrate
Hematoxylin
Buffers 1
Buffers 2
Buffers 3
Wash Water
AB2
HP BLOK
ABC
DAB
STN
BUF1
BUF2
BUF3
H20
Volume
Incubation Time
8 Drops/well
8 Drops/well
or at least 350 μL/well
10 minutes
8 Drops/well
10 mL/tray
8 Drops/well
0.75 mL/well
10 mL/tray
25 mL/tray
25 mL/tray
25 mL/tray
25 mL/tray
25 minutes
25 minutes
3 x 5 minutes
RUNNING PROTOCOL
1. Position the mouse pointer over the RUN button of the Status Area. Click the mouse once. The RUN button that turned red after the
reagent protocol was loaded should now be green, indicating that the MIP immunostainer protocol has been started.
If the slides were not counterstained on the TechMate®, after the TechMate® protocol has finished, the slides can be removed and
manually counterstained and coverslipped if desired. (See Table 4 in Appendix A).
SAFETY AND PRECAUTIONS
1. Take ample precautions when handling reagents. Use disposable gloves, coat, and safety glasses when handling suspected
carcinogens.
2. After use, store as specified. Any storage conditions other than those specified in the package insert must be validated by the user.
3. Avoid contact of eyes and mucous membranes with these reagents. If these reagents come in contact with sensitive areas, wash
with generous amounts of water.
4. DAB may be carcinogenic. Wear gloves when handling DAB and avoid contact with skin. Do not inhale or ingest.
5. Proclin (0.1%) is used as a preservative. Proclin is toxic if ingested.
6. Consult Federal, State or local regulations for disposal of any potentially toxic components.
7. Patient specimens and all materials coming into contact with them should be handled as if capable of transmitting infection, and
disposed of with proper precautions. Never pipette by mouth, and avoid contact of this reagent and tissue specimens with skin and
mucous membranes.
8. CLIA regulations should be followed in all applicable situations.
9. These reagents are optimally diluted. Further dilution may result in loss of antigen immunostaining.
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APPENDIX A.
Table 2. Deparaffinization
Xylene
5 minutes x 2
100% Absolute Alcohol
3 minutes x 2
95% Alcohol
3 minutes
80% Alcohol
3 minutes
3% H2O2 in Absolute Methanol
3 minutes
Running Water or PBS, pH 7.4
5 minutes
Table 3. Heat Induced Epitope Retrieval
Wash slides with reagent water
2 minutes x 3
Put slides in slide rack and place in a 1L glass beaker (Pyrex) containing 500 ml
of working solution of appropriate HIER buffer
Place beaker on hot plate and heat until it boils
10 minutes
After heating, remove beaker from the hot plate and allow cooling at room
temperature
At least 20 minutes
Rinse slides with PBS, pH 7.4
Table 4. Counterstaining & Preservation
Counterstain with hematoxylin
Wash in tap water with several changes until water bath remains clear
Place in blueing solution (i.e., 10 mM PBS, pH 7.4) with 2 changes
Wash in distilled water with 2 changes
Dehydrate sequentially in 70%, 95%, 95%, 100%, and 100% EtOH. Then in xylene
and xylene. (Do not dehydrate when using AEC)
Apply coverslip with Histomount™ Mounting Solution
(Use GVA Mounting Solution when using AEC)
Allow to dry before viewing by light microscopy
1-2 minutes
15-20 seconds
3 minutes total
2 minutes each
10 minutes
APPENDIX B.
Table 5. General Immunohistochemistry Troubleshooting
Problem
l Probable Cause
1. Concentration of the primary antibody
2. Incubation time of primary antibody and substrate too long
3. Reaction temperature too high
Overstaining
Background
Weak immunostaining
1. Concentration of the primary antibody
2. Endogenous peroxidase, endogenous biotin, or alkaline phosphatase in tissue
3. Nonspecific protein binding in tissue
4. Incomplete deparaffinization
5. Inadequate use of rinse buffer
6. Substrate reaction too long
7. Soluble antigen present in tissue
1. Concentration of primary antibody
2. Incubation time of primary antibody too short
3. Sodium azide present in peroxidase label
4. Excessive use of rinse buffer causing dilution of reagents
5. Incompatible counterstain or mounting media which dissolves reaction product
6. Substrate expired
No Immunostaining
1. Incorrect procedure
2. Tissue dried during immunostaining procedure
3. No antigen present in tissue
Positive Control
Immunostaining Only
1. Improper tissue preparation
2. No antigen present in tissue
3. Antigen masked by formalin fixation or denatured by formalin fixative or paraffin embedding
4. Excessive autolysis of tissue
5. Tissue exposed to temperatures above 60oC
TRADEMARKS
Ventana®, ChemMate®, and TechMate® are trademarks of Ventana® Medical Systems, Inc. Invitrogen, Cap-Plus™, Histomount™, and HistoGrip™ are trademarks of
Zymed® Laboratories, Inc. The Cap-Plus™ Detection Kit was developed solely by Zymed® Laboratories, Inc. and does not imply approval or endorsement by Ventana®
Medical Systems, Inc. Zymed® and Ventana® are not affiliated, associated or related in any way.
Authorized Representative for IVDD 98/79/EC: Invitrogen Ltd., Inchinnan Business Park, 3 Fountain Drive, Paisley, PA4 9RF, UK
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Cap-Plus™ Equipo de detección
Para usar en sistemas capilares de tinción inmunohistoquímica basada en huecos ("gaps")
CAT Nº
87-8143
PARA ANTICUERPO PRIMARIO
Amplio espectro*
CROMÓGENO
DAB
SIRVE PARA
600 portas
*Reaccionará con anticuerpos primarios de ratón, conejo, cobayo y rata.
INDICACIONES
Para utilización en diagnóstico in vitro. La interpretación de los resultados debe realizarla un patólogo cualificado, dentro del contexto de la historia
clínica del paciente y otras pruebas diagnósticas. El Equipo de detección Cap-Plus™ de Invitrogen está diseñado para utilizar en sistemas capilares de
tinción inmunohistoquímica automatizados basados en huecos, como el Ventana® TechMate®. Este equipo requiere la utilización de su compañero, el
Equipo tampón Cap-Plus™. Se pueden utilizar cortes congelados o infiltrados en parafina, linfocitos recién preparados y cultivos celulares con fijación.
ALMACENAMIENTO Y VIDA ÚTIL EN DEPÓSITO
Guardar el equipo entre 2 y 8 °C. Todas las especificaciones sobre su rendimiento pierden validez una vez transcurrida la fecha de caducidad del
equipo.
REACTIVOS PROVISTOS
Reactivo A. Un frasco (110 mL) de solución bloqueante de suero lista para su uso.
Reactivo B. Un frasco (110 mL) de anticuerpo secundario biotinilado listo para su uso.
Reactivo C. Un frasco (110 mL) de anticuerpo terciario estreptavidina-HRP conjugado listo para su uso.
Reactivo D1. Un frasco gotero (15 mL) de tampón sustrato concentrado (20x).
Reactivo D2. Un frasco gotero (15 mL) de solución de cromógeno concentrado (DAB).
Reactivo D3. un frasco gotero (15 mL) de peróxido de hidrógeno al 0,6% (20x).
* Prepare DAB agregando 1 gota de cada uno de los Reactivos D1, D2, y D3 a 1 ml de H2O. Mezclar bien. Proteger de la luz y usar dentro de un periodo de 4
horas. Los demás reactivos están listos para su uso.
REACTIVOS Y MATERIALES NECESARIOS PERO NO PROVISTOS
– Equipo tampón Cap-Plus™ (Invitrogen Cat. Nº 87-0003)
– Xileno y etanol
– Agua destilada o desionizada
– HistoGrip™ (Invitrogen Cat. Nº 00-8050) tratamiento de adherencia del portaobjeto
– Anticuerpo primario
– Inmunocolorante capilar automatizado basado en huecos
– Almohadillas para la penetración capilar del reactivo
– Controles tisulares positivos y negativos
– Reactivo para control negativo
– Hematoxilina (Invitrogen Cat. Nº 00-8001)
– Medio de montaje
Clearmount™ (Invitrogen Cat. Nº 00-8110) o
Histomount™ (Invitrogen Cat. Nº 00-8030)
PROTOCOLO DE TINCIÓN RECOMENDADO
A. PREPARACIÓN PREVIA DE LOS PORTAS
-Se requiere la fijación adecuada de tejidos y antígeno para obtener un rendimiento reproducible e
1. PREPARACIÓN DE LA
interpretaciones fiables. Los fijadores adecuados incluyen: formalina tamponada neutra al 10%, B5, fijador
MUESTRA
2. PREPARACIÓN DEL PORTA
3. DESPARAFINIZACIÓN Y
REHIDRATACIÓN
de Bouin, formalina-zinc o fijadores a base de alcohol.
- Se deben realizar frotis celulares preparados a partir de fluidos corporales para asegurar un plano único de
células. Los frotis se deben fijar inmediatamente después de la preparación. Dependiendo de las
propiedades del antígeno, los frotis celulares, cuando se guardan a 4 °C, suelen mantenerse estables durante
una o dos semanas.
- La fijación de citospina o cortes congelados se puede realizar con acetona (100%) a 4 °C por un período
de 10 minutos.
- Para relajar las muestras, colocar los cortes de tejido en un contenedor con agua desionizada o destilada
precalentado a 40-44 oC. A continuación, centrar los cortes planos y sin arrugas en un porta para
microscopio tratado con HistoGrip™. Una adecuada colocación asegurará una acción capilar correcta al
situar dos portas enfrentados en el portaobjeto.
-Cubrir antes los portas con HistoGrip™ (Invitrogen Cat. Nº 00-8050) Como alternativa, cubrir antes con
poli-L-lisina al 0,1% en agua y luego dejar secar al aire.
-Los cortes de parafina se desparafinizan con xileno y rehidratan en una serie de etanol graduado. Lavar los
frotis de células o tejido en un baño de PBS durante 10 minutos antes de comenzar el procedimiento de
tinción.
Nota: No permita que la muestra o los cortes de tejido se sequen a partir de este momento.
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PROTOCOLO RECOMENDADO DE TINCIÓN CONTINUADA
B. PROTOCOLO PARA EL INMUNOCOLORANTE AUTOMATIZADO TECHMATE®
Este equipo está diseñado para ser utilizado de la misma manera que los equipos ChemMate®. En muchos casos, este equipo se puede utilizar en su
protocolo actual, sin cambios. Los siguientes pasos se pueden usar como instrucciones para ejecutar el Equipo de detección Cap-Plus™ en el
inmunocolorante automatizado Ventana® TechMate®. Para recibir más detalles, consulte los manuales del usuario correspondientes del Ventana®
TechMate®. Este Equipo de detección Cap-Plus™ se puede emplear con otras tecnologías automatizadas de inmunocolorantes que utilizan huecos
capilares. Llame al ®Departamento del Servicio Técnico de Invitrogen, al teléfono 800-874-4494 para mayor información.
PREPARACIÓN PARA LA INMUNOTINCIÓN AUTOMATIZADA
1. Los tejidos se deben montar en portas revestidos con HistoGrip™ (Invitrogen® Cat. Nº 00-8050) o poli-L-lisina.
2. Inmediatamente antes de utilizar los portas, se debe secar perfectamente los cortes de tejido con un horno convencional o un microondas. Esto
eliminará el fenómeno de las "manchas de agua" cuando se visualicen los resultados. En un horno convencional, secar los cortes de tejido en el porta
calentándolos a 60 oC por un mínimo de 60 minutos. En un horno a microondas de 800-W, colocar los portas en un portaobjeto plástico en el centro de
la bandeja giratoria y secarlos durante entre 2 y 3 minutos a alta potencia. Nota: Como medida de seguridad, colocar en el horno a microondas, al
mismo tiempo, un depósito separado con agua. Retirar el portaobjeto con todo cuidado y permitir que la parafina derretida se congele antes de
proseguir.
3. Desparafinizar los cortes de tejido de acuerdo con los procedimientos aprobados por su laboratorio (si no se dispone de los mismos, consultar la
Tabla 2 en el Apéndice B). Después de la desparafinación, mantener a los tejidos húmedos en Tampón 2 del Equipo tampón Cap-Plus™. Se debe
realizar la inmunotinción de los portas el mismo día en que se los desparafina.
4. Seguir todos los pasos requeridos para la preparación del tejido: recuperación del epítopo (consulte la tabla 3 en el apéndice B), bloqueo de
avidina/biotina, digestión tisular, etc. Consulte las hojas de especificación de los anticuerpos.
5. Agrupar los portas por anticuerpo.
6. Determinar el número total de portas que se van a analizar y luego establecer el número total de portaobjetos Ventana® TechMate® requeridos. Usar
un portaobjeto por protocolo.
7. Organizar los portas para cada portaobjeto Ventana® TechMate® mediante la Hoja de posicionamiento de anticuerpos Ventana® que se proporciona
en el manual del usuario.
8. Cargar los portas de acuerdo con la Hoja de posicionamiento de anticuerpos® Ventana.
9. Los portas ya están listos para comenzar la inmunotinción automatizada.
CREACIÓN DEL PROTOCOLO DEFINIDO POR EL USUARIO
1. Zona de estado de la pantalla de visualización de mapas: desplazar el cursor del ratón a la columna identificada como CARGA. Hacer clic con el
ratón una vez. Aparece una lista de protocolos predefinidos.
2. Encontrar el protocolo MIP usando la barra de desplazamiento. Llevar el cursor a este protocolo. Hacer clic con el ratón una vez para resaltar. Ahora
aparece el protocolo MIP en la casilla Archivo.
3. Hacer clic una vez en la casilla de carga más pequeña, justo debajo de la casilla archivo. Aparece una casilla amarillo titilante en la pantalla de
visualización de mapas para indicar que este protocolo está cargado. El cursor del ratón se puede desplazar sobre la posición en la pantalla de
visualización de mapas que corresponda al protocolo MIP. Hacer clic con el ratón una vez.
4. De inmediato se cargará la plantilla deseada y la zona de bloques Ventana® TechMate®quedará marcada con los reactivos necesarios para cada
bloque. También se carga el protocolo. El botón ANALIZAR debe estar rojo para indicar que el protocolo se ha cargado con éxito.
BLOK Ab:
HP BLOK:
AB1:
AB2:
ABC:
DAB:
STN:
PAD:
BUF1:
BUF2:
BUF3:
H20
Abreviaturas de la plantilla para el Ventana® TechMate®
solución bloqueante
bloqueo de peróxido de hidrógeno
anticuerpo primario o control negativo
anticuerpo secundario biotinilado
enzima conjugada (el equipo Cap-Plus™ utiliza streptavidina-HRP, no se necesita mezcla previa).
cromógeno/sustrato DAB (véase la preparación del reactivo)
hematoxilina
Almohadillas para penetración capilar
Tampón 1
Tampón 2
Tampón 3
Agua de lavado
Las bandejas de reactivo ya están listas para ser cargadas.
CARGA DE LAS BANDEJAS DE REACTIVOS DEFINIDAS POR EL USUARIO
1. Completar una hoja de posicionamiento de anticuerpos para determinar qué porta va con cada portaobjeto.
2. Introducir los pares de portas, formados previamente en las bandejas de reactivos de 10 pozos, en el portaobjetos, de acuerdo con la hoja de
posicionamiento de los anticuerpos. Nota: Los pares de portas usarán el mismo anticuerpo primario.
3. Preparar las bandejas de reactivos y colocarlas en los "bloques" de la plataforma del inmunocolorante. El número de bandejas preparadas es igual al
número de pares de portas que se van a analizar. La pantalla del ordenador mostrará la plantilla para la ubicación del reactivo cuando se carga el
protocolo del inmunocolorante. A continuación, llenar una bandeja de 10 pozos con cada uno de los siguientes reactivos, de acuerdo con la Tabla 1.
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Tabla 1. Requisitos para cada bandeja de reactivo
Reactivo Cap-Plus
Abreviatura de la
plantilla
Solución bloqueante
BLOK AB
Anticuerpo primario o
AB1
Control negativo del isotipo
Anticuerpo secundario biotinilado
Bloqueo del peróxido de hidrógeno
Estreptavidina-HRP
Cromógeno/sustrato DAB
Hematoxilina
Tampón 1
Tampón 2
Tampón 3
Agua de lavado
AB2
HP BLOK
ABC
DAB
STN
BUF1
BUF2
BUF3
H20
Volumen
8 gotas/pozo
8 gotas/pozo
o al menos 350
μl/pozo
8 gotas/pozo
10 ml/bandeja
8 gotas/pozo
0,75 ml/pozo
10 ml/bandeja
25 ml/bandeja
25 ml/bandeja
25 ml/bandeja
25 ml/bandeja
Tiempo de
incubación
10 minutos
25 minutos
25 minutos
3 x 5 minutos
EJECUCIÓN DEL PROTOCOLO
Colocar el puntero del ratón sobre el botón ANALIZAR de la zona de estado. Hacer clic con el ratón una vez. El botón ANALIZAR que se volvió rojo
después de cargarse el protocolo del reactivo, ahora debe estar verde, lo que indica que comenzó el protocolo del inmunocolorante MIP.
Si los portas no fueron sometidos a doble tinción en el TechMate®, una vez concluido el protocolo TecMate® se pueden retirar y realizar la doble
tinción de manera manual, colocando un cubreobjetos, si se desea.
SEGURIDAD Y PRECAUCIONES
1. No escatime precauciones cuando maneje reactivos. Use guantes desechables, bata y gafas de seguridad cuando maneje
materiales que se sospecha son carcinógenos.
2. Tras usar, almacene según se indica. Cualquier condición de almacenamiento distinta a la especificada en el paquete debe ser
validada por el usuario.
3. Evite el contacto de ojos y mucosas con estos reactivos. Si estos reactivos entran en contacto con zonas sensibles, lave con
abundante cantidad de agua.
4. DAB puede ser carcinogénico. Use guantes cuando maneje DAB y evite el contacto con la piel. No inhale ni ingiera.
5. Se usa Proclin (0,1%) como conservante. Proclin es tóxico por ingestión.
6. Consulte la normativa federal, estatal o local en materia de eliminación de compuestos potencialmente tóxicos.
7. Los especímenes de pacientes y todos los materiales que entren en contacto con ellos deberían manejarse como si fueran
susceptibles de transmitir infecciones, y deberían eliminarse usando las debidas precauciones. No pipetee con la boca, y evite el
contacto de este reactivo y de los especímenes tisulares con la piel y con las membranas mucosas.
8. Debería seguirse la normativa CLIA en todas las situaciones en las que sea de aplicación.
9. Estos reactivos se diluyen óptimamente. La dilución adicional puede ocasionar la pérdida de inmunotinción del antígeno.
APÉNDICE A
Tabla 2. Desparafinación
Xileno
5 minutos x 2
100% Alcohol Absoluto
3 minutos x 2
95% Alcohol
3 minutos
80% Alcohol
3 minutos
3% H2O2 en Metanol Absoluto
3 minutos
Agua Corriente o PBS, pH 7,4
5 minutos
Tabla 3. Recuperación de epitopo inducida por el calor
Lave los portas con agua reactivo
2 minutos x 3
Coloque los portas en una bandeja de portas y colóquelos en un vaso de precipitados de 1
litro (Pyrex) que contenga 500 ml de solución de trabajo del tampón HIER apropiado.
Coloque el vaso de precipitados en un calientaplatos y caliéntelo hasta que hierva.
Tras calentar, retire el vaso de precipitados del calientaplatos y deje enfriar a temperatura
ambiente.
10 minutos
Al menos 20 minutos
Aclare los portas con PBS, pH 7,4
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Tabla 4. Contratinción y Conservación
Contratinción con hematoxilina
Lave en agua corriente con varios cambios, hasta que el baño de agua permanezca limpio
Coloque en solución azulante (blueing solution) (i.e., 10 mm PBS, pH 7,4) con 2 cambios
Lave en agua destilada con 2 cambios
Deshidratar secuencialmente en EtOH 70%, 95%, 95%, 100% y 100%. Luego en xileno y
xileno. (No deshidratar cuando se usa AEC)
Aplicar cubreobjetos con Histomount™ Mounting Solution
(Use GVA Mounting Solution cuando utilice AEC)
Dejar secar antes de visionar con miscroscopio óptico
1-2 minutos
15-20 segundos
3 minutos en total
2 minutos cada uno
10 minutos
APÉNDICE B.
Tabla 5. Resolución de problemas generales en inmunohistoquímica
Problema
Causa probable
1. Concentración del anticuerpo primario
2. Tiempo de incubación del anticuerpo primario demasiado prolongado
3. Temperatura de la reacción demasiado elevada
Tinción
excesiva
Fundamentos
Inmunotinción
débil
No se produce
inmunotinción
Sólo
Inmunotinción
de Control
Positivo
1. Concentración del anticuerpo primario
2. Peroxidasa endógena, biotina endógena, o fosfatasa alcalina en el tejido
3. Unión no-específica de la proteína en el tejido
4. Desparafinación incompleta
5. Uso inadecuado del tampón de aclarado
6. Reacción de sustrato excesivamente prolongada
7. Antígeno soluble presente en el tejido
1. Concentración de anticuerpo primario
2. Tiempo de incubación de anticuerpo primario excesivamente corto
3. Azida de sodio presente en etiqueta de peroxidasa
4. Uso excesivo del tampón de aclarado, que provoca la dilución de los reactivos
5. Medios de contratinción o de montaje incompatibles; que provocan la disolución del producto de
reacción
6. Sustrato caducado
1. Procesamiento incorrecto
2. El tejido se secó durante el procedimiento de inmunotinción
3. No hay antígeno presente en el tejido
1. Preparación inadecuada del tejido
2. No hay antígeno presente en el tejido
3. Antígeno enmascarado por la fijación con formalina o desnaturalizado por la fijación con formalina o la
infiltración en parafina.
4. Excesiva autolisis del tejido
5. Tejido expuesto a temperaturas superiores a 60 oC
MARCAS REGISTRADAS
CAS-Block™, Clearmount™, HistoGrip™, Histomount™ y Peroxo-Block™ son marcas registradas de Zymed Laboratories, Inc. Zymed® y Histostain® son marcas
registradas de Zymed Laboratories, Inc.
Representante autorizado de IVDD 98/79/EC:
Invitrogen Ltd.
Inchinnan Business Park
3 Fountain Drive
Paisley
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UK
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Kit de détection Cap-Plus™
À utiliser avec les systèmes de coloration d’immunohistochimie basés sur la discontinuité capillaire
NO DE CAT.
POUR ANTICORPS
CHROMOGÈNE BON POUR
PRIMAIRES
87-8143
Large spectre*
DAB
600 lames
*Réagira avec les anticorps primaires de souris, de lapin, de cobaye et de rat.
UTILISATION PRÉVUE
Pour Utilisation de Diagnostiques In Vitro. L'interprétation doit être faite par un pathologiste qualifié dans le cadre des antécédents cliniques du
patient et d'autres tests de diagnostics. Le kit de détection Cap-Plus™ de Invitrogen a été conçu pour être utilisé avec les colorants
d’immunohistochimie automatisés basés sur la discontinuité capillaire tel que Ventana® TechMate®. Ce kit nécessite l’utilisation d’un kit de
tampon complémentaire Cap-Plus™. Des tissus congelés ou incorporés dans de la paraffine, des lymphocytes préparés et des cellules cultivées
fixes peuvent être utilisés.
STOCKAGE ET DURÉE DE CONSERVATION
Conserver le kit entre 2 et 8 °C. Toute affirmation de performance est nulle après la date de péremption du kit.
RÉACTIFS FOURNIS
Réactif A. Un flacon (110 mL) de solution de blocage de sérum prête à l’emploi
Réactif B. Un flacon (de 110 mL) d’anticorps secondaires biotinylés prêts à l’emploi
Réactif C. Un flacon (110 mL) d’anticorps tertiaires de conjugué HRP streptavidine prêts à l’emploi
Réactif D1. Un flacon compte-gouttes (de 15 mL) de tampon de substrat concentré (20x)
Réactif D2. Un flacon compte-gouttes (de 15 mL) de solution chromogène concentrée, DAB (20x)
Réactif D3. Un flacon compte gouttes (15 mL) de peroxyde d’hydrogène à 0,6 % (20x)
* Préparer la solution DAB en ajoutant 1 goutte de chacun des réactifs D1, D2 et D3 à 1 ml de H2O. Bien mélanger. Protéger
de la lumière et utiliser dans les 4 heures. Tous les autres réactifs sont prêts à l’emploi.
RÉACTIFS ET MATÉRIEL NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNIS
- Kit de tampon Cap-Plus™ (Invitrogen No de cat. 87-0003)
– Xylène et éthanol
– Eau distillée ou déionisée
– HistoGrip™ (Invitrogen No de cat. 00-8050) traitement d’adhésion pour lames de microscope
– Anticorps primaire
– Immunocolorant automatisé basé sur la discontinuité capillaire
– Tablettes d’imbibition pour réactif
– Témoins tissulaires positifs et négatifs
– Réactif de témoin négatif
– Hématoxyline (Invitrogen No de cat. 00-8001)
– Support pour lames microscopiques
Clearmount™ (Invitrogen No de cat. 00-8110) ou
Histomount™ (Invitrogen No de cat. 00-8030)
PROTOCOLE DE COLORATION SUGGÉRÉ
A. PRÉPARATION PRÉLIMINAIRE DES LAMES
1. PRÉPARATION DE
L’ÉCHANTILLON
2. PRÉPARATION DES LAMES
3. DÉPARAFFINAGE ET
RÉHYDRATATION
- Une fixation adéquate du tissu et de l’antigène est nécessaire pour obtenir une performance pouvant être
reproduite et des interprétations fiables. Les fixateurs adéquats comprennent : formol tamponné neutre à 10 %,
B5, formol de Bouin, de zinc ou des fixateurs à base d’alcool.
- Des frottis de cellules préparés à partir de liquides organiques doivent être faits afin de garantir une couche
unique de cellules. Ils doivent être fixés dès qu’ils sont prêts. Habituellement, en fonction des propriétés de
l’antigène, les frottis de cellules restent stables pendant une à deux semaines lorsqu’ils sont conservés à 4 °C.
- La fixation de sections congelées ou de cytospine peut être faite à l’acétone (100 %) à 4 °C pendant une période
de 10 minutes.
- Pour détendre les spécimens, placer les sections de tissu dans un récipient d’eau déionisée ou distillée
préchauffée à 40-44 °C. Centrer ensuite les sections plates et lisses sur une lame de microscope traitée à
l’HistoGrip™. Une bonne mise en place garantira une action capillaire adéquate lorsque deux lames de
microscope seront placées l’une sur l’autre sur le porte-lames.
- Enduire les lames de HistoGrip™ (Invitrogen No de cat. 00-8050). Une autre alternative consiste à les enduire
de poly-L-lysine à 0,1 % dans de l’eau et de les sécher ensuite à l’air.
- Les sections de paraffine sont déparaffinées avec du xylène et réhydratées dans une série d’éthanol classé.
Laver les frottis de cellules ou le tissu dans un bain de soluté tampon de phosphate pendant 10 minutes avant de
commencer la procédure de coloration.
Remarque : à partir de ce moment, ne pas laisser sécher le spécimen ou les sections de tissu.
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Catalog or www.invitrogen.com). By use of these products you accept the terms and conditions of all applicable Limited Use Label Licenses.
PROTOCOLE DE COLORATION SUGGÉRÉ (SUITE)
B. PROTOCOLE POUR LES IMMUNOCOLORANTS AUTOMATISÉS TECHMATE®
Ce kit a été conçu pour être utilisé à la manière des kits ChemMate®. Dans de nombreux cas, ce kit peut être utilisé avec votre
protocole actuel sans devoir y apporter de modifications. Les étapes suivantes peuvent être utilisées comme base pour utiliser le kit
de détection Cap-Plus™ sur les immunocolorants automatisés de Ventana® TechMate®. Pour plus de détails, se reporter aux
manuels de l’utilisateur appropriés de Ventana® TechMate®. Ce kit de détection Cap-Plus™ peut également être utilisé avec
d’autres immunocolorants automatisés utilisant la technologie de discontinuité capillaire. Veuillez appeler le service technique de
Invitrogen au 800-874-4494 pour de plus amples détails.
PRÉPARATION POUR L’IMMUNOCOLORATION AUTOMATISÉE
1. Les tissus doivent être attachés aux lames du microscope enduites de HistoGrip™ (Invitrogen No de cat. 00-8050) ou de poly-Llysine.
2. Les sections de tissu doivent être séchées à fond dans un four traditionnel ou à micro-ondes juste avant d’utiliser les lames du
microscope. Ceci éliminera le phénomène de « taches d’eau » lors de l’examen des résultats. Dans un four traditionnel, sécher les
sections de tissu sur les lames de microscope en les chauffant à 60 oC pendant 60 minutes minimum. Dans un four à micro-ondes de
800 watts, placer les lames du microscope dans un porte-lames en plastique au milieu du plateau rotatif et sécher les lames pendant
2 à 3 à puissance élevée. Remarque : par précaution, placer en même temps un récipient d’eau séparé dans le four. Retirer avec soin
le porte-lames et laisser la paraffine fondue se solidifier avant de continuer.
3. Déparaffiner les sections de tissu en suivant les procédures approuvées par votre laboratoire (si elles ne sont pas disponibles, voir
le tableau 2 à l’annexe B). Après le déparaffinage, garder les tissus humides dans le tampon 2 du kit de tampon Cap-Plus™. Les
lames doivent être immunocolorées et déparaffinées le même jour.
4. Effectuer toute étape nécessaire de préparation du tissu telle que la récupération de l’épitope (voir le tableau 3 à l’annexe B), le
blocage d’avidine/biotine, la digestion de tissu, etc. Se reporter aux fiches de spécification sur les anticorps.
5. Grouper les lames de microscope selon l’anticorps.
6. Déterminer le nombre total de lames à analyser et déterminer ensuite le nombre total de porte-lames Ventana® TechMate®
nécessaires. Utiliser un porte-lames par protocole.
7. Organiser les lames de microscope pour chaque porte-lames Ventana® TechMate® en utilisant la feuille de positionnement des
anticorps de Ventana® fournie avec le manuel de l’utilisateur.
8. Charger les lames conformément à la feuille de positionnement des anticorps de Ventana®.
9. Les lames de microscope sont désormais prêtes pour l’immunocoloration automatisée.
CRÉATION DU PROTOCOLE DÉFINI PAR L’UTILISATEUR
1. Zone d’état de l’écran Indication cartographique : déplacer le curseur de la souris vers la colonne identifiée par LOAD
(CHARGER). Cliquer une fois sur la souris. Une liste de protocoles prédéfinie s’affiche.
2. Localiser le protocole MIP en utilisant la barre de défilement. Déplacer le curseur vers ce protocole. Cliquer une fois sur la souris
pour mettre en surbrillance. Le protocole MIP doit désormais apparaître dans la case File (Fichier).
3. Cliquer une fois sur la case plus petite Load (Charger) juste en dessous de la case File (Fichier). Une case jaune clignotante
apparaît à l’écran Map View (Indication cartographique) indiquant que ce protocole a été téléchargé. Le curseur de la souris peut
désormais être déplacé vers la position à l’écran Map View qui correspond au protocole MIP. Cliquer une fois sur la souris.
4. Le modèle désiré téléchargera immédiatement et la zone de mosaïque Ventana® TechMate® sera marquée avec les réactifs
nécessaires pour chaque mosaïque. Le protocole est également téléchargé. Le bouton RUN (EXÉCUTER) doit être rouge afin
d’indiquer que le protocole a bien été téléchargé.
Abréviations du modèle de Ventana® TechMate®
BLOK Ab :
Solution de blocage
HP BLOK :
Blocage du peroxyde d’hydrogène
AB1 :
Anticorps primaire ou témoin négatif
AB2 :
Anticorps secondaire biotinylé
ABC :
Conjugué enzymatique (le kit Cap-Plus™ utilise HRP-streptavidine, pas besoin de prémélanger)
DAB :
chromogène/substrat DAB (voir préparation du réactif)
STN :
Hématoxyline
PAD :
Tablettes d’imbibition
BUF1 :
Tampon 1
BUF2 :
Tampon 2
BUF3 :
Tampon 3
H20
Eau de lavage
Les plateaux de réactif sont désormais prêts à être chargés.
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CHARGEMENT DES PLATEAUX DE RÉACTIF DÉFINIS PAR L’UTILISATEUR
1. Compléter une feuille de positionnement des anticorps afin de déterminer quelle lame de microscope accompagne quel portelames.
2. Introduire les paires de lames de microscope, créées auparavant dans les plateaux de réactifs à 10 puits, dans le porte-lames,
conformément à la feuille de positionnement des anticorps. Remarque : les paires de lames utiliseront les anticorps primaires.
3. Préparer les plateaux de réactif et les placer dans les « mosaïques » de la plate-forme de l’immunocolorant. Le nombre de
plateaux préparés équivaut au nombre de paires de lames à analyser. L’écran de l’ordinateur affichera le modèle pour le placement
du réactif une fois que le protocole de l’immunocolorant aura été chargé. Remplir ensuite un plateau à 10 puits avec chacun des
réactifs suivants conformément au tableau 1.
Tableau 1. Exigences pour chaque plateau de réactif
Réactif Cap-Plus
Solution de blocage
Anticorps primaire ou
témoin isotype négatif
Anticorps secondaire biotinylé
Blocage de peroxyde d’hydrogène
HRP-Streptavidine
Chromogène/substrat DAB
Hématoxyline
Tampons 1
Tampons 2
Tampons 3
Eau de lavage
Abréviation du
modèle
BLOK AB
AB1
AB2
HP BLOK
ABC
DAB
STN
BUF1
BUF2
BUF3
H20
Volume
8 gouttes/puits
8 gouttes/puits
ou un minimum de
350 μl/puits
8 gouttes/puits
10 ml/plateau
8 gouttes/puits
0,75 ml/puits
10 ml/plateau
25 ml/plateau
25 ml/plateau
25 ml/plateau
25 ml/plateau
Temps
d’incubation
10 minutes
25 minutes
25 minutes
3 x 5 minutes
EXÉCUTION DU PROTOCOLE
Placer le pointeur de la souris sur la touche RUN (EXÉCUTER) dans la zone d’état. Cliquer une fois sur la souris. La touche RUN
(EXÉCUTER) qui avait viré au rouge lorsque le protocole de réactif a été chargé doit être vert, indiquant que le protocole de
l’immunocolorant MIP a été lancé.
Si les lames n’ont pas de coloration de contraste sur le TechMate®, une fois que le protocole TechMate® est terminé, les lames
peuvent recevoir une coloration de contraste et être recouvertes à la main si on le souhaite.
SÛRETÉ ET PRÉCAUTIONS
1. Faire très attention lors de la manipulation des réactifs. Porter des gants jetables, un tablier et des lunettes de protection
lors de la manipulation de cancérogènes présumés.
2. Après l’utilisation, ranger tel que spécifié. Toute condition de stockage autre que celles spécifiées dans la notice de
conditionnement doit être validée par l’utilisateur.
3. Éviter tout contact de ces réactifs avec les yeux et les muqueuses. Si ces réactifs entrent en contact avec des zones
sensibles, laver abondamment avec l’eau.
4. La solution DAB peut être cancérogène. Porter des gants lors de la manipulation de la solution DAB et éviter tout
contact avec la peau. Ne pas inhaler ou ingérer.
5. Le Proclin (0,1 %) est utilisé comme agent conservation. Le Proclin est toxique s’il est ingéré.
6. Consulter les règles fédérales, d’État ou locales pour l’élimination de tout composant potentiellement toxique.
7. Les échantillons et tous les matériaux avec lesquels ils entrent en contact doivent être manipulés comme étant
susceptibles de transmettre une infection et doivent être éliminés en prenant les précautions nécessaires. Ne jamais remplir
une pipette en aspirant par la bouche et éviter tout contact de ce réactif et des échantillons tissulaires avec la peau et les
muqueuses.
8. Les règles CLIA doivent être suivies dans toutes les situations applicables.
9. Ces réactifs sont dilués de façon optimale. Toute dilution supplémentaire risque de causer une perte de
l’immunomarquage de l’antigène.
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ANNEXE A.
Tableau n° 2. Déparaffinage
Xylène
5 minutes x 2
Alcool absolu à 100 %
3 minutes x 2
Alcool à 95 %
3 minutes
Alcool à 80 %
3 minutes
H2O2 à 3 % dans du méthanol absolu
3 minutes
Eau courante ou PBS, pH 7,4
5 minutes
Tableau n° 3. Récupération d’épitope induite par la chaleur
Laver les lames avec de l’eau réactive
2 minutes x 3
Ranger les lames dans une grille à lames et la placer dans un bécher en verre (Pyrex) de
1 litre contenant 500 ml de solution préparée d’EDTA
Placer le bécher sur une plaque chauffante et chauffer jusqu’à ébullition
Après avoir chauffé le bécher, le retirer de la plaque chauffante et le laisser refroidir à
température ambiante
10 minutes
Au moins 20 minutes
Rincer les lames avec du PBS, pH 7,4
Tableau n° 4. Contre-coloration et conservation
Contremarquer à l’hématoxyline
Laver à plusieurs reprises avec de l’eau du robinet jusqu’à ce l’eau soit bien claire
Placer dans une solution d’azurage (par exemple, PBS à 10 mM, pH 7,4) à deux reprises
Laver dans de l’eau distillée à deux reprises
Déshydrater ensuite dans de l’éthanol à 70 %, 95 %, 95 %, 100 %, et 100 %. Ensuite dans du
xylène et du xylène. (Ne pas déshydrater lorsque l’AEC est utilisé)
Appliquer la solution de fixation Histomount™ sur le couvre-lames
(Utiliser la solution de fixation GVA lorsque l’AEC est utilisé)
Laisser sécher avant d’examiner à la lumière d’un microscope
1 à 2 minutes
15 à 20 secondes
3 minutes en tout
2 minutes chacun
10 minutes
ANNEXE B.
Tableau n° 5. Diagnostic général d’immunohistochimie
Problème
l Cause probable
Surcoloration
Historique
Faible immunomarquage
1. Concentration de l’anticorps primaire
2. Temps d’incubation de l’anticorps primaire et du substrat trop long
3. Température de réaction trop élevée
2. Peroxydase endogène, biotine endogène ou phosphatase alcaline dans le tissu
3. Fixation non spécifique de protéine dans le tissu
4. Déparaffinage incomplet
5. Mauvais usage de la solution tampon de rinçage
6. Réaction du substrat trop long
7. Antigène soluble présent dans le tissu
2. Temps d’incubation de l’anticorps primaire trop court
3. Présence d’azoture de sodium dans le marqueur de peroxydase
4. Usage excessif de la solution tampon de rinçage causant une dilution des réactifs
5. Moyens de contre-coloration ou de fixation incompatibles qui dissolvent le produit de réaction
6. Substrat périmé
Pas d’immunomarquage
1. Procédure incorrecte
2. Tissu séché pendant la procédure d’immunomarquage
3. Aucun antigène présent dans le tissu
Immunomarquage du
témoin positif
uniquement
1. Mauvaise préparation du tissu
2. Aucun antigène présent dans le tissu
3. Antigène masqué par la fixation au formol ou dénaturée par la fixation au formol ou l’enrobage à la
paraffine
4. Autolyse excessive du tissu
5. Tissu exposé à des températures supérieures à 60 oC
MARQUES DE COMMERCE
CAS-Block™, Clearmount™, HistoGrip™, Histomount™, et Peroxo-Block™ sont des marques de Zymed Laboratories, Inc. Zymed® et Histostain® sont des
marques déposées de Zymed Laboratories, Inc.
Représentant Autorisé pour IVDD 98/79/EC: Invitrogen Ltd., Inchinnan Business Park, 3 Fountain Drive, Paisley, PA4 9RF, UK
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Kit di rilevazione Cap-Plus™
Da utilizzarsi con i sistemi di colorazione immunoistichimica basati su gap capillare
N. CAT.
PER CROMOGENO DI
ANTICORPI PRIMARI
87-8143
DAB
ad ampio spettro*
*Reagisce agli anticorpi primari di topo, coniglio, cavia e ratto.
SUFFICIENTE PER
600 vetrini
SCOPO D’UTILIZZO
Per uso diagnostico In Vitro. L’interpretazione deve essere effettuata da un patologo qualificato entro il contesto dell’anamnesi clinica del
paziente ed in considerazione di altri test diagnostici. Il Kit di rilevazione Cap-Plus™ di Invitrogen è da usarsi con coloratori immunoistochimici
automatici basati su gap capillare quali il Ventana® TechMate®. Questo kit richiede l’uso concomitante del relativo Kit per tampone Cap-Plus™. Si
possono usare tessuti congelati o inclusi in paraffina, linfociti appena preparati e cellule coltivate e fissate.
CONSERVAZIONE E DURATA A MAGAZZINO
Conservare il kit a 2-8 °C. Qualsiasi eventuale reclamo relativo alla performance è nullo dopo la data di scadenza del kit.
REAGENTI ACCLUSI
Reagente A. Una boccetta (da 110 mL) di soluzione siero bloccante pronta per l’uso
Reagente B. Una boccetta (da 110 mL) di soluzione a base di anticorpo secondario biotinilato pronta per l’uso
Reagente C. Una boccetta (da 110 mL) di soluzione a base di anticorpo terziario coniugato alla streptavidina-HRP pronta per l’uso
Reagente D1. Una boccetta contagocce (da 15 mL) di tampone di substrato concentrato (20x)
Reagente D2. Una boccetta contagocce (da 15 mL) di soluzione cromogenica concentrata, DAB (20x)
Reagente D3. Una boccetta contagocce (da 15 mL) di perossido di idrogeno allo 0,6% (20x)
* Preparare la DAB aggiungendo 1 goccia ciascuno dei Reagenti D1, D2 e D3 per ogni ml di H2O. Miscelare accuratamente. Tenere lontano da fonti di
luce ed usare entro 4 ore. Tutti gli altri reagenti sono pronti per l’uso.
REAGENTI E MATERIALI OCCORRENTI MA NON ACCLUSI
– Kit per tampone Cap-Plus™ (N. Cat. Invitrogen 87-0003)
– Xilene ed etanolo
– Acqua distillata o deionizzata
– Trattamento adesivo per vetrini da microscopio HistoGrip™ (N. Cat. Invitrogen 00-8050)
- Anticorpo primario
– Immunocoloratore automatico basato su gap capillare
– Compresse di drenaggio del reagente
– Controlli tissutali negativi e positivi
– Reagente per il controllo negativo
– Ematossilina (N. Cat. Invitrogen 00-8001)
– Mezzo di fissaggio
Clearmount™ (N. Cat. Invitrogen 00-8110) o
Histomount™ (N. Cat. 00-8030)
PROTOCOLLO DI COLORAZIONE RACCOMANDATO
A. PREPARAZIONE PRELIMINARE DEI VETRINI
- Il debito fissaggio dei tessuti e degli antigeni risulta determinante ai fini del conseguimento di una
1. PREPARAZIONE DEI
performance riproducibile e dell’affidabilità delle interpretazioni. Tra i fissativi idonei compaiono: formalina
PROVINI
2. PREPARAZIONE DEI
VETRINI
3. DEPARAFFINIZZAZIONE E
REIDRATAZIONE
tamponata neutra al 10%, B5, liquido di Bouin, zinco formalina o fissativi a base di alcol.
- Gli strisci di cellule tratte da liquidi organici dovrebbero essere preparati in modo tale da garantire un
monostrato cellulare. Gli strisci dovrebbero essere fissati immediatamente dopo la loro preparazione. A
seconda delle proprietà dell’antigene utilizzato, gli strisci di cellule rimangono solitamente stabili per una o
due settimane se conservati a 4°C.
- Il fissaggio di citospin o di sezioni congelate può essere eseguito con acetone (al 100%) a 4°C per un periodo
di 10 minuti.
- Per il rilassamento dei provini, immergere le sezioni tissutali in un contenitore di acqua deionizzata o
distillata preriscaldata a 40-44oC. Quindi centrare le sezioni piatte e levigate su un vetrino da microscopio
trattato con HistoGrip™. La centratura corretta garantisce un’azione capillare adeguata quando due vetrini da
microscopio vengono inseriti nel portavetrini l’uno dirimpetto all’altro.
- Pretrattare i vetrini con HistoGrip™ (N. Cat. Invitrogen 00-8050) Quale alternativa, pretrattare con poli-Llisina allo 0,1% in acqua, quindi lasciare asciugare spontaneamente.
- Le sezioni incluse in paraffina devono essere deparaffinizzate con xilene e reidratate in una serie di alcoli
selezionati. Lavare gli strisci di cellule o il tessuto in un bagno di PBS per 10 minuti prima di avviare la
procedura di colorazione.
Nota: da questo punto in poi non lasciare che i provini o le sezioni tissutali si secchino.
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PROTOCOLLO DI COLORAZIONE RACCOMANDATO - SEGUITO
B. PROTOCOLLO PER I COLORATORI AUTOMATICI TECHMATE®
Le modalità d’uso del presente kit sono le stesse di quelle da osservarsi per i kit ChemMate®. In molti casi, questo kit può essere utilizzato
nel proprio protocollo senza alcuna modifica. Quale linea guida per l’uso del Kit di rilevazione Cap-Plus™con gli immunocoloratori
automatici Ventana® TechMate® si possono seguire le fasi riportate qui di seguito. Per informazioni particolareggiate ed esaustive pregasi
consultare il Manuale per l’utente Ventana® TechMate®. Il presente Kit di rilevazione Cap-Plus™può essere usato anche con altri
immunocoloratori automatici facenti ricorso alla tecnologia gap. Per ulteriori informazioni, pregasi rivolgersi al Reparto assistenza tecnica
Invitrogen al numero 800-874-4494.
PREPARAZIONE PER L’IMMUNOCOLORAZIONE AUTOMATICA
1. I tessuti dovrebbero essere fissati su vetrini da microscopio trattati con HistoGrip™ (N.®Cat. Invitrogen 00-8050) o poli-L-lisina.
2. Immediatamente prima dell’uso dei vetrini da microscopio, le sezioni tissutali dovrebbero essere completamente seccate in una stufa
convenzionale o in un forno a microonde. Ciò consente di eliminare il fenomeno delle “macchiettature d’acqua” all’esame dei risultati. Se
si usa una stufa convenzionale, seccare le sezioni tissutali sui vetrini da microscopio riscaldandole a 60oC per un minimo di 60 minuti. Se
si usa un forno a microonde da 800-watt, inserire i vetrini da microscopio in un portavetrini di plastica e porli nel centro del piatto rotante,
quindi farli asciugare per 2-3 minuti ad alta temperatura. Nota: quale misura precauzionale di sicurezza mettere allo stesso tempo nel forno
microonde anche un serbatoio d’acqua. Estrarre con cura il portavetrini ed attendere che la paraffina sciolta si solidifichi prima di
procedere.
3. Deparaffinizzare le sezioni tissutali conformemente alle procedure vigenti presso il proprio laboratorio (qualora non siano disponibili,
pregasi consultare la Tabella 2 nell’Appendice B). Eseguita la deparaffinizzazione, lasciare i tessuti immersi nel Tampone 2 del Kit per
tampone Cap-Plus™. L’immunocolorazione dei vetrini dovrebbe essere eseguita lo stesso giorno in cui vengono deparaffinizzati.
4. Eseguire tutte le fasi di preparazione del tessuto necessarie, quali: richiamo dei determinanti antigeni (vedasi la Tabella 3
nell’Appendice B), blocco dell’avidina/biotina, digestione del tessuto, ecc. Pregasi consultare la scheda tecnica relativa all’anticorpo usato.
5. Raggruppare i vetrini da microscopio per anticorpo.
6. Stabilire il numero complessivo di vetrini che si intende utilizzare e quindi determinare il numero complessivo di portavetrini Ventana®
TechMate® occorrenti. Usare un portavetrini per protocollo.
7. Organizzare i vetrini da microscopio per ciascun portavetrini Ventana® TechMate®facendo riferimento alla Scheda di posizionamento
degli anticorpi Ventana®riportata nel manuale per l’utente.
8. Caricare i vetrini conformemente a quanto riportato nella Scheda di posizionamento degli anticorpi Ventana®.
9. I vetrini da microscopio sono ora pronti e si può quindi avviare l’immunocolorazione automatica.
MESSA A PUNTO DEL PROTOCOLLO DEFINITO DALL’UTENTE
1. Area status dello Schermo Map View (Visualizzazione mappa): spostare il cursore del mouse sulla colonna intitolata LOAD (Carica).
Fare clic con il mouse una volta. Compare un elenco predefinito di protocolli.
2. Individuare il protocollo MIP usando la barra di scorrimento. Spostare il cursore su questo protocollo. Fare clic con il mouse una volta
per evidenziarlo. Il protocollo MIP dovrebbe ora apparire nella casella File.
3. Fare clic una volta sulla casella Load (Carica) più piccola, appena al di sotto della casella File. Nello schermo Map View
(Visualizzazione mappa) compare una casella gialla lampeggiante ad indicazione dell’avvenuto caricamento del protocollo selezionato. Si
può ora spostare il cursore del mouse sulla posizione all’interno dello schermo Map View (Visualizzazione mappa) corrispondente al
protocollo MIP. Fare clic con il mouse una volta.
4. Il modello desiderato viene caricato immediatamente e l’area dei tile Ventana® TechMate® appare etichettata con i reagenti richiesti per
ciascun tile. Viene inoltre caricato il protocollo. Il tasto RUN (Esegui) dovrebbe ora essere rosso ad indicazione dell’avvenuto caricamento
del protocollo.
Abbreviazione dei modelli per il Ventana® TechMate®
BLOK Ab:
Soluzione bloccante
HP BLOK:
Blocco del perossido d’idrogeno
AB1:
Anticorpo primario o controllo negativo
AB2:
Anticorpo secondario biotinilato
ABC:
Coniugato enzimatico (il kit Cap-Plus™prevede l’impiego di streptavidina-HRP, non occorre premiscelare)
DAB:
Cromogeno/substrato DAB (vedasi preparazione dei reagenti)
STN:
Ematossilina
PAD:
Compresse di drenaggio
BUF1:
Tampone 1
BUF2:
Tampone 2
BUF3:
Tampone 3
H20
Acqua di risciacquo
Le vaschette dei reagenti sono ora pronte per esser caricate.
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CARICAMENTO DELLE VASCHETTE DEI REAGENTI DEFINITE DALL’UTENTE
1. Compilare una Scheda di posizionamento degli anticorpi per stabilire a quale portavetrini assegnare ciascun vetrino da microscopio.
2. Inserire le coppie di vetrini da microscopio, precedentemente create in vaschette per reagenti da 10 pozzetti, nel portavetrini
conformemente a quanto riportato nella Scheda di posizionamento degli anticorpi. Nota: le coppie di vetrini usano lo stesso anticorpo
primario.
3. Preparare le vaschette dei reagenti ed appoggiarle sui “tile” della piattaforma dell’immunocoloratore. Il numero di vaschette preparate
coincide con il numero di vetrini accoppiati che si intende utilizzare. Lo schermo del computer mostrerà il modello per il posizionamento
dei reagenti al caricamento del protocollo dell’immunocoloratore. Quindi, riempire una vaschetta da 10 pozzetti con ciascuno dei seguenti
reagenti, conformemente a quanto riportato nella Tabella 1.
Tabella 1. Requisiti per ciascuna vaschetta di reagente
Reagente Cap-Plus
Abbreviazione del
modello
Soluzione bloccante
BLOK AB
Anticorpo primario o
AB1
Controllo isotipo negativo
Anticorpo secondario biotinilato
Blocco del perossido d’idrogeno
Streptavidina-HRP
Cromogeno/substrato DAB
Ematossilina
Tamponi 1
Tamponi 2
Tamponi 3
Acqua di risciacquo
AB2
HP BLOK
ABC
DAB
STN
BUF1
BUF2
BUF3
H20
Volume
Pozzetto da 8 gocce
Pozzetto da 8 gocce
o pozzetto da
almeno 350 μl
Pozzetto da 8 gocce
Vaschetta da 10 ml
Pozzetto da 8 gocce
Pozzetto da 0,75 ml
Vaschetta da 10 ml
Vaschetta da 25 ml
Vaschetta da 25 ml
Vaschetta da 25 ml
Vaschetta da 25 ml
Tempo di
incubazione
10 minuti
25 minuti
25 minuti
3 x 5 minuti
ESECUZIONE DEL PROTOCOLLO
Posizionare il cursore del mouse sul tasto RUN (Esegui) dell’Area di stato. Fare clic con il mouse una volta. Il tasto RUN (Esegui)
divenuto rosso in seguito al caricamento del protocollo del reagente dovrebbe ora essere verde, ad indicazione dell’avvio del protocollo
MIP dell’immunocoloratore.
Se i vetrini non sono stati controcolorati sul TechMate®, al termine del protocollo TechMate®, possono essere rimossi e controcolorati
manualmente e, se lo si desidera, inseriti in un coprivetrino.
SICUREZZA E PRECAUZIONI
1. Esercitare molta cautela durante la manipolazione dei reagenti. Indossare guanti monouso, un camice e occhiali protettivi
durante la manipolazione di sostanze di cui si sospetta la cancerogenicità.
2. Dopo l’uso, conservare conformemente a quanto specificato. Qualsiasi altra condizione di conservazione che si discosti da
quelle specificate nel foglietto illustrativo deve essere convalidata dall’utente.
3. Evitare il contatto dei reagenti con gli occhi o con le mucose. In caso di contatto accidentale dei reagenti con aree sensibili,
risciacquare con acqua abbondante.
4. La DAB potrebbe essere una sostanza carcinogenica. Indossare dei guanti quando si manipola la DAB ed evitare il contatto con
gli occhi. Non inalare o ingerire.
5. Proclin (allo 0,1%) è usato quale conservante. Proclin è tossico se ingerito.
6. Fare riferimento alle normative vigenti a livello nazionale o locale in materia di smaltimento di sostanze potenzialmente
tossiche.
7. I provini dei pazienti e tutti i materiali che entrano in contatto con essi devono essere manipolati quali materiali potenzialmente
infettivi e quindi smaltiti adottando le debite precauzioni. Non pipettare mai con la bocca ed evitare il contatto di questo reagente
e dei provini tissutali con la cute e le mucose.
8. Si devono osservare i regolamenti previsti dalla legge statunitense per il miglioramento dei laboratori clinici (Clinical
Laboratory Improvement Act, CLIA) in tutte le situazioni applicabili.
9. I presenti reagenti sono stati diluiti in base al rapporto ottimale. L’ulteriore diluizione potrebbe causare la mancata
immunocolorazione dell’antigene.
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APPENDICE A
Tabella 2. Deparaffinizzazione
Xilene
5 minuti x 2
Alcool assoluto al 100%
3 minuti x 2
Alcool al 95%
3 minuti
Alcool al 80%
3 minuti
H2O2 al 3% in Metanolo assoluto
3 minuti
Acqua corrente oppure PBS, pH 7,4
5 minuti
Tabella 3. Richiamo dei determinanti antigeni indotto mediante calore (Heat Induced Epitope Retrieval, HIER)
Lavare i vetrini con acqua di reagente
2 minuti x 3
Inserire i vetrini nell’apposito rack per vetrini ed immergere in un becher di vetro (pirex) da 1
litro contenente 500 ml di soluzione attiva di tampone HIER.
Appoggiare il becher sulla piastra riscaldante e riscaldare fino alla bollitura
Al termine del riscaldamento, rimuovere il becher dalla piastra riscaldante e lasciare
raffreddare a temperatura ambiente
10 minuti
Almeno 20 minuti
Risciacquare i vetrini con PBS, pH 7,4
Tabella 4. Controcolorazione e conservazione
Controcolorare con Ematossilina
Lavare in acqua di rubinetto, ricambiata diverse volte, finché il bagnomaria rimane limpido
Immergere in soluzione azzurrante (ovvero, 10 mM di PBS, pH 7,4) eseguendo 2 ricambi
Lavare in acqua distillata, eseguendo 2 ricambi
Disidratare sequenzialmente in EtOH al 70%, 95%, 95%, 100% e 100%. Poi in xilene e xilene.
(Non disidratare se si usa l’AEC)
Inserire nel coprivetrino, utilizzando la soluzione fissativa Histomount™
(Se si usa l’AEC, usare la soluzione di fissaggio a base di alcool glicero-vinilico)
Lasciare asciugare prima di eseguire l’analisi con microscopio ottico
1-2 minuti
15-20 secondi
3 minuti in tutto
2 minuti ciascuno
10 minuti
APPENDICE B.
Tabella 5. Risoluzione di problemi generali relativi all’immunoistochimica
Problema
Causa probabile
Sovracolorazione
Dati di base
Immunocolorazione
debole
1. Concentrazione dell’anticorpo primario
2. Tempo di incubazione dell’anticorpo primario e del substrato eccessivo
3. Temperatura di reazione eccessiva
2. Perossidasi endogena, biotina endogena o fosfatasi alcalinica nel tessuto
3. Legame proteinico aspecifico nel tessuto
4. Deparaffinazione incompleta
5. Uso scorretto del tampone di risciacquo
6. Reazione del substrato eccessivamente prolungata
7. Presenza di antigene solubile nel tessuto
2. Tempo di incubazione dell’anticorpo primario insufficiente
3. Presenza di azoturo di sodio nel marcatore di perossidasi
4. Uso eccessivo del tampone di risciacquo e conseguente diluizione dei reagenti
5. Mezzo di fissaggio o controcolorazione incompatibile causante la dissoluzione del prodotto della reazione
6. Substrato scaduto
Nessuna
immunocolorazione
1. Procedura scorretta
2. Essiccamento del tessuto durante la procedura di immunocolorazione
3. Assenza di antigene nel tessuto
Solo
immunocolorazione
del controllo positivo
1. Preparazione scorretta del tessuto
2. Assenza di antigene nel tessuto
3. Antigene occultato dal fissaggio in formalina o denaturato dal fissante per formalina o dall’inclusione in
paraffina
4. Autolisi eccessiva del tessuto
5. Esposizione del tessuto a temperature superiori a 60 oC
MARCHI COMMERCIALI
CAS-Block™, Clearmount™, HistoGrip™, Histomount™ e Peroxo-Block™ sono marchi commerciali di proprietà di Zymed Laboratories, Inc. Zymed® e Histostain® sono
marchi commerciali registrati di proprietà di Zymed Laboratories, Inc.
Rappresentante Autorizzato per IVDD 98/79/EC: Invitrogen Ltd., Inchinnan Business Park, 3 Fountain Drive, Paisley, PA4 9RF, UK
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Cap-Plus™
DetektionskitFür den Gebrauch mit Immunohistochemie-Färbungssystemen auf Kapillarspaltbasis
KAT.- NR.
FÜR PRIMÄRES ANTIKÖRPER
CHROMOGEN
REICHT FÜR
87-8143
Breitspektrum*
DAB
600 Objektträger
*Reagiert mit Mäuse-, Kaninchen-, Meerschweinchen- und Ratten-Primärantikörpern.
VERWENDUNGSZWECK
Für In Vitro Diagnostischem Gebrauch. Die Interpretation muss im Zusammenhang mit der klinischen Vorgeschichte des Patienten und anderen
Diagnostiktests eines qualifizierten Pathologen vorgenommen werden. Das Cap-Plus™ Detektionskit von Invitrogen ist für den Gebrauch auf
automatisierten Immunohistochemie-Färbern auf Kapillarspaltbasis wie dem Ventana® TechMate® vorgesehen. Dieses Kit muss mit dem begleitenden
Cap-Plus™ Pufferkit verwendet werden. Gefrorene oder paraffin-eingebettete Gewebe, frisch präparierte Lymphozyten und fixierte Kulturzellen können
verwendet werden.
AUFBEWAHRUNG UND HALTBARKEIT
Kit bei 2-8°C aufbewahren. Alle Leistungsangaben sind nach Ablauf des Verfalldatums des Kits ungültig.
MITGELIEFERTE REAGENZIEN
Reagenz A. Eine Flasche (110 mL) gebrauchsfertige Serumblockinglösung
Reagenz B. Eine Flasche (110 mL) gebrauchsfertiger biotinylierter Sekundärantikörper
Reagenz C. Eine Flasche (110 mL) gebrauchsfertiger Streptavidin-HRP-konjugierter Tertiärantikörper
Reagenz D1. Eine Tropfflasche (15 mL) konzentrierter Substratpuffer (20x)
Reagenz D2. Eine Tropfflasche (15 mL) konzentrierte Chromogenlösung, DAB (20x)
Reagenz D3. Eine Tropfflasche (15 mL) 0,6%iges Wasserstoffperoxid (20x)
* DAB vorbereiten, indem je 1 Tropfen der Reagenzien D1, D2 und D3 1 ml H2O hinzugegeben werden. Gut vermischen. Vor Licht schützen und
innerhalb von 4 Stunden verwenden. Alle anderen Reagenzien sind gebrauchsfertig.
ERFORDERLICHE, JEDOCH NICHT MITGELIEFERTE REAGENZIEN UND MATERIALIEN
– Cap-Plus™ Pufferkit (Invitrogen Kat.-. Nr.87-0003)
– Xylen und Ethanol
– Destilliertes oder deionisiertes Wasser
– HistoGrip™ (Invitrogen Kat.-. Nr. 00-8050) Haftbehandlung für Mikroskopträger
– Primärantikörper
– Automatisierter Immunostainer auf Kapillarspaltbasis
– Reagenzaufsaugtücher
– Positive und negative Gewebekontrollen
– Negatives Kontrollreagenz
– Hematoxylin (Invitrogen Kat.-. Nr.00-8001)
– Mounting Medien
Clearmount™ (Invitrogen Kat.- Nr. 00-8110) oder
Histomount™ (Invitrogen Kat.- Nr. 00-8030)
EMPFOHLENES FÄRBUNGSPROTOKOLLL
A. VORLÄUFIGE VORBEREITUNG DER OBJEKTTRÄGER
-Um reproduzierbare Ergebnisse und zuverlässige Interpretationen zu erhalten, ist eine angemessene Gewebe1. PROBENVORBEREITUNG
2. VORBEREITUNG DER
OBJEKTTRÄGER
3. ENTPARAFFINISIERUNG
UND REHYDRIERUNG
und Antigen-Fixierung erforderlich. Geeignete Fixierungsmittel sind u.a.: 10% neutrales gepuffertes Formalin,
B5, Bouin’s, Zinkformalin oder Fixierungsmittel auf Alkoholbasis.
- Es sollten Zellabstriche von Körperflüssigkeiten gemacht werden, um eine Monozellschicht zu erhalten. Die
Abstriche sollten unmittelbar nach der Präparation fixiert werden. Je nach den Eigenschaften des Antigens
sind die Zellabstriche gewöhnlich für ein bis zwei Wochen stabil, wenn sie bei 4°C aufbewahrt werden.
- Die Fixierung von Cytospin oder gefrorenen Gewebeschnitten kann mit Azeton (100%) bei 4°C für eine
Dauer von 10 Minuten erfolgen.
- Um die Proben zu entspannen, die Gewebeschnitte in einen Behälter mit deionisiertem oder destilliertem
Wasser geben, das auf 40-44°C erwärmt wurde. Dann die flachen und faltenlosen Gewebeschnitte auf einen
mit HistoGrip™ behandelten Objektträger aufziehen. Die sachgemäße Platzierung gewährleistet eine
angemessene Kapillarwirkung, wenn zwei Mikroskop-Objektträger auf dem Objektträgerhalter einander
gegenüber platziert werden.
-Die Objektträger mit HistoGrip™ (Invitrogen Kat.-. Nr. 00-8050) beschichten. Als Alternative können sie
auch mit 0,1% Poly-L-Lysin in Wasser beschichtet und dann an der Luft getrocknet werden.
-Die Paraffinschnitte werden mit Xylen entparaffinisiert und in einer gradierten Serie von Ethanol rehydriert.
Vor dem Beginn des Färbungsverfahrens die Zellabstriche oder Gewebe für 10 Minuten in einem PBS-Bad
waschen.
Hinweis: Die Proben oder Gewebeschnitte ab diesem Zeitpunkt nicht mehr trocknen lassen.
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EMPFOHLENES FÄRBUNGSPROTOKOLL, FORTSETZUNG
B. PROTOKOLL FÜR AUTOMATISIERTE TECHMATE® IMMUNOSTAINER
Dieses Kit wird genau so verwendet wie die ChemMate® Kits. In vielen Fällen kann dieses Kit ohne Änderungen im aktuellen Protokoll
verwendet werden. Die folgenden Schritte dienen als Richtlinie für den Gebrauch der Cap-Plus™ Detektionskits auf automatisierten
Ventana® TechMate® Immunostainern. Vollständige Details sind in der entsprechenden Gebrauchsanleitung des Ventana® TechMate® zu
finden. Dieses Cap-Plus™ Detektionskit kann auch mit anderen automatisierten Immunostainern, die Kapillarspalttechnologie anwenden,
verwendet werden. Weitere Details sind von Invitrogens technischem Kundendienst unter +1-800-874-4494 (gebührenfrei innerhalb der
USA) zu erfahren.
VORBEREITUNG FÜR AUTOMATISIERTES IMMUNOSTAINING
1. Die Gewebe sollten auf mit HistoGrip™ (Invitrogen Kat.- Nr. 00-8050) oder Poly-L-Lysin beschichtete Mikroskop-Objektträger
aufgezogen werden.
2. Unmittelbar vor dem Gebrauch der Mikroskop-Objektträger sollten die Gewebeschnitte in einem normalen Ofen oder einem
Mikrowellenherd gründlich getrocknet werden. Dadurch wird bei der Untersuchung der Ergebnisse das "Wasserfleck"-Phänomen
vermieden. In einem normalen Ofen die Gewebeschnitte auf den Mikroskop-Objektträgern bei 60°C für eine Dauer von mindestens 60
Minuten trocknen lassen. In einem 800-Watt-Mikrowellenherd die Mikroskop-Objektträger in einen Plastik-Objektträgerhalter geben, der
auf die Mitte der Drehscheibe gestellt wird, und bei höchster Stufe 2-3 Minuten lang trocknen lassen. Hinweis: Als Sicherheitsmaßnahme
gleichzeitig einen separaten Wasserbehälter in die Mikrowelle stellen. Den Objektträgerhalter vorsichtig herausnehmen und vor dem
Fortfahren das geschmolzene Paraffin fest werden lassen.
3. Die Gewebeschnitte gemäß den genehmigten Laborverfahren entparaffinisieren (wenn keine vorhanden sind, siehe Tabelle 2 in Anhang
B). Nach der Entparaffinisierung die Gewebe in Puffer 2 des Cap-Plus™ Pufferkits feucht halten. Die Objektträger sollten noch am
gleichen Tag, an dem Sie entparaffinisiert wurden, immungefärbt werden.
4. Alle erforderlichen Gewebevorbereitungsschritte durchführen wie: Epitop-Retrieval (siehe Tabelle 3 in Anhang B), Avidin/BiotinBlocking, Gewebe-Digestion, usw. Konsultieren Sie das Antikörper-Datenblatt.
5. Die Mikroskop-Objektträger nach Antikörper gruppieren.
6. Bestimmen, wieviele Objektträger insgesamt verarbeitet werden sollen und dann die insgesamt erforderliche Anzahl an Ventana®
TechMate® Objektträgerhaltern bestimmen. Pro Protokoll einen Objektträgerhalter verwenden.
7. Mit Hilfe des in der Gebrauchsanleitung enthaltenen Ventana Antikörper-Positionierblatts die Mikroskop-Objektträger für jeden
Ventana® TechMate®-Objektträgerhalter organisieren®.
8. Die Objektträger dem Ventana® Antikörper-Positionierblatt gemäß laden.
9. Die Mikroskop-Objektträger sind jetzt bereit, das automatisierte Immunostaining zu beginnen.
ERSTELLEN DES VOM BENUTZER DEFINIERTEN PROTOKOLS
1. Statusbereich des Map View-Bildschirms: den Mauscursor zu der als LOAD identifizierten Spalte bewegen. Die Maus einmal klicken.
Ein vordefiniertes Protokoll erscheint.
2. Mit der Bildlaufleiste das MIP-Protokoll suchen. Den Cursor zu diesem Protokoll bewegen. Die Maus einmal klicken, um das Protokoll
zu markieren. Jetzt sollte das MIP-Protokoll im File-Feld erscheinen.
3. Einmal auf das kleinere Load-Feld unterhalb des File-Felds klicken. Auf dem Map View-Bildschirm erscheint ein gelbes blinkendes
Feld, das anzeigt, dass dieses Protokoll geladen ist. Der Mauscursor kann jetzt zu der Position auf dem Map View-Bildschirm bewegt
werden, die dem MIP-Protokoll entspricht. Die Maus einmal klicken.
4. Die gewünschte Schablone wird automatisch geladen und der Ventana® TechMate® Kachelbereich ist jetzt mit den Reagenzien
markiert, die für jede Kachel erforderlich sind. Das Protokoll ist auch geladen. Die RUN-Schaltfläche sollte jetzt rot sein, um ein
erfolgreiches Laden des Protokolls anzuzeigen.
Schablonenabkürzungen für den Ventana® TechMate®
BLOK Ab:
HP BLOK:
AB1:
AB2:
ABC:
DAB:
STN:
PAD:
BUF1:
BUF2:
BUF3:
H20
Blockinglösung
Wasserstoffperoxidblock
Primärantikörper oder negative Kontrolle
Biotinylierter Sekundärantikörper
Enzymkonjugat (das Cap-Plus™ Kit verwendet Streptavidin-HRP, kein Vormischen erforderlich)
DAB-Chromogen/Substrat (siehe Reagenzvorbereitung)
Hematoxylin
Aufsaugtücher
Puffer 1
Puffer 2
Puffer 3
Waschwasser
Die Reagenztabletts können jetzt geladen werden.
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LADEN DER BENUTZERDEFINIERTEN REAGENZTABLETTS
1. Ein Antikörper-Positonierblatt ausfüllen, um zu bestimmen, welcher Mikroskop-Objektträger in welchen Objektträgerhalter gehört.
2. Die zuvor in den 10-Mulden-Reagenztabletts geformten Mikroskop-Objektträgerpaare dem Antikörper-Positionierblatt gemäß in den
Objektträgerhalter einsetzen. Hinweis: Die Objektträgerpaare müssen die gleichen Antikörper verwenden.
3. Die Reagenztabletts vorbereiten und sie auf die "Kacheln" der Immunostainer-Plattform platzieren. Die Anzahl der vorbereiteten
Tabletts entspricht der Anzahl der zu verarbeitenden Objektträgerpaare. Auf dem Computerbildschirm erscheint die Schablone für die
Reagenzplatzierung, wenn das Protokoll des Immunostainers geladen ist. Dann ein 10-Mulden-Tablett gemäß Tabelle 1 mit jedem der
folgenden Reagenzien füllen.
Tabelle 1. Anforderungen für jedes Reagenztablett
Cap-Plus-Reagenz
Schablonenabkürz
ungen
Blockinglösung
BLOK AB
Primärantikörper oder
AB1
negative Isotyp-Kontrolle
Biotinylierter Sekundärantikörper
Wasserstoffperoxid-Block
Streptavidin-HRP
DAB-Chromogen/Substrat
Hematoxylin
Puffer 1
Puffer 2
Puffer 3
Waschwasser
AB2
HP BLOK
ABC
DAB
STN
BUF1
BUF2
BUF3
H20
Volumen
Inkubationszeit
8 Tropfen/Mulde
8 Tropfen/Mulde
oder mindestens
350 μl/Mulde
8 Tropfen/Mulde
10 ml/Tablett
8 Tropfen/Mulde
0,75 ml/Mulde
10 ml/Tablett
25 ml/Tablett
25 ml/Tablett
25 ml/Tablett
25 ml/Tablett
10 Minuten
25 Minuten
25 Minuten
3 x 5 Minuten
LAUFPROTOKOLL
Den Mauscursor auf die RUN-Schaltfläche des Statusbereichs platzieren. Die Maus einmal klicken. Die RUN-Schaltfläche, die nach dem
Laden des Reagenzprotokolls rot wurde, sollte jetzt grün sein und anzeigen, dass das MIP-Immunostainer-Protokoll gestartet wurde.
Wenn die Objektträger nicht auf dem TechMate® gegengefärbt wurden, nachdem das TechMate®-Protokoll beendet wurde, können die
Objektträger falls erwünscht entfernt und manuell gegengefärbt und mit einem Deckglas bedeckt werden.
SICHERHEIT UND VORSICHTSMASSNAHMEN
10. Bei der Handhabung der Reagenzien ausreichende Sicherheitsmaßnahmen ergreifen. Beim Umgang mit angenommenen
Karzinogenen Einweghandschuhe, Laborkittel und Augenschutz tragen.
11. Nach dem Gebrauch wie vorgeschrieben aufbewahren. Alle Aufbewahrungsbedingungen, ausser den in der Packungsbeilage
vorgeschriebenen Bedingungen, müssen vom Benutzer validiert werden.
12. Diese Reagenzien nicht mit den Augen oder Schleimhäuten in Kontakt bringen. Bei einem Kontakt dieser Reagenzien mit
empfindlichen Bereichen diese mit reichlich Wasser abwaschen.
13. DAB kann karzinogen sein. Bei der Handhabung von DAB Handschuhe tragen und einen Hautkontakt vermeiden. Nicht
einatmen oder einnehmen.
14. Proclin (0,1%) dient als Konservierungsmittel. Proclin ist bei Einnahme toxisch.
15. Bei der Entsorgung potenziell toxischer Bestandteile die staatlichen bzw. örtlichen Bestimmungen beachten.
16. Proben von Patienten und alle Materialien, die mit diesen in Kontakt kommen, sollten als möglicherweise infektiös
gehandhabt und mit angebrachten Sicherheitsvorkehrungen entsorgt werden.
Niemals mit dem Mund pipettieren und einen Kontakt dieses Reagenz und der Gewebeproben mit der Haut und den
Schleimhäuten vermeiden.
17. In allen Situationen sollten die Vorschriften der CLIA eingehalten werden.
18. Diese Reagenzien sind optimal verdünnt. Eine weitere Verdünnung könnte zu einem Verlust der Antigen-Immunfärbung
führen.
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ANHANG A
Tabelle 2. Entparaffinisierung
Xylen
5 Minuten x 2
100% absoluter Alkohol
3 Minuten x 2
95% Alkohol
3 Minuten
80% Alkohol
3 Minuten
3 %iges H2O2 in absolutem Methanol
3 Minuten
Leitungswasser oder PBS, pH 7.4
5 Minuten
Tabelle 3. Wärmeinduziertes Epitop-Retrieval
Objektträger mit Reagenzwasser waschen
2 Minuten x 3
Die Objektträger in ein Objektträgerrack stellen und in ein mit 500 ml Arbeitslösung
des angemessenen HIER-Puffers gefülltes 1-Liter-Becherglas (Pyrex) platzieren.
Das Becherglas auf eine Heizplatte stellen und zum Sieden bringen
Nach dem Erhitzen das Becherglas von der Heizplatte nehmen und bei Raumtemperatur
abkühlen lassen.
10 Minuten
Mindestens 20 Minuten lang
Die Objektträger mit PBS, pH 7.4 abspülen.
Tabelle 4. Gegenfärbung und Konservierung
Gegenfärbung mit Hämatoxylin
Mehrmals in Leitungswasser waschen, bis das Wasserbad sauber bleibt
Zweimal in Bläulösung platzieren (z.B. 10 mM PBS, pH 7.4)
Zweimal in destilliertem Wasser waschen
Nacheinander in 70%, 95%, 95%, 100% und 100% EtOH dehydrieren. Danach in Xylen
und Xylen. (Bei Gebrauch von AEC nicht dehydrieren)
Mit Histomount™ Mounting-Lösung abdecken
(Bei Gebrauch von AEC GVA Mounting-Lösung verwenden)
Vor dem Betrachten mit dem Lichtmikroskop trocknen lassen
1-2 Minuten
15-20 Sekunden
Insgesamt 3 Minuten
Je 2 Minuten
10 Minuten
ANHANG B.
Tabelle 5. Allgemeine Fehlerbehebung für Immunhistochemie
Problem
Mögliche Ursache
Überfärbung
Hintergrund
Schwaches
Immunostaining
1. Konzentration des primären Antikörpers
2. Inkubationszeit für primären Antikörper und Substrat zu lang
3. Reaktionstemperatur zu hoch
2. Endogene Peroxidase, endogenes Biotin oder alkalische Phosphatase im Gewebe
3. Nicht-spezifische Proteinbindung im Gewebe
4. Unvollständige Entparaffinisierung
5. Unangemessene Verwendung des Spülpuffers
6. Substratreaktion zu lang
7. Lösliches Antigen in Gewebe vorhanden
2. Inkubationszeit des primären Antikörpers zu kurz
3. Natriumazid in Peroxidaseetikett vorhanden
4. Übermäßiger Gebrauch von Spülpuffer führt zur Verdünnung der Reagenzien
5. Inkompatibles Gegenfärbungs- oder Mounting-Medium führt zur Auflösung des Reaktionsprodukts
6. Substrat abgelaufen
Kein Immunostaining
1. Falsches Verfahren
2. Gewebe während Immunostaining-Verfahren ausgetrocknet
3. Kein Antigen im Gewebe vorhanden
Nur Immunostaining der
positiven Kontrolle
1. Unsachgemäße Gewebevorbereitung
2. Kein Antigen im Gewebe vorhanden
3. Antigen durch Formalinfixierung maskiert oder durch Formalinfixierungsmittel oder
Paraffineinbettung denaturiert
4. Übermäßige Gewebeautolyse
5. Gewebe ist Temperaturen über 60oC ausgesetzt
MARKEN
CAS-Block™, Clearmount™, HistoGrip™, Histomount™ und Peroxo-Block™ sind Marken von Zymed Laboratories, Inc. Zymed® und Histostain® sind eingetragene
Marken von Zymed Laboratories, Inc.
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Cap-Plus™ Detection Kit - Thermo Fisher Scientific

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