utilizzazione pratica della citometria di flusso per il

GERBAUX E THOMAS, UTILIZZAZIONE PRATICA DELLA CITOMETRIA DI FLUSSO IN ENOLOGIA, P. 1
UTILIZZAZIONE PRATICA DELLA CITOMETRIA DI FLUSSO PER IL CONTROLLO DEI
LIEVITI IN ENOLOGIA
Vincent GERBAUX e Jérôme THOMAS
IFV, Unità di Beaune
Articolo pubblicato in Revue Française d’Œnologie, n.236, juin-juillet 2009, p. 8-13
Introduzione
Due lieviti sono particolarmente importanti in enologia. Saccharomyces cerevisiae è la specie
indispensabile che realizza la fermentazione alcolica. Brettanomyces è un lievito responsabile di
frequenti deviazioni organolettiche. Il controllo di questi lieviti, tuttavia, si effettua raramente.
Gli analizzatori automatici hanno migliorato in modo sostanziale i controlli chimico-fisici in enologia,
ma a confronto le analisi microbiologiche hanno visto scarso sviluppo. Tale situazione, paradossale
per un prodotto della fermentazione, si spiega con il fatto che il vino ha una composizione che lo
protegge dai germi patogeni e quindi i controlli microbiologici non sono obbligatori. Ma il controllo
microbiologico deve essere riconsiderato, rispetto al doppio obiettivo di miglioramento qualitativo e di
riduzione dei costi di produzione. Il costo analitico deve allora essere conteggiato.
La citometria di flusso non è una tecnica nuova. Tuttavia, i progressi dell’ottica e dell’elettronica
permettono oggi di proporre apparecchiature efficaci ed adatte ai laboratori enologici. L’IFV ha
sviluppato un metodo di conteggio dei lieviti viventi che fa uso della citometria di flusso. Per valutare
le diverse possibilità d’applicazione pratica sono stati considerati sia i vini commerciali che vini
ottenuti in condizioni sperimentali.
Materiali e metodi
Il citometro di flusso utilizzato è un modello Cyflow SL (società Partec), equipaggiato con un laser blu
e due rilevatori (dimensione delle particelle e fluorescenza). L’analisi vera e propria consiste nel
miscelare 0.4ml di vino, 0.4 ml di un tampone specifico e 8 µl di fluorocromo (Fluorescina di-acetato,
FDA), attendere 10 minuti, quindi iniettare il campione nel citometro di flusso. Il conteggio dei lieviti si
ottiene in meno di 15 minuti. In 1 ora è possibile analizzare 14 campioni. La zona di numerazione è
da 100 a 1 milione di cellule per millilitro senza preparazione del campione : attraverso
centrifugazione o diluizione è possibile ampliare lo spettro d’azione dello strumento.
Il metodo non è specifico, e può essere utilizzato per il conteggio sia di Saccharomyces sia di
Brettanomyces. Salvo casi particolari, questi due lieviti si succedono durante la vinificazione:
Saccharomyces predomina durante la fermentazione alcolica e Brettanomyces ha la capacità di
svilupparsi più tardi nei vini secchi, durante l’affinamento o anche in bottiglia. Il fatto che il metodo di
conteggio dei lieviti viventi per citometria di flusso non sia specifico, lo rende interessante per molte
situazioni.
Come per tutte le analisi microbiologiche, è molto importante adottare alcune precauzioni in fase di
prelievo. Per il controllo di Brettanomyces nei vini in affinamento, il prelievo deve evitare di
interessare i lieviti in superficie. Quando si preleva dalla barrique si consiglia l’impiego di una siringa
inserita in un tubo capillare. Il campione non deve subire inquinamenti da parte dei lieviti presenti
sulle superfici. Per diverse ragioni, tra cui la sedimentazione, la popolazione di Brettanomyces è
crescente spostandosi dalla superficie verso il fondo del contenitore: si consiglia quindi di effettuare il
prelievo appena sopra il livello delle fecce. È importante inoltre accertarsi che la fermentazione
alcolica sia completamente terminata e che quindi i lieviti Saccharomyces cerevisiae presenti siano
poco o per nulla attivi.
Il metodo di riferimento utilizzato per il conteggio dei lieviti è l’incubazione in scatola Petri in stufa a
28°C con il 5% di CO2. Per la crescita si è utilizzato il terreno agarizzato YPD (estratto di lievito,
peptone e destrosio). Per Saccharomyces cerevisae, l’incubazione è di 2-3 giorni. Per il conteggio dei
“lieviti totali” è necessario attendere 7 giorni. Per valutare la popolazione di Brettanomyces, il terreno
YPS è addizionato di 50 mg/l di cicloesimide, che inibisce Saccharomyces cerevisiae, e l’incubazione
è di 7 giorni.
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Controllo di una fermentazione alcolica. Un mosto Chardonnay è stato ripartito in 3 lotti :
testimone, con aggiunta di solo fosfato d’ammonio (40 g/hl dopo una caduta di 25 punti densità), con
aggiunta dei fosfato d’ammonio come nella tesi precedente e di un nutriente complesso (20 g/hl dopo
una caduta di densità tra 5 e 25 punti). La popolazione blastomicetica presente è stata seguita con
citometria di flusso. La crescita dopo l’inoculo è risultata rapida (Figura 1).
La fase stazionaria viene
raggiunta con 60-70 milioni dei
Témoin
Phosphate d'A.
Activateur FA
cellule nei tre lotti sperimentali.
Témoin
Phosphate d'A.
Activateur FA
Tale livello di popolazione
resta praticamente costante
1,10
8,0
durante
la
fermentazione
alcolica, che avviene aduna
1,08
7,5
temperatura di 16-18°C. La
caduta
della
densità
è
Chaptalisation
accelerata
in
presenza
di
1,06
7,0
fosfato d’ammonio ed ancor
più
con
l’aggiunta
1,04
6,5
complementare di nutrienti
complessi. In queste ultime
due tesi, la popolazione dei
1,02
6,0
lieviti
vivi
decresce
rapidamente una volta esauriti
gli zuccheri (meno di 0.2g/l
1,00
5,5
misurati a 25 giorni). Nel lotto
testimone la popolazione di
0,98
5,0
lievito resta a livelli elevati più
0
7
14
21
28
a lungo, e la fine della
Temps (jours)
fermentazione alcolica è più
stentata (3.8 g/l di zuccheri a
Figura 1 : Evoluzione della densità e della popolazione di lieviti vivi
25 giorni).
durante la fermentazione alcolica di un mosto chardonnay
Population (log cellules / ml)
Densité
Risultati e Discussione
Fase 1 :
Acqua + zuccheroi + fosfato d’ammonio
+ lieviti secchi attivi
8 ore (35°C iniziali, quindi 20°C)
Fase 2 :
+ vino + acqua + zucchero + fosfato d’ammonio
48 ore a 20°C
Tirage 1 : 30 % del volume
Colmatura con mezzo nuovo
48 ore a 20°C
Tirage 2 : 30 % del volume
Colmatura con mezzo nuovo
72 ore a 20°C
Tirage 3 : 30 % del volume
Colmatura con mezzo nuovo
48 ore a 20°C
Tirage 4
Durante lo svolgimento della fermentazione alcolica, la
citometria di flusso permette quindi di seguire in tempo reale la
popolazione di Saccharomyces cerevisiae. Una caduta della
popolazione vivente, in corrispondenza di una fermentazione
alcolica stentata, dà il segnale della necessità di un ulteriore
inoculo e permette d’anticipare l’intervento.
Controllo di un pied de cuve. Un vino chardonnay,
caratteristico di un vino base spumante, è stato aggiunto di 24
g/l di zucchero dopo essere stato ripartito in flaconi con tappo
a vite, per la simulazione di una presa di spuma. Il protocollo
d’ottenimento di un pied de cuve si ispira alla tecnica
sviluppata dal CIVC. Alla fine del periodo consigliato, il pied de
cuve è mantenuto per la realizzazione di inoculi successivi,
per un periodo di 1 settimana (schema 1). Le analisi dei tenori
in zucchero mostrano che al momento del secondo tirage il
pied de cuve è in situazione di carenza, diversamente da
quanto avviene al momento degli altri tiraggi.
Schema 1 : Protocollo d’ottenimento di un pied de cuve per
l’elaborazione di vini spumanti (fonte CIVC) e suo mantenimento
per la realizzazione dei tiraggi successivi
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vivantes
mortes
7,0
Tirage 1
Tirage 2
Tirage 4
6,5
Tirage 3
6,0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Temps (jours)
Figura 2 : Evoluzione della popolazione di lievito in un pied de cuve
mantenuto per realizzare tiraggi successivi.
Il controllo dei lieviti vivi durante la presa di spuma mostra una crescita immediata e regolare nel
primo tiraggio, con una fase stazionaria leggermente superiore a 1 milione di cellule / ml (Figura 3).
6,5
Population (log cellules / ml)
Population (log cellules / ml)
7,5
La figura 2 mostra che la
popolazione di lieviti vivi
aumenta leggermente durante
la fase di preparazione del pied
de cuve. Nonostante l’aggiunta
di nuovo vino base, la
popolazione di lievito si riduce
nel secondo e terzo tirage,
probabilmente
a
causa
dell’esaurimento
degli
zuccheri. Una nuova fase di
crescita
si
constata
in
occasione del quarto tiraggio.
In parallelo è stato seguito il
numero di cellule morte
utilizzando una fluoro cromo
specifico (ioduro di propidio). Il
numero di cellule morte
aumenta in corrispondenza del
primo e secondo tiraggio per
stabilizzarsi in seguito.
6,0
Tirage 1
Tirage 2
5,5
Tirage 3
Tirage 4
5,0
0
7
14
21
28
Temps (jours)
Nel caso del secondo tiraggio, si
nota un tempo di latenza di una
settimana, che conferma lo stato
fisiologico non ottimale delle
cellule. Nel terzo e quarto
tiraggio la crescita immediata e
rapida. Il livello di popolazione in
fase stazionaria è di circa 1,6
milioni di cellule, superiore a
quello del primo tiraggio.
La citometria di flusso permette
quindi di seguire la dinamica
della popolazione in un pied de
cuve destinato alla presa di
spuma o alla ripresa di
fermentazione e di aggiustare di
conseguenza le operazioni.
Figura 3 : Evoluzione della popolazione di lieviti vivi durante la presa
di spuma a seguito di tiraggi successivi.
Mutizzazione. Per simulare questa operazione, sono stati mutizzati con diverse dosi di SO2 tre mosti
di chardonnay, prelevati a diverse concentrazioni di zuccheri ed alcool. La popolazione blastomicetica
al momento della mutizzazione è nell’ordine dei 50 milioni di cellule per tutti e tre i mosti (Tabella 1).
Nel mosto 1 (all’inizio della fermentazione alcolica) una dose di 100mg/l di SO2 riduce la popolazione
di lievito di tre log, ed una dose di 150 mg/l permette d’eliminarla totalmente. Nel mosto 2, 100 mg/l
sono sufficienti per uccidere tutti i lieviti. Nel mosto 3 (il più avanti nella fermentazione alcolica) 50
mg/l di SO2 producono un effetto visibile ma limitato e 100mg/l eliminano la popolazione. Le misure
effettuate 24 e 48 ore dopo la mitizzazione danno risultati simili.
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Lieviti vivi
Tabella 1 : Evoluzione della
popolazione di lieviti vivi
dopo mutizzazione con SO2
di mosti chardonnay.
Solfitaggio (mg/l)
Tempo
0
(log cellule/ml)
50
100
150
Mosto 1 :
T0
7,7
5.0 % v/v
24 h.
7,7
7,6
4,4
< 2.0
120 g/l zuccheri
48 h.
7,7
7,5
4,3
< 2.0
Mosto 2 :
T0
9.0 % v/v
24 h.
7,7
7,4
< 2.0
< 2.0
60 g/l zuccheri
48 h.
7,8
7,2
< 2.0
< 2.0
Mosto 3 :
T0
11.0 % v/v
24 h.
7,6
6,2
< 2.0
< 2.0
30 g/l zuccheri
48 h.
7,5
5,3
< 2.0
< 2.0
7,8
7,5
La
citometria
di
flusso
permette di realizzare dei test
preventivi sui mosti destinati ai
vini liquorosi, per determinare
la
dose
di
solforosa
necessaria al trattamento.
Questa tecnica può essere
alternativa
ai
test
di
combinazione della SO2. Può
inoltre rivelarsi interessante
per
una
mitizzazione
a
posteriori.
Controllo di Brettanomyces nei vini rossi durante l’affinamento. Il livello di contaminazione da
Brettanomyces è stato determinato su 144vini rossi campionati specificatamente per questa analisi
(vedi materiali e metodi). Si è trattato di vini secchi e generalmente contenuti in barrique. La
determinazione per citometria di flusso è stata accompagnata da un conteggio su piastra (usando
terreno YPD addizionato di cicloesimide).
Le popolazioni blastomicetiche determinate con citometria di flusso si sono rivelate fortemente
correlate con le popolazioni determinate in piastra (tabella 2). Per questa applicazione, il limite
inferiore di determinazione è fissato a 200 cellule/ml per la citometria di flusso (tenendo conto della
diluizione 50:50 con il tampone). In tutti i vini analizzati, il conteggio su capsula di Petri ha sempre
indicato meno di 200 Brettanomyces per ml.
Classi di
popolazione in
citometria di flusso
(cellule / ml)
Numero
di vini
Torbidità
media
(NTU)
Superiore a 20 000
11
Tra 2 000 e 20 000
Popolazione media
(cellule/ml)
Citometria
di flusso
Capsula
Petri
557
243 000
211 000
22
132
7 750
5 120
Tra 200 e 2 000
43
36
605
439
Inferiore a 200
68
22
Inf. à 200
19
Coefficiente di
correlazione
tra citometria e
capsula Petri
0.99
Tabella 2 : Determinazione della popolazione di Brettanomyces in 144 vini rossi durante l’affinamento
In qualche caso la determinazione su capsula Petri indica popolazioni largamente inferiori a quelle
ottenuto per citometria di flusso. Sono possibili diverse spiegazioni al fenomeno. Il campione può
essere inquinato da lieviti di superficie o di materiale. Può esistere una popolazione attiva di
Saccharomyces cerevisiae parallelamente alla fine di una fermentazione alcolica stentata. Infine,
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Brettanomyces può essere in uno stato fisiologico che impedisce la sua crescita su piastra, come
mostra l’esperimento seguente.
Cytométrie : Témoin
Cytométrie : 30 mg/L SO2
Boîte de Pétri : Témoin
Boîte Pétri : 30 mg/L SO2
Population (log cellules / ml)
7
6
cellules mortes
5
cellules vivantes non cultivables
4
3
cellules vivantes
2
0
2
4
6
8
Temps (jours)
10
12
14
Figura 4 : Evoluzione della popolazione di Brettanomyces in un vino
rosso solfitato o non solfitato.
Una massa di pinot noir
contaminata da Brettanomyces
viene suddivisa in due lotti:
testimone e tesi addizionata di
30 mg/l di SO2.
Nel
lotto
testimone,
la
popolazione resta elevata ed i
risultati ottenuti con i due
metodi
sono
comparabili
(Figura 4).
Nel caso del lotto solfitato, i
risultati sono diversi secondo il
metodo
utilizzato.
La
popolazione che cresce in
piastra rappresenta i lieviti
coltivabili. La citometria di
flusso, invece, conteggia tutti i
lieviti viventi, siano essi
coltivabili o no. Questi risultati
mettono in evidenza uno stato
“vivente ma non coltivabile” di
Brettanomyces.
Una sperimentazione complementare mostra la relativa buona tolleranza di Brettanomyces alla SO2
(Tabella 3). Un’ora circa dopo l’aggiunta, solamente una dose di 50 mg/l elimina il 95% della
popolazione. La dose di 30 mg/l elimina il 22% La dose de 30 mg/l élimine 22% della populazione di
Brettanomyces nel vino 1 e l’81 % nel vino 2. L’efficacia della solfitazione dipende dalle
caratteristiche del vino (in particolare il pH) e dalla popolazione di Brettanomyces.
SO2
0 mg/l
10 mg/l
30mg/l
50mg/l
Vin 1
38.000
36.000
29.500
2.150
Vin 2
345.000
355.000
66.500
10.800
Tabella 3 : Effetto immediato della SO2 sulla
popolazione di Brettanomyces in due vini rossi
contaminati (cellule/ml)
Durante lo svolgimento della fermentazione malolattica e l’affinamento dei vini rossi, la citometria di
flusso permette quindi di seguire la presenza ed il livello della popolazione di Brettanomyces. La
messa in evidenza di una crescita cellulare informa sul grado d’urgenza di un’operazione di
stabilizzazione microbiologica,che può così essere realizzata prima della comparsa di odori fenolati.
Parallelamente, la citometria di flusso permette di realizzare test di stabilizzazione dei vini contaminati
da Brettanomyces, e di verificare l’efficacia di un’operazione di stabilizzazione nel tempo.
Messa in evidenza di uno sviluppo di lieviti in un vino in bottiglia
Su 43 vini bianchi in bottiglia che presentavano torbidità sono stati effettuati dei conteggi dei lieviti vivi
presenti. L’analisi in citometria di flusso è stata realizzata in parallelo con la coltivazione in piastra su
terreno non specifico. La popolazione determinata in citometria di flusso è ben correlata con quella
ottenuta in piastra per livelli di popolazione superiori a 200 cellule/ml (tabella 4). Con contaminazioni
inferiori, la citometria di flusso non è abbastanza precisa e dà valori superiori a quelli del conteggio in
piastra. La torbidità del vino non è in relazione con la popolazione di lieviti vivi presente.
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Classi di populazione
in citometria di flusso
(cellule / ml)
Numero
di
vini
Torbidità
media
(NTU)
> 20 000
9
> 2 000 e < 20 000
Popolazione media
(cellule / ml)
Citometria di
flusso
Capsula
Petri
4,8
90.700
73.800
4
5,7
2.650
2.700
> 200 e < 2 000
7
5,6
830
920
< 200
23
7,3
70
24
Coefficiente
di
correlazione
0,87
0,41
Tabella 4 : Determinazione della popolazione di lieviti vivi in 43 vini bianchi in bottiglia che presentavano
torbidità
Altre determinazioni di Brettanomyces hanno interessato 81 vini rossi in bottiglia. La valutazione della
popolazione è stata effettuata per citometria di flusso e con conteggio in piastra su terreno YPD
aggiunto di cicloesimide. I risultati ottenuti con i due metodi sono fortemente correlati (tabella 5). I
dati sulle popolazioni determinate con citometria di flusso tendono tuttavia ad essere più bassi. La
popolazione vivente di Brettanomyces in una bottiglia è più o meno vecchia e può essere composta
da cellule viventi ma non coltivabili, quindi che non vengono messe in evidenza dal conteggio su
piastra. La torbidità rilevata non è legata alla popolazione determinata.
Popolazione media
(cellule / ml)
Classi di
popolazione in
citometria di
flusso
(cellule / ml)
Numero
di
vini
Torbidità
media
(NTU)
> 20 000
2
18
176.700
189.800
> 2 000 e < 20 000
12
78
6.800
3.800
> 200 e < 2 000
19
88
570
100
< 200
48
55
< 200
3
Citometria di
Capsula Petri
flusso
Coefficiente
di
correlazione
0,99
Tabella 5 : Determinazione della popolazione di Brettanomyces in 81 vini rossi in bottiglia
La citometria di flusso si applica al controllo dei vini in bottiglia, sia per assicurare una buona stabilità
microbiologica nel tempo, sia per dare spiegazione a difetti insorti. Tale tecnica analitica può anche
dare un’informazione interessante per la preparazione dei vini all’imbottigliamento. La conoscenza
della popolazione blastomicetica vivente, in questa fase, permette d’orientare di conseguenza le
operazioni di stabilizzazione. Per quanto riguarda nello specifico Brettanomyces, questo controllo può
evitare le contaminazioni incrociate legate alle attrezzature.
Conclusioni
I lavori presentati mostrano che oggi la citometria di flusso si presta a numerose applicazioni in
campo enologico. Il metodo proposto è semplice e rapido. Il fatto che non sia specifico per una
specie può rappresentare un vantaggio. Quando la citometria di flusso indica popolazioni al di sotto di
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200cellule/ml, il problema della specificità non si pone nemmeno. Se l’analisi citometrica evidenzia la
presenza di una popolazione blastomicetica vivente, è interessante ottenere le informazioni
complementari sulla massa analizzata per la corretta interpretazione dei risultati: svolgimento della
fermentazione alcolica ed eventualmente malolattica, solfitazione … Se persiste un dubbio, è sempre
possibile ricorrere alle tecniche più specifiche (conteggio in piastra, PCR quantitativa).
E stato sviluppato un citometro di flusso adatto alle applicazioni enologiche (Oenolyser, Società
Partec), oltre ad un kit di dosaggio che permette di riprodurre il metodo d’analisi messo a punto
dall’IFV (Kit OenoYeast). Il Cyflow SL, utilizzato per i lavori presentati, e l’Oenolyser sono stati messi
a confronto nell’analisi di 30 vini (10 bianchi e 20 rossi). I risultati ottenuti con i due apparecchi sono
molto simili dal punto di vista microbiologico (tabella 6).
Popolazione di lieviti
(cellule / ml)
Media
Minimo
Massimo
Cyflow SL
Oenolyser
40.600
40
320.000
37.100
30
360.000
Tabella 6 : Confronto tra citometri di flusso nella determinazione della popolazione blastomicetica in 30 vini
bianchi e rossi
La citometria di flusso è quindi oggi a disposizione dei laboratori enologici. Tale tecnica non necessita
di condizioni operative particolari. Tuttavia, è in grado di dare un’informazione microbiologica che
richiede un’interpretazione specifica per il settore. Le condizioni di prelievo del campione sono
importanti ed impongono l’applicazione di una procedura scritta. La citometria di flusso offre nuove
possibilità di sviluppo per l’enologia predittiva e preventiva.
Bibliografia
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-Renouf, V., Lonvaud-Funel, A., Walling, E., Coulon, J. 2006. "Le suivi microbiologique du vin. 2 : Conseils
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en cours d’élevage : Effet souche et influence des traitements par le SO2. Rev. Fr Oenol., 219, 1-6.
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