Controllo microbiologico delle superfici

Transcript

numero 1
dicembre 2005
IL MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO DELLE SUPERFICI
Soprattutto in ambito farmaceutico, ma sempre di più anche nel settore alimentare, è
fondamentale minimizzare il rischio di contaminazione microbiologica nelle aree produttive. E’
compito del Controllo Qualità e dei Laboratori di supporto garantire un monitoraggio costante,
che consente di intervenire per tempo qualora si presentino contaminazioni che possono influire
negativamente sui processi produttivi.
I controlli ambientali di tipo microbiologico sono volti soprattutto a monitorare le superfici e
l’aria, ed in questo numero tratteremo in particolare il controllo delle superfici.
A seconda del grado d’igiene necessario nei vari processi e del tipo di prodotto trattato, ogni
unità operativa dovrà seguire propri standard di controllo. E’ possibile in ogni caso tracciare
alcuni criteri universali, facendo riferimento alle GMP, alle farmacopee e alle linee guida
esistenti in ambito farmaceutico e alimentare (es. FSA e FDA). Si tratta quindi di impostare un
piano di monitoraggio, il quale dovrà descrivere:
1. Il campionamento, aree e frequenza
2. I sistemi di monitoraggio
3. I limiti di “allerta” e di “azione”
4. Le risposte alle eventuali deviazioni dai limiti.
1. CAMPIONAMENTO: AREE E FREQUENZA
La definizione delle aree d’interesse e della frequenza dei campionamenti deve essere
successiva all’esecuzione di uno studio preliminare, che permette di tracciare il profilo della
flora microbica (o bioburden) presente nell’ambiente. Lo studio consente di identificare i
cosiddetti “punti critici” ed è necessario per individuare le possibili fonti di contaminazione e
l’eventualità di fenomeni ciclici. Il campionamento riguarda le più diverse superfici (pavimenti,
pareti, attrezzature, …) ed è prioritario quando è previsto il contatto diretto con i prodotti; esso
è condotto prima, durante e dopo situazioni operative ma è utile anche dopo operazioni di
disinfezione e pulizia, per verificarne l’efficacia.
Il numero di campioni da considerare varia secondo l’estensione dell’area da monitorare.
A titolo di esempio, consideriamo un impianto farmaceutico per produzione sterile. Le aree
delle “Clean Rooms” sono classificate in 4 gradi, secondo il livello di attenzione richiesto:
- Grado A: aree in cui si svolgono operazioni asettiche ad alto rischio, in cui è prevista
l’esposizione del prodotto all’ambiente (es. riempimento di flaconi).
- Grado B: locali in cui si svolgono attività asettiche, che includono le aree a Grado A
KAIROSafe review n. 1, dicembre 2005
1/8
- Gradi C e D: locali meno critici, in cui si svolgono operazioni accessorie (es. preparazione di
soluzioni da filtrare).
Le aree a Grado A e B richiedono un monitoraggio più accurato e frequente. Se, ad esempio, i
gradi A e B richiedono un monitoraggio di superfici, aria ed operatori al termine di ogni turno,
per gli altri gradi è sufficiente un controllo giornaliero o settimanale. La frequenza va in ogni
modo incrementata all’aumentare dell’operatività dell’area.
2. SISTEMI DI MONITORAGGIO
Attualmente, i sistemi più utilizzati per il monitoraggio microbiologico delle superfici sono i
tamponi e le piastre da contatto. Nuove metodiche prevedono l’utilizzo di spugnette e slides,
molto utili in specifiche circostanze.
2.1 TAMPONI (SWABS)
E’ un semplice sistema costituito da uno stelo rigido (in plastica,
legno o alluminio) e da una testa morbida (in cotone, fibra
sintetica o alginato). Sono utilizzati sia in campo alimentare sia
farmaceutico e clinico, per la loro semplicità d’utilizzo e per la
versatilità di applicazione su molteplici superfici. I tamponi sono
indicati soprattutto per le superfici irregolari o per i punti non
agevoli da raggiungere. La difficile ripetibilità rende comunque il
sistema più adatto per analisi qualitative piuttosto che
quantitative.
Caratteristiche
I tamponi possono essere confezionati in blister o provette, e sono spesso inclusi in veri e propri
kit che, oltre al tampone stesso, comprendono un terreno liquido o semisolido che può fungere
da terreno di trasporto. I tamponi possono essere asciutti o preumidificati.
Campionamento
La procedura di campionamento deve essere standardizzata per minimizzare la variabilità dei
risultati. Vi sono alcune fasi fondamentali da seguire:
- Delimitazione dell’area da campionare con una maschera sterile (tipicamente 10x10 cm2).
- Estrazione del tampone sterile dal proprio involucro.
- Umidificazione con la soluzione appropriata; eliminazione dell’eventuale liquido in eccesso
premendo il tampone sulla parete della provetta.
- Campionamento dell’area in esame, strisciandovi il tampone orizzontalmente, verticalmente e
diagonalmente per circa 20 secondi; il tampone va ruotato in modo che tutta la testa entri in
contatto con la superficie.
- Inserimento del tampone nella provetta contenente il terreno prescelto (soluzione
neutralizzante o terreno di trasporto).
- Striscio immediato su piastra oppure conservazione a +4°C fino al momento dell’analisi.
2/8
La scelta del tipo di tampone deve tenere conto della necessità di non interferire con il recupero
dei microrganismi, sia nella fase di campionamento sia in quella di conservazione. Negli ultimi
anni sono state compiute notevoli innovazioni in questo senso, con modifiche apportate sia ai
materiali utilizzati per i vari componenti sia ai terreni di trasporto per la conservazione dei
campioni. In alternativa al cotone, sono state sviluppate fibre sintetiche (viscosa, dacron, rayon)
e gel (alginato) che ottimizzano il recupero dei microrganismi dalle superfici senza interferirne
con la crescita. L’alginato, in particolare, consente un recupero totale dei microrganismi
raccolti, andando a sciogliersi completamente nella soluzione in cui è immerso dopo il
campionamento.
Il terreno di conservazione del tampone può essere costituito da una semplice soluzione
neutralizzante (in grado di neutralizzare l’effetto dei disinfettanti utilizzati per la pulizia delle
superfici, si veda la Tabella 1) oppure da un vero e proprio terreno di trasporto. La formulazione
deve in ogni caso consentire la conservazione del campione mantenendone inalterate le
caratteristiche. Un esempio di terreno di trasporto è costituito dal Maximum Recovery Diluent,
soluzione isotonica con un basso contenuto di peptone, particolarmente indicato quando il
campione deve essere sottoposto a successive diluizioni.
Tabella 1: Agenti neutralizzanti più utilizzati e loro spettro d’attività
Agente neutralizzante
Spettro d’attività
Glicina o Istidina
Aldeidi e fenoli
Lecitina
Composti di ammonio quaternario
Polisorbato 80
Fenoli
Sodio solfito
Formaldeide e glutaraldeide
Sodio tioglicollato
Composti a base di mercurio
Sodio tiosolfato
Composti alogenati
La novità più recente è rappresentata dai tamponi preumidificati. Si tratta di tamponi con la
testa già imbevuta di una soluzione neutralizzante accuratamente bilanciata, ed il vantaggio
evidente è di non dover umettare il tampone prima dell’utilizzo. Altrettanto interessanti sono i
metodi che prevedono l’utilizzo delle spugnette. Il vantaggio di poter campionare una superficie
ben più ampia rispetto al tampone è importante soprattutto nel settore alimentare, per la
ricerca di Listeria e Salmonella. In modo molto simile al prelievo col tampone, una spugna sterile
umettata è passata sulla superficie da esaminare, quindi riposta in un sacchetto sterile da cui,
dopo un passaggio in stomacher, è prelevata un'aliquota da inoculare in piastra Petri.
Tamponi e spugnette nel catalogo KAIROSafe
Kairosafe propone una vasta gamma di sistemi per il controllo microbiologico delle superfici.
Oltre ai sistemi più semplici e classici, spiccano i tamponi preumidificati e spugnette di vario
tipo, prodotti da TSC Ltd, azienda leader del settore. Nelle pagine seguenti si trovano
un’esauriente scheda prodotta relativa ai tamponi preumidificati e una lista dei vari prodotti
disponibili.
3/8
SCHEDA PRODOTTO
TAMPONI PREUMIDIFICATI
Innovativi device che rendono semplice e veloce il monitoraggio microbiologico delle
superfici. Possono essere utilizzati in campo alimentare, farmaceutico e clinico.
Caratteristiche
Il prodotto consiste in un tamponcino con stelo in polistirene e testa in viscosa, contenuto
in una provetta di polipropilene, confezionato in “peel pouch” e sterilizzato con raggi
gamma.
La testa in viscosa è preumidificata con una soluzione neutralizzante propriamente
formulata, che neutralizza i disinfettanti comunemente utilizzati e non interferisce con la
crescita dei microrganismi durante la conservazione ed il trasporto del campione.
Vantaggi

Semplice da utilizzare, non occorre umettare il tampone
Confezionamento singolo in peel-pouch
Etichettatura sulla provetta per consentire l’identificazione del campione
Conservazione a temperatura ambiente
Possibilità di formulazioni custom made
Documentazione tecnica che accompagna il prodotto
Certificato di Qualità lotto-specifico
Istruzioni d’uso
Scheda tecnica
Conservazione e stabilità
I tamponi possono essere conservati a temperatura ambiente per un massimo di 6 mesi
Lista dei sistemi offerti da KAIROSafe
per il controllo microbiologico delle superfici
Tamponi asciutti senza provetta
Tamponi asciutti in provetta di polipropilene
Tamponi in provetta con neutralizzante
Tamponi preumidificati in provetta
Tamponi in provetta con Maximum Recovery Diluent
Tamponi in provetta con terreni di trasporto Amies, Cary Blair e Stuart
Spugnette asciutte o con neutralizzante. Spugnette con e senza manico
Quadrato di campionamento 10x10 cm2
4/8
2.2 PIASTRE DA CONTATTO
Si tratta di piastre con diametro di 55 mm (superficie 24 cm2) e fondo grigliato. Sono riempite
con agar a formare una superficie convessa e sono identificate con il nome commerciale di
RODAC (Replicate Organism Detection And Counting).
L’utilizzo di queste piastre è molto diffuso grazie soprattutto
alla semplicità di utilizzo ed alla ripetibilità dei risultati
ottenuti. La disponibilità di vari tipi di confezionamento le rende
particolarmente adatte al controllo delle aree sterili per
produzioni farmaceutiche. Possono essere utilizzate su una gran
varietà di superfici, purché lisce e di facile accesso, e
presentano solo lo svantaggio di lasciare tracce di agar nel punto
di campionamento, richiedendo quindi una pulizia accurata dopo
l’operazione.
Le piastre possono essere confezionate in due modi:
- Semplice (film termorestringente), per l’uso in ambienti senza particolari esigenze asettiche.
- Con più involucri e radiosterilizzate, per l’utilizzo in isolatori o clean room farmaceutiche. Gli
involucri sono eliminati gradualmente nel passaggio dalle aree meno critiche (grado C e D) a
quelle con più alto grado d’attenzione (grado A e B).
Campionamento
Il loro utilizzo è molto semplice, infatti, è sufficiente:
- Asportare gli involucri esterni e selezionare un numero appropriato di piastre.
- Togliere il coperchio dalla piastra.
- Appoggiare il lato con l’agar alla superficie da campionare, premendo leggermente per circa
10 secondi, oppure utilizzare gli appositi applicatori, che consentono di standardizzare sia la
pressione sia il tempo d’applicazione.
- Chiudere la piastra con il coperchio ed incubare alle condizioni indicate.
- Dopo l’incubazione procedere alla lettura dei risultati: il numero di Unità Formanti Colonie
(UFC) va riferito alla superficie della piastra.
Caratteristiche
Le piastre per controlli ambientali contengono di solito TSA, SDA o PCA. In commercio si trovano
anche altre formulazioni, quelle offerte da Kairosafe sono elencate brevemente nella Tabella 2.
Tabella 2: Terreni disponibili in piastre Rodac per il controllo di superfici
Terreno
Utilizzo
MacConkey Agar
Coliformi
Plate Count Agar (PCA)
Carica batterica totale, ramo alimentare
Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
Funghi e lieviti
SDA + Cloramfenicolo
Funghi e lieviti su superfici contaminate
Tryptic Soy Agar (TSA)
Carica batterica totale
VRBG Agar
Coliformi
5/8
Nella scelta del tipo di terreno, va considerata l’esigenza di neutralizzare l’effetto battericida o
batteriostatico dei disinfettanti utilizzati per la pulizia delle superfici, per questo ai normali
terreni possono essere aggiunti agenti neutralizzanti, di cui abbiamo già parlato nelle pagine
precedenti (torna a Tabella 1).
Inoltre, per gli ambienti in cui si ritiene presente una contaminazione da antibiotici è previsto
l’utilizzo di piastre con TSA a cui sono state aggiunte la Beta-lattamasi (enzima per
l’inattivazione di tutti gli antibiotici beta-lattamici) oppure la Penasi (enzima in grado di
inattivare le sole penicilline). L’aggiunta di questi enzimi neutralizza gli antibiotici presenti
nell’ambiente, in modo che la crescita dei batteri ad essi sensibili non sia più inibita.
Alternativamente alle piastre rodac, per il controllo microbiologico ambientale si possono usare
le cosiddette "slides a contatto”, palette di plastica con applicazione di agar su entrambi i lati.
Come per le piastre, il tempo di contatto con la superficie da controllare è di circa 10 secondi.
Si procede quindi con l’incubazione alle condizioni indicate per i vari tipi di terreno.
Piastre Rodac nel catalogo KAIROSafe
Kairosafe propone una vasta gamma di piastre per il controllo microbiologico ambientale, sia
contenenti terreni con formulazione classica che con aggiunta di neutralizzanti o enzimi. Tra
queste spiccano sicuramente le piastre con TSA e Beta-lattamasi prodotte da Labobasi SA,
azienda specializzata nella produzione di terreni di coltura pronti.
SCHEDA PRODOTTO
LE PIASTRE CON BETA-LATTAMASI
Piastre Rodac 55 mm, oppure piastre 90 mm, con TSA e Beta-lattamasi per il controllo
microbiologico di ambienti contaminati da antibiotici beta-lattamici.
Piastre Rodac 55 mm con TSA + Beta-lattamasi + neutralizzanti
Le piastre sono radio-sterilizzate e in triplo involucro per l’uso in camere sterili e in
isolatori. Le piastre Rodac sono disponibili anche in confezione semplice.
Quando usare la Beta-lattamasi:
La Beta-lattamasi è un enzima ad ampio spettro che agisce su tutti gli antibiotici betalattamici (penicilline e cefalosporine). Da usare negli impianti di produzione di
antibiotici beta-lattamici.
La Penasi (o penicillinasi) si limita all’azione su una gamma di penicilline, escludendo del
tutto le cefalosporine.
Documentazione tecnica che accompagna il prodotto
Certificato di Qualità
Scheda tecnica dettagliata
Scheda di sicurezza
6/8
3. RISULTATI DEL CAMPIONAMENTO E LIMITI
Il risultato del monitoraggio microbiologico delle superfici si esprime in Unità Formanti Colonie
(UFC)/unità di superficie. Utilizzando i tamponi, si fa riferimento ad una maschera di
campionamento 10x10 cm2 ed il risultato è espresso in UFC/100 cm2. Utilizzando le piastre da
contatto, si considera la superficie della piastra stessa ed il risultato è espresso in UFC/24 cm2.
Comunque, è preferibile considerare ogni campione in modo indipendente, piuttosto che
analizzare la media fra più prelievi. Ciò consente di individuare le contaminazioni localizzate.
Il giudizio sulla qualità microbiologica deve essere espresso in base agli standard stabiliti
internamente, e può essere completata tenendo conto di due limiti:
- Limite di Allerta: il numero di UFC è tale da indicare una deviazione rispetto alle condizioni
operative standard. Il superamento del limite di allerta deve semplicemente “mettere
sull’avviso” ed indurre ad una valutazione attenta dei processi effettuati e del
comportamento del personale.
- Limite di Azione: segnala una situazione da correggere con interventi immediati.
Tali limiti non possono assumere il significato di un valore assoluto, ma vanno inquadrati
all’interno di un trend e valutati seguendo le caratteristiche dell’ambiente a cui sono riferiti.
A titolo di esempio, riportiamo quanto previsto in un impianto farmaceutico per produzione
sterile. Seguendo le normative di riferimento, si considerano quali Limiti di Azione i valori
riportati dalla Tabella 3.
Tabella 3: Limiti raccomandati per il monitoraggio microbiologico delle Clean Room
Classificazione dell’area
UFC/piastra (24 cm2)
Grado A (classe 100, ISO 5)
<1
Grado B (classe 100, ISO 5)
5
Grado C (classe 10.000, ISO 7)
25
Grado D (classe 100.000, ISO 8)
50
Per quanto riguarda i Limiti di Allerta, si dà la possibilità di definizione sulla base delle proprie
esigenze operative.
4. STUDIO DEI RISULTATI ED AZIONI CORRETTIVE
E’ importante che i risultati del monitoraggio ambientale siano valutati periodicamente e che
siano tracciati trend specifici per le varie aree.
La presenza di valori sopra i Limiti di Allerta deve portare come prima conseguenza
all’incremento del numero dei controlli e della loro frequenza. Invece, il superamento dei Limiti
di Azione porterà ad approntare vere e proprie operazioni correttive, che dipenderanno dalla
fonte della contaminazione e dalla sua entità.
Oltre al dato relativo alle UFC, può essere utile anche l’identificazione dei microrganismi.
Questo vale soprattutto in particolari circostanze, come ad esempio durante la messa a punto
del piano di campionamento, per definire la flora presente e la sua stagionalità, oppure nei casi
7/8
in cui si riscontra una contaminazione al di fuori dei limiti, per individuarne la fonte. Una
conoscenza approfondita della contaminazione delle singole aree permette inoltre di scegliere i
disinfettanti più adatti per le operazioni di pulizia.
CONCLUSIONI
L’approntamento di un adeguato piano di monitoraggio ambientale consente di mantenere sotto
costante controllo le aree operative. In particolare durante i processi produttivi, è fondamentale
che si mantenga monitorata ogni fase, per garantire un intervento precoce ed evitare danni
irreparabili ai lotti in produzione. Il monitoraggio delle superfici va associato al controllo dei
parametri ambientali di temperatura e umidità, alla verifica dell’eventuale contaminazione
particellare dell’aria ed al controllo degli operatori. La scelta dei metodi di campionamento più
idonei, un’adeguata frequenza dei test ed una pronta risposta alle eventuali deviazioni
riscontrate rappresentano i punti di forza di un Controllo Qualità efficiente e risolutivo.
Per informazioni e richieste:
KAIROSafe S.r.l.
Sistiana, 41/D 34013 Duino Aurisina (TS)
Telefax: 040 299502
e-mail: [email protected]
web: www.kairosafe.it
Terreni di coltura disidratati
Terreni di coltura pronti all’uso
Accessori per microbiologia
Kit per controllo microbiologico delle superfici
Ceppi microbici liofilizzati
Indicatori biologici e chimici per sterilizzazione
LAL test
8/8