Cellule Staminali

Cellule Staminali
L’antigene CD34 nelle fasi iniziali dell’ematopoiesi
Il concetto di un precursore comune, rappresentato da una cellula staminale, per tutte le linee
del sistema ematopoietico è stato inizialmente proposto, circa un secolo fa, da A.
Pappenheim. La conferma sperimentale di tale concetto è stata impossibile fino allo sviluppo
di popolazioni di cellule staminali aventi marcatori genetici unici. Esperimenti di trapianto con
cellule di questo tipo portano ad una ricostituzione ematologica completa con tutte le cellule
mature esprimenti il marcatore originale, confermando l’ipotesi di una singola cellula
staminale ematopoietica. Le cellule staminali ematopoietiche primitive e le cellule progenitrici
sono eventi molto rari da evidenziare nel midollo spinale e nel sangue periferico così come
nel tessuto fetale ematopoietico e nel sangue del cordone ombelicale. Questo compartimento
cellulare è in effetti eterogeneo, comprendendo cellule staminali estremamente primitive,
progenitori impegnati nel differenziamento e precursori morfologicamente differenziati.
Gli studi iniziali sull’ematopoiesi si basavano su colture cellulari in vitro tediose ed esperimenti
di trapianto in vivo. Nel 1985 un grande passo avanti è stato realizzato con la scoperta di
anticorpi monoclonali che si legano ad una porzione della superficie cellulare presente su tutti
i progenitori ematopoietici. Indicata in seguito come CD34, questa molecola rimane l’unico
marcatore fenotipico che identifica le cellule ematopoietiche agli stadi primordiali.
Approssimativamente lo 0.1% delle cellule mononucleate del sangue periferico normale e
dall’1% al 4% delle cellule del midollo spinale esprimono l’antigene CD34. L’identificazione e
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la caratterizzazione delle cellule staminali ematopoietiche CD34 hanno aperto nuovi campi di
ricerca ed sono divenute di grande interesse sia per la ricerca biologica, sia per quella clinica.
L’antigene CD34
La molecola CD34 è una glicoproteina integrale di membrana monomerica di tipo I, di peso
molecolare apparente pari a 105-120 kDa. La sequenza di 373 aa della proteina (40 kDa) è
pesantemente glicosilata con un massimo di 9 complessi tipo N-glicani e numerosi O-glicani
pesantemente sialilati. Questa caratteristica glicosilazione è tipica della famiglia delle
sialomucine, che comprende la leucosialina e il CD34. Una caratteristica chiave nella
biochimica del CD34 è il polimorfismo della glicosilazione, come dimostrato dalla variabilità
degli epitopi nelle analisi immunologiche. Il gene codificante per l’antigene CD34 è localizzato
sulla regione cromosomica 1q32, in una regione contenente un gruppo di geni che codificano
per le molecole di adesione. Comunque la sequenza amminoacidica del CD34 non presenta
omologie identificate con nessuna proteina conosciuta.
La funzione dell’antigene CD34 negli stadi iniziali dell’ematopoiesi è ancora vaga. La struttura
tipo mucina del CD34 suggerisce un ruolo nell’adesione cellulare, forse nell’adesione dei
progenitori e delle cellule staminali alle cellule stromali. E’ interessante il fatto che alcuni
anticorpi monoclonali del CD34 (per esempio l’Immu-133) possono indurre adesione cellulare
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omotipica nelle linee cellulari CD34 .
La porzione citoplasmatica di 73 amminoacidi contiene molti siti potenzialmente fosforilabili
che possono essere fosforilati dalla fosfochinasi C in vitro. Comunque, la trasduzione del
segnale mediata dal CD34 per mezzo di questo meccanismo non è stata dimostrata.
Varie caratteristiche molecolari del CD34 rimangono da spiegare e precisamente:
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la natura del suo polimorfismo;
l’identità degli enzimi coinvolti nelle sue modificazioni post-trascrizionali;
l’identificazione dei suoi ligandi putativi;
la determinazione dei substrati citoplasmatici per la trasduzione del segnale mediata dal
CD34.
Gli anticorpi monoclonali anti-CD34 sono gli unici importanti attrezzi di ricerca per rispondere
a queste domande.
ANTICORPI MONOCLONALI CD34
Dodici anni dopo lo sviluppo del primo anticorpo monoclonale anti-CD34 (clone My10), più di
30 diversi anticorpi anti-CD34 sono stati ormai descritti e classificati nel corso degli Workshop
internazionali HLDA. Per questi anticorpi sono state definite tre classi di reattività sulla base
della suscettibilità differenziale della membrana al trattamento enzimatico dell’antigene CD34.
Il legame degli anticorpi CD34 è stato analizzato dopo trattamento con neuraminidasi,
glicoproteasi O e chimopapaina. Questa classificazione di reattività non corrisponde ad un
epitopo esattamente mappato sull’antigene CD34, infatti gli anticorpi di una determinata
classe possono riconoscere epitopi separati spazialmente. Viceversa, esperimenti di
inibizione incrociata mostrano che anticorpi di classi diverse possono legare epitopi
sovrapposti.
Gli anticorpi di classe I reagiscono con gli epitopi sensibili a tutti e tre i tagli enzimatici.
L’Immu-409 e l’Immu-133 appartengono a questa classe, sebbene entrambi gli anticorpi
mostrino caratteristiche distintive:
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l’Immu-409 esibisce una bassa costante di affinità (1.9 x 10 M per legarsi alle cellule
KG1a). Nessun progenitore normale e solo pochi campioni leucemici si marcano con
l’Immu-409. Così come la reattività dell’Immu-409 è completamente dipendente dalle
porzioni carboidratiche, è probabile che l’epitopo riconosciuto da questo anticorpo
corrisponda a una struttura oligosaccaridica non standard. L’anticorpo lavora in Westernblotting, Immunoprecipitazione e Citometria a flusso (immunofluorescenza sia diretta, sia
indiretta). L’Immu-409 può essere utile nei lavori di ricerca per la mappatura degli epitopi
o per la determinazione della distribuzione del polimorfismo del CD34. Non è appropriato
per l’immunofenotipizzazione della leucemia acuta.
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L’Immu-133 ha una costante di affinità di 32 x 10 M . Esso riconosce un epitopo
localizzato nelle posizioni amminoacidiche 43-50, a livello della posizione aminoterminale
della porzione extracellulare. L’epitopo dipende parzialmente dalle porzioni carboidratiche
associate e pare essere ben espresso in varie circostanze. L’anticorpo è impiegabile
nella tecnica Western-blotting, nella Immunoprecipitazione e nella Citometria a flusso
(immunofluorescenza diretta e indiretta).
Gli anticorpi di classe II reagiscono con epitopi che sono resistenti alla neuraminidasi e
sensibili alla O-glicoproteasi e alla chimopapaina. Il prototipo anticorpale meglio conosciuto di
questa classe è il QBend-10:
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Il QBend-10 ha una costante di affinità di 1.3 x 10 M . Esso si lega ad un epitopo
localizzato nelle posizioni amminoacidiche 37-55 all’interno della sequenza peptidica. E’
interessante il fatto che questa sequenza si sovrappone con la porzione che è
riconosciuta dall’anticorpo di classe I Immu-133, confermando i risultati ottenuti dagli studi
di legame di inibizione crociata. Il legame QBend-10 induce l’adesione delle cellule
omotipiche, indicando la pertinenza funzionale della regione CD34 riconosciuta dagli
anticorpi Immu-133 e QBend-10. Per l’analisi in Citometria a flusso è raccomandata in
modo particolare la forma coniugata con ficoeritrina. Questo anticorpo è anche adatto per
la tecnica Western-blotting, l’Immunoprecipitazione e l’Immunoistochimica.
Gli anticorpi di classe III reagiscono con le molecole CD34 indipendentemente dal loro stato
di glicosilazione. Se confrontata con quella degli epitopi di classe I e II, l’espressione degli
epitopi di classe III è generalmente maggiore. Comunque, fra diversi anticorpi di classe III si
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possono verificare minime variazioni nel modello di marcatura di vari bersagli CD34 . La
reattività della classe III sembra corrispondere a tre epitopi conformazionali non sovrapposti.
Il 581 è un anticorpo ragguardevole di classe III:
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in ogni coniugazione con un fluorocromo il 581 è talmente brillante che la distinzione fra
cellule negative e positive è veramente chiara. Questo anticorpo riconosce un epitopo
resistente alla denaturazione e può essere utilizzato nella tecnica Western-blotting, a
dispetto dei primitivi rapporti che indicavano gli anticorpi di classe III inappropriati per
questa applicazione. Ancora può essere utilizzato per esperimenti condotti in
immunoprecipitazione.
I quattro anticorpi Immu-409, Immu-133, QBend-10 e 581 sono rappresentativi dell’attuale
classificazione degli epitopi in tre ampie famiglie. Nonostante le incertezze riguardanti la
struttura del CD34, gli anticorpi CD34 sono largamente impiegati per applicazioni nel campo
della ricerca come studi immunologici di patologie ematologiche e la conta delle cellule
staminali. E’ critico selezionare l’anticorpo e la classe di reattività appropriati, in quando
dipendono dal particolare campo di applicazione. Le sezioni seguenti forniscono alcune linee
guida.
Studi di patologie ematologiche a carattere maligno.
L’impiego della Citometria a flusso per eseguire ricerche nell’ambito delle patologie maligne
ematologiche è assai diffuso. L’espressione del CD34 è indice di fenotipo immaturo; la sua
coespressione con antigeni di differenziazione tipici di fenotipi maturi può definire fenotipi
anormali associati con trasformazioni oncogenetiche.
Comunque, il polimorfismo dei gradi di glicosilazione nell’espressione del CD34 è il più
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grande tranello per l’analisi di leucemia acuta. Ogni cellula leucemica CD34 esprime una
combinazione unica di epitopi CD34 e può sfuggire al riconoscimento da parte di determinati
anticorpi anti-CD34. Se lo scopo è evidenziare tutte le cellule maligne, allora l’impiego di un
anticorpo di classe III è una strategia ragionevole. Per circonvenire la variabilità degli epitopi
CD34, un approccio alternativo è mescolare molti anticorpi diretti contro epitopi diversi.
Una sfida futura per la ricerca nella caratterizzazione immunologica della leucemia sarà
sezionare e classificare le modificazioni post-trascrizionali dell’antigene CD34 in diversi tipi di
cellule maligne. Gli anticorpi appartenenti a tutti i tre tipi di classi di reattività si potrebbero
mostrare utili a questo riguardo.
Enumerazione dei progenitori e delle cellule staminali
L’attuale più importante utilizzo a scopo di ricerca degli anticorpi CD34 è l‘enumerazione delle
cellule staminali ematopoietiche con la Citometria a flusso. C’è un numero crescente di studi
riguardanti la mobilitazione dei progenitori delle cellule del sangue periferico per trapianti di
tipo autologo e allogenico. La combinazione degli anticorpi CD34 con la Citometria a flusso
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ha reso ciò semplice per identificare e conteggiare le cellule progenitrici CD34 . In questo
campo sono state pubblicate molte linee guida, fra cui le raccomandazioni ISHAGE. Questo
documento descrive un metodo basato sul gating CD45/SS in combinazione con la marcatura
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CD34, che è il più adatto alla determinazione di eventi rari come le cellule CD34 .
La scelta dell’anticorpo CD34 è cruciale. Poiché gli epitopi di classe III sono quelli più
ampiamente espressi, il 581 è ben adatto per questa applicazione. L’anticorpo J33 è
diventato lo standard per l’analisi del CD45. Combinando il 581-PE con il J33-FITC e
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utilizzando un’appropriata strategia di gating, il conteggio dei progenitori CD34 è riproducibile
e oggettivo.
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Lo Stem-Kit CD34 Cell Enumeration Kit fornisce uno strumento sofisticato e dedicato alla
ricerca. Lo Stem-Kit contiene cinque reattivi (un reagente a due colori, 581-PE/J33-FITC, un
controllo negativo, un reagente di lisi, il controllo positivo Stem-Troll e le fluorosfere Stem+
Count) e permette la determinazione diretta della conta assoluta di CD34 con la Citometria a
flusso.
Cellule staminali/sottogruppi di progenitori
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Il compartimento CD34 , che costituisce solo una piccola frazione del tessuto ematopoietico,
comprende cellule a vari stadi di differenziazione, compreso un piccolo gruppo di cellule
staminali quiescenti con capacità di autorinnovarsi. L’analisi multiparametrica in Citometria a
flusso può essere utilizzata per analizzare l’eterogeneità dell’espressione molecolare a livello
della membrana cellulare all’interno di questo compartimento. Particolarmente significativi
sono gli studi per determinare il fenotipo del compartimento più immaturo, ossia quelle cellule
con capacità di autorinnovamento, come accertato da esperimenti con colture cellulari e di
trasferimento.
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Il fenotipo CD34 , CD38 , HLA-DR e CD90(Thy-1) definisce un sottogruppo che contiene le
cellule più primitive. L’acquisizione dell’espressione del CD38 e la perdita dell’espressione del
CD90 si verifica quando la linea cellulare viene impegnata e c’è la differenziazione delle
cellule progenitrici. La differenziazione può essere ulteriormente accertata con l’espressione
degli antigeni specifici per la linea, come il CD33, il CD13, il CD7, il CD10, il CD19, il CD56, il
CD41a e la Glicoforina A. Anche nuovi antigeni di differenziazione con distribuzione tessutale
limitata, come un antigene di membrana specifico per gli eritroblasti, potrebbero dimostrarsi
utili nello studio degli stadi iniziali di differenziazione ematologica.
I profili di espressione delle citochine e dei recettori dei fattori di crescita sono importanti
chiavi di ampliamento e conoscenza della regolazione delle cellule progenitrici tramite le
citochine e i mediatori solubili. I prodotti delle molecole proto-oncogeniche c-kit (CD117) e
FLT3/FLK2 (CD135) sono i recettori del fattore di crescita tirosinchinasi che sono espressi
sulle cellule staminali ematopoietiche e sono coinvolti nel controllo della proliferazione
cellulare.
Molto recentemente sono stati caratterizzati nuovi recettori espressi sulle cellule progenitrici.
Un esempio è dato dal recettore per il Poliovirus (PVR, CD155) e le relative molecole di
membrana omologhe denominate PRR. La funzione e i ligandi fisiologici di PVR/PRR non
sono ancora stati identificati. La disponibilità di nuovi anticorpi monoclonali verso queste
molecole aiuterà ad aprire un nuovo campo di indagine nella biologia degli stadi iniziali della
ematopoiesi.
INTERAZIONI
Un altro aspetto eccitante è rappresentato dal ruolo del microambiente interno degli organi
ematopoietici nella regolazione e nel sostegno della differenziazione e dell’autorinnovamento
delle cellule staminali ematopoietiche. Il tessuto stromale è un compartimento eterogeneo
comprendente le cellule endoteliali con due principali tipi cellulari in aggiunta: i macrofagi
centrali e le cellule reticolari. Queste sono associate entrambe alla matrice extracellulare che
consiste essenzialmente di fibronectina e proteoglicani eparansolfati. I proteoglicani caricati
negativamente possono agire come una riserva che concentra i fattori di crescita
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ematopoietici, rendendoli disponibili per i progenitori CD34 . Le interazioni fra le cellule
stromali e le cellule staminali affini sono cruciali per il mantenimento e la guida delle cellule
staminali. Sono coinvolte sia l’adesione cellulare eterotipica, sia quella omotipica, così come
le interazioni di tipo adesivo con la matrice extracellulare.
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Le cellule CD34 esprimono molte molecole di adesione appartenenti a famiglie distinte come
integrine (VLA-4), selectine (L-selectina), adressine (CD44) e molecole di adesione della
superfamiglia delle immunoglobuline (PECAM-1, CD31). I corrispondenti ligandi fisiologici per
queste molecole di adesione possono essere trovati sia sulla membrana delle cellule stromali,
che nella matrice extracellulare.
La disponibilità di un ampio pannello di anticorpi monoclonali diretti contro le molecole di
adesione permette ulteriori indagini in questo campo.