07_Rassegna - Della Latta - Recenti Progressi in Medicina

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Recenti Prog Med 2015; 106: 131-136
Valutazione biomolecolare dei profili trascrittomici umani
in campioni di sangue intero: un possibile approccio clinico?
Veronica Della Latta1,2, Manuela Cabiati1, Maria Aurora Morales1, Silvia Del Ry1
Riassunto. L’analisi dei profili di espressione genica su campioni di sangue periferico rappresenta l’approccio più promettente per lo studio di biomarcatori diagnostici e prognostici, integrando le informazioni quantitative ottenute
dal semplice dosaggio plasmatico con quelle qualitative
derivanti dallo studio dei profili trascrittomici. Nuove tecniche di raccolta di campioni biologici, più facilmente reperibili e accessibili, sono in fase di sviluppo per minimizzare le
problematiche legate all’approccio bioptico, più invasivo. A
tal fine sono stati validati metodi che consentono di isolare
i leucociti partendo da un volume minimo di sangue intero
quali il metodo PAXgene. Sfruttando l’applicazione di tale
metodo è stato possibile studiare l’espressione genica di
biomarcatori e dei relativi pathway di azione implicati in
diverse patologie e fino a oggi valutabili con tecniche di
biologia molecolare solo a livello tessutale, identificando
così nuovi e più specifici bersagli terapeutici.
Bio-molecular evaluation of human transcriptomic profile in
whole blood sample: a potential clinical approach?
Parole chiave. Leucociti, PAXgene, RNA.
Key words. Leukocytes, PAXgene, RNA.
Introduzione
me campioni di sangue periferico, espettorato o urine. A oggi, l’analisi dei profili di espressione genica
su campioni di sangue periferico rappresenta l’approccio più promettente per lo studio di biomarcatori diagnostici, prognostici e predittivi, integrando
le informazioni quantitative ottenute dal semplice
dosaggio plasmatico con quelle qualitative derivanti dallo studio dei profili trascrittomici. Nella
pratica clinica i campioni di sangue, regolarmente
raccolti e conservati in banche biologiche per applicazioni mediche e di ricerca scientifica, possono essere considerati preziose fonti di acido ribonucleico
(RNA) per analisi di espressione genica1-3.
Negli ultimi anni lo studio dell’integrità genomica ha assunto sempre maggiore importanza
nella diagnostica molecolare, nella ricerca medica
e nella sperimentazione di nuovi farmaci. La conoscenza di specifici biomarcatori per la diagnosi
e la prognosi di differenti patologie potrebbe consentire la messa a punto di specifiche metodiche
cliniche per lo sviluppo di trattamenti utili nel migliorare la qualità di vita dei pazienti. La medicina
personalizzata, basandosi su test di genomica predittiva e di altre strategie analitico-sperimentali,
rappresenta un approccio chiave per lo sviluppo
di terapie farmacogenetiche capaci di indirizzare
individualmente e, pertanto, in modo più sicuro ed
efficace, l’uso di nuovi farmaci migliorando appropriatezza, rapporto rischio/beneficio e applicazioni
di procedure diagnostiche e terapeutiche.
Tuttavia, il reperimento di campioni tessutali
tramite prelievi bioptici richiede un approccio invasivo per i pazienti che presenta un, seppur piccolo,
margine di rischio; diventa, pertanto, auspicabile
mettere a punto tecniche di raccolta di campioni
biologici più facilmente reperibili e accessibili, co-
Summary. At present, the analysis of transcriptional profile of blood samples is the more efficient and promising
approach to study diagnostic and prognostic biomarkers,
complementing the quantitative information obtained by
a simple plasma assay, with the qualitative one of mRNA
expression. More novel and available blood collection techniques are being developed reducing problems linked to
the invasive bioptic approach. To this purpose, in the last
years, methods able to isolate leukocytes from minimal
quantity of whole blood have been developed, among
these the PAXgene methods offer undeniable advantages.
This latter method allows to study the transcriptomic profile of many biomarkers and related pathways involved in
different pathologies, until now analyzed only with molecular biology techniques at tissue level, identifying new and
more specific therapeutic targets.
Le cellule del sangue
A livello ematico, i leucociti rappresentano la
componente minore dal punto di vista quantitativo; si dividono in due categorie distinguibili in
base a caratteristiche tintoriali e morfologiche:
• mononucleati (o agranulociti): monociti (2-8%)
e linfociti (20-30%);
• granulociti: neutrofili (55-70%), eosinofili (14%) e basofili (0,1-1%) (figura 1).
Istituto di Fisiologia Clinica, CNR, Pisa; 2 Dottorato GenOMeC, Università di Siena.
Pervenuto il 3 dicembre 2014. Accettato dopo revisione l’8 gennaio 2015.
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Recenti Progressi in Medicina, 106 (3), marzo 2015
Classificazione dei leucociti
Agranulociti
o mononucleati
Leucociti
(globuli bianchi)
Monociti
Linfociti (B e T)
Neutrofili
Granulociti
Eosinofili
Basofili
Figura 1. Classificazione e differenziamento dei globuli
bianchi.
I leucociti svolgono la loro attività, principalmente correlata al sistema immunitario, al di fuori del circolo sanguigno, promuovendo sia risposte
pro-infiammatorie sia eventi apoptotici.
In condizioni patologiche, i rapporti tra le varie
categorie leucocitarie dell’emogramma variano,
riflettendo i cambiamenti metabolico-molecolari a
livello d’organo e sono stati così riconosciuti essere
potenziali strumenti di uso diagnostico per il monitoraggio di numerose patologie, come neoplasie,
disfunzioni mitocondriali, malattie cardiovascolari
e neurodegenerative.
Tecniche di estrazione: da ieri a oggi
I campioni di sangue periferico sono la principale fonte di leucociti/monociti umani per indagini di tipo biologico-molecolare e per l’analisi
di nuovi biomarcatori malattia-specifici. Questa
tipologia di campioni è utilizzata in alternativa
alla raccolta di campioni tessutali, decisamente
più invasiva, e risulta particolarmente importante la loro modalità di prelievo, utilizzo e conservazione4.
Le tecniche per la separazione delle varie componenti figurate del sangue sono molteplici e ognuna caratterizzata da vantaggi e svantaggi.
Negli ultimi anni l’approccio alla diagnostica si
è evoluto dalla consueta analisi di DNA alla valutazione dell’espressione genica attraverso lo studio
dell’RNA. La sfida dei ricercatori è stata quella di
sviluppare nuovi protocolli mirati alla raccolta e
quindi al mantenimento dell’integrità dell’RNA
stesso, minimizzando eventi di degradazione dell’RNA e cambiamenti nei profili di espressione genica5-7. Nonostante ciò, rimane ancora da chiarire
quale sia la tecnica migliore per la corretta estrazione e conservazione dell’RNA.
Negli anni ’70 il principale metodo di estrazione dei monociti era basato solo sulla capacità
di separare le cellule in base alla loro velocità di
eritro-sedimentazione mediante centrifugazione
(counterflow centrifugation)8,9 in una soluzione
tampone, capace di mantenere invariata la struttura cellulare, evitando l’utilizzo di sostanze
chimiche (come, per es., coloranti) e fisiche (come l’uso di anticorpi o sostanze per la lisi della
membrana plasmatica) per ottenere la separazione cellulare mediante l’uso di vari gradienti.
Purtroppo, tale metodica, basandosi solo sul concetto della velocità di eritrosedimentazione, non
permetteva né di separare diverse tipologie cellulari con simili proprietà di sedimentazione né di
ottenere rese di estrazione che rientrassero più o
meno nello stesso range di efficienza, rendendo
così difficoltosa la riproducibilità dei risultati10.
Questa procedura, costosa e di difficile esecuzione, intorno agli anni ’80 è stata sostituita dalla
separazione monocitaria mediante gradiente con
Percoll11,12, nonostante la resa dell’RNA totale
fosse minore. Grazie alla formazione di un gradiente che si genera mediante centrifugazione, il
Percoll è stato molto utilizzato per la separazione
di popolazioni cellulari, dalle quali estrarre acidi
nucleici, in quanto risulta essere atossico e incapace di penetrare la membrana cellulare. Inoltre,
ha un pH di circa 9,0 modificabile in un range
compreso tra 5,5-10,0 senza che le sue caratteristiche possano subire alterazioni, ha una bassa osmolarità, è viscoso e può essere facilmente
rimosso tramite purificazione. Successivamente
questo metodo di separazione è stato combinato e
potenziato con un co-polimero sintetico idrosolubile, il Ficoll Hypaque (F/H). Tale tecnica si basa
su centrifugazione in gradiente di densità per separare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC, peripheral blood mononuclear cell)
da altre cellule ematiche: cellule a minore densità
si concentrano sopra lo strato di F/H, mentre i
globuli rossi e i granulociti si raccolgono sul fondo
della provetta. La metodica F/H è di più semplice
esecuzione e permette di contenere i costi13, ma
ha lo svantaggio di richiedere un volume notevole
V. Della Latta et al.: Valutazione biomolecolare dei profili trascrittomici umani in campioni di sangue intero
Sangue
venoso
eparinato
Stratificazione
con
Ficoll/Hypaque
Centrifugazione Plasma
Piastrine
per 20 min
PBMC
a 900 g a TA
FH
2 lavaggi
per 10 min
a 400 g a TA
PBMC
Linfociti B
FH
Monociti
RBC
PMN
Prelievo
ematico
PAXgene
RNA tubes
Lavaggi+
risospensioni
Lavaggi+
risospensioni
Purificazione
di sangue dal paziente (generalmente 10 o 60 ml).
Inoltre, è necessario effettuare la procedura di
isolamento il più velocemente possibile o, quando
non possibile, conservare il campione per breve
periodo di tempo a circa 4 °C procedendo al suo
mescolamento continuo (figura 2).
Con lo scopo di mettere a punto un protocollo
di estrazione che prevedesse minori quantità di
sangue, sono stati validati metodi di isolamento
dei PBMC partendo da un volume di circa 6-8 ml
di sangue intero14. La raccolta del campione è effettuata utilizzando provette contenenti EDTA come anticoagulante ed estraendo immediatamente
l’RNA, al fine di evitarne la degradazione, attraverso saggi commerciali dedicati. Un’altra tecnica
generalmente utilizzata per l’estrazione dell’RNA
totale da tessuto è quella basata sull’uso della guanidina-tiocianato fenolo cloroformio, che permette
una rapida inibizione dell’attività delle RNasi garantendo maggiore resa di estrazione, buon grado
di purezza e migliore integrità dell’RNA estratto.
Lo svantaggio di tale metodica è la possibile presenza di contaminazione da DNA genomico, che
porta a significative problematiche durante studi di biologia molecolare (reazione a catena della
polimerasi-PCR- e/o Real-Time PCR). Nel 2001 la
ditta PreAnalytiX (DIALAB and Qiagen, Hilden,
D) ha introdotto con successo un sistema PAXgene
Blood RNA, tutt’oggi utilizzato nelle applicazioni
di ricerca clinica. Queste provette contengono una
sostanza stabilizzante dell’RNA e risultano particolarmente adatte alla raccolta, allo stoccaggio e
al trasporto dei campioni ematici. Effettuando un
prelievo di 2,5 ml di sangue intero è possibile, attraverso un sistema di estrazione dedicato (PAXgene Blood RNA extraction kit), isolare e purificare
RNA totale intracellulare per uso diagnostico. I
campioni di sangue intero vengono raccolti in specifiche provette, PAXgene Blood RNA tube, contenenti reagenti adibiti all’immediata stabilizzazione dell’RNA, attivi già a partire dal momento del
prelievo. Il sistema di estrazione, PAXgene Blood
Figura 2. Tecnica Ficoll/Hypaque (F/H) per la separazione dei PBMC da sangue periferico.
Eluizione
RNA totale
estratto
Figura 3. Metodica PAXgene (modificato da PAXgene
Blood RNA Kit Handbook).
RNA extraction kit, consente di ottenere l’RNA da
campioni ematici attraverso centrifugazioni combinate con tamponi di lavaggio, capaci di allontanare
le componenti cellulari dagli acidi nucleici, incluse
le proteine (figura 3).
Questo approccio sembra essere una valida
alternativa per la conservazione del campione
ematico, in quanto è possibile conservare i campioni a temperatura di -20/-80 °C fino a 50 mesi
permettendo il mantenimento dello stesso grado di
purezza del sangue fresco e un’adeguata stabilità
del profilo di espressione genica degli effettori di
interesse4,6,15-17. Infatti, l’analisi dei profili trascrittomici di campioni sottoposti a prolungati periodi
di congelamento risulta essere molto similare a
quella ottenuta dai campioni estratti e analizzati nelle 24 ore successive al prelievo. Grazie alla
minima invasività e al vantaggio di ottenere buone rese di RNA estratto totale, il metodo basato
sull’utilizzo del PAXgene Blood RNA extraction
kit è impiegato negli studi di espressione genica
per l’identificazione di biomarcatori correlati a differenti patologie, quali, per esempio, le malattie
cardiovascolari. Nelle condizioni in cui è possibile
ottenere contemporaneamente biopsie tessutali e
campioni ematici, come per es. avviene durante interventi di chirurgia cardiaca, è possibile evidenziare come il confronto delle variazioni dei profili
trascrittomici di geni target mimi le alterazioni osservabili a livello tessutale18. Lavorare con metodi
non invasivi, come il semplice prelievo di sangue,
permette quindi di superare le problematiche relative alla reperibilità delle biopsie tessutali, garantendo la possibilità di evidenziare ipotetiche
variazioni di espressione degli effettori in studio
grazie al confronto con soggetti sani. La figura 4
riassume i vantaggi ottenibili dall’utilizzo della
metodica PAXgene.
Recentemente, grazie all’applicazione del metodo PAXgene, è stato possibile valutare l’espressione genica di marcatori coinvolti nello sviluppo
della malattia cardiovascolare fino a oggi valuta-
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Recenti Progressi in Medicina, 106 (3), marzo 2015
2,5 ml sangue
intero
Grado di purezza: contaminazione DNA genomico ≤1%
Stabilità dell’RNA e resa di estrazione ≥3µg
Facilità
di conservazione
Riproducibilità
e velocità
Facilità
di trasporto
Provetta PAXgene
Figura 4. Vantaggi della metodica PAXgene.
bili con tecniche di biologia molecolare (PCR, Real-Time PCR, elettroforesi SDS-PAGE e analisi di
Western Blot) solo a livello tessutale o a livello plasmatico attraverso dosaggi immunometrici (saggi
ELISA e RIA). Questi ultimi permettevano di verificare solo la loro concentrazione ematica e le eventuali successive alterazioni a livello d’organo. L’utilizzo della tecnica PAXgene, data l’opportunità
di valutare anche i sistemi recettoriali nel sangue
periferico, fornisce un’informazione più completa
per la migliore caratterizzazione delle componenti
infiammatorie, apoptotiche e di rimodellamento
associate allo sviluppo delle patologie cardiache.
Applicazioni del PAXgene negli studi clinici
In questi ultimi anni sono stati condotti studi basati sulla valutazione dell’espressione genica di biomarcatori tipici del profilo infiammatorio
su leucociti estratti da campioni di sangue periferico sfruttando i vantaggi relativi all’impiego
del PAXgene. È stato dimostrato che pazienti con
patologie cardiovascolari presentano aumentati
livelli di citochine pro-infiammatorie derivanti
dall’attivazione delle cellule circolanti del sistema
immunitario, come i PBMC, e correlate con il deterioramento della funzionalità e delle prestazioni
del cuore. La maggiore produzione di queste citochine potrebbe così rispecchiare le alterazioni dovute agli infiltrati cellulari infiammatori nel cuore
di pazienti affetti da danno cardiaco.
Studi recenti19,20 riportano dati originali riguardanti il profilo trascrittomico del sistema del pe­
ptide natriuretico di tipo C (CNP), del suo recettore
specifico NPR-B e di quello adrenomedullina/intermedina (ADM/IMD) in sangue periferico di pazienti con scompenso cardiaco in funzione della gravità
della patologia. Il CNP appartiene alla famiglia dei
peptidi natriuretici e mostra proprietà strutturali e
fisiologiche simili a quelle degli altri membri della
famiglia quali il peptide natriuretico atriale (ANP)
e quello cerebrale (BNP). Il CNP è prodotto principalmente dall’endotelio e recentemente è stata evidenziata una sua produzione a livello cardiaco21.
Oltre alle azioni di diuresi e natriuresi, il CNP è in
grado di indurre vasorilassamento attraverso iperpolarizzazione delle cellule muscolari lisce grazie
al legame ad alta affinità con il recettore specifico
NPR-B e con quello di clearance NPR-C. Il peptide
ha effetti antinfiammatori e interagisce con diverse
citochine vasoattive, come il monossido di azoto, alcune prostaglandine e altri peptidi vasodilatatori,
che contribuiscono alla sua attività vasodilatante.
È stato dimostrato che la sua espressione non è
confinata solamente a livello d’organo e tessuto, ma
risulta essere presente anche nelle cellule del torrente circolatorio, includendo i leucociti22. La possibilità di determinare l’espressione del CNP e del
sistema recettoriale a partire da campioni di sangue periferico è stata così dimostrata superando
la necessità di analisi più invasive per i pazienti,
gettando le basi per una migliore e più completa interpretazione della fisiopatologia cardiovascolare.
V. Della Latta et al.: Valutazione biomolecolare dei profili trascrittomici umani in campioni di sangue intero
Come il CNP, anche l’ADM è un potente peptide
natriuretico endogeno espresso in vari tessuti e ha
azione vasodilatatrice in grado di aumentare la gittata cardiaca e di regolare il tono vascolare locale
e sistemico. L’ADM è inoltre secreta dai PBMC ed
è capace di sopprimere la produzione di citochine
infiammatorie. Elevati livelli plasmatici di ADM
sono stati misurati in pazienti con scompenso cardiaco, suggerendo un suo potenziale effetto protettivo ed è stato dimostrato che ADM potrebbe essere
un valido marker di prognosi e sopravvivenza in
questi pazienti20. L’IMD, conosciuta anche come
adrenomedullina-2, è espressa in vari tessuti, quali
cuore, reni, polmoni, tratto gastrointestinale, cervello, epidermide, pancreas, milza, timo, ovaie e come ADM è secreta dai PBMC22. È stato dimostrato
che anche l’IMD agisce sul sistema cardiovascolare
con effetto ipotensivo e vasodilatatorio.
Dallo studio dei profili trascrittomici a livello
circolante di ADM/IMD e di CNP/NPR-B è stata
evidenziata una loro forte correlazione, probabilmente dovuta alle azioni svolte non solo a livello
cardiaco ma anche sistemico, rendendoli importanti marcatori di patologia19,20.
Grazie all’utilizzo del metodo PAXgene è possibile inoltre analizzare l’espressione genica di
specifici sistemi recettoriali; infatti, recenti studi
hanno caratterizzato il profilo di espressione dei
recettori adenosinergici specifici per il ligando
adenosina, quali ADORA1, ADORA2a, ADORA2b
e ADORA314,23. L’adenosina è un nucleotide purinico rilasciato dalle cellule ed è un importante
agente cardio-protettivo e antinfiammatorio capace di modulare numerose funzioni fisiologiche, tra
cui la vasodilatazione, la soppressione dell’attività
contrattile cardiaca, l’inibizione dell’aggregazione
piastrinica e l’induzione del processo angiogenetico. In condizioni fisiologiche questo nucleotide è
rilasciato nello spazio extracellulare; nel momento
in cui si presenta una condizione di danno/stress
la concentrazione di adenosina trifosfato (ATP), rilasciata a livello extracellulare, aumenta, e questa
viene metabolizzata ad adenosina grazie all’azione
di due nucleotidasi: ecto-nucleoside di-fosfato difosfoidrolasi (CD39) ed ecto-5’-nucleotidasi (CD73).
Durante tali eventi quindi la concentrazione di
adenosina dovrebbe risultare notevolmente aumentata, ma a causa della sua breve emivita non
è di facile quantificazione; per questo motivo risulta essenziale riuscire a valutare i profili di
espressione dei suoi recettori e delle componenti
del suo metabolismo. Valutando simultaneamente l’espressione dei quattro sottotipi recettoriali
in leucociti umani estratti da campioni di sangue
periferico di pazienti con scompenso cardiaco di diversa gravità14,23, è stata osservata un’attivazione
del sistema recettoriale adrenergico e degli enzimi
di conversioni CD39-CD73 in funzione della severità della patologia.
Recentemente, il PAXgene è stato utilizzato
anche per mettere a punto analisi di espressione genica riguardanti componenti regolatorie di
pathway implicati in diverse neoplasie. Infatti, in
uno studio incentrato sul cancro del colon retto,
tale metodica è risultata essenziale per l’identificazione di geni espressi in maniera differenziale
tra soggetti sani e con patologia. In particolare, è
stata evidenziata una serie di geni, appartenenti
alla famiglia dei recettori Toll-like, che risulta essere up-regolata nel tumore24. Il PAXgene b
­ lood
RNA extraction kit è stato anche utilizzato per
una convalida analitica in uno studio rivolto contro il cancro alla prostata, dimostrando che anche
a livello di sangue periferico sono riscontrate le
stesse variazioni dei profili trascrittomici evidenziate nel tessuto prostatico25.
La tecnica del PAXgene per l’estrazione di RNA
da sangue periferico ha trovato ampio impiego anche in studi preliminari rivolti contro malattie neurodegenerative come, per esempio, la sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Tale patologia, dall’esito infausto, colpisce l’apparato motorio. I meccanismi che
causano neurodegenerazione nella SLA sono completamente sconosciuti, pertanto, l’identificazione di
biomarcatori potrebbe permettere di rilevare i primi
segni di SLA, valutare la progressione della malattia, monitorare gli effetti del trattamento, o addirittura aiutare a identificare la causa della malattia.
A tale proposito, una potenziale fonte di materiale
genetico da analizzare con studi sui profili trascrittomici deriva dai campioni di sangue periferico, in
quanto i soggetti affetti da SLA sono costantemente
sottoposti a prelievi ematici26. In questi ultimi anni
la tecnica del PAXgene per l’estrazione da sangue
periferico sta trovando ampio impiego anche negli
studi di genome wide-association27.
Conclusioni
La maggiore disponibilità di stabilizzatori di
RNA e lo sviluppo di sistemi per raccolta, estrazione e stoccaggio di campioni ematici ha notevolmente migliorato la tipologia e la qualità dei risultati di analisi di espressione genica. Come appena
descritto, esiste un ampio spettro di applicazioni
cliniche del metodo PAXgene che evidenziano la
possibilità di ottenere in maniera del tutto non invasiva informazioni che fino a pochi anni fa avrebbero richiesto la raccolta di campioni bioptici per
l’analisi tessutale. Tuttavia, rimane la necessità
di ottimizzare la qualità dell’RNA estratto e la sua
resa a lungo termine.
Nuove e future prospettive cliniche stanno
portando i ricercatori a concentrare la loro attenzione sull’analisi dei profili trascrittomici, rispetto all’analisi del DNA, con l’intento di riuscire a
standardizzare e migliorare ulteriormente la raccolta e la purificazione dell’RNA intracellulare da
sangue intero per applicazioni in studi di diagnostica molecolare. Tali studi, basati su approcci
di analisi globale, consentono l’identificazione di
nuovi bersagli terapeutici valutando geni modulati durante l’evoluzione della patologia clinica. Per
questo diventa importante la cooperazione medicoricercatore, con lo scopo di: trasferire i risultati dal
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Recenti Progressi in Medicina, 106 (3), marzo 2015
laboratorio al paziente; elevare l’accuratezza della
diagnosi clinica; arruolare e informare i soggetti/
pazienti garantendo il corretto consenso informato
e la tutela della riservatezza individuale.
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Indirizzo per la corrispondenza:
Dott. Silvia Del Ry
CNR Istituto di Fisiologia Clinica
Via Giuseppe Moruzzi 1
56124 Pisa
E-mail: [email protected]
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