Nanoparticles for in-vitro and in

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO BICOCCA
Scuola di Dottorato di Scienze
Corso di Dottorato di Ricerca in Fisica e Astronomia
Laura Sironi
Matricola 041003
Nanoparticles for in-vitro and in-vivo
biosensing and imaging
Tutore
Prof. Giuseppe Chirico
Coordinatore
Prof. Claudio Destri
Ciclo XXIII 2008-2010
Negli ultimi due decenni numerosi studi si sono concentrati sul cambiamento delle proprietà
chimiche e fisiche di un materiale a seguito della riduzione a scale nanometriche delle sue
dimensioni. Questi studi hanno rivelato molteplici applicazioni possibili per le nanostrutture, che
sono impiegate, per esempio, in biologia e medicina per ottenere immagini, per individuare
situazioni patologiche, per diagnosi, come sensori e per la terapia fototermica.
I metalli nobili (soprattutto oro e argento) sono particolarmente versatili ai fini di queste applicazioni
grazie a un fenomeno conosciuto come oscillazione dei plasmoni di superficie (SPR): si tratta di
un’oscillazione in fase degli elettroni della banda di conduzione, indotta da un campo
elettromagnetico incidente. Questa oscillazione è risonante con la radiazione incidente stessa a
una particolare frequenza dipendente da forma, dimensioni, orientazione e costante dielettrica
della nano particella (NP). L’accoppiamento tra SPR e campo elettromagnetico incidente
determina l'aumento della proprietà radiative (come assorbimento e scattering) della nano
particella; la loro sezione d’urto di estinzione è 105-106 volte maggiore rispetto ai coloranti organici
e risultano inoltre altamente fotostabili e, a seconda della forma, sono in grado i convertire in modo
efficiente luce in calore.
La risonanza plasmonica, variabile nella parte visibile (per NP sferiche) o del vicino infrarosso dello
spettro elettromagnetico (per NP anisotrope) può inoltre interagire con l’emissione di fluorescenza
dei coloranti e modificarne di conseguenza la brillanza e il tempo di vita dello stato eccitato.
A seconda della distanza fluoroforo-NP e dell’anisotropia delle NP si può ottenere un aumento o
una diminuzione della fluorescenza. In entrambi i casi, ci si aspetta che in seguito a un
cambiamento della costante dielettrica delle NP, indotta ad esempio in seguito al riconoscimento di
una proteina che avviene sulla superficie della nanoparticella, avvenga un cambiamento nelle
proprietà di emissione dei fluorofori.
Gli effetti della risonanza di superficie diventano inoltre particolarmente importanti se combinati con
l’eccitazione a due fotoni (TPE), che consiste nell’assorbimento simultaneo di due fotoni, ciascuno
di energia pari alla metà di quella necessaria ad eccitare una molecola dal livello fondamentale al
primo stato eccitato. Questa tecnica risulta particolarmente utile nel contesto di questo lavoro di
ricerca perché influisce anche sulla resa quantica di luminescenza di NP anisotrope: grazie a
fenomeni non lineari come la TPE l'intensità di luminescenza (TPL) viene aumentata (se
accoppiata con una appropriata risonanza plasmonica) di molti ordini di grandezza rispetto a
quanto si ottiene con eccitazioni a singolo fotone di superici lisce, rendendo quindi queste
nanoparticelle particolarmente utili per imaging in-vivo nella regione del vicino infrarosso dello
spettro elettromagnetico.
La TPE offre una serie di vantaggi unici per studi biologici sia in-vitro che in-vivo. La banda di
assorbimento a due fotoni dei coloranti utilizzati tradizionalmente in biologia è ampia rispetto
all’analogo caso a singolo fotone permettendo l’eccitazione simultanea di piùfluoro fori con una
singola lunghezza d’onda. Inoltre, il fatto di usare una lunghezza d’onda infrarossa permette
un’alta penetrazione nei tessuti grazie al ridotto scattering. L’eccitazione ha luogo solamente nel
piano focale poiché la probabilità di assorbire contemporaneamente due fotoni dipende dal
quadrato dell’intensità incidente. Come conseguenza, i fenomeni di foto-tossicità e fotodanneggiamento risultano notevolmente ridotti. Questi vantaggi fanno della TPE una tecnica
assodata per la ricerca scientifica biologica e medica, che può essere accoppiata all’utilizzo di
nanoparticelle d’oro anisotrope.
In accordo con queste considerazioni, il progetto di ricerca si è sviluppato lungo due linee
principali, legate all’uso delle nano particelle come sensori e mezzi di contrasto per imaging non
lineare.
Lo scopo della prima parte del progetto di ricerca è quello di sfruttare il cambiamento del tempo di
vita e della brillanza di un colorante, indotto dall’interazione con i plasmoni di superficie, per
rilevare piccole quantità di proteina in soluzione in condizioni fisiologiche. Il sistema studiato è
basato sull’uso di nanoparticelle d’oro del diametro di 5 e 10 nm a cui vengono legati (grazie a un
ponte streptavidina-biotina) il colorante FITC e l’anticorpo specifico per la proteina da riconoscere.
L’interazione del fluoroforo con la risonanza dei plasmoni della superficie d’oro, che avviene
principalmente attraverso il quenching, influenza il tempo di vita dello stato eccitato, misurato
dall’analisi dei burst di fluorescenza in soluzione. Il legame della proteina alla NP d’oro, grazie al
riconoscimento antigene-anticorpo, modifica ulteriormente il tempo di vita della FITC, permettendo
così una misura della concentrazione della proteina.
In particolare, il costrutto è stato utilizzato per misurare i cambiamenti nel tempo di vita del
colorante indotti dal legame della proteina modello BSA (bovine serum albumine); in seguito è
stato applicato al riconoscimento della proteina p53, la cui rilevazione è di particolare interesse
come segnale per diagnosi e prognosi di tumori, sia in soluzioni standard sia in estratti cellulari
totali. Inoltre è stata valutata la selettività della sonda rispetto a proteine globulari. I dati indicano
che il tempo di vita della FITC risulta essere un parametro sensibile per rilevare piccole quantità di
proteine in soluzione con un limite di circa 5 pM, determinato principalmente dall’accuratezza
statistica con cui avviene la misura del tempo di vita.
Nella seconda parte del progetto, mi sono focalizzata sull’utilizzo di nanoparticelle anisotrope d’oro
come mezzi di contrasto per imaging di cellule. Le loro proprietà di fotoluminescenza (TPL) sono
state studiate sfruttando l’eccitazione a due fotoni; mi sono in particolare focalizzata su
nanoparticelle d’oro ellissoidali (nanorod), che possono essere facilmente ottenute grazie a una
sintesi che fa uso di un surfattante standard, il CTAB (cetyl trimethulammonium bromide). Le
nanoparticelle anisotrope asimmetriche con bracci ad elevato rapporto assiale sono state ottenute
in collaborazione con l’Università di Pavia, utilizzando per la prima volta il surfattante zwitterionico
LSB (laurylsulphobetaine) nel metodo di sintesi mediato da “seed”. La concentrazione di LSB
presente nella soluzione di crescita permette di controllare le dimensioni delle NP e la posizione
del picco di risonanza plasmonica, che può essere variato nell’intervallo del vicino infrarosso da
700 a 1100 nm.
I campioni sono stati analizzati con diverse tecniche in modo da ottenere una loro completa
caratterizzazione: dai dati ottenuti misurando il loro spettro di assorbimento nella regione UVvisibile dello spettro, tramite la miscoscopia a trasmissione (TEM), il Dynamic Light Scattering e la
spettroscopia di correlazione della fluorescenza, sono stati determinati la forma, le dimensioni e il
grado di aggregazione. Sono state trovate tre popolazioni: nanosfere con diametro inferiore a 20
nm, nanostars caratterizzate da bracci trapezoidali e nanoparticelle con bracci con un elevato
rapporto assiale.
Al fine di applicare le NP come sonde per imaging, è stata effettuata una loro caratterizzazione
spettroscopica utilizzando l’eccitazione a due fotoni; in particolare sono state studiate la
dipendenza del segnale di luminescenza emesso dalla potenza, dalla lunghezza d’onda e dalla
polarizzazione della luce incidente.
La TPL è stata quindi sfruttata per valutare l’internalizzazione delle NPs in differenti linee cellulari
(cellule HEK, epiteliali alveolari e macrofagi).
Oltre all’utilizzo come mezzo di contrasto per imaging e nella terapia fototermica, le NP possono
essere sfruttate anche per il trasporto di farmaci e sono in grado di stimolare e/o sopprimere le
resposte immunitarie. Inoltre possono essere funzionalizzate in modo da trasportare vaccini e
adiuvanti (agenti aggiunti ai vaccini per aumentare la risposta immunitaria contro gli antigeni), che
agiscono in modo da aumentare le risposte immunitarie innate e adattive che generano una
effettiva memoria immunologica.
In questo scenario e al fine di sfruttare in futuro le peculiari caratteristiche di emissione delle
nanoparticelle per imaging in tempo reale in-vivo e di studiarne gli effetti immunologici,
parallelamente alle attività descritte, ho condotto uno studio iniziale riguardante processi di
dinamica cellulare in-vivo in condizioni standard, ovvero con cellule marcate con sonde
fluorescenti tradizionali.
Con questo scopo sono stati condotti esperimenti sfruttando un sistema di microscopia intravital
con eccitazione a due fotoni, che permette di studiare il comportamento di diverse popolazioni di
cellule del sistema immunitario in organi linfoidi e in tessuti periferici.
In particolare è stata studiata l’interazione tra due specie cellulari appartenenti al sistema
immunitario, le cellule dendritiche (DC) e natural killer (NK). In questo ambito ho sviluppato un
metodo di analisi per caratterizzare il comportamento dinamico delle cellule NK basato
sull’osservazione di un set di parametri (velocità media e istantanea, confinement ratio, distanza
inter-cellulare, spostamento quadratico medio) e, dal punto di vista biologico, ho verificato che uno
dei meccanismi di attivazione delle capacità immunitarie delle NK è dovuto alla loro interazione
diretta con le DC.