Ingegneria Genetica CFU lezioni=5 CFU Laboratorio=1 Frequenza

Ingegneria Genetica
CFU lezioni=5 CFU Laboratorio=1
Frequenza: 4 ore settimanali
Obiettivi formativi del corso
1) Illustrare le principali metodologie utilizzate nel campo dell’ingegneria genetica
2) Permettere la familiarizzazione con i databases del genoma dei vari organismi
3) Permettere la familiarizzazione con la ricerca bibibliografica al fine di presentare un seminario su
argomento specifico di interesse.
Syllabus
Il programma verte sulle tecniche di base utilizzate nel campo dell’ingegneria genetica al fine di creare
organismi in grado di produrre proteine varianti o provenienti da altre specie.
Programma dettagliato del corso
La tecnologia del DNA ricombinante: le endonucleasi di restrizione, l’elettroforesi su gel.
I vettori di clonazione plasmidici:il vettore di clonazione plasmidico pBR322. Trasformazione e selezione.
Altri vettori plasmidici di clonazione.
Creazione e screening di una genoteca. Screening mediante ibridazione con DNA, mediante saggio
immunologico, mediante attivita’ proteinica. L’autoradiografia.
La clonaizone di sequenze di DNA che codificano proteine eucariotiche.
I vettori per clonare frammenti di DNA di grandi dimensioni: i vettori basati sul batteriofago lambda, i
cosmidi, sistemi vettoriali batterici ad inserto molto grande.
La trasformazione genetica dei procarioti: il trasferimento di DNA in E. coli, l’elettroporazione, la
coniugazione.
Tecniche di sequenziamento del DNA.
La PCR.
La manipolazione dell’espressione genica nei procarioti. Espressione genica da promotori forti e regolabili. I
promotori regolabili, l’aumento della produzione delle proteine. I sistemi su larga scala. L’espressione in altri
microorganismi.
Le proteine di fusione. Serie di geni in tandem unidirezionali, i vettori di espressione della traduzione. Il
miglioramento della stabilita’ delle proteine. Come superare il problema della limitatezza dell’ossigeno.
L’impiego di ceppi ospiti delle proteasi.
Integrazione del DNA nel cromosoma ospite. L’aumento della secrezione proteica. Il concetto di carico
metabolico.
La produzione di proteine ricombinanti nelle cellule eucariotiche. I sistemi di espressione a base di S.
cerevisiae. L’espressione diretta. La secrezione di proteine eterologhe.
Altri sistemi di espressione basati sul lievito. Esempio di antigene di superficie del virus dell’epatite B e del
lisozima C2 bovino.
I sistemi di espressione basati sulle cellule di insetto in coltura. Sistema di espressione basato sul
baculovirus. La produzione di baculovirus ricombinante. La costruzione di un vettore navetta a baculovirus
E.coli-cellula insetto. La purificazione selettiva della proteina ricombinante da cellule di insetto mediante
marcatura per affinita’.
I vettori di espressione per le cellule di mammifero. I sistemi marcatori selezionabili per i vettori di
espressione nei mammiferi. L’espressione di due geni clonati in una stessa cellula di mammifero.
La mutagenesi mirata e la manipolazione delle proteine. I procedimenti della mutavenesi mirata. La
mutagenesi mirata agli oligonucleotidi con il DNA di M13. La mutagenesi mirata agli oligonucleotidi con il
DNA plasmidico. La mutagenesi mirata agli oligonucleotidi amplificata tramite PCR. La mutagenesi casuale
con inneschi oligonucleotidici degeneri. La mutagenesi casuale con gli analoghi dei nucleotidi.
La manipolazione delle proteine. L’addizione dei legami bisolfuro. Il cambiamento dell’asparagina in altri
aminoacidi. La riduzione del numero dei residui sulfidrile liberi. L’incremento dell’attivita’ enzimatica. La
modificazione del cofattore metallico necessario. La modificazione della specificita’ dell’enzima.
L’aumento della stabilita’ e della specificita’ degli enzimi.
La diagniostica molecolare. Gli anticorpi monoclonali. I sistemi diagnostici applicati al DNA. La diagnosi
molecolare delle malattie genetiche.
La produzione microbica di agenti terapeutici. L’isolamento dei cDNA dell’interferone. La manipolaizone
genetica degli inteferoni umani. La manipolazione genetica dell’ormone della crescita umano.
L’ottimizzazione dell’espressione genica.
Gli enzimi: la DNAsai I e l’alginato-liasi.
Gli anticorpi monoclonali come agenti terapeutici. Struttura e funzione degli anticorpi. Gli anticorpi
monoclonali di origine umana. Gli anticorpi monoclonali ibridi uomo-topo. Gli agenti terapeutici contro
l’HIV.
La sintesi di prodotti commerciali mediante microorganismi ricombinanti.
Le endonucleasi di restrizione. La sintesi dell’acido L-ascorbico, la sintesi microbica dell’indaco. La sintesi
degli aminoacidi. Gli antibiotici. La clonazione dei geni della biosintesi degli antibiotici. La sintesi di nuovi
antibiotici. La manipolaizone degli antibiotici polichetourici. I biopolimeri. Produzione della resina
xantorrea. I geni della biosintesi della melanina. Sintesi di un biopolimero adesivo animale in cellule
microbiche. La sintesi microbica della gomma. La produzione microbica dei poliidrossialcanoati.
Ingegneria genetica delle pinate: metodologie. I sistemi vettoriali derivanti dal plasmide Ti. I metodi fisici
per trasferire i geni alle piante. Il bombardamento con microproiettili. La manipolazione dell’espressione
genica nelle cellule vegetali.
Gli animali transgenici. Metodologia. Il metodo del vettore retrovirale. Il metodo della microiniezione del
DNA. Il metodo delle cellule staminali embrionali manipolate. La clonazione mediante trasferimento del
nucleo.
Argomenti da conoscere per poter frequentare efficacemente il corso
Genetica, Chimica generale, Chimica organica.
Bibliografia
“Biotecnologia molecolare” B.R. Glick J.J Pasternak
Prove di verifica dell’apprendimento
Gli studenti sono tenuti a preparare un seminario della durata di circa 20 minuti su un argomento tra quelli
trattati durante il corso semestrale, o di argomento attinente alla Ingegneria Genetica
Dati del docente
Nome: Stefano Landi
Dipartimento: Scienze dell’Uomo e dell’Ambiente
Telefono: 050 832 241
E- mail: [email protected]
Pagina web:
Orario di ricevimento: Tutti i giorni dalle 13.45 alle 15
Luogo di ricevimento: Istituto di Genetica, Via S. Giuseppe 22