istruzioni del produttore

TB-test IgG/IgA/IgM
Test immunoenzimatici per la determinazione degli
anticorpi IgA, IgG o IgM diretti contro i Micobatteri nel
siero e in altri fluidi di origine umana .
Per uso diagnostico in vitro.
Indice:
1. Diagnosi sierologica di infezioni micobatteriche
2. Principio del metodo
3. Reagenti
4. Strumenti e materiali richiesti ma non forniti
5. Raccolta dei campioni e preparazione
6. Precauzioni
7. Preparazione dei reagenti
8. Procedimento
9. Calcolo dei risultati analitici
10. Interpretazione dei risultati
11. Bibliografia
1. Diagnosi sierologica delle infezioni micobatteriche
Il complesso antigenico A60 è un antigene inter specifico
riscontrato nel citosol di micobatteri tipici ed atipici. Esso
reagisce con anticorpi creati durante infezioni micobatteriche
(tubercolosi, lebbra, ecc.), e reagisce anche con gli anticorpi
prodotti durante le infezioni da nocardia (8. 9. 10). Gli
anticorpi anti-micobatterici sono assenti negli individui sani (4.
6. 8). Infezioni inapparenti o recesse causate da micobatteri
sono tuttavia più frequenti di quanto si ritenga (8. 9. 11. 15).
In particolare, si osservano con frequenza anticorpi IgM dopo
contatti professionali (ad esempio nel personale ospedaliero
e dei servizi sociali) oppure in condizioni sociali disagiate. Nel
secondo caso la reazione IgM positiva si riscontra più
facilmente nei neonati e nei bambini cresciuti in condizioni
malsane. Un test IgM positivo rilevato nel siero e nel liquido
cefalo-rachidiano (LCF) è estremamente utile per stabilire la
diagnosi di meningite tubercolosa (9. 16), per la diagnosi
sierologica di infezioni tubercolose primarie latenti polmonari
o extrapolmonari (8), e nella prognosi di ricadute (3). Il lungo
lavoro condotto per stabilire la validità clinica del test Tb-test
IgG ha portato alle seguenti conclusioni:
- Gli individui sani sono negativi, anche se hanno reazione
intradermica positiva e se vivono in paesi gravemente
endemici (4. 6. 8. 9. 11. 15. 16).
-La prevalenza di infezioni subcliniche inapparenti è
fortemente sottovalutata nei paesi del terzo mondo, ma anche
nei paesi sviluppati in determinati gruppi sociali e
professionali: persone a costante contatto con individui
appartenenti al terzo o quarto mondo (ad esempio lavoratori
di magazzini di generi alimentari, personale ospedaliero,
carcerati), persone affette da malattie non tubercolari e
pazienti ospedalizzati con infezione da HIV ed altri. Tutti
questi gruppi rivelano una percentuale di A60 sieropositivi
talvolta ben superiore a quella della popolazione generale
che presenta una frequenza di casi positivi compresa tra 1,5
e 3% (11. 15).
- In pazienti con infezione tubercolare, il test indica la
presenza di anticorpi IgG se il paziente ha subito uno stimolo
antigenico scatenante. Il test sarà positivo principalmente nei
casi di pazienti con infezione in atto. Sarà inoltre positivo nei
casi di vaccinazioni di richiamo in popolazioni sane.
- Nei pazienti affetti da tubercolosi extrapolmonare il test sarà
efficace a seconda dell’organo colpito.
- Nel 10-20% dei pazienti, l’attività immunologica umorale è
debole. I pazienti che mostrano tale anergia possono risultare
negativi (1. 6. 9).
- Le meningiti tubercolari causano la formazione di anticorpi
nel liquido cefalo-rachidiano (LCF), rilevabili alla diluizione
1:10 (9. 16).
La presenza di anticorpi IgG indica una buona reazione
immunologica dei pazienti all’infezione. (1). L’anergia che
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interessa alcuni pazienti prima o all’inizio del trattamento
riguarda sia l’immunità cellulare (PPD) sia la produzione di
IgG (6). La produzione di anticorpi IgA è in gran misura
indipendente dalla produzione di anticorpi IgG e può verificarsi mentre il paziente è in condizione anergica di IgG (16).
Gli anticorpi IgA formano facilmente complessi con antigeni e
sono all’origine di vari processi infiammatori in vari organi (2).
Gli anticorpi IgA sono facilmente rilevabili nel siero di alcuni
individui a rischio apparentemente sani, nello sputo di
pazienti affetti da tubercolosi polmonare e nei fluidi biologici di
pazienti affetti da infezioni extrapolmonari. In particolare,
anticorpi specifici IgA sono rilevati nel 30% circa dei pazienti
affetti da morbo di Crohn (13). È interessante notare che le
persone in contatto con questi pazienti mostrano solo elevati
anticorpi IgG (14) e che la presenza di anticorpi anti-A60 in
quei pazienti è probabilmente dovuta ad infezioni
micobatteriche secondarie, in quanto altri studi non
riferiscono la loro presenza (24) e poiché in tali pazienti non
sono mai stati rilevati acidi nucleici specifici di micobatteri.
2. Principio del metodo
TB-test è un test immuno-enzimatico con dosaggio in fase
solida (10). I campioni di siero umano diluito (IgG, IgA,IgM),
sputo (IgG, IgA) o liquido cefalo-rachidiano (LCR; IgG, IgM)
sono distribuiti nei pozzetti di micropiastre rivestiti da
complessi micobatterici A60. La loro incubazione determina la
formazione di complessi antigeni-anticorpi. I componenti del
siero non legati vengono eliminati con il lavaggio. Si procede
quindi all’incubazione dei pozzetti con anticorpi anti IgA, IgG
o IgM umani marcati con perossidasi che si legano ai
complessi adesi al fondo del pozzetto. Gli anticorpi non legati
vengono eliminati con il lavaggio. Si dispensa quindi una
soluzione di tetra-metil-benzidina (TMB) contenente
perossido di idrogeno. Durante la reazione della perossidassi
con la TMB si sviluppa colore la cui intensità è proporzionale
alla presenza nel campione degli anticorpi specifici. Per i test
IgA e IgG, la curva standard è costituita dal tracciato delle
densità ottiche degli standard. La concentrazione del siero in
esame analizzato allo stesso tempo degli standard è quindi
rilevata dalla curva standard e trasformata in siero-unità
relative, il che consente all’operatore di prendere in
considerazione le inevitabili variazioni quotidiane che si
verificano durante i test. Per i test IgM, un valore soglia è
costituito dalla densità ottica ottenuta con un riferimento
positivo. Il campione la cui densità ottica è equivalente o
superiore a tale valore è considerato positivo. I controlli
inclusi nei test IgG hanno lo scopo di verificare se il test è
stato effettuato correttamente e non devono essere usati
come standard.
3. Reagenti
1). 2 flaconi da 50 ml ciascuno di diluente del campione (siero
o sputo). Conservanti: sodio azide e sodio mertiolato al di
sotto dei limiti di tossicità per IgG e IgA, sodio mertiolato per
IgM. In questo reagente può comparire un deposito nero, che
non influisce sulla qualità del reagente stesso.
2). 1 flacone contenente 13 ml (tappo blu scuro) di antiimmunoglobuline umane marcate con perossidasi (antihumIg-POD) in tampone contenente uno stabilizzatore
proteico. Conservante: metilisotiazolo e bromonitrodiossano
per l’anti-humIgA-POD e timolo per l’anti-humIgG-POD e
l’anti-humIgM-POD . In questa soluzione si può formare un
precipitato, che non incide sulla qualità del reagente.
3). 1 flacone contenente 1,6 ml di una soluzione concentrata
(10x) di TMB e DMSO. La soluzione è irritante per gli occhi, la
pelle e il sistema respiratorio (Xi R 36/37/38: irritante per gli
occhi, le vie respiratorie e la pelle; S 26: in caso di contatto
con gli occhi, lavare immediatamente ed abbondantemente
con acqua e consultare un medico; 36/37: usare indumenti
protettivi e guanti adatti).
4). 1 flacone contenente 16 ml di diluente per TMB: tampone
citrato contenente 0,02% di H2 O2 .
5). 1 flacone contenente 16 ml di acido solforico (H2SO4)
(0.5N) (tappo rosso).
6). Standard IgG e IgA: ogni fiala contiene 1,9 ml di standard
negativo (tappo giallo), 1 Unità/ml (tappo bianco), 2 Unità/ml
(tappo viola), 4 Unità/ml (tappo rosa), 8 Unità/ml (tappo rosso
vivo), 16 Unità/ml (tappo blu chiaro). Conservanti: sodio azide
e sodio mertiolato. Pronto per l’uso.
Standard IgM: ogni fiala contiene 1,9 ml di calibratore
negativo (tappo grigio) o limite positivo (tappo marrone).
Conservante: sodio mertiolato. Pronto per l’uso.
7). Controlli per IgG (solo nel kit codice 9236) 1 fiala
contenente 0,25 ml di controllo debolmente positivo (225-375
U/ml) (tappo verde) e una contenente 0,25 ml di controllo
altamente positivo (600-1100 U/ml) (tappo arancione) .
Conservante: sodio azide al di sotto dei limiti di tossicità.
Diluire come i campioni di siero (1:100).
8). 1 flacone contenente 50 ml di soluzione di lavaggio
concentrata 20x .
9). 12 strisce da 8 pozzetti rivestiti di antigene A60 da
Mycobacterium bovis (BCG).
4. Strumenti e materiali richiesti ma non forniti
- pipette da 10, 100 e 1000µl,
- un fotometro con possibilità di misurare assorbanze a 450
nm,
- provette per diluizione di sieri,
- acqua distillata o demineralizzata,
- incubatore a 37°C.
5. Raccolta dei campioni e
preparazione
I campioni da analizzare devono essere siero, sputo, liquido
cefalo-rachidiano (LCR) o altri fluidi biologici. Raccogliere i
campioni utilizzando le tecniche normali. Evitare l’emolisi.
Lasciar coagulare il sangue a temperatura ambiente in provetta sterile, quindi prelevare il siero. Lo sputo può essere
utilizzato nei test IgA e IgG con diluizione 1:20. Il liquido
cefalo-rachidiano (LCR) può essere usato nei test IgG e IgM
con diluizione 1:10.
Utilizzare solamente materiali monouso.
Conservare i campioni in luogo fresco e congelarne una
parte.
Non
sottoporre
i
campioni
a
cicli
ripetuti
di
congelamento/scongelamento.
6. Precauzioni
1. Non pipettare mai a bocca.
2. Utilizzare guanti ed indumenti di protezione adatti.
3. Non utilizzare assieme reagenti di lotti diversi.
4. Non utilizzare i componenti dopo la data di scadenza.
5. Conservare i reagenti al buio ad una temperatura di +4 °C.
Solamente l’acido solforico, la soluzione tamponata di lavaggio ed i pozzetti rivestiti possono essere conservati a
temperatura ambiente.
6. Portare i reagenti a temperatura ambiente solo al momento
dell’utilizzo.
7. Evitare la contaminazione microbica dei reagenti durante
l’apertura e il prelevamento di aliquote dai flaconi.
8. Sostituire la punta delle pipette dopo ogni operazione per
evitare le contaminazioni incrociate.
9. Assicurarsi che tutti i pozzetti siano processati nelle stesse
condizioni ed incubati per lo stesso periodo di tempo.
10. Una determinazione, una volta iniziata, deve essere
completata senza interruzioni.
11. Incubare i pozzetti all’ombra o al buio. Evitare ogni
contatto fisico con la soluzione madre di tetra-metil-benzidina
(TMB). In caso di contatto lavare abbondantemente con
acqua la superficie contaminata.
12. I prodotti di derivazione umana usati sono risultati negativi
all’analisi per le seguenti infezioni: HIV I e II, Epatiti B e C.
Tuttavia devono essere manipolati come se si trattasse di
materiale infetto. Pulire eventuali punti contaminati con
appropriati prodotti antivirali.
13. Il limite di tempo di utilizzo di un kit aperto è di sei mesi o
improrogabilmente la data di scadenza indicata sul kit
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comunque la data che cade prima, a condizione che tutti i
componenti siano stati chiusi in modo corretto, non siano stati
contaminati e siano stati conservati in modo adeguato.
7. Preparazione dei reagenti
a) Soluzione di lavaggio
Aggiungere 19 volumi di acqua distillata ad un volume di
soluzione concentra 20x e tamponata.
b) Soluzione TMB di lavoro
Aggiungere 9 volumi del diluente per TMB ad un volume di
soluzione TMB concentrata 10x. Questa soluzione deve
essere preparata al momento dell’uso e deve essere priva di
colore ed omogenea.
Preparazione della soluzione diluita TMB
Numero di TMB
pozzetti
concentrata
0,10 ml
8
0,26 ml
24
0,35 ml
32
0,50 ml
48
0,75 ml
72
1,00 ml
96
TMB
diluente
0,9 ml
2,34 ml
3,15 ml
4,50 ml
6,75 ml
9,00 ml
8. Procedimento
1. Portare i pozzetti rivestiti con A60 a temperatura ambiente.
2. Diluire 1:100 i sieri da sottoporre a test con il diluente del
campione. Nel caso delle IgG diluire 1:100 anche i controlli
positivi.
Per gli altri tipi di campione:
a) Per IgA e IgG lo sputo deve essere diluito 1:20 nello stesso
diluente.
b) Per IgG e IgM l’ LCR deve essere diluito 1:10 nello stesso
diluente.
c) Una diluizione 1:10 di liquido pleurico nello stesso diluente
può essere usata per le IgG.
d) Una diluizione 1:30 della saliva nello stesso diluente può
essere usata per le IgA
Il fattore di diluizione da usare per altri liquidi biologici va
determinato con l’analisi di una serie di campioni di malati e di
persone sane, utilizzando per esempio 1:10, 1:25, 1:50,
1:100, 1:150 come fattore di diluizione.
Mescolare bene. In alcune regioni la presenza di anticorpi a
basso livello è molto comune negli individui sani ed è
necessaria una diluizione superiore per evitare falsi positivi.
Questo si determina con un’analisi a varie diluizioni, ad
esempio 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, di un pannello di sieri
negativi provenienti da quelle regioni. Per bambini , neonati e
pazienti HIV+ può essere più opportuna una diluizione di 1:50
o 1:25.
3. Gli standard sono già diluiti e devono essere usati come
sono.
Nota: La determinazione delle IgA e delle IgG è
semiquantitativa e basata sull’uso degli standard forniti. Si
può ottenere una determinazione indicativa utilizzando solo
gli standard a 2 e 16 unità per le IgG o 4 e 16 unità per le IgA.
4. Pipettare 100µl di campione diluito in un micropozzetto.
Usare due pozzetti per campione ed identificare ciascun
pozzetto. Procedere nello stesso modo per gli standard.
5. Incubare 1 ora a 37°C.
6. Diluire la soluzione concentrata e tamponata di lavaggio
durante questo periodo di incubazione.
7. Lavare i pozzetti sotto un getto leggero di soluzione di
lavaggio: riempire e svuotare i pozzetti 5 volte (3 volte con un
lavatore per piastre automatico). Alla fine del processo di
lavaggio i pozzetti devono essere completamente asciutti.
Nota: voltare le piastre e batterle su un foglio di carta
assorbente. NON strofinare l’interno dei pozzetti.
8. Distribuire 100 µl di anticorpi anti-immunoglobuline umane
coniugati con perossidasi in ciascun pozzetto.
Incubare per 30 minuti a 37°C.
9. Diluire la TMB un poco prima dello scadere dei 30 minuti.
10. Lavare i pozzetti sotto un getto leggero di soluzione di
lavaggio: riempire e svuotare i pozzetti 5 volte (3 volte con un
lavatore per piastre automatico). Alla fine del processo di
lavaggio i pozzetti devono essere completamente asciutti
Nota: voltare le piastre e batterle su un foglio di carta
assorbente. NON strofinare l’interno dei pozzetti.
11. Distribuire rapidamente 100µl della soluzione diluita TMB
in ciascun pozzetto.
Incubare a 37°C per 15 minuti esatti.
12. Aggiungere rapidamente 100µl di H2SO4.
13. Leggere l’assorbanza a 450 nm.
Il bianco del fotometro è tarato su aria (pozzetti vuoti e
nuovi).
Riepilogo del procedimento
PASSAGGI
CALIBRATORI
CAMPIONI
Standard pronti
per l’uso
100µl
Campioni
e
Controlli Diluiti
100µl
INCUBARE 1 ORA A 37 °C
Lavare 5 volte con Soluzione di Lavaggio
Aggiungere
anti-Ig
umane
marcate
con 100µl
100µl
perossidasi
INCUBARE 30 MINUTI A 37 °C
Lavare 5 volte con Soluzione di Lavaggio
TMB diluita
100µl
100µl
INCUBARE 15 MINUTI A 37°C
H2SO4
100µl
LETTURA A 450 nm
100µl
9. Calcolo dei risultati analitici
A) Test IgA e IgG
1. Calcolare l’assorbanza media (D.O. a 450nm) per ogni
campione e per ogni standard.
2. Tracciare su una carta semilogaritmica il risultato di ogni
standard, tranne che per lo standard negativo, sull’asse verticale (ordinate=Y), in relazione al numero di unità
corrispondenti sull’asse orizzontale (ascisse=x) Questa curva
standard dovrebbe essere una linea retta tra le 2 e le 16 unità
per IgG, ma non necessariamente per IgA. L’estrapolazione
dei dati oltre 16 unità non è consigliata a causa della perdita
di precisione delle misure a densità elevate. I sieri con D.O.
superiore a quella ottenuta con 16 unità dovranno essere
ulteriormente diluiti e analizzati nuovamente sulla base dei
nuovi fattori di diluizione.
3. Utilizzando l’assorbanza media per ciascun campione,
determinare la corrispondente concentrazione di anticorpi
espressa in unità/ml come segue: dalla curva standard,
trovare il valore di assorbanza sull’asse Y e tracciare una
linea orizzontale fino alla curva standard. Al punto di
intersezione, tracciare una linea verticale fino all’asse X e
leggere la relativa concentrazione in Ig specifiche del
campione. Moltiplicare per il fattore di diluizione applicato
(normalmente 100) per ottenere le unità ELISA.
4. Controlli: il controllo debolmente positivo per IgG dovrebbe
dare risultati tra 225 e 375 U, il controllo fortemente positivo
per IgG dovrebbe dare risultati tra 600 e 1100 U.
B) Test IgM
1. Calcolare l’assorbanza media (D.O. a 450nm) per ogni
campione e per ogni standard.
2. Valori normalizzati: Per ridurre le variazioni quotidiane e
per comparare i dati ottenuti in giornate differenti, dividere
l’assorbanza dei campioni analizzati per l’assorbanza dello
standard positivo ottenuto durante l’analisi.
superiori a 1,0 sono considerati positivi per IgM. Il test è
positivo a condizione che siano escluse interferenze da
condizioni patologiche.
C. Valori Normali
I valori degli standard devono trovarsi entro i limiti di D.O.
sotto riportati:
Standard
Std 1 U
Std 2 U
Std 4 U
Std 8 U
Std 16 U
Std negativo
Std limite pos
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Anda 111022 Ver.0301
IgG
0,25-0,45
0,40-0,80
0,60-1,10
0,9-1,45
1,35-1,90
0,05-0,20
IgM
-------------------------0,10-0,35
0,40-0,75
Il controllo positivo basso per le IgG deve dare risultati
compresi tra 225 e 375 U. Il controllo positivo alto per le IgG
deve dare risultati compresi tra 600 e 1100 U.
D) Limiti del metodo
I risultati ottenuti con questo test devono essere valutati
congiuntamente ad osservazioni cliniche ed ai risultati di altre
analisi.
1. La concentrazione di anticorpi circolanti deve essere
utilizzata come complemento di altre informazioni disponibili
al medico (sintomi, risultati di altre analisi, osservazione
clinica). - Ad esempio, l’assenza di anticorpi IgG o IgA in
pazienti che mostrano altri sintomi tipici di infezione TB non
devono essere considerati falsi negativi, ma invece un caso di
anergia che indica che l’infezione è in uno stadio avanzato
e/o che il paziente necessita di aiuto esterno per superare la
sua malattia. Analogamente, la presenza di anticorpi IgM in
individui apparentemente sani indica l’inizio di un’infezione.
Queste persone andrebbero pertanto osservate per
determinare se l’infezione è benigna e transitoria oppure se si
svilupperà in malattia. Infine, un livello alto di anticorpi IgG e
di IgA in individuo apparentemente sano indica il suo costante
contatto con fonti di infezione e la necessità di essere tenuto
in osservazione.
2. Campioni emolizzati o lipemici possono portare a risultati
alterati.
Eurospital
TB-test Curva standard per IgA
D.O. del campione a 450nm / D.O. dello std positivo a 450nm
Il valore normalizzato dello standard positivo è 1. Tutti i
campioni la cui assorbanza normalizzata è inferiore a 0,8
sono considerati negativi, in quanto indicano livelli di anticorpi
inferiori a quelli attesi per confermare l’infezione. Tutti i
campioni con valori normalizzati compresi tra 0,8 e 1,0 sono
considerati dubbi e tutti i campioni con valori normalizzati
IgA
0,15-0,35
0,25-0,60
0,45-1,00
0,8-1,40
1,45-1,95
0,05-0,20
Eurospital
TB-test Curva standard per IgG
Autore
Specificità
%
Sensibilità
%
Commento
Controlli =
48 (IgG)
et 71 (IgG)
coltura negativa,
76 (IgM)
98 (IgM)
100 (IgG e/o 68 (IgG e/o nessuna casistica
IgM))
IgM)
di TB. Cut-off
positivo: IgG = 0.50
D.O., IgM = 0.43 D.O.
Caminero
Fluido pleurico,
100
50-55
et al (20)
Controlli = Pazienti
con versamento
pleurico di altra
causa. Cut-off
positivo IgG: fluido
pleurico = 150 U.,
siero = 235 U.
Wang et al 85,4
Controlli = altri
81,4-61,9
(21)
pazienti, incl. TB
inattivi, e non-pazienti.
Cut-off
positivo IgG = 300 U.
Sensibilità più
elevata con TB
polmonare che
in altri tipi di TB.
Charpin
al (3)
Yu et
(22)
E) Specificità
1. Le micobatteriosi differerenti da quelle causate da M.
tuberculosis (tubercolosi tipica) e M. bovis possono portare a
risultati positivi con TB-test (2. 3. 4. 5).
Questo è il caso di organismi dei gruppi M. avium
(tubercolosi atipica), M. paratuberculosis e M. leprae. È il
caso inoltre di altri micobatteri, come M. xenopi, M. chelonae
o M. kansasii, che raramente causano malattie. Questi
micobatteri atipici causano talvolta infezioni secondarie in
pazienti immunodepressi (cancro, HIV, ecc.) oppure infezioni
inapparenti nelle persone sane (19).
2. Sono riportate reazioni crociate da malattia non tubercolare
causata da Nocardia, come pure sono frequenti ed
inapparenti infezioni secondarie causate da micobatteri
durante Leishmaniosi (8. 9. 10).
3. È possibile l’interferenza con malattie non tubercolari
polmonari (4. 8. 9. 10), causate da infezioni secondarie da
una delle specie di micobatteri indicate sopra che sono
spesso benigne e transitorie.
4. I trattamenti immuno-depressivi alterano presumibilmente
la risposta immune all’infezione (1) e danno risultati negativi
per IgG o/e IgA, nei pazienti tubercolosi.
5. Tutti i campioni siero positivi a IgM dovrebbero essere
sottoposti ad un test di conferma dopo il loro assorbimento su
proteina G, per eliminare la possibile interferenza dovuta a
fattore reumatoide oppure ad alti livelli di IgG.
6. La specificità di TB-test dipende dalla popolazione studiata
e dai gruppi di controllo prescelti in ogni prova clinica.
Alcuni esempi sono presentati nella tabella seguente.
F) Sensibilità
La sensibilità dei kit TB-test dipende dai valori di cut-off
utilizzati. Questi valori di cut-off devono essere determinati
separatamente in ciascuna popolazione, in quanto variano
con il livello di esposizione al bacillo TB e agli altri micobatteri
ambientali (8. 22). Analogamente, i valori predittivi positivo e
negativo variano con la prevalenza di TB nella popolazione
(8). Alcuni esempi sono riportati nella tabella seguente.
4di 7RM31/04 codice32106
Anda 111022 Ver.0301
al
95 (sani)
88 (non –TB)
84
Gevaudan
et al (8)
86,7
98,6
Munshi et
al (23)
92
100
Gupta et al 90
(18)
91,6
Kaustova
(19)
Varia a
seconda del
gruppo
studiato
80-91,5
I valori cambiano con il
cut-off scelto, 4 falsi
negativi diventarono
positivi dopo il trattamento
anti TB. Cut-off positivo
IgG: 200 U
Controlli = personale
ospedaliero, servizio
pneumologico, in
contatto con TB.
Cut-off positivo
IgG = 200 U.
Controlli = soggetti sani,
cut-off positivo IgG=225U.
TB extrapolmonare
Utilizzate IgG + IgA,
Controlli = popolazione
sana e pazienti diversi
daTB.
63.3% dei tecnici
che manipolano il bacillo
erano positivi.
Cut-off positivo:
IgG = 250 U.,
IgA = 150 U.
Malattie non-tubercolari,
differenti gruppi di pazienti
esaminati, la
maggioranza di falsi
positivi riscontrata
effettivamente infetta da
Micobatteri atipici. La
maggioranza di positivi
alle IgM è diventata
negativa dopo 1 o 2 mesi,
indicando infezione
inapparente.
Cut-off positivo:
IgG = 125 U., IgA =200U,
IgM=1,0 D.O.
10. Interpretazione dei risultati
A) Cut off
I dati sierologici sono una valutazione dello stato umorale
immune di un paziente o di una popolazione. Non
sostituiscono la rilevazione di antigeni, ma sono comparabili
al test della tubercolina, che valuta lo stato immune cellulare
di un paziente o di una popolazione. La differenza consiste
nella lunga durata della reattività cutanea dopo l’esposizione,
che non si riscontra nell’immunità umorale. In questo caso la
produzione di anticorpi sembra dipendere dal carico di
antigeni. Una seconda differenza è la possibilità di analizzare
tre diversi classi di gamma-globuline. Come nel caso di
reazione cutanea i clinici devono adattare il cut-off della
misurazione sierologica al livello di endemia osservato nella
regione o all’interno della popolazione analizzata. In generale
sono risultati applicabili i seguenti cut-off:
IgM
Assorbanza
Negativo < Rifer. Pos. – 20%
Rif. Pos. – 20% <Borderline < Rif. Pos.
Positivo > Riferimento. Pos
IgA
Valori normalizzati
< 0.8
0.8 – 1.0
> 1.0
IgG
Siero – Unità
Siero – Unità
Negativo <200
< 125
Borderline
neg. 201 – 300
125 – 225
pos. 301 – 350
Positivo > 350
> 225
I valori sopra indicati, si riferiscono ad adulti normali. Per i
bambini e le persone infette da HIV, i valori di cut off positivo
sono ridotti a 120 unità per IgG e 200 unità per IgA.
I valori di cut-off possono essere adeguati alle condizioni
locali. In particolare, devono essere aumentati nelle regioni
ad alta incidenza di micobatteri (MTb o altri). In generale il
valore di cut-off di una regione può essere calcolato sulla
base di test su 20-50 persone sane non-infettate.
Per gli altri tipi di campioni, i valori di cut off devono essere
adattati in quanto gli anticorpi sono rari nella maggior parte
degli altri liquidi biologici. Si raccomanda allora di determinare
i propri valori di reiferimento, testando 20-50 persone affette
da malattie non batteriche.
La ricerca degli anticorpi IgG dovrebbe essere completata
con la ricerca di anticorpi IgM (1). Per uso diagnostico,
l’analisi sia di IgG che di IgA aumenta in modo considerevole
la specificità e la sensibilità (›90%) dei risultati (18). Per
ottenere la conclusione diagnostica più precisa, i dati
sierologici devono sempre essere integrati con test clinici,
microbiologici, radiografie e test cutaneo (1).
B) Popolazione sana
Nella popolazione adulta sana, il test IgM può risultare
positivo senza conseguenze nei seguenti casi:
a. Si può osservare una risposta positiva IgM da 7 a 10 giorni
dopo un test cutaneo.
b. La presenza di Fattore Reumatoide può provocare un
risultato positivo.
c. La vaccinazione BCG può indurre la sintesi di anticorpi,
specialmente di classe IgM (12).
d. I contatti con un focolaio micobatterico possono essere
rivelati da una sintesi di anticorpi IgM di breve durata .
e. Una infezione inapparente, asintomatica, con micobatteri
atipici causa la produzione di anticorpi.
Gli individui negativi ai raggi X e con assenza di sintomi
possono avere i seguenti risultati serologici:
IgM – IgG – IgA- :
test cutaneo positivo: contatto precedente.
Nessuna infezione, non si prescrive alcun intervento.
IgM + IgG – IgA - :
test cutaneo positivo o negativo. Questo risultato denota
un’infezione contratta recentemente. Può essere utile
intraprendere una cura.
IgM – IgG + IgA +/- :
test cutaneo positivo: contatto precedente con buona risposta
immunologica. Non si prescrive alcun intervento.
IgM + IgG + IgA +/- :
contatto precedente e riesposizione recente. Sorvegliare.
C) Forme di Tubercolosi
È stabilito che le infezioni micobatteriche raggiungono lo stato
di malattia attiva quando le difese immunitarie dell’ospite
sono ridotte (9). La malattia compare più facilmente in
presenza di più fattori che favoriscono l’evoluzione dell’infezione (cancro, HIV, malnutrizione, tabagismo, alcoolismo,
condizioni di vita malsane, ecc.). Questa premessa di
debolezza immunologica è ulteriormente amplificata dalla
areattivita immunologica indotta dagli stessi micobatteri
invasori i quali, in circostanze a loro favorevoli, sono in grado
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di inibire l’immunità umorale e cellulare del paziente.
L’areattività immunologica è generalmente eliminata dopo
due settimane di chemioterapia efficace. Ciononostante, può
durare più a lungo se il trattamento non è appropriato oppure
se viene effettuato ad uno stadio più avanzato dell’infezione
(6).
a) Tubercolosi Reattiva (R):
la malattia evolve positivamente in quanto l’immunità cellulomediata è ben efficente(1) Clinicamente si presenta con
forme localizzate.
b) Tubercolosi Areattiva (A):
si verifica in presenza di un’immuno depressione
preesistente, talvolta amplificata dal bacillo. La malattia è
caratterizzata da più localizzazioni non circoscritte. Ci sono
cavità, distruzione parenchimale e presenza abbondante di
micobatteri. Nei casi più gravi sono assenti IDR ed anticorpi.
c) Situazioni intermedie (RI, AI):
si osservano inoltre Tubercolosi Intermedia Reattiva (IR) e
Tubercolosi Intermedia Areattiva (IA).
Mantoux 5 IU
Mantoux 10 IU
Multitest IMC
Sierologia IgM
Sierologia IgG
Microbiologia
Risposta alla
terapia
R A
IR
IA
+
+
+
+/+
+/+
+
+/+/+/+
+/+/+
+/+
+/-
+/+
-
R = TB Reattiva
A = malattia inattiva (areattiva/anergica)
IR = TB stadio Intermedio Reattivo
IA = TB stadio Intermedio Areattivo
Interpretazione dei risultati
M-G- e Mantoux+ : infezione superata senza segni clinici in
atto (R)
M-G+ e Mantoux+: TB in fase terminale o malattia in atto
(R,IR)
M+G+ e Mantoux+: malattia in atto (IR,IA)
M+G- e Mantoux+: malattia in atto ( IA)
M+G- e Mantoux-: malattia in atto (A o IA)
M-G- e Mantoux-: malattia non TBC o forma di TBC areattiva
(A)
M+G+ e Mantoux-: malattia in atto (IR,IA)
M-G+ e Mantoux-: malattia in atto (IR)
D) HIV
Gli individui affetti da HIV sono spesso affetti da funzioni
immunologiche ridotte. In questi casi la reazione intradermica
Mantoux deve essere considerata positiva quando il diametro
dell’indurimento raggiunge i 5 mm. Gli unici anticorpi antimicobatterici che si può ritenere di rilevare sono di classe
IgM. Gli anticorpi IgG sono prodotti in piccole quantità e si
devono ricercare in sieri con diluizione molto bassa. La
positività degli IgM nel paziente HIV è sufficiente per avviare
una profilassi, anche se i risultati della tubercolina sono
negativi (1).
E) Anticorpi IgA
Gli anticorpi IgA hanno un potenziale infiammatorio molto
potente. Le IgA polimeriche e i complessi immuni IgA attivano
il complemento e possono scatenare meccanismi infiammatori in vari organi (2). L’aumentata produzione di anticorpi
specifici IgA è associata in via sperimentale all’aumento di
suscettibilità alle infezioni (7). Durante un’infezione
(sintomatica o meno), la produzione di anticorpi IgA avviene
normalmente dopo la produzione iniziale di anticorpi IgM. La
produzione di anticorpi IgA non viene ridotta in maniera
drastica dalla anergia che può ridurre la produzione di IgG e
la iperreattività osservata all’esordio dell’infezione in alcuni
pazienti. Apparentemente gli anticorpi IgA fanno parte della
risposta immunologica TH2 che colpisce alcuni pazienti: in
casi estremi alcuni pazienti anergici privi di reazione cutanea
e con IgG basse possono abbondantemente produrre
anticorpi IgA (16.18). Contrariamente, gli individui che
rispondono in maniera corretta ad uno stimolo di risposta
immunologica micobatterica possono mostrare livelli alti di
anticorpi IgG senza gli IgA (14. 16. 18). La presenza di
anticorpi IgA nel siero di popolazione sana è stato correlato
con un contatto costante con focolai di infezione. Gli anticorpi
IgA sono osservati con livelli bassi ma significativi di anticorpi
IgG (11) e questi anticorpi possono evidenziare un processo
infiammatorio (19) in organi diversi dai polmoni in individui
apparentemente sani (2). La presenza di anticorpi IgA in
siero, sputo o altri fluidi biologici di pazienti affetti da
tubercolosi indicano che la risposta immunologica di questi
pazienti è stata, parzialmente o totalmente mal indirizzata. In
rare occasioni è l’unico anticorpo specifico che può essere
rilevato. La sua ricerca è pertanto necessaria nel caso in cui
l’anergia immunitaria ha depresso la sintesi di anticorpi IgM e
IgG (14. 16. 18) Nei pazienti affetti da infezioni
extrapolmonari, la presenza di anticorpi IgA rilevata nei fluidi
corporali (fluido pleurico, fluido pericardico ecc.) alla
diluizione 1:20 è un segno importante di infezione
micobatterica. Il rilevamento di IgA in questi fluidi è, nei casi
difficili, una preziosa indicazione diagnostica che completa il
rilevamento di anticorpi IgM e IgG nel siero.
F) Interpretazione dei risultati
1. I casi sierologicamente positivi nella popolazione sana
sono attribuiti a semplici contatti. La sieropositività ad IgM
denota un contatto recente, è molto frequente ma transitoria.
Essa è ad esempio riscontrata nei bambini e neonati che
vivono in condizioni di vita malsane (5), tra allievi infermieri
che studiano la manipolazione delle colture oppure tra i
soldati. La positività IgM scompare normalmente dopo 1 o 2
mesi, a condizione che il soggetto non sia più in contatto con
il focolaio di infezione. La vaccinazione BCG causa una
produzione transitoria di IgM. La sieropositività IgA è scarsa e
si trova ad esempio nel personale di volo che si reca
abitualmente nei paesi del Terzo Mondo (1). La sieropositività
IgG è ancora più scarsa nei soggetti sani e denota una
frequente esposizione a focolai di infezione (poliziotti,
personale ospedaliero, micobatteriologi, personale di
supermercati ecc.) (15).
2. I soli veri casi di “Falsi positivi” si osservano nelle infezioni
da membri dei generi Nocardia e Corynebacterium, i due
gruppi più vicini a Mycobacterium. Le malattie provocate sono
facilmente distinguibili dalle micobatteriosi sulla base dei
sintomi clinici.
3. La sierologia positiva è osservata con frequenza in alcune
malattie ben definite (fibrosi cistica, Leishmaniosi,
pneumopatia cancerosa, sarcoidosi, AIDS). Questa
sieropositività denota una colonizzazione micobatterica.
L’infezione è spesso inapparente, ma il paziente dovrebbe
essere seguito nel caso di evoluzione della malattia.
4. In alcuni pazienti la positività sierologica può indicare
un’infezione oppure un’infezione secondaria, inapparente o
meno, da micobatteri diversi da M.Tuberculosis.
5. La presenza di anticorpi IgM indica l’inizio di una infezione
primaria. Il test IgM è particolarmente utile per la diagnosi
precoce di meningiti tubercolari.
Gli anticorpi IgM sono superiori agli IgG nel rilevamento di
colonie di micobatteri nei pazienti affetti da AIDS.
6. Gli anticorpi IgG compaiono quando un’infezione è ben
sviluppata. Essi indicano che il paziente produce una buona
risposta immunologica contro l’infezione.
7. Le misurazioni di IgM più IgG sono valutate
congiuntamente per rilevare casi di infezione cronica (3).
8. Gli anticorpi IgG sono analizzati di routine sia nelle
infezioni croniche che per valutare gli effetti della terapia. I
pazienti immunologicamente deboli sviluppano una
condizione anergica, portata avanti, almeno in parte, dallo
stesso bacillo (17). Una terapia efficace, osservata attraverso
il miglioramento di manifestazioni cliniche e negativizzazioni
di colture, è spesso accompagnata da un aumento del titolo
di IgG, accompagnato da una diminuzione del titolo durante
la terapia, a condizione che la terapia non venga iniziata
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troppo tardi. Nel caso la terapia si rivelasse inefficace, o nel
caso di paziente recidivo, il titolo di IgG aumenta
nuovamente.
9. La persistenza di livelli bassi di anticorpi dopo la terapia
dovrebbe indicare la presenza di sacche antigeniche non
eliminate.
10. Il rilevamento di anticorpi IgA è estremente utile nei casi
difficili di anergia, come in assenza di reazione tubercolinica e
nella mancanza di sintesi di anticorpi IgG.
11. Il rilevamento di anticorpi IgA nei fluidi corporali diversi da
siero o sputo rafforzano la diagnosi di infezione micobatterica
nei casi di:
- sospette meningiti
- pleuriti e pericarditi
- tubercolosi renale
- AIDS
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Redatto in data 12 febbraio 2004
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