NOVA Lite HEp-2 External EB Kits

NOVA Lite® HEp-2 External EB Kits
Per uso diagnostico In Vitro
Codice Prodotto: 704230, 704235
Complessità CLIA: elevata
Finalità d’uso
Questo prodotto (kit o substrato) è indicato per essere utilizzato per lo screening e la titolazione di
anticorpi anti nucleo circolanti mediante un test di immunofluorescenza. Deve essere utilizzato come
supporto nella diagnosi e nel trattamento del lupus eritematoso sistemico (LES), della Sindrome di
Sjögren, dell’artrite reumatoide e di altri patologie del tessuto connettivo.
Riassunto e Spiegazione del test
Anticorpo anti nucleo (ANA) è un termine che descrive una varietà di autoanticorpi diretti contro i
costituenti dei nuclei cellulari comprendenti DNA, RNA e varie proteine nucleari1. Questi ANA si
riscontrano con un’elevata frequenza nei pazienti con malattie reumatiche o del tessuto connettivo, in
particolare il LES. Esiste un’elevata correlazione tra il LES e la presenza di ANA, l’assenza di ANA
sostanzialmente esclude la patologia2. Tuttavia, i pazienti affetti da patologie quali artrite reumatoide,
scleroderma e dermatomiositi sono spesso ANA positivi e in altri stati patologici si osservano bassi titoli
di ANA. Risultati positivi agli ANA sono stati inoltre riportati in pazienti anziani sani.
Pur essendo l’immunofluorescenza indiretta il metodo preferenziale per lo screening degli ANA circolanti,
si raccomanda la titolazione dei campioni ANA positivi all’end point insieme ad ulteriori indagini con test
più specifici per gli autoanticorpi del DNA a doppio filamento (dsDNA) e per gli antigeni nucleari estraibili
(ENA).
Le sezioni congelate di fegato di ratto storicamente erano il substrato più diffuso per l’identificazione
degli ANA, però queste sono state sostituite da vari tipi di linee cellulari. Le cellule HEp-23 costituiscono
una linea cellulare epiteliale caratterizzata da nuclei estremamente grandi rispetto alle altre linee
cellulari. Quando le cellule di HEp-2 sono utilizzate nello screening con ANA, i vantaggi sono molteplici:
innanzitutto le cellule di HEp-2 sono un substrato di antigene standardizzato con minore variabilità da un
lotto all’altro rispetto al tessuto dei roditori; in secondo luogo, le cellule di HEp-2 sono più grandi e quindi
consentono una visualizzazione più facile della morfologia cellulare con un conseguente aumento della
sensibilità del test rispetto alle sezioni di fegato di ratto e infine molte cellule di HEp-2 si dividono
attivamente, esponendo gli antigeni non normalmente espressi nelle cellule a riposo delle sezioni di
fegato di ratto3.
Principio della Metodica
Si utilizza una tecnica di immunofluorescenza indiretta4 in cui i campioni del paziente e i controlli
adeguati sono incubati con il substrato di HEp-2. Gli anticorpi che non reagiscono sono rimossi e poi
viene applicato un coniugato adeguato marcato con fluoresceina. Il coniugato che non si lega viene
rimosso come prima. I vetrini sono osservati con un microscopio a fluorescenza e i campioni positivi
danno luogo alla fluorescenza di colore verde mela che corrisponde alle aree della cellula dell’HEp-2
dove si è legato l’autoanticorpo.
Reagenti
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Substrato di HEp-2 ANA vetrini a 6 o 12 pozzetti.
Siero di controllo positivo (pattern omogeneo/granuloso, intensità di colorazione 3+), contenente
lo 0,09% di sodio azide. Preduilito, pronto all’uso.
Siero di controllo positivo (pattern centromerico, intensità di colorazione 3+), contenente lo 0,09%
di sodio azide. Preduilito, pronto all’uso.
Siero di controllo negativo (universalmente negativo per tutti gli autoanticorpi), contenente lo
0,09% di sodio azide. Preduilito, pronto al’uso.
FITC-IgG (H+L) coniugato con fluoresceina, contenente lo 0,09% di sodio azide. Preduilito,
pronto all’uso.
Blu di Evans all’1%.
Tampone PBS II, soluzione liquida concentrata 40 volte.
Mezzo di montaggio, contenente un agente “anti-affievolimento”
Vetrini coprioggetti.
1
Avvertenze/ Precauzioni
Questo prodotto (kit) è stato messo a punto per l’uso diagnostico In Vitro Il prodotto deve essere
utilizzato esclusivamente da personale adeguatamente formato. Si raccomanda di attenersi
rigorosamente alla procedura indicata. Il siero di tutti i donatori umani fornito (solo kit) è stato testato ed è
risultato negativo all’antigene dell’Epatite B e agli anticorpi del virus dell’Epatite C e del HIV 1 e 2. Ciò
nonostante, questi test non possono garantire l’assenza di agenti infettivi. Devono essere stabiliti metodi
di trattamento e di eliminazione adeguati come per tutti i materiali potenzialmente infettivi e soltanto
personale esperto ed autorizzato deve eseguire le procedure. Alcuni dei componenti del kit contengono
lo 0,09% di sodio azide come conservante e bisogna seguire certe precauzioni – non ingerire né
permettere il contatto con la pelle o le membrane mucose. In caso di contatto, lavare con molta acqua e
rivolgersi al medico. Azotidrati metallici esplosivi si possono formare con il rame e il piombo. Lavare con
molta acqua i recipienti che hanno contenuto questi reagenti allo scopo di evitare la formazione di
azotidrato.
Condizioni di conservazione
Un kit o i vetrini non aperti devono essere conservati a 2-8°C e possono essere usati fino alla data di
scadenza indicata. NON CONGELARE. Una volta estratti dal loro involucro, i vetrini devono essere usati
immediatamente. Il tampone PBS II diluito può essere conservato fino ad un mese a 2-8°C. Il coniugato
fluoresceinato deve essere conservato lontano dalla luce naturale, fluorescente o UV il più possibile.
Tutti i reagenti devono essere conservati a 2-8°C.
Raccolta dei campioni
I prelievi di sangue devono essere effettuati per via venosa. Lasciare che il sangue si coaguli in modo
naturale per separare il siero il più rapidamente possibile onde evitare l’emolisi. Il siero può essere
conservato a 2-8°C per un massimo di 7 giorni prima del dosaggio (rif. 11), oppure per periodi più lunghi,
aliquotare e conservare a -20°C o temperature inferiori. NON congelare e decongelare più di una volta.
Evitare l’uso di sieri lipemici, emolizzati o contaminati da batteri in quanto si potrebbero avere titoli più
bassi o pattern di colorazione non chiari.
Procedura
Materiali Forniti
704230
10
1
1
1
1
1
2
1
1
HEp-2 ANA Substrate Slide (6-well) (Vetrini x 6 pozzetti con cellule HEp-2)
1mL Homo. Ptn. (use w/Conj. 504070 or 504088) (homogeneous) (Controllo positivo Omog. Ptn.
(da utili/ con Coniugato 504070 o 504088), prediluito)
1mL Centromere Positive Control (Controllo positivo centromerico, prediluito)
1mL IFA System Negative Control (Controllo negativo, prediluito)
7mL FITC IgG (H+L) HEp Conjugate (fluorescein) (Coniugato fluoresceinato FITC-IgG (H+L)
HEp)
3mL 1% Evans Blue Counterstain (Blu di Evans al 1%)
25mL PBS II Concentrate (x40) (PBS II concentrato, x 40)
3mL PVA Mounting Medium (Mezzo di montaggio)
10 Coverslips (Vetrini coprioggetti)
704235
20
1
(da
1
1
1
1
2
1
1
HEp-2 ANA Substrate Slide (12-well) (Vetrini x 12 pozzetti con cellule HEp-2 ANA)
1mL Homo. Ptn. (use w/Conj. 504070 or 504088) (homogeneous) (Controllo positivo Omog. Ptn.
utili/con Coniugato 504070 o 504088),prediluito)
1mL Centromere Positive Control (Controllo positivo centromerico, prediluito)
1mL IFA System Negative Control (Controllo negativo, prediluito)
15mL FITC IgG (H+L) HEp Conjugate (fluorescein) (Coniugato fluoresceinato FITC-IgG (H+L)
HEp)
3mL 1% Evans Blue Counterstain (Blu di Evans al 1%)
25mL PBS II concentrate (x40) (PBS II concentrato, x 40)
10mL PVA Mounting Medium (Mezzo di montaggio)
20 Coverslips (Vetrini coprioggetti)
Materiali richiesti ma non forniti
1.
2.
3.
4.
5.
Acqua distillata o deinoizzata per diluire il PBS II concentrato.
Recipiente per contenere il PBS II diluito e bottiglia in plastica a pressione per il lavaggio iniziale
con PBS II.
Micropipette e puntali monouso per dispensare i campioni dei pazienti.
Camera umida per le fasi d’incubazione
Microscopio a fluorescenza con filtro 495nm e filtro 515nm.
Se sono forniti solo i vetrini, è può procurarsi da INOVA:: i controlli positivi p.e. Omog. Ptn. (da utili/ con
Coniugato 504070 o 504088) (504090), centromerice (508184), il controllo negativo (508186), il
coniugato anti-IgG (H+L) umane purificato per affinità (504088, 504070, prediluito pronto all’uso, o
504032, (diluire 1/50 – 1/200 al’uso), PBS II (508998), Blu di Evans (504049 facoltativo), mezzo di
montaggio (504046, 504047), vetrini coprioggetti.
2
Esecuzione del test
Controllo di qualità
I controlli negativi e positivi devono essere usati ogni volta che sono testati i campioni.
1.
Mezzo di montaggio: Togliere il mezzo di montaggio dal frigorifero per portarlo a temperatura
ambiente (18-28°C) con anticipo.
2.
Diluire il PBS II concentrato. Diluire il PBS II con acqua distillata o deinoizzata (1 parte di PBS II +
39 parti di acqua distillata o deinoizzata) e mescolare. NB: Preparare tutto il PBS II soltanto se
l’intero kit deve essere utilizzato in un mese. Il PBS II si usa per diluire i campioni dei pazienti e
come tampone di lavaggio.
3.
Diluire i campioni dei pazienti.
Screening: Diluire i campioni 1/40 aggiungendo 25µL di siero in 975µL di PBS II.
Titolazione: Fare una serie di diluizioni del siero nel PBS II (p.e. 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 e 1/640
ecc.). Per esempio: Prendere 500µL della diluizione del campione 1/40, diluire con 500µL di PBS
II per ottenere una diluizione 1/80. Ripetere questa procedura per raddoppiare ulteriormente le
diluizioni.
4.
Vetrini con substrato. I vetrini devono essere portati a temperatura ambiente (18-28°C) circa 30
minuti prima di essere tolti dalla confezione. Etichettare correttamente i vetrini, metterli nella
camera umida e aggiungere una goccia di ciascuno dei due controlli positivi e di un controllo
negativo rispettivamente nei pozzetti 1, 2 e 3. Aggiungere 25µL di campioni diluiti nei pozzetti
rimanenti.
5.
Incubazione vetrini. Incubare i vetrini per 30 minuti in una camera umida a temperatura ambiente
(18-28°C). (Dei fazzoletti di carta inumiditi sul fondo della camera manterranno l’umidità.)
6.
Lavaggio PBS II. Togliere i vetrini dalla camera umida e risciacquarli con cura con il PBS II in una
bottiglia di plastica a pressione. Sistemare i vetrini in una vaschetta di Coplin di PBS II diluito o in
un rack immerso in PBS II per un massimo di 5 minuti.
7.
Aggiunta di coniugato fluorescente. Riportare i vetrini nella camera umida e coprire
immediatamente ogni pozzetto con una goccia di coniugato fluorescente. NON LASCIARE I
POZZETTI SCOPERTI PER OLTRE 15 SECONDI. L’ESSICATURA DEL SUBSTRATO
COMPROMETTE SERIAMENTE I RISULTATI.
8.
Incubazione vetrini. Incubare i vetrini per 30 minuti in una camera umida a temperatura ambiente
(18-28°C) al buio.
9.
Lavaggio PBS II. Lavare nuovamente come descritto nella fase .6. Colorazione di contrasto
opzionale. Aggiungere 2-3 gocce di Blu di Evans al 1% per 100mL di PBS II prima di immergere i
vetrini.
10.
Montaggio con il vetrino coprioggetti. Rimuovere un vetrino alla volta dal lavaggio PBS II.
Asciugare rapidamente intorno ai pozzetti e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio in
ciascun pozzetto. Abbassare con cura il vetrino sul vetrino coprioggetti, evitando le bolle d’aria,
ma se ci sono non tentare di rimuoverle.
11.
Lettura dei vetrini con il microscopio a fluorescenza. I vetrini finiti devono essere letti il più presto
possibile ma possono essere conservati a 2-8°C nell’oscurità fino a 1 settimana, senza una
grossa perdita di fluorescenza.
Controllo di qualità
Il controllo positivo omogeneo del kit deve dare un pattern di colorazione omogeneo di colore verde mela
brillante nei nuclei delle cellule (3+). Il controllo positivo centromerico del kit deve dare un pattern
granuloso discreto (3+) di solito in multipli di 46). Il controllo negativo del kit deve avere una colorazione
verde scuro in tutte le cellule HEp-2, senza fluorescenza visibile. Se i controlli non risultano come sopra
descritto, il test non è valido e deve essere ripetuto. NB: Se si usa il Blu di Evans come colorazione di
contrasto, un campione negativo avrà un aspetto arancione scuro. Nel campione positivo, invece, i nuclei
si coloreranno di verde e le regioni non colorate della cellula avranno un colore rosso scuro.
Interpretazione dei risultati
Negativo
Un campione è considerato negativo se la colorazione specifica del nucleo è equivalente o inferiore a
quella del pozzetto di controllo negativo.
3
Positivo
Un campione è positivo se la colorazione del nucleo è superiore a quella del controllo negativo e
l’aspetto è chiaramente visibile sulla maggior parte delle cellule HEp-2. Di solito, i controlli del kit hanno
un’intensità 3+. La tabella qui di seguito riassume una varietà di pattern di colorazione del nucleo che è
possibile osservare in base ai tipi e alle relative quantità di anticorpi presenti nel campione:
PATTERN
ASPETTO
ANTIGENTI COINVOLTI
PRINCIPALI MALATTIE
ASSOCIATE
Omogeneo
Forte colorazione
del nucleo (Scl70 può
presentare un
aspetto
maculato)
DNA doppio filamento
DNA monofilamento
Istoni
Scl-70
Titoli elevati: LES
Titoli bassi: LES
o altre patologie del tessuto
5
connettivo
Granuloso
Macchie fini o
granulari
(grosse), di solito
senza
colorazione del
nucleo
SS-A
SS-B
Sm
RNP + altri
Titoli elevati: Sindrome di
Sjögren – complexo sicca
LES
Patologie miste del tessuto
connettivo
Scleroderma
Titoli bassi: altre patologie
del tessuto connettivo
PATTERN
ASPETTO
ANTIGENTI COINVOLTI
PRINCIPALI MALATTIE
ASSOCIATE
Nucleolare
Centromero
Mitocondriale
Jo-1
Macchie grosse
larghe (di solito
meno di 6
macchie per
nucleo, con o
senza macchie
fini)
Macchie di medie
dimensioni
(di solito un
multiplo di 46)
Pattern
granuloso
citoplasmatico
filamentoso
granulare grosso
che si estende
intorno al nucleo
e nel citoplasma
Colorazione a
macchie sottili
concentrate
intorno al nucleo
Pm-Scl
Nucleoli
Ku
e altri antigeni nucleari
sconosciuti
Centromerico
Cromosomico
Titoli elevati:
Scleroderma & sindrome di
6
Sjögren
Sindrome di CREST
7
Cirrosi biliare primaria
Scleroderma
(40%) e
a volte sindromi sovrapposte
9,10
M2
Jo-1
(Istidil-tRNA sintetasi)
Polimiositi, dermatomiositi
associate con malattia
polmonare interstiziale
Limitazioni del test
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Titoli elevati di ANA sono generalmente associati a malattie del tessuto connettivo ma l’anamnesi
del paziente e altri risultati sierologici devono essere presi in considerazione prima di fare la
diagnosi.
Una piccola percentuale di pazienti con LES possono essere ANA negativi con
l’immunofluorescenza indiretta ma possono risultare ANA positivi con altri metodi8.
I pazienti con LES indotto da farmaco possono presentare una positività omogenea o periferica.
Al contrario, i pazienti sottoposti a terapia steroidea possono risultare ANA negativi con altri
metodi8.
In un campione può essere presente più di anticorpo. Diluendo il siero, i vari pattern si possono
vedere meglio. Allo stesso modo, con titoli molto elevati, si può avere un effetto che maschera la
reale positività. Tutti i campioni sospetti o con titoli apparentemente bassi devono essere diluiti
ulteriormente.
La fonte luminosa, i filtri e l’ottica dei microscopi a fluorescenza di diverse marche influiranno
sulla sensibilità del test. La performance del microscopio è influenzata notevolmente da una
corretta manutenzione, e in particolare dalla centratura e dalla sostituzione della lampada a
vapori metallici dopo il periodo di tempo consigliato.
Un basso livello di anticorpi ANA può essere rilevato in pazienti che presentano condizioni
cliniche differenti dalle malattie reumatiche e del tessuto connettivo. Negli individui normali
l’incidenza dei risultati positivi per gli anticorpi ANA cresce con l’aumentare dell’età.
Quando s’interpretano i pattern di colorazione, deve essere considerata la presenza eventuale di
più di una specificità di anticorpi. Combinazioni di anticorpi possono presentare pattern omogenei
o granulosi. Si consigliano dei test specifici per il DNA monofilamento e per gli ENA da eseguire
su tutti i campioni omogenei.
4
8.
9.
Sebbene venga generalmente utilizzata per lo screening una diluzione del siero del paziente di
1/40, in alcuni casi è possibile riscontrare un basso livello di colorazione aspecifica dei nuclei in
presenza di alcuni campioni a bassa diluzione.
Il test ANA costituisce soltanto un aiuto alla formulazione della diagnosi e non costituisce un test
diagnostico da solo. I risultati del test devono essere interpretati quale parte di un quadro clinico
completo.
I vetrini venduti separatamente vengono classificati come “Reagenti analita-specifici”.
Ad eccezione di un componente del kit , le caratteristiche analitiche e prestazionali non sono stabilite.
Prestazioni
Precisione
La procedura di controllo qualità per ciascun lotto prevede il test di vetrini multipli con un controllo a
concentrazione nota diluito fino alla diluizione limite. Ciascun lotto possiede un controllo a titolo finale
predefinito. Questo dimostra che non esistono differenze significative nelle prestazioni di vetrini
appartenenti allo stesso lotto o a lotti diversi.
Sensibilità
La sensibilità dei test e il limite d’identificazione dipendono dal microscopio utilizzato. Non esiste nessun
dispositivo di calibrazione internazionale per standardizzare questi parametri.
Specificità
Un pannello di oltre 50 campioni clinici di diversa caratterizzazione, compresi almeno 10 campioni
negativi, è stato testato con il kit HEp-2 di The Binding Site e con un equivalente kit HEp-2 disponibile in
commercio. Le prestazioni del kit HEp-2 di The Binding Site sono risultate paragonabili, in termini di
specificità ed intensità, a quelle del kit equivalente.
Resumen del procedimiento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Portare il mezzo di montaggio a temperatura ambiente.
Diluire il PBS II 1/40 con acqua distillata o deinoizzata .
Diluire i sieri 1/40 con PBS II.
Togliere i vetrini dal frigorifero e portarli a temperatura ambiente (18-28°C).
Togliere il vetrino dalla confezione e metterlo in una camera umida. Aggiungere 25µL di controlli
e di sieri diluiti. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (18-28°C).
Risciacquare i vetrini con un getto di PBS II e lavarli per 5 minuti in un rack o vaschette coplin.
Riportare il vetrino nella camera umida e aggiungere immediatamente una goccia di coniugato
fluorescente.
Incubare i vetrini per 30 minuti.
Lavare ancora come descritto nella fase 6.
Aggiungere il mezzo di montaggio in ciascun pozzetto e il vetrino coprioggetti.
Leggere i vetrini con il microscopio a fluorescenza.
5
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Protein Refence Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed A Milford Ward. J
Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
Fornitore:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
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624230ITA
Rev. 5
January 2014
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