diastat anti-ro - Technogenetics

BEIA HSV 1 IgG
20921
Edizione
20/04/2013
Solo per uso professionale
TECHNOGENETICS SRL
N° 00525
Pag. 1 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
INTRODUZIONE
Il kit BEIA HSV 1 IgG è un test immunoenzimatico qualitativo
(ELISA) per la determinazione nel siero o nel plasma degli anticorpi
di classe IgG specifici verso l’Herpes Simplex Virus di tipo 1 (HSV
1).
SIGNIFICATO CLINICO
Il virus dell'Herpes simplex umano (HSV) appartiene alla famiglia
delle Herpesviridae, sottofamiglia delle Alphaherpesviridae.
La particella virale è di tipo icosaedrico e misura 180-200 nm di
diametro. Il virione completo è costituito da un nucleo cilindrico
proteico o core, attorno al quale si avvolge il genoma virale
costituito da una molecola lineare a doppia elica di DNA; esso è
rivestito da un capside e da un pericapside da cui protrudono
proiezioni lunghe 8-10 nm costituite da glicoproteine.
Sulla base di differenze antigeniche tra queste glicoproteine
vengono distinti due differenti sierotipi: HSV 1 e HSV 2
La trasmissione del HSV richiede un contatto diretto tra un soggetto
che elimina virus ed un individuo suscettibile. La penetrazione del
virus avviene a livello delle mucose o attraverso lesioni della cute.
Per HSV di tipo 1 la localizzazione più frequente è l'orofaringe, per
HSV di tipo 2 la mucosa genitale. L'infezione primaria da HSV
induce una risposta immunitaria umorale specifica caratterizzata da
sintesi di IgM seguite da IgG ed IgA.
La presenza ed il titolo di IgG e IgM HSV-specifiche possono essere
determinati con tutta una serie di reazioni sierologiche che vanno da
quelle più tradizionali, come la reazione di fissazione del
complemento, la reazione di neutralizzazione dell'infettività e
l'immunofluorescenza, a quelle più recenti, come i saggi
immunoenzimatici.
Qualora le eventuali IgM HSV-specifiche presenti nel siero vengano
evidenziate è necessario tenere conto della possibile interferenza di
alcuni fattori, tra i quali ad esempio la competizione da parte delle
IgG HSV-specifiche che in questo modo possono rendersi
eventualmente responsabili di risultati falsi negativi per IgM. Al
contrario, una possibile causa di risultati falsi positivi per IgM è
Pag. 2 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
rappresentata dalla presenza nel siero di fattore reumatoide (IgM
anti-IgG). L'impiego di un test "a cattura" permette di risolvere
entrambe queste insidie.
La dimostrazione di IgM HSV specifiche nel siero del soggetto
depone per una infezione in atto; tuttavia, data la possibile
comparsa di IgM anche nel corso di infezioni ricorrenti, qualora sia
necessario valutare un paziente per un'infezione primaria, tranne
che si tratti di un neonato, è necessario procedere anche ad una
titolazione delle IgG HSV-specifiche su due campioni di siero
raccolti in tempi opportunamente distanziati (non meno di due
settimane).
Nel caso di un'infezione primaria, accanto alla positività per IgM
sarà rilevabile una differenza significativa nel titolo anticorpale; al
contrario qualora il soggetto sia affetto da un episodio ricorrente e
conseguente a riattivazione, il titolo di IgG HSV-specifiche nei due
campioni di siero sarà aumentato solo di poco, in maniera non
significativa, o per nulla.
PRINCIPIO DEL METODO
Il test BEIA HSV 1 IgG è un dosaggio immunoenzimatico in
micropozzetti. I micropozzetti di polistirene sono rivestiti con
antigene HSV 1. I campioni da esaminare vengono incubati nei
micropozzetti; le IgG del campione si legano formando un
complesso antigene-anticorpo. Dopo eliminazione mediante
lavaggio dei componenti del siero non legati alla fase solida, la
presenza di IgG anti-HSV 1 viene rilevata attraverso il legame con
un anticorpo monoclonale anti-IgG umane coniugato con
perossidasi.
Dopo allontanamento del coniugato enzimatico non legato viene
aggiunto il substrato-TMB che, per azione dell’enzima presente sulla
fase solida, sviluppa una colorazione azzurra.
L’aggiunta di una soluzione di acido solforico 1N blocca la reazione
e provoca il viraggio del colore dall’azzurro al giallo.
La densità ottica letta a 450/620 è direttamente proporzionale alla
quantità di IgG specifiche anti-HSV 1presenti nel campione in
esame.
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CONTENUTO DELLA CONFEZIONE
La confezione è sufficiente per 96 determinazioni
Componente
SORB
A
Strip da 8 micropozzetti frazionabili
12x8x1
CONTROL
-
B
Controllo Negativo
1 x 2 mL
CAL
CO
C
Calibratore Cut-Off
1 x 2 mL
CONTROL
+
D
Controlo Positivo
1 x 2 mL
E
Diluente Campioni BEIA System
1 x 120 mL
F
Coniugato
1 x 13,5 mL
DIL
SPE
CONJ
BUF
WASH 20X
G
Tampone di Lavaggio
1 x 100 mL
SUBS
TMB
H
Substrato-TMB
1 x 13,5 mL
I
Soluzione Stoppante
1 x 25 mL
Istruzioni per l’uso
1
H2SO4
A.
B.
C.
D.
Strip sensibilizzate
Strip sensibilizzate con HSV 1 purificato, in busta ermetica
richiudibile. Riporre le strip non utilizzate nella busta e
richiudere. Le strip sono frazionabili in micropozzetti singoli.
Controllo Negativo
Siero umano negativo per anticorpi IgG anti-HSV 1. Contiene
0,09%
p/p
di
sodio
azide
come
conservante.
Reagente pronto all'uso.
Calibratore Cut-off
Siero umano a concentrazione nota di anticorpi IgG anti-HSV 1.
Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente
pronto all’uso.
Controllo Positivo
Siero umano positivo per anticorpi IgG anti-HSV 1. Contiene
0,09%
p/p
di
sodio
azide
come
conservante.
Reagente pronto all'uso.
Pag. 4 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
E.
Diluente Campioni BEIA System
Soluzione salina tamponata (PBS) e proteine. Contiene 0,09%
p/p di sodio azide come conservante e Tween 20. Reagente
pronto all'uso.
F. Coniugato
Soluzione contenente anticorpo monoclonale anti-IgG umane,
marcato con perossidasi. Reagente pronto all'uso.
G. Tampone di Lavaggio
Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene
0,1 % di Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti.
H. Substrato-TMB
Soluzione contenente H2O2/TMB, stabilizzanti e colorante
(rosa). Reagente pronto all'uso.
I. Soluzione Stoppante
Soluzione 1N di acido solforico. Reagente pronto all'uso.
MODALITÀ DI CONSERVAZIONE
Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8°C al riparo dalla luce.
Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza riportata
sull’etichetta.
REAGENTI INTERCAMBIABILI
Il Diluente Campioni BEIA System, il Tampone di Lavaggio, il SubstratoTMB e la Soluzione Stoppante sono intercambiabili tra i diversi kit
della linea BEIA.
MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI





Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm.
Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di
micropiastre.
Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 200, 500, 1000 µL.
Provette monouso e normale vetreria da laboratorio.
Acqua distillata o deionizzata.
Pag. 5 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
AVVERTENZE E PRECAUZIONI









Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente
(18-25°C). Prelevare solo la quantità necessaria per l'analisi.
Evitare l'essiccamento dei micropozzetti.
Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita.
Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti
diversi.
Cambiare il puntale tra un campione e l’altro.
Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad
azzurro, il reagente non deve essere utilizzato.
Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione
del campione.
Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni
di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo
criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire.
Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle
pipette e del lettore.
AUTOMAZIONE
Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel
qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello
strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica.
PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina-EDTA).
Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni
possono essere conservati a 2-8 °C. In caso contrario, aliquotare i
campioni e congelarli a -20°C. Evitare ripetuti scongelamenti e
congelamenti. Si sconsiglia l’uso di campioni lipemici, torbidi ed
emolizzati. I campioni devono essere opportunamente diluiti con il
Diluente Campioni BEIA System prima del dosaggio. Vedi
esecuzione del test.
Pag. 6 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
PREPARAZIONE DEI REAGENTI

Tampone di Lavaggio
Diluire il Tampone di Lavaggio (20x) 1:20 con acqua distillata o
deionizzata prima dell'uso. Dopo ricostituzione il tampone è stabile
15 giorni se conservato a 2-8°C e comunque non oltre la data di
scadenza riportata sull'etichetta originaria. Nel Tampone di Lavaggio
concentrato si possono formare dei precipitati cristallini che si
solubilizzano portando il reagente a 37°C prima della diluizione. Si
raccomanda di diluire la quantità di tampone necessaria per
eseguire i lavaggi dell'analisi in corso.
CICLO DI LAVAGGIO
Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un
lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi
manualmente.
1. Svuotare completamente i pozzetti.
2. Riempirli con 300 µL di tampone di lavaggio.
3. Svuotare i pozzetti.
4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli.
5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti
al termine del lavaggio.
ESECUZIONE DEL TEST
1.
2.
Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno 30-60 minuti
a 18-25°C).
Diluire (1:81) i campioni in esame con il Diluente Campioni
BEIA System (esempio 10 µL di siero e 800 µL di Diluente
Campioni BEIA System). Agitare su Vortex.
Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione
del numero di campioni in esame, del Controllo Negativo, del
Calibratore Cut-off e del Controlo Positivo (vedi il paragrafo
“Schema del dosaggio”). Richiudere accuratamente la busta.
Pag. 7 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di ciascun siero in
esame prediluito, del Controllo Negativo, del Calibratore Cutoff e del Controlo Positivo.
4. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 30
minuti.
5. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
6. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di Coniugato.
7. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 30
minuti.
8. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
9. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di Substrato-TMB.
10. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 15
minuti.
11. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun
pozzetto 100 µL di Soluzione Stoppante.
12. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm.
3.
CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA
Le condizioni che consentono l’accettazione dei risultati sono :

il rapporto tra la DO del Controllo Positivo e la DO del
Calibratore Cut-off deve essere essere > 1.5

il rapporto tra la DO del Controllo Negativo e la DO del
Calibratore Cut-off deve essere < 0.6
Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra
elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non
possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non
conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di
Assicurazione Qualità proprie del laboratorio.
Si consiglia di instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità
interne al laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle
sedute ed alla gestione di eventuali non conformità.
Pag. 8 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
CALCOLO DEI RISULTATI
Al fine di correlare il risultato analitico allo stato immunitario del
campione si suggerisce di determinare i risultati calcolando l’index
anticorpale (I.A.) con la seguente formula:
DO campione
_____________________________________________
Index anticorpale (I.A.) =
DO Calibratore Cut-off
Per il Calibratore Cut-off calcolare, se eseguito in multiplo, il valore
medio di densità ottica (DO). I seguenti valori devono essere
considerati solo come un esempio e non devono essere usati in
luogo dei dati ottenuti dall'utilizzatore.
Esempio di calcolo:
Controllo Negativo
1ª DO
0,085
2ª DO
0,081
DO
0,083
I.A.
0,2
Calibratore Cut-off
0,472
0,480
0,476
Controllo Positivo
1,877
1,766
1,822
3,8
Campione A
0,162
0,180
0,171
0,4
Campione B
0,578
0,543
0,560
1,2
Campione C
1,303
1,230
1,266
2,7
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella
europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi:
I.A.
INTERPRETAZIONE
> 1.1
Il campione è da considerare POSITIVO per la presenza di
anticorpi di classe IgG anti-HSV 1
 0.9
Il campione è da considerare NEGATIVO per la presenza di
anticorpi di classe IgG anti-HSV 1
0.9 1.1
ZONA GRIGIA: Il campione è da considerare DUBBIO per la
presenza di anticorpi di classe IgG anti-HSV 1
Va tenuto presente che:
- il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici di
classe IgG. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato
infettivo;
Pag. 9 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
- una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo
test, ma va fondata sull’insieme dei dati clinici disponibili.
Dati clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione,
eventualmente col conforto di test di conferma o di II livello;
- risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la
ripetizione del test sullo stesso campione; con la ripetizione del test
su un prelievo successivo; col confronto con un test di riferimento.
PRESTAZIONI DEL KIT
Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le
specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza
sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo
previsto dal fabbricante.
SENSIBILITÀ E SPECIFICITÀ
Sensibilità e specificità sono state valutate confrontando le
prestazioni del kit BEIA HSV 1 IgG nei confronti di un kit già
immesso sul mercato con prestazioni accettabili (EIA HSV 1 IgG).
BEIA
HSV 1 IgG
+
-
EIA HSV 1 IgG
+
150
0
2
35
Da questi dati si ottiene:
Sensibilità relativa
Specificità relativa
Concordanza
98,7%
100%
98,9%
SPECIFICITÀ ANALITICA
Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 10
mg/mL di emoglobina, fino a 1 mg/mL di bilirubina e fino a 30
mg/mL di trioleina. L’uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati
viene comunque sconsigliato.
Pag. 10 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
RIPETIBILITÀ
La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata
valutando un campione negativo con I.A. < 0.5 e due campioni
positivi rispettivamente con I.A. di 1.2 e 2.7. I campioni sono stati
replicati 6 volte per seduta in ciascuna di 12 sedute diverse. Sono
stati ottenuti coefficienti di variazione inferiori al 20% per il
campione negativo ed inferiori al 10% per i due campioni positivi.
LIMITAZIONI
Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti
dei campioni possono alterare i livelli rilevabili di IgG specifiche.
PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA
Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le
operazioni previste per l'esecuzione del test.

Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell’area di
laboratorio designata.

Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca.

Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni
indossando guanti monouso e camici.

Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio.

Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici
di lavoro eventualmente contaminate.

Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il
dosaggio in appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento
secondo le norme vigenti.

Controllare periodicamente il grado di contaminazione
dell'ambiente di lavoro e degli operatori.
Reagenti contenenti siero

I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati
e trovati negativi per HbsAg, anti-HCV ed anticorpi anti-HIV.
Poiché nessun metodo può garantire che tali derivati non
possano trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si
raccomanda di manipolare i reagenti con le opportune cautele.

Pag. 11 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
Reagenti pericolosi

Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritante per gli occhi e per la pelle
S26
In caso di contatto con gli occhi, lavare
immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare
un medico.
SCHEMA DEL DOSAGGIO












Preparare i reattivi
Diluire i campioni 1:81 con il Diluente Campioni BEIA System
Dispensare
100 L di Controllo Negativo in singolo o doppio
100 L di Calibratore Cut-off in doppio
100 L di Controllo Positivo in singolo o doppio
100 L di campione prediluito in singolo o doppio,
Incubare 30 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Coniugato
Incubare 30 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Substrato-TMB
Incubare 15 minuti a T.A. (18-25°C)
Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante
Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm
A
B
C
D
E
F
G
H
1
CN
CN
CC
CC
CP
CP
P1
P2
2
P3
P4
P5
P6
P7
….
….
….
3
4
….
Pag. 12 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
BEIA HSV 1 IgG
20921
Version
20/04/2013
For professional use only
TECHNOGENETICS SRL
Pag. 13 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
INTENDED USE
The BEIA HSV 1 IgG kit is a qualitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for the detection of IgG antibodies to
Herpes Simplex Virus type 1 (HSV 1), in human serum or plasma
samples.
CLINICAL RELEVANCE
Human Herpes Simplex virus (HSV) belongs to the family of
Herpesviridae, a subfamily of the Alphaherpesviridae.
HSV is a icosahedral virus with a diameter of 180-200 nm. Virion
consists of a cylindrical proteinic nucleus or core, and the viral
genome made of a linear double-stranded DNA molecule is
wrapped around it. A capsid and a pericapsid surround the core
and from their surface glycoproteins project as spikes approximately
8-10 nm in length. According to the antigenic differences among the
glycoproteins it's possibile to distinguish two different serotypes:
HSV 1 and HSV2.
HSV infection spreads from person to person by direct contact
between an individual eliminating the virus and another one
catching it. HSV penetrates through mucosas or skin lesions. HSV
type 1 usually affects oropharynx, while HSV type 2 affects the
genital area. Primary HSV infection induces a specific humoral
immune response, characterized by the production of IgM followed
by IgG and sometimes IgA. Specific IgG and IgM to HSV antibodies
can be detected in serum and their titers can be determined by
different serological assays, starting from the most traditional such
as the complement fixation assay, the neutralization assay and the
immunofluorescence assay to the recent ones like the enzyme
immunoassays. The use of serological assays for the detection of
HSV specific IgM is complicated by interfering factors like specific
IgG which, competing with IgM, could be responsible for false
negative results. On the contrary, false positive results in the
detection of IgM antibodies can occur in presence of the rheumatoid
factor in serum
(IgM anti-IgG). A test that utilizes "Capture system" can elude the
occurrence of both false results.
Pag. 14 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
Although IgM specific HSV antibodies should indicate an active
infection, detectable levels of IgM can also be found in recurrent
infections. Therefore, whenever the diagnosis of a primary infection
is needed, the patients, new-born excluded, should be tested for the
presence of HSV specific IgG antibodies in two serum samples taken
at least 2 weeks one from the other.
In primary infections, positive results for the presence of IgM and a
significant difference in the antibody titer of sprcific IgG antibodies
will occur; on the contrary, reactivation of the virus due to recurrent
infections will result in a low, not significant or not detectable
increase of the HSV specific IgG antibody titer in both serum
samples.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The BEIA HSV 1 IgG kit is a qualitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for the detection of specific IgG
antibodies to HSV 1, in human serum or plasma. During the first
incubation, only anti-HSV 1 specific antibodies present in serum or
plasma bind to the inner surface of the wells coated with the HSV 1
antigen. After the first incubation the wells are washed to remove
non-reactive serum components. During the second incubation a
monoclonal antibody anti-human IgG conjugated with horseradish
peroxidase (HRP) is added. After a second washing cycle, a
Substrate-TMB solution is dispensed into the wells in order to detect
specific antibodies during a subsequent incubation. The enzymatic
reaction is then stopped by adding a Stop Solution which changes to
yellow the blue colour developed into the wells. The amount of
colour is directly proportional to the specific IgG anti-HSV 1
concentration in the patient samples.
Pag. 15 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
KIT COMPONENTS
Package size: 96 tests.
Component
SORB
A
Coated Strip
12x8x1
CONTROL
-
B
Negative Control
1 x 2 mL
CAL
CO
C
Cut-off Calibrator
1 x 2 mL
CONTROL
+
D
Positive Control
1 x 2 mL
E
Sample Diluent BEIA System
1 x 120 mL
F
Conjugate
1 x 13,5 mL
DIL
SPE
CONJ
BUF
WASH 20X
G
Wash Buffer
1 x 100 mL
SUBS
TMB
H
Substrate-TMB
1 x 13,5 mL
I
Stop Solution
1 x 25 mL
Package Insert
1
H2SO4
A.
B.
C.
D.
E.
Coated strips
Breakable strips coated with inactivated HSV 1 packed in
sealed pouch. Place the unused strips in the pouch and reseal.
Negative Control
Negative human serum for IgG antibodies anti-HSV 1.
Contains 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready
to use reagent.
Cut-off Calibrator
Human serum, containing IgG antibodies anti-HSV 1 with
known concentration. Contains 0.09% w/w of Sodium azide
as preservative. Ready to use reagent.
Positive Control
Positive human serum for IgG antibodies anti-HSV 1. Contains
0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use
reagent.
Sample Diluent BEIA System
Buffered salt solution (PBS). Contains protein, 0,09 % w/w
Sodium azide and Tween 20. Ready to use reagent
Pag. 16 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013
F.
G.
H.
I.
Conjugate
Monoclonal anti-human IgG antibody conjugated with
horseradish peroxidase. Ready to use reagent.
Wash Buffer
Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 % di
Kathon CG and Tween 20. See “Preparation of reagents”.
Substrate-TMB
Tetramethylbenzidine H2O2/TMB in stabilizing buffered
solution. Contains pink dye. Ready to use reagent.
Stop Solution
1N Sulphuric acid solution.
Ready to use reagent.
STORAGE OF REAGENTS
Store all reagents at 2-8°C avoiding exposure to light. Do not use
reagents after the expiry date indicated on the label.
INTERCHANGEABLE REAGENTS
The Sample Diluent BEIA System, Wash Buffer, Substrate-TMB and Stop
Solution are common to all BEIA kits.
MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED





Microplate reader with 450/620 nm filters.
Manual or automated microplate washing device.
Precision pipettes with disposable tips 10,100,200,500,1000 L
Disposable pipettes and normal glassware.
Distilled or deionised water.
WARNINGS AND PRECAUTIONS


Bring all reagents to room temperature (18-25°C) before use.
Only take the quantity necessary for the assay.
Avoid wells drying.
Pag. 17 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013







Use clean glassware.
Use a clean disposable pipette tip for each reagent.
Use a clean disposable pipette tip for each sample.
If the Substrate-TMB shows a change from pink to blue colour,
discard the reagent.
For repeated assays, each time provide for new diluted samples.
Every analytical run should include control samples in order to
validate the results, according to criteria and procedures
established by each laboratory.
Periodical maintenance and calibration of pipettes and microplate
reader are required.
AUTOMATION
The test can be performed on automated ELISA processor. Please
refer to specific instrument manual for proper applications.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The test can be performed on serum or plasma (heparin – EDTA).
Specimens may be stored refrigerated at 2-8 °C up to 5 days. For
longer storage they should be aliquoted and stored frozen at – 20°C.
Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed,
lipemic or turbid specimens. All serum and plasma samples must be
pre-diluted with Sample Diluent BEIA System prior to assay. See
assay protocol.
PREPARATION OF REAGENTS
Wash Buffer (20 X)
Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or
deionised water. The diluted Wash Buffer is stable 15 days when
stored at 2-8 °C; in any case, do not use it after expiry date printed
on the original label. If crystallization occurs in the concentrated
Wash Buffer, warm the solution to 37 °C before diluting. Only dilute
the quantity necessary for the assay.
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WASHING CYCLES
Both using a microplate washer and washing the plate manually,
perform the following steps.
1.
Empty the wells
2.
Fill them with 300 µL of Wash Buffer.
3.
Empty the wells
4.
Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles
5.
Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the
washing cycles.
ASSAY PROTOCOL
Allow all reagents to reach room temperature leaving them at least
30-60 minutes at 18-25 °C.
1.
Dilute the samples to be assayed (1 :81) with the Sample Diluent
BEIA System (i.e. 10 µL of serum and 800 µL of Sample Diluent
BEIA System). Shake on Vortex.
2.
Select the number of strips required for the assay according to the
number of samples to be assayed and the Negative Control, Cut-off
Calibrator and Positive Control (see paragraph “Summary of
protocol” below). Reseal the pouch.
3.
Dispense 100 µL of Negative Control, Cut-off Calibrator, Positive
Control and of the diluted samples.
4.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 30 minutes.
5.
Perform a washing cycle following the suggested procedure (see
Washing Cycles).
6.
Dispense 100 µL of Conjugate in each well.
7.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 30 minutes.
8.
Perform a washing cycle following the suggested procedure (see
Washing Cycles).
9.
Dispense 100 µL of Substrate-TMB in each well .
10.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 15 minutes.
11.
Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µL of Stop Solution
into each well.
12.
Read the optical density in bi-chromatism at 450/620 nm.
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CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS
RUN VALIDATION CRITERIA
Criteria used to validate the obtained results are the following:

The ratio of the OD for Positive Control to the OD for the Cutoff Calibrator must be > 1,5

The ratio of the OD for Negative Control the OD for the Cutoff Calibrator must be < 0,6
If the above criteria are not met, the run is invalid and the results
cannot be reported without a documented critical review of the
data. The non conformity must be addressed and treated according
to each laboratory’s Quality Assurance procedures. Each lab should
establish and follow its own internal Quality Control procedures
and use the QC results to validate runs and manage non
conformities.
CALCULATION OF RESULTS
In order to correlate the analytical results to the immunity of the
sample results should be determined calculating the antibody index
(A.I.) using the following formula:
O.D. sample
________________________________________
Antibody Index (A I) =
O.D. Cut-off Calibrator
For the Cut-off Calibrator calculate, if assayed in duplicate, the mean
OD value (OD). The data below show typical results for the test.
These data are intended as an example only and should not be used
to calculate results from another run.
Negative Control
Cut-off Calibrator
Positive Control
Sample A
Sample B
Sample C
1ª OD
0,085
0,472
1,877
0,162
0,578
1,303
2ª OD
0,081
0,480
1,766
0,180
0,543
1,230
OD
0,083
0,476
1,822
0,171
0,560
1,266
A.I.
0,2
3,8
0,4
1,2
2,7
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INTERPRETATION OF RESULTS
Results from our clinical trials, performed on samples representative
of the European population, suggest the following interpretative
criteria:
A.I.
INTERPRETATION
> 1.1
Sample should be considered POSITIVE for the presence of
anti-HSV 1 IgG antibodies.
< 0.9
Sample should be considered NEGATIVE for the presence of
anti-HSV 1 IgG antibodies.
0.9  1.1
GREY ZONE: Sample should be considered BORDERLINE
for the presence of anti-HSV 1 IgG antibodies.
Please consider that:
- the test only detects specific IgG antibodies. It cannot per se and
univocally be referred to as evidence of infection;
- a medical decision cannot be made on the basis of a single test
result but should be grounded on all the available clinical data;
discrepancies in clinical data should be clarified prior to final
decisions, also, if necessary, by confirmatory or 2 nd level tests;
- results within grey zone should be made clear: re-testing the same
sample; testing a sample from another collection from the same
patient; comparing the results with those of a reference test.
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PERFORMANCE DATA
Warning: Data below do not represent the performance
specifications of the kit, but only experimental evidence that the
performance of the kit is within such specifications, as intended by
the manufacturer.
SPECIFICITY AND SENSITIVITY
The diagnostic sensitivity and specificity were evaluated comparing
the BEIA HSV 1 IgG results versus an established EIA commercial
kit (EIA HSV 1 IgG) with acceptable performances.
BEIA
HSV 1 IgG
+
-
EIA HSV 1 IgG
+
150
0
2
35
From which the following table can be calculated:
Relative Sensitivity
Relative Specificity
Agreement
98,7%
100%
98,9%
ANALYTICAL SPECIFICITY
No interference has been observed in samples with hemoglobin up
to 10 mg/mL, bilirubin up to 1 mg/mL, triolein up to 30 mg/mL.
Lipemic, turbid or hemolyzed samples, however, should not be
used.
REPEATABILITY
The within-run and run-to-run variability were determined using
one negative sample with A.I. of < 0.5 and two positive samples,
containing value of Antibody Index (A.I) : 1.2 and 2.7. These
samples were tested 6 times per single run in 12 different analytical
runs. Coefficients of variation lower than 20% have been obtained
for the negative sample and 10% for the positive samples.
LIMITATIONS
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens
may affect the detectable levels of specific IgG.
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GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE

Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the
procedural directions.

Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab.

Do not pipette solutions or samples by mouth.

Wear disposable gloves and overalls when handling reagents
and samples. Avoid direct contact.

Wash hands thoroughly after assay.

Throughly clean working area with proper detergent
solutions.

Collect solid and liquid waste material in proper containers
and provide for disposal according to the local regulations.

Periodically check contamination level of operators and
rooms.
Reagents containing serum

All components of human origin have been tested and found
negative for HbsAg, anti-HCV and anti-HIV antibodies. Since
no known test can guarantee, however, that products derived
from human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other
infectious diseases, these reagents should be handled as
hazardous material.
Hazardous Reagents

Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritating to eyes and skin.
S26
In case of contact with eyes, rinse immediately
with plenty of water, and seek for medical advice.
SUMMARY OF PROTOCOL



Prepare reagents
Pre-dilute samples 1:81 with Sample Diluent
Dispense:
100L of Negative Control in single or duplicate
100L of Cut-off Calibrator in duplicate
100L of Positive Control in single or duplicate
100 L of pre-diluted samples in single or duplicate
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








Incubate 30 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Conjugate
Incubate 30 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Substrate-TMB
Incubate 15 minutes at R.T. (18-25°C)
Dispense 100 L of Stop Solution
Read the O.D. at 450/620nm
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
NC
NC
CC
CC
PC
PC
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
….
….
….
3
4
….
REFERENCE - BLIOGRAFIA
- Nahmias A.J. , Lee F.K. , and S. Beckman-Nahmias : Seroepidemiological and sociological patterns of herpes simplex virus
infection in the world. 1990 Scan. J. Infec. Dis.(suppl). 69 : 19-36
- Forsgren M. , Stemar G. , Anzen B. and Enocksson E. :
Management of woman at term pregnancy complicated by Herpes
Simplex. 1990 Scan. J Infect. Dis. 71 : 58-66
- Aurelius E. , Johansson B. , Skoldenberg B. , and Forsgen M. :
Encephalitis in immunocompetent patients due to herpes simplex
virus types 1 and 2 as determined by type-specific polymerase chain
reaction and antibody assays of cerebrospinal fluid. 1993 J. Med.
Virol. 39 : 179-186
- Lopez C. , Arvin A. , and Ashley R. : Immunity to herpesvirus
infection in humans. 1993 in Roizman, R..J.Withley and C. lopez (ed)
, The human herpesvirus. Raven Press, New York, N.Y.
Pag. 24 - 24 BEIA HSV 1 IgG Ed. 20/04/2013