Introduzione Descrizione del progetto Le impronte digitali

Introduzione
Hai mai sognato di diventare un detective? Ti sei appassionato ai casi di Gil Grissom e
Horatio Caine in C.S.I.? La genetica forense si occupa di rilevare ed esaminare le tracce
necessarie per stabilire o escludere l'associazione tra un sospetto e la scena del crimine;
può essere considerata in parte di natura sociale, in parte una scienza multidisciplinare
che si avvale, per le indagini, dei contributi della fisica, della chimica, della biologia,
nonché della psicologia e della criminologia. L’applicazione della metodologia forense è
un
modo sia per affinare le capacità d’interpretazione dei dati provenienti da discipline diverse
sia per acquisire nuove conoscenze scientifiche. Se sei interessato al lato pratico della chimica, della
biologia molecolare o delle biotecnologie, alle esperienze di laboratorio e alla scienza in generale ti
divertirai nel partecipare a questo progetto. Questa esperienza permette di capire quali sono i cardini di
un’indagine forense:
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Abilità di ricerca nel raccogliere le prove sulla scena del crimine
Applicazione del metodo scientifico.
Capacità di analizzare ed interpretare dati che provengono da diverse discipline scientifiche.
Capacità risolutiva del DNA fingerprinting nell’indagine forense.
Le moderne tecniche di laboratorio (di solito non disponibili nelle scuole medie superiori) e le
scienze che rivestono un ruolo di primo piano nella investigazione.
Descrizione del progetto
Tipi di impronte digitali
1. impronte visibili, sono quelle impresse su inchiostro, colore, sangue e gel.
2. impronte plastiche sono quelle impresse su superfici soffici come argilla, sapone, cera,
stucco e polvere.
3. impronte latenti sono quelle invisibili lasciate sugli oggetti dalle sostanze che traspirano
attraverso la pelle (secrezioni oleose, sali, aminoacidi e acqua). Poiché queste ultime
non sono visibili ad occhio nudo è necessario usare sostanze chimiche, polveri (di
carbonio o di alluminio a seconda del colore della superficie su cui si trovano) oppure il
laser per rilevarle da una scena del crimine.
Unicità
Le impronte sono costituite da creste (pelle in rilievo) e solchi (pelle non in rilievo) che si avvolgono a
formare un profilo distintivo. Le impronte visibili sono perciò lasciate dalle creste, mentre i solchi
sono le aree vuote che si osservano fra queste. Altre caratteristiche molto importanti sono le ‘minutiae’
dell’impronta che contribuiscono in modo decisivo a
renderla unica. Come riportato nella Figura 1 questi
elementi distintivi consistono in terminazioni (ridge
endings), chiusure (enclosures) e biforcazioni delle
creste, talvolta in punti (ridge dot). Sono queste
caratteristiche (in media circa 150 per impronta) che il
sistema AFIS estrae e compara. Quando vengono
rilevati un certo numero di punti di corrispondenza
specifici, le due impronte sono considerate identiche.
Figura 1. Minutiae.
IDENTIFICAZIONE DELLE CARATTERISTICHE DI UN’IMPRONTA
Sei stato assunto come interno nella divisione dei servizi forensi di un’agenzia investigativa. Sulla
scena del crimine gli investigatori raccolgono le prove e le spediscono in laboratorio senza che vengano
inquinate. Il tuo lavoro è risolvere questo caso, cercando di capire le teorie e i principi che sono alla
base del processo investigativo. Adesso l’imputazione del sospetto (colpevole o innocente) è nelle tue
mani, non puoi commettere errori, perchè dal tuo lavoro potrebbe dipendere il futuro di un innocente
ingiustamente accusato di un crimine.……
Categorie di impronte digitali sulla base del loro motivo centrale (Figura 2):
1. Arch (arco): sono costituite da linee che emergono da un lato dell’impronta ed
escono sul lato opposto
2. Loop (cappio): sono costituite da linee che entrano ed escono su uno stesso lato
dell’impronta dopo aver fatto una curva
3. Whorl (voluta): sono costituite da cerchi
Le impronte digitali
L’analisi delle impronte digitali è utilizzata da più di un secolo per assicurare il rispetto della
legge. Nel 1881 Henry Faulds intuì per la prima volta che le impronte digitali trovate sulla scena di un
crimine potevano essere usate per individuare colui che lo aveva commesso. Nel 1892 Sir Francis
Galton fu l’autore del primo trattato sull’argomento che di lì a poco avrebbe portato Scotland Yard ad
usufruirne e nel 1910 la procedura fu accettata dagli Stati Uniti.
Le impronte digitali sono universali e uniche ed è per questo che ancora oggi sono un utile
strumento di valutazione nelle indagini forensi. In altre parole, nessuno possiede impronte digitali
identiche (si formano prima della nascita e permangono fino alla decomposizione post- mortem),
neanche i gemelli monozigoti. Dal 1924 ad oggi l’FBI ha catalogato oltre 200 milioni di impronte che
possono essere confrontate attraverso il sistema computerizzato AFIS (Automated Fingerprint
Identification Systems).
Analisi semplificata delle impronte digitali
Le impronte digitali:
1. sono caratteristiche individuali.
2. permangono inalterate (come forma, ma non come dimensione) durante la vita di una persona.
3. possono essere classificate.
Arch
Loop
Whorl
Figura 2. Categorie di impronte digitali.
Approssimativamente il 60% della popolazione possiede loop, il 35% whorl e il 5% arch. Inoltre
esistono sottocategorie come riportato nella Tabella 1 e come mostrato nella Figura 3.
Tabella 1. Tipi di sottocategorie di impronte digitali.
I. Arch
II. Loop
a)
Plain arch
a) Radial loop
b)
Tented arch
b) Ulnar loop
III. Whorl
a)
Plain whorl
b)
Central pocket whorl
c)
Double loop
d)
Accidental whorl
Nelle Plain arch, le più semplici,
le creste formano una specie di
onda; nelle Tented arch invece le
creste salgono a formare una
specie di picco; le Ulnar loop si
aprono in direzione delle dita
piccole, mentre le Radial loop si
aprono verso il pollice; una Plain
whorl e una Central pocket
whorl hanno almeno una cresta
che compie un circuito completo
(spirale, ovale, o qualsiasi
variante di una forma circolare);
il Double loop è fatto da due loop
combinati in una impronta; infine
l’Accidental whorl contiene due
o più modelli tra quelli proposti.
Figura 3: esempi di sottocategorie di impronte digitali.
COME SONO USATE LE IMPRONTE IN UNA INDAGINE?
Alle persone implicate vengono prese le impronte digitali e trasferite in formato elettronico.
Utilizzando i moderni computer un set di impronte può essere sottoposto a scansione trovando la
corrispondenza con un possibile sospetto in pochi minuti, attraverso il sistema AFIS.
Il sangue sulla scena del crimine
Il sangue contiene globuli rossi, globuli bianchi, piastrine e plasma. Inoltre ha caratteristiche di natura
ereditaria che possono essere messe in evidenza da reazioni antigene-anticorpo permettendo di
distinguere i diversi gruppi sanguigni. Quando antigeni sconosciuti vengono in contatto con il sangue si
ha l’agglutinazione, cosa che, sulla scena del delitto, indica la
presenza di vari tipi di sangue (Figura 5). Inoltre i globuli
bianchi sono cellule dotate di nucleo e perciò è possibile
ottenere da queste il DNA per effettuare il fingerprinting. Infine
poiché il sangue di tutti i mammiferi contiene l’enzima catalasi
è possibile effettuare un primo test con perossido di idrogeno
per verificare se quello trovato sia effettivamente sangue.
Figura 5. Rappresentazione schematica dell’ agglutinazione.
Fattori di comparazione tra peli/capelli diversi sono: diametro, colore, ruvidezza, distribuzione dei
granuli, presenza o assenza di midollo, come riportato nella Tabella 2. Elementi che permettono di
inserire un individuo all’interno di una popolazione.
Tabella 2. Caratteristiche dei peli/capelli al microscopio ottico.
Popolazione
Caucasica
Asiatica
Africana
Americana
Caratteristiche
da lisci ad ondulati, granuli di pigmento uniformemente
distribuiti, midollo frammentato o assente, sezione
ovale/rotonda
pigmenti densi distribuiti uniformemente, sezione rotonda,
capello ruvido e dritto, midollo continuo
riccio, pesantemente pigmentato con distribuzione non
uniforme, variazioni di diametro, midollo frammentato o
assente
Inoltre al microscopio ottico è semplice distinguere fibre naturali e sintetiche (cotone, seta, rayon,
poliestere, nylon etc.) dai peli di origine animale dato che non presentano i tre tessuti caratteristici di
questi ultimi. Attenzione alla lana che invece è un tipo di pelo di animale.
Il DNA fingerprinting
Identificare significa attribuire esatte generalità ad un certo individuo. Il DNA fingerprinting è un
metodo di identificazione che consiste nella comparazione del DNA proveniente da individui diversi.
Così come l’impronta digitale di un individuo è unica, allo stesso modo il DNA (lo stesso per ciascuna
cellula del nostro organismo) identifica inequivocabilmente ognuno di noi. Dato che non può essere
alterato da nessun trattamento, il DNA fingerprinting è un metodo di elezione per l’identificazione e la
distinzione degli individui . Le analisi alla base della diagnosi delle malattie genetiche e dei test
condotti in ambito forense, sono rese possibili dalle caratteristiche stesse del DNA: infatti, oltre alle
regioni codificanti (poco variabili da individuo a individuo) vi si trovano regioni non codificanti
polimorfiche che possiedono un elevato grado di variabilità. Tipi particolari di polimorfismi di
lunghezza sono le VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) e le STR (Short Tandem Repeats),
costituite da un numero variabile di ripetizioni di una breve sequenza nucleotidica (Figura 4). In questo
modo il numero di ripetizioni presenti nel genoma di ciascun individuo costituisce la sua impronta
genetica. Tali sequenze che sono ereditate in modo Mendeliano, variano da individuo a individuo, sono
simili tra persone legate da un rapporto di parentela e sono identiche in gemelli omozigoti.
Peli e capelli nella scienza forense
Si tratta di elementi importanti in una indagine forense per vari motivi:
1. perchè possono essere disseminati sulla scena di un crimine.
2. perchè da ogni singolo campione è possibile risalire all’impronta genetica dell’individuo cui
appartiene.
Un pelo/capello può presentare caratteristiche ben
riconoscibili al microscopio ottico. Perciò è possibile
valutarne da una parte il colore e la consistenza, dall’altro i
tessuti di cui si compone (cuticola, corteccia e midollo). La
corteccia contiene i pigmenti responsabili della
colorazione. Il midollo, non sempre presente, è un tubo
cavo (continuo o frammentato) che decorre per tutta la
lunghezza del capello. Figura 6. Rappresentazione
schematica dei principali tessuti che costituiscono peli e capelli.
Figura 4 Polimorfismo STR di una sequenza ATTT in 3 alleli.
L’impronta molecolare del DNA può essere rilevata pressoché da ogni tipo di campione biologico e
attraverso opportune analisi di laboratorio si può ottenere un profilo distintivo che viene visualizzato
come una specie di codice a barre.
Come individuare i polimorfismi STR del DNA?
Il primo passo nella realizzazione del DNA-fingerprinting è l’estrazione del DNA da un campione
biologico. Successivamente l’amplificazione mediante la reazione a catena della polimerasi (PCR)
delle regioni polimorfiche e la successiva corsa elettroforetica su gel di agarosio permettono di
evidenziare le diverse dimensioni delle regioni. Il semplice confronto dei profili ottenuti dai campioni
biologici con i profili degli individui sospetti permette di identificare colui che ha lasciato una traccia.
PCR
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (POLYMERASE CHAIN REACTION)
La reazione a catena della Polimerasi è basata sulle leggi della replicazione del DNA e permette di
“copiare” un segmento di DNA che si trova tra due regioni di sequenza nota. Questo è possibile grazie
all’enzima Taq polimerasi, una DNA polimerasi capace di ricostruire una elica del DNA utilizzando
come stampo l’altra. Taq deriva dal batterio Thermus aquaticus, il microrganismo che abita le calde
sorgenti idrotermali dal quale è stata isolata per la prima volta. Ogni singola reazione d’amplificazione
viene fatta utilizzando dei reagenti che vengono combinati opportunamente in una mix e aggiunti al
DNA stampo
• Tampone di amplificazione: BUFFER
• MgCl2
• Nucleotidi trifosfato (dNTP’S): dATP, dCTP, dGTP e dTTP.
• Primer foward e primer reverse.
• Taq polimerasi.
• DNA stampo.
• Acqua bidistillata sterile per portare al volume finale desiderato.
Il ciclo di PCR prevede tre momenti fondamentali:
• DENATURAZIONE del DNA stampo ad una temperatura compresa tra 94°C e 99°C.
• APPAIAMENTO (annealing) dei primer. Avviene a temperature variabili tra i 50°C e i 65°C.
• ESTENSIONE da parte della Taq polimerasi a partire dai primer a 72°C.
La temperatura è alzata e abbassata automaticamente da una apparecchiatura detta termociclatore, che
dunque permette di passare, in modo ciclico, attraverso le tre fasi del programma di PCR. Questa
metodica permette di ottenere un aumento del numero di copie di tipo geometrico a partire da piccole
quantità di DNA stampo (in 32 cicli con efficienza del 100%, si ottengono 1.07 miliardi di copie della
regione bersaglio).
ANALISI DELLE “PROVE”
Queste sono alcune delle impronte rinvenute sulla scena del crimine: individuate alcuni caratteri distintivi e
determinate se corrispondono a quelle dei sospetti. Le conclusioni di ciascun gruppo saranno valutate con un
punteggio.
Uno sguardo alle impronte digitali
Esamina i caratteri distintivi di alcune impronte digitali rinvenute sulla scena del crimine:
1. Che tipo di impronte sono (arc, loop, o whorl)?
2. Riesci a individuare alcune “minutiae”?
3. Puoi identificare a chi appartengono basandoti sui verbali della polizia?
Indaga sulla scena del crimine
Durante l’investigazione viene riportata l’esatta disposizione degli oggetti presenti sulla scena del
crimine perchè questo può essere utile per risolvere il delitto. Di solito viene impedito l’accesso
all’intera scena con del nastro per impedire che persone non autorizzate rimuovano o spostino oggetti.
Osserva bene la scena del crimine, fissa nella tua mente i particolari e stasera prova a
disegnare quello che ti ricordi.
Strategia sperimentale
In questa esperienza ciascun gruppo effettuerà i passaggi chiave di una estrazione del DNA genomico da un
campione di cellule della mucosa buccale, prelevate mediante un tampone da uno o più sospetti.
Successivamente procederà al caricamento di un campione su gel di agarosio e visualizzarà ed interpreterà il
risultato di un DNA profiling ottenuto mediante amp lificazione via PCR di alleli STR.
PROTOCOLLO: Preparazione di un gel di agarosio
Individua i particolari interessanti basandoti anche sul lavoro dell’agente che sta
effettuando i rilevamenti:
1. Pesare la quantità opportuna di agarosio (in base alle dimensioni dei frammenti da separare) ed
aggiungerla al volume stabilito di tampone TEA 1 X.
2. Portare ad ebollizione il gel in un forno a microonde verificando lo scioglimento dell'agarosio.
3. Aggiungere la giusta quantità di bromuro di etidio ATTENZIONE: agente mutageno
4. Versare il gel nella vasca elettroforetica all’interno della slitta, sulla quale sarà stato precedentemente
sistemato un pettine vicino ad un'estremità della vaschetta. I denti del pettine formeranno, una volta
solidificatosi il gel, i pozzetti in cui verranno caricati i campioni di DNA.
5. Dopo circa 30 minuti rimuovere delicatamente il pettine dal gel solidificato.
6. Aggiungere il tampone da elettroforesi (TEA 1X) fino a coprire il gel per almeno 2 mm.
PROTOCOLLO: Estrazione del DNA da campioni biologici umani
Indossare camice e guanti di lattice
1. raccogliere con un tampone sterile le cellule della mucosa buccale dalla saliva
2. aliquotare 500 µl di buffer T1 (lysis buffer) in un tubo da 1,5 ml
3. Prelevare il tampone buccale dalla busta facendo attenzione a non contaminarlo
4. Introdurre il tampone buccale nel tubo da 1,5 ml contenente 500 µl buffer T1 e stemperare nella
soluzione. Dopodichè reintrodurre accuratamente il tampone buccale nella propria busta e porla in
sicurezza per eventuali altre analisi
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Agitare delicatamente per inversione (5-6 volte)
Aggiungere 25 µl di proteinasi K (10 mg/l) e mescolare delicatamente per inversione (5-6 volte)
Incubare a temperatura ambiente per 2 minuti
Incubare a 50°C per 5 minuti
Vortexare vigorosamente per 15 secondi
Aggiungere 200 µl di buffer B3
Agitare delicatamente per inversione (5-6 volte)
Incubare a 50°C per 5 minuti
Tarare la micropipetta ad un volume superiore a quello del campione e trasferire tutto il campione
all’interno della colonna colonna. N.B. non toccare la matrice bianca con la punta
Centrifugare 1 minuto a 12.000 rpm
Eliminare ciò che è passato nel tubo collettore
Aggiungere 500 µl di buffer BW (Wash Buffer)
Centrifugare 1 minuto a 12.000 rpm
Posizionare la colonna in un tubo da 1,5 ml sterile
Aggiungere 18 µl di buffer BE (preriscaldato a 50°C)
Incubare a temperatura ambiente per 1 minuto
Centrifugare 1 minuto a 12.000 rpm
Il campione di DNA, estratto dalle cellule e purificato da tutte le altre componenti cellulari, si trova nel
tubo da 1,5 ml e può essere conservato in frigo a 4°C.
PROTOCOLLO: Preparazione e caricamento dei campioni
1. Aggiungere Blue di Bromofenolo 10X ai campioni di DNA (ad esempio 2 µl di Blue per 18 µl di campione) e
caricarli nei pozzetti con una micropipetta.
2. Applicare il coperchio alla vasca elettroforetica e inserire gli elettrodi in modo tale che il polo positivo (rosso)
si trovi all'estremità del gel più lontana dai pozzetti. Utilizzando come riferimento la banda del Blue di
Bromofenolo, continuare la corsa elettroforetica per il tempo desiderato.
3. Controllare il gel su un transilluminatore a raggi UV e documentare il risultato con una fotografia.
Glossario
AGAROSIO.
Polisaccaride lineare costituito da unità ripetute di agarobiosio intercalate da unità alternate di galattosio e 3,6-anidrogalattosio. E’
uno dei costituenti dell'agar, una miscela di polisaccaridi isolati da alcune specie di alghe.
BLU DI BROMOFENOLO (BBF).
Colorante blu violaceo da aggiungere al campione necessario per visualizzare la corsa. Inoltre contiene
glicerolo che serve per non disperdere il DNA nel tampone durante il caricamento su gel di agarosio.
BROMURO DI ETIDIO.
Il 3-8 diamino 5 etil-fenilfenantridio bromuro è un agente mutageno che si intercala tra le basi del DNA e per questo motivo va
utilizzato con prudenza ed è necessario indossare i guanti quando si utilizzano materiali che lo contengono. Possiede la proprietà di
riemettere fluorescenza quando viene colpito da un fascio di luce ultravioletta.
CATALASI.
Enzima capace di catalizzare la trasformazione di H2 O2 (perossido di idrogeno) in acqua e ossigeno O2 .
CENTRIFUGA.
Apparecchiatura utilizzata per separare composti con diversi pesi specifici o densità mediante forza centrifuga. Oltre ad essere un
mezzo di separazione e di precipitazione, distingueremo in quest’ultimo caso un SOPRANATANTE fluido ed un PELLET adeso al
tubo, è anche un mezzo efficiente di essiccazione ed evaporazione.
CROMOSOMI.
Strutture presenti nel nucleo delle cellule in cui hanno sede i geni portatori dei caratteri ereditari.
DNA.
Acido desossiribonucleico. Materiale genetico di tutti gli organismi viventi. Nel nucleo degli eucarioti è complessato con proteine
(ISTONI) ed organizzato in strutture lineari dette CROMOSOMI. Nei procarioti il DNA è organizzato in un singolo cromosoma
circolare al quale sono associate poche proteine. I mitocondri e i cloroplasti contengono materiale genetico sotto forma di molecola
circolare a doppia elica, con associate poche o nessuna proteina.
EDTA pH 8.
Chelante degli ioni bipositivi capace cioè di sequestrare ioni come magnesio (Mg++) e calcio (Ca ++) indispensabili per il
funzionamento di alcuni enzimi tra cui quelli che tagliano il DNA (DNAasi).
ELUITO.
Campione acquoso che risulta da estrazione in laboratorio a partire da vari tipi di materiale.
ETANOLO.
L’ alcol etilico CH3 CH2 OH, favorisce la precipitazione del DNA ed è utilizzato per effettuare dei lavaggi.
EUCARIOTI.
Organismi le cui cellule hanno il nucleo provvisto di una membrana che lo delimita rispetto al citoplasma.
LISI.
Procedimento di rottura della cellula.
MICROLITRO.
Unità di misura di un volume pari a 10-6 l (simbolo µl).
NaOH.
Comunemente detta soda aumenta il pH facilitando la rottura della cellula.
NANOMETRO.
Unità di misura di lunghezza pari a 10-9 m (simbolo nm).
NUCLEOSIDE.
Zucchero e base.
NUCLEOTIDE.
Subunità di base delle molecole di DNA e di RNA costituita da zucchero, base azotata e gruppo fosfato.
PCR.
Reazione a catena della polimerasi.
pH.
Scala di misura dell'acidità o dell'alcalinità di una sostanza o di una soluzione. Varia tra 1 e 14.
POLIMERI.
Composti ad elevato peso molecolare ottenuti a partire da monomeri tramite reazioni di polimerizzazione.
PRIMER.
Catena oligonucleotidica ottenuta mediante sintesi in laboratorio.
PROTEINA.
Composti formati da amminoacidi che costituiscono gran parte del “materiale da costruzione” delle cellule e dell’organismo.
Hanno anche la funzione di regolare o facilitare le reazioni biochimiche nelle cellule: in questo ultimo caso si dicono enzimi. Ogni
proteina viene costruita grazie all’informazione contenuta in uno o più geni.
PROTEINASI K.
Enzima che serve per distruggere le proteine. Agisce ad elevate temperature 50°C.
RAGGI UV.
Radiazioni elettromagnetiche di lunghezza d'onda compresa tra 100 e 400 nm. Vengono convenzionalmente classificati in tre
bande: ma presentano fra loro grandi differenze: gli UV-A sono molto meno energetici degli UV-B. Si conoscono raggi
ultravioletti ancora più energetici degli UV-B: sono gli UV-C (lunghezza d'onda fra 100 e 285 nm)
Radiazioni UV-A (onde lunghe) da 315 a 400 nm
Radiazioni UV-B (onde medie) da 280 a 315 nm
Radiazioni UV-C (onde corte) da 100 a 280 nm
RNA.
Acido ribonucleico.
RNasi.
Enzima che degrada l’RNA.
SDS (Sodio dodecil solfato).
Sostanza detergente (sapone) che scioglie la membrana cellulare costituita in gran parte da lipidi (grassi).
TAMPONE.
Si definiscono tamponi tutti quei composti che mantengono il pH delle soluzioni ai valori di interesse.
TE.
E’ una soluzione contenete solitamente Tris -HCl 10 mM pH 8 e EDTA 1 mM pH 8 in acqua distillata.
TEA 50X.
Tampone per elettroforesi contenente Tris base, Acido Acetico glaciale ed EDTA pH8. Viene usato in concentrazione 1X.
Tris-HCl pH8.
Soluzione tampone per mantenere il DNA nelle condizioni ottimali.