Metodo per la determinazione di Ibuprofene in acque superficiali

COPIA AD USO ESCLUSIVO DI ……………………….
Progetto EMAS di Distretto
finalizzato all’Attestato APO (Ambiti Produttivi Omogenei) e al supporto delle
singole organizzazioni dei comparti chimico – farmaceutico operanti nel territorio
della provincia di Latina
Metodo per la determinazione di
Ibuprofene in acque superficiali,
sotterranee e di scarico.
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INDICE
1.
Scopo e campo applicazione
2.
Principio del metodo
3.
Responsabilità
4.
Apparecchiature, Reagenti e Materiali
5.
Regolazione e ottimizzazione dello strumento
6.
Taratura del sistema HPLC UV-visibile
7.
Analisi del campione tal quale
7.1 Concentrazione su SPE
8.
Condizioni cromatografiche
9.
Calcolo dei risultati
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1. SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Scopo della presente procedura è descrivere in maniera esaustiva la modalità
operative per la determinazione del principio attivo IBUPROFENE, utilizzato per
la produzione di molti farmaci anti-infiammatori, in campioni acquosi (es: acque
superficiali, sotterranee, di scarico).
Il metodo è applicabile a campioni la cui concentrazione di ibuprofene è
superiore ai 0,5 µg/L.
2. PRINCIPIO DEL METODO
Il metodo consente la determinazione dell’ ibuprofene contenuto in campioni
acquosi opportunamente trattati. La determinazione prevede i seguenti passaggi:
¾ Introduzione della soluzione da analizzare, preventivamente trattata, in
HPLC.
¾ Rivelazione UV- visibile a 214 nm
¾ Determinazione quantitativa dopo la taratura effettuata con opportune
soluzioni standard.
3. RESPONSABILITA’
La responsabilità di eseguire le operazioni descritte nella presente procedura è
del personale del laboratorio debitamente addestrato e autorizzato per questa
prova.
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4. APPARECCHIATURE, REAGENTI E MATERIALI
Per le operazioni il laboratorio utilizza le seguenti apparecchiature, campioni di
riferimento e reagenti:
¾ Acqua bidistillata
¾ Metanolo, Acetone, Diclorometano, Acetonitrile di grado per HPLC
¾ Soluzione Acetonitrile:Metanolo 90:10
¾ Standard certificato di ibuprofene
¾ Colonnine STRATA-X 33u Polymeric Reversed Phase 200 mg/3 mL o
equivalenti
¾ Sistema HPLC con detector UV- visibile
¾ Colonna per HPLC: Zorbax SB C18, 5 µm 4.6*150 mm o equivalente
¾ Fase mobile A per HPLC: 0.1 % Acido Ortofosforico in acqua
¾ Fase mobile B per HPLC: Acetonitrile/Metanolo 90:10
¾ Sistema da vuoto
¾ Rotavapor
¾ Vetreria di classe A
5. REGOLAZIONI ED OTTIMIZZAZIONI DELLO STRUMENTO
L’ottimizzazione e la regolazione dello strumento vanno condotte secondo
quanto descritto nel manuale d’uso dello strumento.
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6. TARATURA DEL SISTEMA HPLC UV-VISIBILE
La retta di taratura viene effettuata preparando delle soluzioni a diversa
concentrazione a partire da standard certificati. Preparare una soluzione
madre di Ibuprofene circa100 mg/L in acetonitrile:metanolo 90:10 stabile per
tre mesi se conservata a 4 ± 1°C.
Da tale soluzione preparare, per diluizione con Acetonitrile/Metanolo 90:10,
soluzioni ad almeno cinque diverse concentrazioni note in un range compreso
tra 10 µg/L e 10 mg/L. La retta di taratura sarà determinata dall’area ottenuta
dalla media di almeno tre iniezioni per ogni concentrazione.
7. ANALISI DEL CAMPIONE TAL QUALE.
Filtrare il campione su filtro da 0,45 µm direttamente in una vial da 2 mL.
Iniettare seguendo le condizioni cromatografiche descritte di seguito.
Per valori superiori a 10 mg/L è necessario diluire il campione affinché la
concentrazione letta dallo strumento rientri nel range della retta di taratura.
Per valori inferiori a 50 µg/L è necessario effettuare una estrazione su
colonnine SPE come descritto di seguito.
7.1
ESTRAZIONE SPE
Filtrare circa 100 mL del campione su filtro da 0,45 µm e raccogliere il
filtrato in cilindro graduato. Attivare la colonnina STRATA-X
33,
precedentemente collocata sul sistema da vuoto, con circa 3 ml di
metanolo ad un flusso di circa 1mL/min. Sciacquare con circa 3 ml di
acqua, quindi far passare il campione. Al termine sciacquare con altri 3 mL
di acqua distillata e lasciar asciugare la colonnina.
Eluire l’ adsorbato con Acetone (circa 3 mL) e Diclorometano (circa 3mL) in
ampolla a cuore di volume 50 mL.
Ridurre il volume con rotavapor ad una temperatura di 35°C fino a circa 1
mL finire di portare a secco sotto leggero flusso di N2.
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Il campione viene ripreso con 1 mL della fase mobile Acetonitrile: Metanolo
90:10 e filtrato con filtro da 0,45 µm in una vial con insert ed iniettato per
l’analisi cromatografica.
8. CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE
L’analisi cromatografica viene effettuata utilizzando un cromatografo ad
alta risoluzione corredato con colonna Zorbax SB C18 .
Le condizioni ottimali prevedono un volume di iniezione di 100 µL con un
flusso di 2 mL /min. L’eluizione avviene in modalità isocratica avente le
seguenti fasi mobili:
Fase mobile A: 60% (0,1% H3PO4 in acqua)
Fase mobile B: 40% (Acetonitrile:Metanolo 90:10)
L’individuazione del composto target avviene tramite rivelatore UV-visibile
alla lunghezza d’onda di 214 nm.
9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
La quantificazione per un campione con concentrazione superiore ai 50
µg/L avviene applicando la seguente formula:
Dove:
C = concentrazione di Ibuprofene nel campione espressa in µg/L
A = area del picco del campione
q = valore dell’intercetta della retta di taratura
m = valore della pendenza della retta di taratura
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d = fattore di diluizione
Nel caso in cui il campione sia stato sottoposto a concentrazione con
colonnine SPE si applica la seguente formula:
Dove:
x C’ = concentrazione di Ibuprofene nel campione espressa in µg/L
x C = concentrazione ricavata dalla retta di taratura espressa in µg/L
fa = fattore di arricchimento dato dalla formula:
o Vf = volume di fase mobile utilizzata per riprendere il
campione espressa in mL
o Vi = volume di campione trattato su colonnine espresso in
mL.
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