307-312 Attu - Turchi - Recenti Progressi in Medicina

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Attualità
Recenti Prog Med 2012; 103: 307-312
Biobanca ad azoto liquido:
una risorsa preziosa per la ricerca biomedica
Stefano Turchi1, Antonella Mercuri1, Guido Lazzerini1, Maria Rosa Chiesa1, Laura Musacchio2,
Sabrina Tozzi3, Mauro Boni3, Ottavio Zirilli1,3, Maria Grazia Andreassi1
Riassunto. Le biobanche sono una risorsa fondamentale
per il progresso della conoscenza scientifica di molte malattie multifattoriali e per le tecnologie delle “-omiche” (trascrittomica, proteomica, metabolomica, esposoma) al fine di individuare i meccanismi patogenetici e definire
nuovi strumenti di prevenzione, diagnosi e cura. La collezione di campioni biologici umani per una Banca Biologica è, tuttavia, un processo complesso che richiede la rigorosa attinenza a tutti i requisiti normativi vigenti sulla qualità e la sicurezza delle biobanca. L’obiettivo di questo articolo è quello di discutere le prospettive scientifiche, le
problematiche metodologiche e procedurali di un processo di allestimento di una biobanca, descrivendo la realizzazione recente di una Banca Biologica ad azoto liquido (-196 °C) a fini di ricerca presso l’Istituto di Fisiologia
Clinica, al Campus CNR di Pisa.
Liquid nitrogen biobank: a resource for biomedical research.
Parole chiave. Biobanca, esposoma, metabolomica, proteomica, trascritto mica.
Key words. Biobank, esposoma, metabolomica, proteomica, trascritto mica.
Introduzione
La conservazione di campioni umani (campioni
di sangue, cellule isolate e frazionate) rappresenta, infatti, una grande opportunità per la ricerca
medica al fine di scoprire i meccanismi patogenetici, le “impronte molecolari” e nuovi biomarcatori della maggior parte delle malattie complesse,
nella cui patogenesi i fattori ambientali interagiscono con fattori di tipo genetico1-4. Per tali prospettive, c’è un grande impegno nella comunità
scientifica per organizzare collezioni di materiale
biologico da un basso livello di organizzazione
(raccolte di campioni biologici “fai da te”) a strutture bene organizzate e controllate, a tutti gli effetti considerabili biobanche, che rispondano a tutti i requisiti normativi vigenti sulla qualità, lo
stoccaggio e la sicurezza dei campioni5,6. L’obiettivo di questo articolo è di discutere le prospettive
scientifiche, le problematiche metodologiche e procedurali di un processo di allestimento di una biobanca, descrivendo la realizzazione recente di una
Banca Biologica ad azoto liquido (-196 °C) a fini di
ricerca, presso l’Istituto di Fisiologia Clinica, al
Campus CNR di Pisa.
La costituzione di una biobanca, o banca biologica, – annoverata da Time nel 2009 tra le 10 idee
in grado di cambiare il mondo1 – sta diventando un
importante strumento per la ricerca scientifica e il
progresso della conoscenza medica, fornendo prospettive concrete per il raggiungimento di una “medicina personalizzata”2,3. Molti Paesi industrializzati attualmente stanno investendo ingenti risorse
nel biobanking pubblico e privato per la realizzazione di grandi collezioni di materiale biologico.
Nell’ultimo decennio, solo negli Stati Uniti sono
state istituite circa 179 biobanche che raccolgono i
campioni di 345.000 cittadini3. Nel 2007 il Regno
Unito ha istituito una biobanca nazionale (UK Biobank) allo scopo di raccogliere da 500000 persone
i campioni biologici e DNA da impiegare nel campo della ricerca medica sulle malattie comuni4.
Una biobanca è definita come un «sistema che
archivia uno o più tipi di campioni biologici per
studi futuri e che consente un recupero efficiente
ed una stabilità ottimale dei campioni»4.
Summary. Biobanks are a critical resource for “omics” technologies in order to dissect molecular mechanism and
gene-environmental interactions of common diseases, such
as cancer, cardiovascular diseases, diabetes, and neurodegenerative diseases. Progress in basic biomedicine may
contribute to advance personalised medicine in which
treatments will no longer be “one size fits all”, but instead
“tailored” to the molecular and genetic profile of each patient. Currently, there are major efforts worldwide to professionalize biobanks in order to move ahead from a “do-ityourself” tissue collection - as is most frequent at present for providing high quality preservation and storage of biological samples with potentially greater scientific impact. In
this paper, we describe our recent experience in the design
and development of a high-security liquid nitrogen storage
system (-196°C) as a key resource for biomedical research.
1 Unità Banca Biologica, Istituto di Fisiologia Clinica, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Pisa; 2 Air Liquide Sanità Service,
Milano; 3Unità Prevenzione e Protezione, Area della Ricerca di Pisa, Consiglio Nazionale delle Ricerche.
Pervenuto l’11 giugno 2012.
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L’importanza della raccolta di campioni biologici
per ricerche “-omiche”
Nonostante decenni di ricerca clinica ed epidemiologica, l’eziologia di molte malattie multifattoriali, quali cancro, malattie cardiovascolari, malattie neurodegenerative e diabete, è ancora in
gran parte sconosciuta. Le nuove tecnologie “-omiche”, quali trascrittomica, proteomica, metabolomica ed esposoma, stanno rivoluzionando il nostro
approccio alla conoscenza della biologia umana,
con la prospettiva concreta di fornire informazioni
per lo sviluppo di utili strumenti diagnostici e di
nuove strategie terapeutiche7-10.
lativo di esposizione dalla gestazione alla vita
adulta, negli studi di medicina ambientale13,14. Lo
studio dell’esposoma promuove l’applicazione delle tecniche “-omiche” nell’ambito dell’epidemiologia molecolare al fine di meglio caratterizzare l’intervallo che intercorre tra l’esposizione a fattori
ambientali e l’insorgenza di malattie15,16.
In questo contesto scientifico, il più importante
prerequisito è l’attenta gestione e lo stoccaggio di
campioni biologici in modo da preservare e controllare la qualità del materiale biologico per gli
studi di “-omica”.
La figura 1 schematizza le biomolecole all’interno di biofluidi, cellule e tessuti (DNA, mRNA,
proteine, peptidi, fosfolipidi, e piccoli metaboliti)
che sono attualmente di maggior interesse per la
ricerche “-omiche” (figura 1).
La trascrittomica è la scienza che studia
l’espressione genica utilizzando gli strumenti della biologia molecolare e della bioinformatica. Questo
campo sta avanzando rapidamente, soprattutto grazie a tecniche (high-throughput) ad alta processività
come la tecnologia microarray che consente la comparazione di un gran numero
di soggetti affetti (e non) da
specifiche patologie o esposti e non esposti (casi e controlli) a specifici fattori ambientali7-10.
La proteomica è la scienza che studia le proteine
presenti in specifici tipi cellulari o tessuti per comprendere il loro ruolo in condizioni fisiopatologiche. A differenza del genoma, lo studio
del proteoma è altamente
dinamico nel tempo, in relazione al tipo di cellula consiFigura 1. Le principali biomolecole per le ricerche “-omiche” della Medicina Ambientale e Personaderata ed in risposta all’amlizzata.
biente7-10).
Lo studio della metabolomica è finalizzato ad individuare piccole molecole, a basso peso molecolare
Aspetti etici per la raccolta e la conservazione
(metaboliti), prodotti dai cambiamenti nell’espresdei campioni umani in banche biologiche
sione genica e proteica7-10. Gli studi di metaboloper scopi di ricerca
mica sono eseguiti in campioni biologici con risonanza magnetica nucleare, spettroscopia e spetQuando si allestisce un archivio a lungo termitrometria di massa per identificare i componenti
ne di materiali biologici per ricerche future, devochimici di vie metaboliche: substrati, enzimi e i lono essere presi in considerazione diversi fattori,
ro prodotti.
per i quali si raccomanda la rigorosa attinenza a
La regolazione dell’espressione genica medianprotocolli standardizzati in modo da ottenere biote meccanismi epigenetici sta anche emergendo cobanche di alta qualità17-19. Gli aspetti salienti dell’allestimento di una biobanca sono schematizzati
me fattore determinante della risposta cellulare e
nella figura 2 a pagina seguente.
tessutale nelle malattie multifattoriali11. L’epigenetica descrive i meccanismi che consentono alle
Oltre alle questioni metodologiche, il prerequisicellule di rispondere rapidamente ai cambiamenti
to fondamentale per la raccolta di campioni biologiambientali, rappresentando un legame importanci per una banca biologica o per un progetto di ricerte tra geni e ambiente12.
ca specifico richiede l’approvazione del Comitato EtiIn aggiunta, è stato recentemente introdotto il
co di pertinenza5.
concetto di “esposoma”, che riflette l’effetto cumu-
S. Turchi et al.: Biobanca ad azoto liquido: una risorsa preziosa per la ricerca biomedica
tistiche, diversi da quelli
per i quali è stato originariamente acquisito il consenso informato degli interessati, sono consentiti limitatamente al perseguimento di scopi scientifici e statistici direttamente collegati
con quelli originari»18. L’utilizzo dei campioni biologici
per ogni specifico progetto
di ricerca deve essere, comunque, oggetto di autorizzazione da parte del Comitato Etico dell’istituzione
sulla base di uno specifico
protocollo. Inoltre, i donatori hanno il diritto di essere
dettagliatamente informati
sulle modalità di trattamento dei loro dati personali raccolti, nonché degli
strumenti e dei mezzi utiFigura 2. Rappresentazione schematica di un archivio di campioni biologici.
lizzati per garantirne la riservatezza nel rispetto del
codice in materia di protezione dei dati a tutela della
privacy e della dignità degli individui. In Italia, si
In conformità a quanto affermato sulla tutela dei
rinvia per una più ampia analisi dell’argomento aldati personali e i principî etici riguardo la tutela dei
le linee guida pubblicate dal CNB Comitato Nasoggetti umani (la Dichiarazione Universale delzionale per la Biosicurezza e le Biotecnologie5.
l’Unesco sulla Bioetica ed i Diritti Umani 2005; la
Dichiarazione Universale dell’Unesco sul Genoma
Umano ed i Diritti Umani 1997; la Dichiarazione di
Helsinki sui Principî Etici che coinvolgono la ricerca
Progettazione di una raccolta di campioni
medica su soggetti umani 1964 e 2008), i campioni
per una banca biologica di alta qualità
biologici devono essere acquisiti solo con il consenso
informato dei partecipanti, anche definendo i limiti
Quando si progettano studi di ricerca con camentro cui possono esser usati, in particolar modo
pioni biologici, i ricercatori si trovano di fronte alla
quando condotta sul DNA5,18.
domanda di come archiviare un vasto numero di
campioni in modo da consentire il più grande nuDi fondamentale importanza è l’informazione
mero di opzioni di ricerca nel futuro19-21. Una racalla richiesta del consenso che deve essere chiara
e precisa e basarsi sia su un opuscolo informativo
comandazione generale è che il protocollo per la
sia su una breve conversazione (face-to-face conraccolta, il processamento e l’archiviazione dei camsent). Il consenso deve essere espresso in forma
pioni biologici includa il maggior numero di tipi di
campioni al fine di fornire un’ampia risorsa per una
scritta e, in generale, ai donatori dovrebbe essere
sempre garantita la possibilità in qualsiasi movasta gamma di futuri quesiti scientifici19-21.
Per quanto riguarda il processo di raccolta del
mento di revoca, compresa la distruzione dei campioni biologici e i relativi dati personali5,18. Sebcampione, è di estrema importanza adottare le metodologie operative più adeguate con rispetto al tratbene non ci sia unanime accordo sulla specificità
del consenso, in letteratura esistono numerose
tamento e all’archiviazione in modo da preservare
intatte le caratteristiche biologiche dei campioni19proposte di modelli specifici per banche biologi21
che, proposte che sono state preparate prendendo
. Ad esempio, è necessario considerare vari aspetti
in considerazioni numerosi modelli in uso presso
tecnici, come la selezione attenta dell’anticoagulanvarie istituzioni5,18.
te e/o preservanti nelle provette di prelievo, la temA livello nazionale, è riconosciuta la possibilità
peratura e la lunghezza dello stoccaggio al fine di
di acquisire un “consenso parzialmente ristretto”,
evitare perdite o danni del materiale biologico19,20.
consenso che permette di usare il materiale biologico (ed i dati connessi) per le finalità della ricerca
Il plasma è normalmente raccolto in provette
specifica che ha dato il via alla raccolta e per futucon aggiunta di anticoagulante (comunemente EDre finalità ad essa connesse in modo più o meno diTA, citrato o eparina), mentre il siero è collocato in
retto: «la conservazione e l’ulteriore utilizzo di
una provetta senza additivi o contenente in molti
campioni biologici e di dati genetici raccolti per la
casi una forma di silice micronizzata per rallentarealizzazione di progetti di ricerca e indagini stare la coagulazione.
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Per le ricerche genetiche, la raccolta di sangue
con EDTA è idonea per studi sul DNA. Un tempo
rapido di processamento è un altro fattore cruciale per tutto il processo di raccolta del campione per
evitare la degranulazione cellulare per azione di
proteasi in cellule ex vivo.
Per alcuni tipi di biomarcatori può essere necessario aggiungere un mix di inibitori delle proteasi al fine di evitare la degradazione del campione. In generale, una raccomandazione importante
è che il campione sia separato appena possibile nei
diversi componenti (plasma, siero, cellule) e ciascuna parte sia mantenuta alla temperatura appropriata19,20. Più velocemente si separa il plasma
dalle cellule, maggiore risulta la qualità del campione: questo è particolarmente importante per i
biomarcatori che sono sia circolanti sia presenti
nelle piastrine22.
Quando i campioni non vengono analizzati immediatamente, andrebbero mantenuti ad una temperatura bassa perché la temperatura ambiente
provoca il degrado dei marcatori proteici piu’ labili (citochine), antiossidanti (acido ascorbico, acido
urico, -tocoferolo ) ed altri analiti (folati e vitamina B-12 ). Il controllo della temperatura durante
la raccolta dei campioni e la conservazione a lungo
termine è essenziale e determina l’utilità dei campioni nelle analisi future23-25. Generalmente, per
una conservazione a lungo termine, lo stoccaggio a
-80 °C viene adottato per aliquote di siero e plasma, contenenti un gran numero di molecole solubili che richiedono temperature molto basse per rimanere intatte23-25.
Alcuni biomarcatori, tuttavia, possono degradarsi spontaneamente durante la conservazione anche a -80 °C e per questi può essere necessario lo
stoccaggio a temperature più basse in azoto liquido26. Al contrario, il DNA purificato può esser stoccato a 4 °C per settimane , a -20 °C per mesi e -80 °C
per anni28. Le cellule vitali sono stabili a temperatura ambiente fino a 48 h; successivamente, i campioni cellulari devono essere o coltivati o crioconservati in azoto liquido al fine di rimanere vitali.
colare condizione, sembra che la maggior parte delle cellule stoccate rimangono vitali e invariate a
tempo indeterminato19-21.Tuttavia, la creazione e la
manutenzione delle biobanche con criocontenitori in
azoto liquido richiede un’attenta pianificazione per
garantire al personale che utilizza l’impianto di lavorare in condizioni di sicurezza. La manipolazione
dell’azoto liquido necessita l’osservazione di regole
rigorose il cui scopo è prevenire due rischi primari:
l’anossia e le ustioni per contatto o da proiezioni. In
una sala criogenica, durante la fase di riempimento dei criocongelatori, si può potenzialmente avere
una vaporizzazione dell’azoto liquido che va a diminuire il volume di ossigeno nell’aria. Un’indicazione
generale di quali possano essere le conseguenze dell’esposizione ad atmosfera sotto-ossigenata, sono:
21%-18% possibili difficoltà respiratorie, 18%-12%
atmosfera non respirabile, problemi respiratori gravi, sotto 12% svenimento e morte. Il rischio elevato
dipende anche dal fatto che l’azoto è inodore, il che
lo rende più insidioso rispetto ad altri gas tossici
(per es., ammoniaca o idrogeno solforato) la cui presenza anche a bassissime concentrazioni è rivelata
dal caratteristico odore. In ogni sala di crioconservazione, pertanto, devono essere presenti sensori ossigeno e sistemi di ventilazione forzata per proteggere l’operatore dal rischio di asfissia. In aggiunta,
è altrettanto importante che lo staff sia adeguatamente formato sull’uso di efficaci sistemi di protezione al fine di minimizzare il rischio di possibili incidenti. La tabella 1 riassume le principali precauzioni da adottare in una criobanca ad azoto liquido.
Tabella 1. Norme di sicurezza di una biobanca d’azoto liquido.
Accesso ristretto a personale autorizzato
Personale formato (lavoro in coppia)
Utilizzo di sistemi meccanici di ventilazione
Sensore ossigeno con soglia di allarme <19%
Immediata uscita dalla sala in caso di sintomi
da deficit d’ossigeno
Stoccaggio a lungo termine del campione:
perché scegliere una biobanca ad azoto liquido?
La nostra esperienza
Il metodo migliore per la conservazione delle cellule e biomolecole è la loro crioconservazione in azoto liquido che sta diventando una opzione di archiviazione sempre più comune per la ricerca biomedica29-31. L’obiettivo della crioconservazione è quello
di minimizzare i danni ai materiali biologici. Più
bassa è la temperatura, tanto più è il periodo di conservazione vitale. Il termine “crioconservazione”
(conservazione criogenica) si riferisce alla conservazione di cellule, tessuti e organi, a seguito di opportune procedure di preparazione, alla temperatura ultra-bassa dell’azoto liquido (-196 °C). A questa
temperatura, la cellula entra in uno stato di “assoluta quiescenza”, tutte le reazioni fisiche e biochimiche sono praticamente arrestate; in questa parti-
Al fine di creare una banca biologica realizzata
secondo i più elevati livelli di qualità e sicurezza, il
nostro Istituto al Campus CNR di Pisa ha recentemente attivato una partnership con Air Liquide Sanità Service, in grado di assicurare il know-how necessario per la realizzazione di un impianto di stoccaggio di campioni biologici con i più qualificati standard di crioconservazione ed alti livelli di sicurezza.
Il nucleo della struttura è una sala adeguatamente dimensionata, all’interno della quale sono
posizionati i contenitori criogenici alimentati tramite una linea di distribuzione sottovuoto dell’azoto liquido, stoccato, a sua volta, in un serbatoio criogenico esterno.
S. Turchi et al.: Biobanca ad azoto liquido: una risorsa preziosa per la ricerca biomedica
Il riempimento dei criocontenitori avviene in modo
automatico, in funzione dei
livelli di riempimento impostati sui contenitori stessi. A
garanzia di sicurezza sia per
il personale che per i campioni biologici, inoltre, l’accesso alla biobanca è controllato e tracciato tramite
badge elettronici. Tutti i parametri critici, gli automatismi di impianto e gli accessi
badge sono gestiti da un sistema di gestione e controllo
appositamente progettato
(CryoSMART- Air Liquide
Sanità Service SpA). Nel caso specifico, il sistema, attivo 24 ore/giorno per 365
giorni/anno, è stato configurato per monitorare e gestire costantemente i parameFigura 3. Struttura schematizzata delle caratteristiche strutturali, organizzative e gestionali della
tri e le condizioni operative
Biobanca dell’Istituto di Fisiologia Clinica al Campus CNR di Pisa.
dei criocontenitori (temperatura, livello, stato coperchi e stato elettrovalvola), la
percentuale di ossigeno ambientale, la fornitura dell’azoto liquido, la sincroIn questa ottica, è raccomandabile che si passi da
nizzazione del riempimento dei criocontenitori e
una fase di raccolta di campioni di tipo “artigianatutti i possibili stati di allarme evidenziati anche
le”, come spesso ancora accade nei nostri Centri di
tramite dispositivi acustici e visivi. Ogni allarme
ricerca e di clinica, ad un processo di allestimento
identificato come critico potrà essere inviato via
di una biobanca con un elevato grado di competenSMS, chiamata vocale o e-mail agli operatori coinza professionale e di implementazione di tecnologie
volti, al fine di consentire l’intervento in caso di
informatizzate al fine di garantire tutti i requisiti
emergenza (figura 3).
normativi vigenti sulla qualità e la sicurezza delle
Il medesimo sistema informativo consente, inolBanche Biologiche.
tre, agli utenti di tracciare la “vita” del campione
biologico dall’accettazione all’analisi, con un partiBibliografia
colare dettaglio delle posizioni di stoccaggio e di
eventuali movimentazioni.
1. Park A. Biobanks. Time 2009; 12 march online:
Attualmente, nella nostra banca sono già prehttp://www.time.com/time/specials/packages/artisenti oltre 5000 campioni di fluidi biologici, desticle/0,28804,1884779_1884782_1884766,00.html
nati ad aumentare grazie alla capacità della sala di
2. Riegman PHJ, Morente MM, Betsou F, de Blasio P,
ospitare 28 criocontenitori con una capacità di stocGeary P; Marble Arch International Working Group
caggio per ognuno di circa 20000 provette di camon Biobanking for Biomedical Research. Biobanking
for better healthcare. Mol Oncol 2008; 2: 213-22.
pioni biologici.
3. Végvári A, Welinder C, Lindberg H, Fehniger TE,
La Biobanca del nostro Istituto potrà integrare
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do alla crescente richiesta di conservazioni di camJ Clin Bioinforma 2011; 16: 24.
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parte dell’intera comunità scientifica.
concept to reality. Pharmacogenomics 2005; 6: 639-46.
Conclusioni
Le biobanche sono una risorsa fondamentale per
le nuove tecnologie ricerche “-omiche”, offrendo la
grande opportunità di migliorare la comprensione
delle malattie complesse per definire una “medicina personalizzata” in cui i trattamenti non saranno più uguali per tutti, ma su base individuale per
profilo molecolare e genetico di ciascun paziente32.
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Indirizzo per la corrispondenza:
Dott. Maria Grazia Andreassi
Consiglio Nazionale delle Ricerche
Istituto di Fisiologia Clinica
Via Giuseppe Moruzzi, 1
56127 Pisa
E-mail: [email protected]
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