Rienzi parametri seminali e tecniche di PMA

PARAMETRI SEMINALI E TECNICHE DI
PROCREAZIONE MEDICALMENTE ASSISTITA
INTRODUZIONE
L’esame del liquido seminale rappresenta il cardine dell’iter diagnostico relativo alla valutazione
della fertilità maschile. Consente di valutare il potenziale riproduttivo dell’uomo e l’eventuale
necessità di ricorrere a procedure di riproduzione medicalmente assistita (PMA). In quest’ultimo
caso, mediante l’individuazione della corretta strategia da adottare (rapporti mirati, inseminazione
intrauterina o FIVET/ICSI) e l’utilizzo delle metodiche più adeguate di preparazione del liquido
seminale, è stato possibile ottenere gravidanze anche in casi in cui, per impedimenti anatomici o
funzionali del partner maschile o femminile, sarebbe stato improbabile, se non impossibile,
concepire per via naturale.
PARAMETRI SEMINALI CONVENZIONALI
L’esame seminale comprende la valutazione sia dei parametri macroscopici (liquefazione, odore,
pH, viscosità, volume) che microscopici (conta, motilità e morfologia nemaspermiche ed eventuale
presenza di agglutinazioni). Secondo il nuovo manuale WHO 2010 sull’esame del liquido seminale
(1), un campione viene classificato come oligozoospermico (concentrazione <15 M/ml),
astenozoospermico (motilità progressiva <32%), teratozoospermico (forme tipiche <4%),
normozoospermico (tutti i parametri nella norma), azoospermico (assenza di spermatozoi
nell’eiaculato). La presenza di agglutinazioni può essere indicativa della presenza di anticorpi antispermatozoo, sebbene sia necessario ricorrere a test più specifici (Mar test o immunobead test) per
formulare una diagnosi di infertilità immunologica. Tuttavia, una agglutinazione massiva, falsando
la valutazione della concentrazione e della motilità nemaspermiche, influisce negativamente sulla
preparazione del campione seminale.
PREPARAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE IN LABORATORIO
Lo scopo delle metodiche di selezione nemaspermica consiste nel mimare in vitro, quanto più
possibile, le modificazioni che fisiologicamente lo spermatozoo subisce durante il transito
nell’apparato genitale femminile. Le vie genitali femminili, infatti, svolgono una funzione
indispensabile nella preparazione dello spermatozoo all’incontro con l’ovocita, rendendolo capace
di penetrare gli involucri esterni del gamete femminile. La prima fase di tale “capacitazione” si
verifica al momento del contatto con il muco cervicale, il quale agisce da barriera selezionando
negativamente gli spermatozoi che presentano alterate motilità e morfologia; il processo sarà poi
completato durante il passaggio in utero e nelle tube, fino al raggiungimento del cumulo ooforo.
Purtroppo le modificazioni cui lo spermatozoo va incontro durante il transito utero-tubarico sono
solo parzialmente sostituibili con le attuali metodiche di capacitazione in vitro.
Un postulato considerato irrinunciabile per migliorare le caratteristiche del campione in esame
consiste nella necessità di eliminare il plasma seminale e le componenti cellulari non
nemaspermiche (leucociti, cellule epiteliali etc…) in esso contenute al fine di ottenere un campione
incontaminato. Inoltre, è fondamentale la scelta del terreno di coltura appropriato in cui
risospendere il pool di spermatozoi durante il trattamento. Tutti i terreni di coltura utilizzati
contengono come base comune una miscela di sali inorganici nota come “soluzione salina
bilanciata”, la cui funzione consiste nel controllare il pH e la pressione osmotica, più un
supplemento di carboidrati e aminoacidi che fornisce alle cellule un adeguato apporto energetico.
La scelta dei componenti di un terreno di coltura condiziona, ovviamente, il risultato che ci si
propone di ottenere. Infatti, tale scelta deve tenere conto delle modificazioni che verranno indotte
negli spermatozoi una volta a contatto con il terreno in questione, in modo da sincronizzare al
massimo la sua maturazione con i tempi biologici di maturazione dell’ovocita.
Le metodiche di preparazione seminale consentono dunque di: 1) separare gli spermatozoi dal
plasma seminale concentrandoli in un piccolo volume di terreno di coltura; 2) selezionare gli
spermatozoi dotati di migliore motilità e morfologia; 3) aumentare le capacità cinetiche degli
spermatozoi selezionati e conservarne la motilità nel tempo; 4) fornire un campione incontaminato.
La scelta della metodica di selezione nemaspermica da utilizzare deve: a) essere la meno traumatica
per la cellula nemaspermica; b) essere, sia in caso di normospermia che in caso di dispermia, la più
utile a seconda delle caratteristiche del campione seminale da preparare. Tuttavia non è garantito
che tali metodiche riescano a selezionare spermatozoi funzionali ed effettivamente dotati di capacità
fecondante.
Le tecniche più comunemente impiegate per la preparazione del liquido seminale sono la
migrazione ascendente (swim-up) e la centrifugazione in gradiente discontinuo di densità, spesso
precedute da un lavaggio preliminare del campione.
Lo swim-up si basa sulla migrazione attiva degli spermatozoi dal plasma seminale in un terreno di
coltura appropriato. Inizialmente descritto da Mahadevan e Baker nel 1984 (2), può essere
effettuato da pellet (in seguito a diluizione e centrifugazione del campione), o da seme liquefatto
(3). Quest'ultimo approccio è da preferire in quanto e’ stato riportato che lo swim-up da pellet può
determinare la produzione di elevati livelli di radicali dell’ossigeno (ROS) (4) che, attraverso la
perossidazione lipidica, sembrano influire negativamente sulle funzioni spermatiche (5,6).
La metodica di separazione per gradiente di densità permette una migliore selezione di spermatozoi
di buona qualità, svolgendo allo stesso tempo una potente azione di filtro su tutte le altri
componenti seminali (7) consentendo, in particolare, di ridurre la generazione di ROS derivanti da
cellule contaminanti o da spermatozoi atipici (8). Inoltre, essendo più facile da standardizzare
rispetto allo swim-up, fornisce dei risultati meno variabili. Questa tecnica sfrutta la centrifugazione
di plasma seminale stratificato sopra dei gradienti di densità di silice colloidale, che separano le
cellule a seconda della loro densità. Inoltre, gli spermatozoi mobili migrano attivamente attraverso
il gradiente per formare un soffice pellet alla base del tubo da centrifugazione. Generalmente viene
utilizzata una preparazione semplice a due gradienti discontinui di densità, tipicamente 40 % v/v e
80 % v/v.
La scelta della tecnica di preparazione seminale da adottare è dettata dalla natura del campione. Per
esempio, secondo il nuovo manuale WHO 2010, lo swim-up da strato è spesso utilizzato quando il
campione è considerato per lo più normale, mentre in caso di severa oligozoospermia,
teratozoospermia o astenozoospermia, la separazione su gradiente di densità è preferibile in quanto
è possibile recuperare un numero maggiore di spermatozoi motili (1).
Gli spermatozoi prelevati dall'epididimo e dal tessuto testicolare richiedono una preparazione
specifica. L'indicazione tipica per effettuare una aspirazione epididimale è l'azoospermia ostruttiva
piuttosto che la disfunzione testicolare. In questo caso, un numero relativamente elevato di
spermatozoi può essere ottenuto a fini terapeutici. Gli aspirati epididimali possono essere spesso
ottenuti con una minima contaminazione da parte di eritrociti e altre cellule non germinali,
rendendo l'isolamento e la selezione degli spermatozoi relativamente semplice. Se si riesce ad
ottenere un elevato numero di spermatozoi, la separazione su gradiente di densità può essere un
metodo di preparazione efficace; tuttavia, se la conta nemaspermica è bassa è consigliabile
effettuare un semplice lavaggio (1). In entrambi i casi la metodica di inseminazione più indicata è la
ICSI (IntraCytoplasmic Sperm Injection).
Nel caso in cui l’azoospermia sia di tipo secretorio, o non sia stato possibile rinvenire spermatozoi
nell’aspirato epididimale, viene effettuata una biopsia testicolare. Gli spermatozoi testicolari sono
invariabilmente imprigionati nel tessuto e contaminati da un elevato numero di eritrociti e altri tipi
cellulari. Di conseguenza, al fine di isolare una preparazione pressochè pulita di spermatozoi sono
necessari degli step aggiuntivi, primo fra tutti la rottura enzimatica o meccanica dei tubuli
seminiferi. Gli spermatozoi così ottenuti vengono preparati tramite semplice lavaggio e utilizzati
per la tecnica ICSI, data la scarsità del numero e della percentuale di forme normalmente motili (1).
In alcuni uomini, infine, il liquido seminale passa nella vescica al momento della eiaculazione,
risultando in aspermia, o assenza apparente di eiaculato. Se non è possibile alcun trattamento
farmacologico, o se questo non risulta efficace, gli spermatozoi possono essere recuperati
direttamente dall'urina, come descritto nel Manuale WHO 2010. In questo caso, il campione di
urina viene centrifugato al fine di concentrare gli eventuali spermatozoi presenti e in seguito trattato
utilizzando la separazione su gradiente di densità. L'alcalinizzazione dell'urina, per esempio per
ingestione di bicarbonato di sodio, sembra aumentare la probabilità che gli spermatozoi qui eiaculati
mantengano le loro caratteristiche cinetiche (9).
TECNICHE DI PROCREAZIONE MEDICALMENTE ASSISTITA
IUI
L’inseminazione intrauterina (IUI) è una tecnica di PMA di I livello il cui scopo consiste
nell’incrementare la densità dei gameti maschili nel sito dove avviene, in vivo, la fecondazione. A
questo proposito, il liquido seminale, opportunamente preparato in laboratorio generalmente
mediante swim-up o separazione su gradiente di densità, viene depositato nella cavità uterina per
mezzo di un catetere sottile. In letteratura non sono ancora riportate chiare evidenze a supporto di
una tecnica di preparazione seminale in particolare. Infatti, ad oggi mancano studi controllati
randomizzati ben condotti che comparino l’efficienza di un gradiente e/o di uno swim-up e/o di un
semplice lavaggio e centrifugazione con riferimento ai risultati clinici. Sebbene alcuni studi, sulla
base del confronto dei diversi parametri seminali, possano suggerire una preferenza per il
trattamento del campione su gradiente di densità, non si possono ancora trarre salde conclusioni a
riguardo (10).
FIVET
La FIVET è una tecnica di PMA di II livello in cui viene favorito l’incontro in vitro tra i gameti
femminili, prelevati mediante aspirazione transvaginale del liquido follicolare, e quelli maschili,
ottenuti in seguito alla preparazione laboratoristica del campione seminale. Poiché ovocita e
spermatozoi rimangono in contatto per un lungo periodo di tempo in vitro, è necessario che la
preparazione seminale utilizzata sia il più possibile libera da contaminazioni. Di conseguenza, la
tecnica di preparazione seminale da preferire sembra essere la separazione su gradiente di densità,
eventualmente seguita da uno swim-up se i parametri seminali basali lo consentono.
ICSI
La ICSI è una tecnica di PMA di II livello in cui un singolo spermatozoo viene iniettato
direttamente nel citoplasma di un ovocita Metafase II, rimosso delle cellule del cumulo. Il campione
seminale può essere trattato con le metodiche precedentemente descritte o, nel caso di
oligozoospermia severa/criptozoospermia/utilizzo di spermatozoi testicolari o epididimari, tramite
un semplice lavaggio seguito da centrifugazione, al fine di concentrare in un piccolo volume gli
spermatozoi presenti. Secondo quanto suggerito da De Vos et al. nel 1997 (11), la separazione su
gradiente può essere omessa; infatti, la soluzione di PVP in cui vengono posizionati gli spermatozoi
poco prima dell’inseminazione svolge una funzione simile, in virtù della sua elevata densità.
Nel caso della ICSI, al contrario di quanto accade per la tecnica FIVET classica, la scelta dello
spermatozoo da inseminare dipende dall’operatore, che quindi ricopre un importante ruolo di filtro.
La selezione degli spermatozoi avviene normalmente al microscopio invertito all’ingrandimento
400x. Tuttavia, recentemente è stato introdotto un nuovo sistema di selezione microscopica degli
spermatozoi, mediante studio della morfologia della testa (MSOME: Motile Sperm Organellar
Morphology Examination) ad un ingrandimento fino a 6600x. Con questa procedura si possono
selezionare spermatozoi privi di anomalie nucleari, quali i vacuoli, da iniettare nell’ovocita tramite
IMSI (Intracytoplasmic Morphologically-selected Sperm Injection) (12-15).
PROSPETTIVE FUTURE E CONCLUSIONI
Le tecniche di preparazione del liquido seminale oggi a disposizione permettono di selezionare gli
spermatozoi con migliori motilità e morfologia. E’ noto tuttavia che la relazione tra questi criteri
convenzionali e la fertilità non è diretta. Per questo motivo negli ultimi anni sono stati sviluppati
nuovi test funzionali che diano indicazioni addizionali sulla qualità dello spermatozoo. Le
metodiche più utilizzate consistono nella valutazione e quantificazione dei fenomeni apoptotici (per
esempio il test dell’Annessina V e il test del fluorocromo JC-1) e nello studio della frammentazione
del DNA (per esempio il TUNEL test). Sulla corrente di questi recenti studi, sono state sviluppate
nuove tecniche di separazione nemaspermica in grado di selezionare una popolazione di
spermatozoi con una bassa percentuale di cellule apoptotiche e un basso livello di frammentazione
del DNA. E’ stato descritto (16, 17) che già le tecniche convenzionali di preparazione seminale
(swim-up e centrifugazione su gradiente) permettono di ottenere una sostanziale riduzione delle
cellule apoptotiche, limitando il rischio di utilizzo di spermatozoi non funzionali nelle tecniche di
PMA. Recentemente, inoltre, è stata sviluppata una nuova metodica di separazione (MACS:
Magnetic Active Cell Sorting) basata sull’utilizzo di biglie magnetiche in grado di legarsi
all’Annessina V esposta sulle cellule in apoptosi. Il MACS si è rilevato un metodo efficiente nella
riduzione della percentuale di cellule apoptotiche e, quindi, dei livelli di frammentazione del DNA
nei campioni così processati (18).
Un altro metodo sviluppato al fine di ridurre il livello di frammentazione nella popolazione di
spermatozoi selezionata è la glass-wool filtration (8,19,20), in cui il campione seminale viene
filtrato attraverso delle fibre di vetro densamente impacchettate.
Per concludere, attualmente esistono diverse tecniche in grado di selezionare gli spermatozoi
ritenuti migliori, in termini di potenziale di fertilizzazione e successivo sviluppo embrionale, da
utilizzare per le tecniche di PMA. La scelta della metodica deve essere personalizzata sulla base
delle caratteristiche del campione seminale e la strategia di inseminazione prescelta. Sono inoltre
disponibili nuove metodiche di preparazione seminale che tuttavia risultano ancora poco utilizzate
nella pratica clinica e che necessitano di studi ulteriori e sistematici per valutarne la reale efficacia.
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