Scarica il PDF - Giornale SIGENP

RECENT ADVANCE
IN BASIC SCIENCE
a cura di
Salvatore Accomando
Un nuovo marker efficace
di infiammazione intestinale: la proteina
high mobility group-box1 (HMGB1)
Protein high mobility group-box1 (HMGB1): a new marker
of gastrointestinal inflammation
Roberta Vitali1 (foto)
Laura Stronati2
Salvatore Cucchiara3
ENEA, Dipartimento
Sostenibilità dei Sistemi Produttivi
e Territoriali, Laboratorio
Tecnologie Biomediche;
2 Sapienza Università di Roma,
Dipartimento di Biotecnologie
Cellulari e Ematologia; 3 Sapienza
Università di Roma, Dipartimento
di Gastroenterologia, Epatologia
e Endoscopia Digestiva Pediatrica
1
Key words
Marker infiammatorio • Malattie infiammatorie
croniche intestinali • HMGB1
Abstract
The fecal high mobility group box1
protein (HMGB1) is a non-invasive biomarker for Inflammatory Bowel Diseases (IBD) which helps to distinguish
whether the intestinal inflammation is
clinically evident or subclinical. This allows to recommend its use to control
the development of the disease and
evaluate the response to therapy in
IBD. As a matter of fact HMGB1 is an
active player in the inflammation of intestinal mucosa and consequently represents a good candidate as a target
for IBD therapy.
Indirizzo per la corrispondenza
Salvatore Cucchiara
viale Regina Elena 324, 00161 Roma
E-mail: [email protected]
172
Nel lume intestinale sono presenti una vasta
quantità di molecole immunogeniche e proinfiammatorie, con le quali il sistema immunitario è in
costante interazione, di conseguenza la mucosa
intestinale è in uno stato continuo di controllata
reattività immunologica. Tale reattività può essere
definita come una infiammazione fisiologica che
deve essere mantenuta al minimo per preservare
le condizioni di salute. La perdita del suo controllo porta a stati infiammatori che, se protratti, conducono a specifiche patologie.
L’infiammazione cronica intestinale è alla base
delle malattie infiammatorie intestinali (IBD, da
“Inflammatory Bowel Disease”), che includono la
malattia di Crohn (MC) e la colite ulcerosa (CU).
Le IBD sono disordini immuno-mediati del tratto
gastro-intestinale con una patogenesi derivante
da un’alterata interazione tra fattori genetici, immunologici e microbici 1.
L’ipotesi patogenetica prevalente è quella di una
reazione immunologica abnorme da parte dell’intestino nei confronti della normale flora intestinale. Tradizionalmente, una risposta mucosale adattativa aberrante, causata soprattutto dalle cellule
T, è stata considerata la maggiore responsabile
della patogenesi delle IBD. Tuttavia le recenti
scoperte dei geni difettivi nel sistema immunitario
innato hanno spostato l’attenzione sulle fasi precoci della risposta immune 2.
L’attivazione della risposta immunitaria innata
verso i batteri è mediata da una famiglia di recettori (PRRs, da “Pattern Recognition Receptors”)
che includono i recettori di superficie “toll like”
(TLRs) e le proteine NOD (da “Nucleotide Oligomerization Domain”) che mediano l’attivazione
del fattore di trascrizione NF-kB. Alcune mutazioni dei TLRs e delle proteine NODs producono
sensori difettivi verso i patogeni e predispongono
l’ospite a infezioni ricorrenti e alla perpetuazione
Giorn Gastr Epatol Nutr Ped 2015;VII:172-176
RECENT ADVANCE IN BASIC SCIENCE
HMGB1 nell’infiammazione intestinale
dell’infiammazione intestinale 2. In seguito all’attivazione
dei PRRs la risposta immunitaria innata, per essere perpetuata, si avvale di specifiche
molecole endogene, chiamate
“allarmine” o DAMPs (da “Damage Associated Molecular
Pattern”). Queste ultime sono
normalmente presenti nella
cellula e vengono rilasciate
nella matrice extracellulare durante infezioni, stress cellulare
o danno tissutale e in tal modo
attivano il sistema immunitario.
Una proteina nucleare, high
mobility group-box1 (HMGB1),
è stata oggetto di particolare
attenzione nelle sue funzioni di
“allarmina” essendo coinvolta nella risposta infiammatoria
dovuta o meno ad infezioni.
HMGB1 è una proteina di 25
kDa con funzioni di citochina
proinfiammatoria espressa abbondantemente in molti tipi di
cellule ed altamente preservata 3. Tale proteina fu originariamente scoperta come proteina
nucleare. È stato però dimostrato che in condizioni infiammatorie, ad esempio in presenza di LPS, TNFalfa, IL-1, IL-6 e
IL-8, o in caso di danno tissutale, HMGB1 è attivamente rilasciata dalle cellule del sistema immunitario nella matrice
extracellulare, dove si comporta come citochina proinfiammatoria 3. Dopo essere
stata secreta forma complessi
infiammatori con ssDNA, LPS,
IL-1beta e nucleosomi, che
interagiscono rispettivamente con i recettori TLR9, TLR4,
IL1R e TLR2 coinvolti nella risposta immunitaria innata 3.
In tal modo HMGB1 extracellulare induce la produzione di
mediatori dell’infiammazione,
amplificando quindi tale condizione (Fig. 1).
Attualmente HMGB1 è considerata un potente mediatore
infiammatorio ed è implicata
in diverse patologie infiammatorie e di tipo auto-immune,
come la sepsi, l’artrite reumatoide, il lupus eritematoso, le
miositi e, come dimostrato dai
nostri studi, le IBD 4. Alcuni dati
in letteratura riportano inoltre,
sempre in riferimento al tratto
gastrointestinale, che HMGB1
altera la permeabilità della
barriera intestinale 5, e che, in
modelli murini di coliti indotte
chimicamente, il trattamento
con anticorpi policlonali antiHMGB1 è in grado di ridurre
l’infiammazione 6.
Viste le specifiche proprietà
della proteina, il nostro gruppo
di ricerca, storicamente inte-
ressato allo studio della patogenesi delle IBD, ha rivolto la
sua attenzione allo studio del
ruolo di HMGB1 in queste patologie.
Dati ottenuti nei nostri laboratori hanno mostrato per la
prima volta che HMGB1 è
secreta da tessuti intestinali
umani infiammati prelevati da
pazienti pediatrici affetti da
IBD 4. HMGB1 risulta significativamente aumentata nelle
feci di una coorte di pazienti
pediatrici con IBD, rispetto ai
controlli sani (Fig. 2). Pertanto
tale proteina può essere considerata come un nuovo marker
di infiammazione intestinale da
valutare in campioni fecali 4.
Nello studio è emerso inoltre
che i livelli endogeni di HMGB1
nei tessuti dei pazienti non
erano aumentati né a livello
Figura 1.
HMGB1 è una “damage associated molecular pattern molecule”
(DAMP).
173
R. Vitali et al.
a
b
Figura 2.
HMGB1 è presente nelle feci di pazienti affetti da IBD. I livelli di HMGB1 risultano significativamente aumentati nelle feci di pazienti affetti da malattia di Crohn e Colite Ulcerosa rispetto ai controlli sani. (a) I
campioni sono mostrati in accordo con il grado di severità di malattia. (B) L’analisi densitomentrica mostra che HMGB1 è fortemente aumentata nelle feci di pazienti con IBD (p < 0.001) rispetto ai controlli sani.
proteico né a livello di mRNA,
dimostrando che l’aumento
di HMGB1 fecale ritrovato nei
pazienti è causato da una aumentata secrezione della stessa a carico della mucosa intestinale infiammata 4. L’efficacia
di HMGB1 come biomarcatore
di infiammazione intestinale è
stata testata attraverso l’analisi di correlazione tra i livelli
di HMGB1 e quelli di Calprotectina (usata di routine come
marcatore di infiammazione) in
campioni fecali di pazienti pediatrici e adulti affetti da IBD,
che ha dimostrato l’esistenza
174
di una correlazione positiva tra
i due bio-marcatori (dati non
pubblicati).
Studi successivi sono stati
volti ad indagare se l’inibizione di HMGB1 potesse essere
una valida strategia per ridurre l’infiammazione intestinale.
L’inibizione di HMGB1 è stata quindi ottenuta con il Dipotassio Glicirrizinato (DPG),
una molecola naturale estratta dalla radice della liquirizia
che si è dimostrata capace di
inibire l’attività citochinica di
HMGB1 7. In un modello murino di colite indotta chimica-
mente mediante il destran-solfato (DSS), il trattamento con il
DPG è in grado di ridurre l’infiammazione intestinale conducendo ad una significativa
riduzione della severità della
colite (Fig. 3A) 8. In particolare,
in campioni murini di mucosa
colonica in cui è stata indotta la colite, il trattamento con
DPG riduce considerevolmente l’espressione delle principali
citochine
pro-infiammatorie
quali: TNF-alpha, IL-1beta e
IL-6 (Fig. 3B) 8, e modula lo
stress ossidativo riducendo
l’espressione di enzimi chiave
RECENT ADVANCE IN BASIC SCIENCE
HMGB1 nell’infiammazione intestinale
a
Figura 3A.
IL trattamento con DPG riduce la severità delle coliti murine chimichiamente indotte. Topi del ceppo
C57BL/6 in cui la colite era indotta mediante DSS, sono stati trattati con due dosi di DPG (3 e 8 mg/Kg)
per 7 giorni. Lo score clinico totale è stato analizzato (consistenza delle feci, presenza di sangue nelle feci
e aspetto generale) e risulta notevolmente diminuito in seguito al trattamento con DPG.
B
Figura 3B.
DPG riduce l’espressione degli mRNA delle seguenti citochine pro-infiammatorie: TNF-alpha, IL-1beta
IL-6 nei tessuti infiammati di topi trattati con DSS. I dati rappresentano l’espressione del gene target, analizzato meriante real-time PCR, normalizzato rispetto al gene di riferimento. UN, animali non trattati; DSS,
destran-solfato; DPG, Dipotassio Glicirrizinato. ** p=0.001.
di questa via di segnale (iNOS
e COX-2) 9. Parallelamente, i
livelli di HMGB1, che risultano
elevati nelle feci di topi affetti da colite indotta mediante
DSS, sono fortemente ridotti
nelle feci in seguito al trattamento con DPG 8. Utilizzando
dosi crescenti di DSS, per indurre coliti di diversi gradi di
gravità, è emerso che HMGB1
fecale aumenta proporzionalmente all’aumentare della
dose di DSS, mostrando che
la proteina consente di differenziare una infiammazione severa da una forma sub-clinica.
Inoltre i livelli di HMGB1 fecale
si normalizzano, tornando ai livelli dei controlli sani, in caso
di completa guarigione della
mucosa intestinale ottenuta in
seguito alla sospensione del
trattamento con l’induttore chimico (DSS) 10. In accordo con
questa evidenza, in pazienti af-
fetti da IBD, il livello di HMGB1
fecale correla positivamente
con gli indici endoscopici delle
malattie (“Simple Endoscopic
Score” per la malattia di Crohn
[SES-CD] e “Mayo Score Endoscopico” per la Colite Ulcerosa) 10.
Gli studi sinora condotti dimostrano quindi che HMGB1
è un protagonista attivo
dell’infiammazione a carico della mucosa intestinale
175
R. Vitali et al.
e rappresenta pertanto un
buon candidato come target
di terapia per le patologie infiammatorie intestinali. Inoltre
l’HMGB1 fecale costituisce
un biomarcatore non invasivo
per le IBD, in grado di distinguere tra infiammazione intestinale clinicamente evidente
e subclinica, consentendo di
suggerirne l’uso per monitorare il decorso della malattia
e valutare la risposta alla terapia nelle malattie infiammatorie intestinali.
Bibliografia
Sartor RB. Mechanisms of disease: pathogenesis of Crohn’s disease and ulcerative colitis. Nat
1
ed cancer. Biochem Biophys Res
Commun 2007;360:394-400.
Clin Pract Gastroenterol Hepatol
2006;3:390-407.
2
Yamamoto-Furusho JK. Genetic factors associated with the development
of inflammatory bowel disease. World
J Gastroenterol 2007;13:5594-7.
Bianchi ME. HMGB1 loves company. J Leukoc Biol 2009;86:573-6.
3
Vitali R, Stronati L, Negroni A, et
al. Fecal HMGB1 is a novel marker
of intestinal mucosal inflammation in pediatric inflammatory bowel disease. Am J. Gastroenterol
2011;106:2029–40.
Mollica L, De Marchis F, Spitaleri
A, et al. Glycyrrhizin binds to High-Mobility Group Box 1 protein
and inhibits its cytokine activities.
Chem Biol 2007;14:431-41.
7
Vitali R, Palone F, Cucchiara S, et
al. Dipotassium glycyrrhizate inhibits HMGB1-dependent inflammation and ameliorates colitis in
mice. PLoS One 2013;8:e66527.
8
4
5
6
Sappington PL, Yang R, Yang H,
et al. HMGB1 B box increases the
permeability of Caco-2 enterocytic
monolayers and impairs intestinal
barrier function in mice. Gastroenterol 2002;123:790-802.
Maeda SY, Hikiba W, Shibata T, et
al. Essential roles of high-mobility
group box 1 in the development of
murine colitis and colitis-associat-
Vitali R, Palone F, Pierdomenico
M, et al. Dipotassium glycyrrhizate via HMGB1 or AMPK signaling
suppresses oxidative stress during
intestinal inflammation. Biochemical Pharmacol 2015;97:292-9.
9
Palone F, Vitali R, Cucchiara S, et
al. Role of HMGB1 as a suitable
biomarker of subclinical intestinal
inflammation and mucosal healing in patients with inflammatory
bowel disease. Inflamm Bowel Dis
2014;20:1448-57.
10
• Le malattie infiammatorie intestinali croniche (IBD, da “Inflammatory Bowel Disease”) sono disordini immuno-mediati
del tratto gastro-intestinale.
• La proteina nucleare high mobility group-box1 (HMGB1), possiede attività di citochina proinfiammatoria, ed è attual-
mente considerata un potente mediatore infiammatorio implicato in diverse patologie infiammatorie e di tipo autoimmune.
• HMGB1 fecale costituisce un biomarcatore non invasivo per le IBD.
• L’inibizione di HMGB1 risulta essere una valida strategia per ridurre l’infiammazione intestinale in modelli murini di
colite, e rappresenta pertanto un buon candidato come target di terapia per le patologie infiammatorie intestinali
umane.
176