17α-OH PROGESTERONE

17α-OH
PROGESTERONE
RIA CT
REF KS16CTN
Italiano
English
p.
p.
96
3
12
M471 – Rev. 0 – 09/2007
REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS
Reag.
Quant.
CT
2 x 48
CAL│0
1 x 3 mL
Pronti per l'uso,
Ready for use
CAL│1- 5
5 x 0.5 mL
Pronti per l'uso,
Ready for use
CONJ│I125
1 x 55 mL
Pronto per l'uso,
Ready for use
WASH
1 x 10 mL
Conc.
CTR│1
CTR│2
1 x 0.5 mL
1 x 0.5 mL
Liofili,
Lyophilized
"Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito
Internet all'indirizzo www.radim.com".
“The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our
website www.radim.com".
“Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην
ηλεκτρονική διεύθυνση www.radim.com".
“In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website
unter der Adresse www.radim.com konsultiertwerden”.
"Le mode d’emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à
l'adresse www.radim.com”.
“Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en
nuestro sitio Internet www.radim.com”.
"As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas
no nosso site Internet, ao endereço www.radim.com".
KS16CTN – 17α-OH PROGESTERONE RIA CT
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DOSAGGIO
RADIOIMMUNOLOGICO
PER
LA
DETERMINAZIONE
QUANTITATIVA DEL 17α-OH PROGESTERONE NEL SIERO O PLASMA
UMANO
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO
APPLICAZIONI CLINICHE
Il 17-α-idrossiprogesterone (17OH) è un ormone steroideo C-21 (peso molecolare: 330,3) prodotto,
a partire dal 17- α-idrossi pregnenolone, nelle ghiandole surrenali e anche nelle ovaie, nei testicoli e
nella placenta. Il 17OH viene sottoposto ad idrossilazione in posizione 11 e 21 al fine di produrre
cortisolo attraverso l’11-deossicortisolo.
Di norma, i dosaggi di 17OH nel liquido amniotico o nel siero sono rilevanti ai fini della diagnosi di
iperplasia surrenale congenita (CAH). La CAH è dovuta a un deficit di un enzima specifico (sono
stati descritti ben sei diversi deficit enzimatici). In conseguenza di tali carenze si genera un
aumento di ACTH che dà luogo a iperplasia surrenale, con relativo incremento di numerosi
precursori steroidei. Tuttavia è anche molto importante conoscere il valore di 17OH nei pazienti
affetti da varicocele. Il 17OH ed il testosterone rappresentano gli indicatori del funzionamento delle
cellule di Leydig e, in pazienti di sesso maschile in età avanzata, il livello di 17OH indica la
presenza di ipertrofia prostatica benigna (BPH) e di carcinoma della prostata (PCA). Nei gruppi
PCA e BPH il livello di 17OH nel plasma risulta notevolmente più basso rispetto a quello riscontrato
in uomini in condizioni normali.
Esistono altre patologie che richiedono la determinazione del 17OH e tra queste figurano le
situazioni di infertilità maschile, di ragazze con virilizzazione prepuberale, di bambini con dolore
surrenale prematuro: in tali casi i valori di 17OH risultano aumentati in assenza o a seguito di una
stimolazione con ACTH.
PRINCIPIO DEL METODO
Una quantità definita di 17OH Progesterone marcata con I125 compete con il 17OH Progesterone
presente nei calibratori e nei campioni per un numero definito di siti di un anticorpo adsorbito sulla
superficie interna di provette di polistirene. Poiché l’anticorpo è altamente specifico, non è
necessario eseguire estrazioni o separazioni cromatografiche. Dopo 3 ore di incubazione a 37°C la
reazione di competizione viene interrotta per aspirazione della miscela di reazione. Le provette
vengono, quindi, lavate con tampone di lavaggio diluito e aspirate. La concentrazione di 17OH
Progesterone nei campioni viene calcolata per interpolazione sulla curva di calibrazione.
REAGENTI CONTENUTI NEL KIT
Il kit 17α-OH PROGESTERONE RIA CT contiene reagenti sufficienti per 96 determinazioni. Ogni
kit contiene i seguenti reagenti:
1 - Provette Sensibilizzate CT
2x48 provette sensibilizzate con anticorpo anti-17OH Progesterone. Pronte per l’uso.
2 - Coniugato Radioattivo CONJ│I125
1 flacone da 55 mL contenente 17α-OH Progesterone marcato con I125 (grado HPLC), in
tampone fosfato/acido citrico con BSA. Conservante: NaN3 (<0.1%).
Contenuto di radioattività: 190 KBq. Pronto per l’uso.
Questo kit contiene l125 (emivita: 60 giorni), il quale emette radiazioni ionizzanti di tipo X (28
keV) e γ (35.5 keV).
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3 - Calibratori CAL
CAL 0: 1 flacone (3 ml) di Calibratore 0 in siero umano. Conservante: NaN3 (0.5%). Pronto per
l’uso.
CAL 1-5: 5 flaconi (0.5 ml) di calibratori per 17α-OH Progesterone in siero umano. Le
concentrazioni esatte dei calibratori sono riportate sulle etichette dei flaconi. Conservante: NaN3
(0.5%). Pronti per l’uso.
Nota: Usare il CAL 0 per le diluizioni dei sieri.
4 - Soluzione di Lavaggio (concentrata 70x) WASH
1 flacone (10 ml) di Soluzione di Lavaggio (Tris-HCl) concentrata 70x. Preparare la quantità
necessaria di soluzione di lavoro del tampone di lavaggio aggiungendo 69 parti di acqua
distillata ad 1 parte di tampone di lavaggio concentrato (70x). Usare un agitatore magnetico per
rendere la soluzione omogenea. La soluzione di lavoro inutilizzata deve essere eliminata al
termine della giornata.
5 - Siero di Controllo CTR
2 flaconi di controlli (liofili) in siero umano con timolo. Ricostituire i controlli con 0.5 ml di acqua
distillata.
Il range dei sieri di controllo è riportato sull’etichetta dei flaconi.
CONSERVAZIONE E SCADENZA DEI REATTIVI
- I reattivi non utilizzati sono stabili a 2-8°C fino alla data di scadenza riportata su ciascuna
etichetta.
- Dopo ricostituzione i controlli sono stabili per 1 settimana a 2-8°C. Per periodi di conservazione
più lunghi suddividere in aliquote e conservare a -20°C fino a 3 mesi.
- La soluzione di lavoro del tampone di lavaggio deve essere preparata fresca ogni volta e usata
nello stesso giorno della preparazione.
- Dopo l’apertura del flacone il Coniugato Radioattivo è stabile fino alla data di scadenza
riportata sull’etichetta, se conservato a 2-8°C nel flacone originale ben chiuso.
- Alterazioni dell’aspetto fisico dei reattivi possono indicare una loro instabilità o deterioramento.
MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO
• Acqua distillata
• Pipette per dispensare 25 μl, 500 μl e 3 ml (si raccomanda di utilizzare pipette di precisione
con puntali in plastica monouso).
• Agitatore tipo vortex
• Agitatore magnetico
• Bagno termostatato a 37°C
• Pipetta a ripetizione automatica da 5 ml per i lavaggi
• Contatore gamma in grado di misurare I125 (efficienza minima: 70%).
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MATERIALE RADIOATTIVO
Radionuclide presente: I125
INFORMATIVA (D.Lgs. 230/95 – D.Lgs. 241/00 art. 19) E NORME DI SICUREZZA E
PREVENZIONE
Per ottenere risultati corretti e riproducibili è necessario osservare le seguenti norme:
− Non mescolare reagenti di lotti differenti.
− Non usare i reagenti dopo la data di scadenza.
− Non esporre i reattivi e i campioni a calore intenso o a sorgenti di inquinamento.
− Usare vetreria perfettamente pulita ed esente da contaminazioni di ioni metallici o sostanze
ossidanti.
− Usare acqua distillata o deionizzata, conservata in recipienti perfettamente puliti.
− Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile usare pipette
con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo.
− Non modificare in alcun modo il Procedimento Operativo di esecuzione del test. Eventuale
non rispetto di:
•
sequenza e quantità nell’aggiunta dei reattivi
•
tempi e temperatura di incubazione
può dare luogo a risultati clinici errati.
− Ricostituire i reagenti liofili secondo le modalità descritte sulle etichette. Eventuale utilizzo di
reattivi o volumi non idonei può dar luogo a dati clinici non attendibili.
− In caso di procedura manuale è importante l’utilizzo di pipette calibrate e l’acquisizione di
un’adeguata manualità tecnica. In particolare è essenziale una buona precisione nella
preparazione e dispensazione dei reattivi. E’ necessario un adeguato piano di
manutenzione (pulizia e calibrazione) degli strumenti di dispensazione.
− Accertarsi che tutta la strumentazione usata (vetreria, bagno termostatato, agitatore e
lavatore, contatore gamma, frigoriferi usati per la conservazione dei kit e dei campioni) sia
perfettamente funzionante, adeguatamente calibrata e sia soggetta ad un regolare piano di
manutenzione. Un uso non accurato di ognuno di questi strumenti può produrre errori
metodologici che possono condizionare la riproducibilità e l’affidabilità dei risultati ottenuti.
− Utilizzare un adeguato metodo per la corretta identificazione dei campioni. Possibili
conseguenze possono essere sia la perdita di specificità del dispositivo che risultati analitici
errati.
Con lo scopo di ridurre i rischi di tipo fisico, biologico e chimico, è necessario osservare
le seguenti norme di sicurezza:
− Utilizzare dispositivi di protezione individuale (es.: guanti monouso, camice, ecc.) durante la
manipolazione di materiale radioattivo e/o potenzialmente infetto e durante il dosaggio.
− Non pipettare i reagenti con la bocca.
− Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio.
− La manipolazione di sostanze radioattive deve essere eseguita in aree specificamente
predisposte.
− Le sostanze radioattive devono essere conservate nei loro contenitori originali in un’area
specificamente predisposta.
− E’ necessario compilare un registro che indichi dettagliatamente l’ingresso, la conservazione
e l’eliminazione di tutto il materiale radioattivo ricevuto.
− E’ necessario eliminare immediatamente qualunque contaminazione radioattiva secondo le
procedure stabilite.
− I materiali di origine umana utilizzati nella preparazione del presente kit sono stati testati per
la presenza di HBsAg, anti-HIV e anti-HCV e sono risultati ripetutamente negativi.
Comunque nessun test attualmente disponibile garantisce l'assenza degli agenti virali
responsabili della sindrome da immunodeficienza acquisita, dell'epatite B ed epatite C. Tutti
i reagenti contenenti materiale biologico e tutti i campioni di siero umano devono essere
considerati potenzialmente infettivi.
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−
−
−
−
−
Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; qualora ciò si verificasse ripulire
accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato
per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo
le modalità opportune.
La sodio azide contenuta come conservante in alcuni reagenti può reagire con il piombo ed
il rame delle tubature formando azidi di metallo altamente esplosive. Per evitare la
formazione e l'accumulo di tali composti far scorrere abbondante acqua durante
l’eliminazione dei reagenti.
Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del 05.02.97, che fa riferimento alle direttive CEE
(91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE), tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in
automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER
180103 (rifiuti infetti o potenzialmente infetti); devono quindi essere eliminati affidandoli a
ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento.
Tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni con radioisotopi devono essere smaltiti affidandoli a
ditte autorizzate al ritiro in accordo a quanto previsto nel D.Lgs. 241/2000.
L'acquisto, la detenzione, l'impiego e lo smaltimento di materiale radioattivo (sia solido che
liquido) sono soggetti alle disposizioni locali previste dalle autorità legislative.
¾ La quantità di radioattività alla data di riferimento è specificata nell’etichetta esterna
del kit.
RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
- Conservare i campioni di siero o plasma a 2-8°C.
- Se il dosaggio non viene effettuato entro 48 ore dal prelievo si raccomanda di conservare i
campioni a -20°C.
- Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento dei campioni.
- Il siero ed il plasma con eparina forniscono risultati simili (evitare i campioni con plasmacitrato):
Y (Siero) = 0.92 x (plasma-eparina) + 0.10
-
r = 1.0
n = 18
Il plasma-EDTA fornisce valori mediamente più bassi del 15% rispetto al siero e al plasma con
eparina:
Y (Siero) = 1.16 x (plasma-EDTA) – 0.10
r = 0.99
n = 18
PROCEDURA DI DOSAGGIO
•
•
•
Prima dell’uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente.
Mescolare delicatamente i reattivi e i campioni per inversione o rotazione.
Allestire una curva di calibrazione per ogni seduta analitica, in quanto non è possibile utilizzare
per un dosaggio dati provenienti da sedute analitiche precedenti.
1.
Predisporre ed etichettare il numero di provette sensibilizzate necessarie per dosare in
duplicato ogni calibratore, campione o controllo. Preparare due provette non sensibilizzate per
la determinazione dell’attività totale.
2.
Agitare brevemente su vortex calibratori, campioni e controlli. Dispensare 25 μl di ciascun
calibratore, campione e controllo nelle rispettive provette.
3.
Dispensare 500 μl di Coniugato Radioattivo in tutte le provette, comprese quelle per l’attività
totale.
4.
Scuotere delicatamente il portaprovette per eliminare eventuali bolle d’aria intrappolate nel
liquido contenuto nelle provette.
5.
Incubare 3 ore a 37°C.
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6.
Aspirare (o decantare) il liquido contenuto in tutte le provette, tranne quelle per l’attività totale,
facendo attenzione che il puntale dell’aspiratore raggiunga il fondo delle provette e che aspiri
tutto il liquido.
7.
Lavare tutte le provette, tranne quelle per l’attività totale, con 3 ml di soluzione di lavoro del
tampone di lavaggio, evitando la formazione di schiuma.
8.
Lasciare decantare le provette in posizione verticale per 2 minuti circa ed aspirare eventuali
gocce di liquido residue.
9.
Contare tutte le provette per 1 minuto con il contatore gamma.
SCHEMA DEL DOSAGGIO: vedi pag. 23
CALCOLO DEI RISULTATI
1.
2.
Calcolare la media delle determinazioni in duplicato.
Calcolare il rapporto (rapporto di competizione) tra la radioattività legata alle provette di
calibratori, campioni e controlli (B) e la radioattività legata alle provette del Calibratore 0
(B0).
cpm (calibratori, campioni o controlli)
B/Bo (%) =
X 100
cpm (Calibratore 0)
3.
4.
5.
6.
Usando carta semilogaritmica a 3 cicli o logit-log e ponendo in ordinata i rapporti di
competizione B/B0(%) per ogni calibratore e in ascissa le rispettive concentrazioni di 17αOH Progesterone, tracciare la curva di calibrazione. Scartare i valori palesemente
discordanti.
Per costruire la curva di calibrazione è possibile utilizzare un sistema di interpolazione dati
automatizzato. In caso di utilizzo di un sistema automatico di interpolazione si raccomanda
di usare la curva a 4 parametri logistici.
Per interpolazione dei valori B/B0(%) di campioni e controlli sulla curva di calibrazione,
determinare le rispettive concentrazioni di 17α-OH Progesterone.
Per ogni dosaggio determinare la capacità legante B0/T.
DATI RAPPRESENTATIVI
I dati riportati nella tabella sottostante sono forniti a titolo di esempio e non devono essere utilizzati
al posto della curva di calibrazione realmente ottenuta per calcolare le concentrazioni di 17α-OH
Progesterone in campioni e controlli.
17α-OH Progesterone RIA CT
Attività totale
Calibratore
cpm
B/Bo (%)
48579
0.00
0.15
0.53
1.02
3.10
11.10
ng/ml
ng/ml
ng/ml
ng/ml
ng/ml
ng/ml
19831
15587
10398
7074
2930
1028
100.0
78.6
52.4
35.7
14.8
5.2
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CARATTERISTICHE DI PERFORMANCE E LIMITI DEL TEST
A. Limite di rilevazione
Il limite di rilevazione del test, definito come la concentrazione apparente calcolata
dall’interpolazione della media meno due deviazioni standard di 20 replicati del Calibratore 0, è
risultata essere 0,02 ng/ml.
B. Specificità
La specificità è stata calcolata aggiungendo ad un pool di campioni di 17α-OH Progesterone (±
0.5 ng/ml) gli steroidi che potrebbero essere presenti nel campione del paziente.
Composto
Quantità aggiunta
(ng/ml)
Cross-Reattività
(%)
500
1000
1000
500
500
500
500
2500
5000
5000
5000
100
0.7
0.3
0.5
0.022
0.5
ND
0.035
0.008
ND
0.001
0.001
17OH-Progesterone
Progesterone
17-α-idrossipregnenolone
21-deossicortisolo
Pregnenolone
11-deossicortisolo
Corticosterone
11-deossicorticosterone
Cortisolo
Testosterone
Androstenedione
Estradiolo
C. Precisione
RIPETIBILITÁ
RIPRODUCIBILITÁ
(INTRA-SAGGIO)
(INTER-SAGGIO)
Siero
N
<X> ± DS
(ng/ml)
CV
(%)
Siero
N
<X> ± DS
(ng/ml)
CV
(%)
A
B
C
10
10
10
0.43 ± 0.03
2.35 ± 0.13
7.55 ± 0.38
6.2
5.6
5.1
A
B
20
20
0.77 ± 0.07
1.97 ± 0.10
9.2
5.2
DS: Deviazione Standard; CV: Coefficiente di Variazione
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D. Accuratezza
TEST DI DILUIZIONE
Campione
Diluizione
Concentrazione
teorica
(ng/ml)
Concentrazione
misurata
(ng/ml)
1
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1.92
0.96
0.48
0.24
3.83
2.16
1.13
0.53
0.25
2
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
3.33
1.66
0.83
0.42
6.65
3.32
2.12
0.88
0.39
I campioni sono stati diluiti con Calibratore 0.
TEST DI RECUPERO
Campione
17OH aggiunto
(ng/ml)
17OH recuperato
(ng/ml)
Recupero
(%)
1
6.65
5.17
2.93
1.25
0.92
6.10
4.32
2.69
1.22
0.87
92
84
92
98
95
2
7.37
5.90
3.60
2.01
1.69
7.23
5.78
3.57
2.14
1.65
98
98
99
107
98
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Fattore di conversione:
Da ng/ml a nmol/L : x 3.03
Da nmol/L a ng/ml : x 0.33
Al momento non risulta disponibile alcuna preparazione di riferimento internazionale per
questo parametro.
Metodo di riferimento: 50 campioni di siero di pazienti (valori compresi tra 0.3 ng/ml e 10.0
ng/ml) sono stati dosati insieme al metodo di riferimento con trizio. L’analisi di regressione
lineare risulta piuttosto soddisfacente.
17α-OH Progesterone RIA CT = 0.99 (riferimento H3) + 0.06 ng/ml
r = 0.96
E. Tempo intercorso tra l’aggiunta dell’ultimo calibratore e il campione
Come mostrato nella seguente tabella, il dosaggio si mantiene accurato anche quando un
campione viene dispensato nelle provette sensibilizzate 36 minuti dopo l’aggiunta dell’ultimo
calibratore.
TEMPO TRASCORSO
Siero
(ng/ml)
0'
12'
24'
36'
Siero 1
Siero 2
Siero 3
Siero 4
Siero 5
Siero 6
0.50
0.86
1.22
1.86
3.29
4.52
0.58
0.86
1.25
1.90
3.70
4.76
0.56
0.93
1.24
1.93
3.46
5.18
0.56
0.83
1.26
1.93
3.48
4.65
CONTROLLO DI QUALITA’ INTERNO
-
-
La percentuale della capacità legante B0/T deve risultare > 25%.
Se i risultati ottenuti dosando il Controllo 1 e/o il Controllo 2 non rientrano nei limiti riportati
sull’etichetta dei flaconi non è opportuno utilizzare i risultati ottenuti, a meno che non vi sia
una spiegazione soddisfacente della discrepanza rilevata.
Ogni laboratorio può preparare un proprio pool di sieri da utilizzare come controllo, da
conservare congelato in aliquote. Non congelare e scongelare un’aliquota più di due volte.
I criteri di accettazione per le differenze riscontrate tra i risultati in duplicato dei campioni
devono basarsi sulla buona prassi di laboratorio.
KS16CTN – 17α-OH PROGESTERONE RIA CT
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INTERVALLI DI RIFERIMENTO
Questi valori sono puramente indicativi, ciascun laboratorio potrà stabilire i propri range di valori
normali.
Intervallo concentrazione
- dal 2.5 al 97.5% percentili (ng/ml)
Numero di
soggetti
Maschi normali
0.59 – 3.44
72
Femmine normali
- Fase follicolare
- Fase luteinica
0.11 - 1.08
0.95 - 5.00
48
49
2.50 – 9.78
3.40 – 8.50
4.53 – 18.86
43
31
35
Gravidanza
- Primo trimestre
- Secondo trimestre
- Terzo trimestre
LEGENDA SIMBOLI: vedi pag. 20
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RADIOIMMUNOASSAY FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF 17α-OH
PROGESTERONE IN HUMAN SERUM OR PLASMA
FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY
CLINICAL APPLICATION
17-α-hydroxyprogesterone (17OH) is a C-21 steroid hormone (molecular weight 330.3) which is
produced from 17-α-hydroxy pregnenolone in the adrenals and also in the ovaries, testes and
placenta. 17OH is hydroxylated at 11 and 21 positions to produce cortisol via 11-deoxycortisol.
As a rule, serum or amniotic fluid 17OH dosages are relevant to diagnose congenital adrenal
hyperplasia (CAH). This CAH is due to a specific enzyme defect (six distinct enzyme deficiencies
have been described). As a result of these deficiencies, ACTH increases and produces adrenal
hyperplasia and the raise of many steroid precursors. But it is also very interesting to know the
value of 17OH in patients with varicocele. (17OH and testosterone represent markers of Leydig cell
function) and in ageing male patients to detect Benign Prostatic Hypertrophy (BPH) and carcinoma
of the prostate (PCA) (plasma 17OH is significantly lower in PCA and BPH groups than in normal
men).
There are other domains for 17OH investigations as: male infertility, girls with peripubertal
virilization, children with premature adrenache (in these cases, the values of 17OH are increased
without or after ACTH stimulation).
PRINCIPLE OF THE ASSAY
A fixed amount of 125I labelled steroid competes with the steroid to be measured present in the
sample or in the calibrator for a fixed amount of antibody sites immobilized on the wall of a
polystyrene tube. Neither extraction nor chromatography is required because of the high specificity
of the coated antibodies. After 3 hours incubation at 37°C, an aspiration step terminates the
competition reaction. The tubes are then washed with 3 ml of washing solution and aspirated. A
calibration curve is plotted and the 17OH concentrations of the samples are determined by dose
interpolation from the calibration curve.
REAGENTS PROVIDED WITH THE KIT
The 17α-OH PROGESTERONE RIA CT kit contains sufficient reagents for 96 determinations.
Each kit contains the following reagents:
1 - Coated Tubes CT
2x48 tubes coated with anti 17α-OH Progesterone. Ready to use.
2 - Radioactive Conjugate CONJ│I125
1 bottle (55 ml) containing [I-125]-labelled 17α-OH Progesterone (HPLC grade) in
phosphate/citric acid buffer with bovine serum albumin. Preservative: NaN3 (<0.1%).
Radioactivity contents: 190 kBq. Ready to use.
This kit contains 125I (half life: 60 days), emitting ionizing X (28 keV) and γ (35.5 keV) radiations.
3 - Calibrators CAL
KS16CTN – 17α-OH PROGESTERONE RIA CT
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CAL 0: 1 vial (3 ml) of Calibrator 0 in human serum. Preservative: NaN3 (0.5%). Ready to
use.
CAL 1-5: 5 vials (0.5 ml) of calibrators for 17α-OH Progesterone in human serum. See exact
values stated on vial labels. Preservative: NaN3 (0.5%). Ready to use.
Note: Use CAL 0 for sera dilutions.
4 - Wash Solution (70X concentrated) WASH
1 vial (10 ml) of Wash solution (Tris-HCl) 70x concentrated. Prepare an adequate volume of
Working Wash solution by adding 69 volumes of distilled water to 1 volume of Wash Solution
(70x). Use a magnetic stirrer to homogenize. Discard unused Working Wash solution at the
end of the day.
5 - Control Serum CTR
2 vials of controls (lyophilised) in human serum with thymol. Reconstitute the controls with 0.5
ml of distilled water.
The range of control sera is printed on the vials label.
STORAGE AND EXPIRATION DATING OF REAGENTS
- Before opening or reconstitution, all kits components are stable until the expiry date, indicated
on the label, if kept at 2 to 8°C.
- After reconstitution, controls are stable for one week at 2 to 8°C. For longer storage periods,
aliquots should be made and kept at -20°C for 3 months.
- Freshly prepared Working Wash solution should be used on the same day.
- After its first use, Radioactive Conjugate is stable until expiry date, if kept in the original wellclosed vial at 2 to 8°C.
- Alterations in physical appearance of kit reagents may indicate instability or deterioration.
MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED
• Distilled water
• Pipettes for delivery of 25 µl, 500 µl and 3 ml (the use of accurate pipettes with disposable
plastic tips is recommended)
• Vortex mixer
• Magnetic stirrer
• Water bath at 37°C
• 5 ml automatic syringe for washing
• Aspiration system (optional)
• Any gamma counter capable of measuring 125I may be used (minimal yield 70%).
RADIOACTIVE MATERIAL
Radionuclide: 125I
ITALIAN DECREES (D.Lgs. 230/95 – D.Lgs. 241/00 art. 19) AND RULES OF PREVENTION
AND SECURITY
In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must be observed:
− Do not mix reagents of different lots.
− Do not use reagents beyond their expiry date.
− Do not store or leave reagents and samples at high temperatures or areas of possible
contamination.
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M471 – Rev. 0 – 09/2007– Pag. 13/24
−
−
−
−
−
−
−
−
Use thoroughly clean glassware, free from metal ion contamination or oxidizing substances.
Use distilled or deionized water, stored in perfectly clean containers.
Carefully avoid any contamination among samples; for this purpose, disposable tips should
be used for each sample and reagent.
Do not modify in any way the "Assay Procedure". Altering
• volume of reagent added
• exact temperature and incubation times
may cause incorrect clinical results.
Reconstitute lyophilized reagents as described on the relative labels. Any deviation in
reagent use or wrong volumes may affect the reliability of results obtained.
In case of manual procedure, it is important to use calibrated pipettes and have appropriate
technical manuals. It is important to prepare and dispense the reagents accurately. Ensure
that all the equipment used is in perfect working order, has been correctly calibrated and is
regularly maintained.
Ensure that all the equipment used (glassware, incubators, shakers, tube washers, gamma
counter and fridge/freezers used for reagents and samples storage) is in perfect working
order, has been correctly calibrated and is regularly maintained. Any deviation from the
correct use of the equipment listed can produce errors in the methodology, this may affect
the reproducibility and reliability of results obtained.
Utilise a suitable method for the correct identification of patient samples. Incorrect
identification may cause a specificity losses of the system and wrong clinical results.
In order to reduce physical, biological and chemical risks, the following precautions
must be observed:
− Use protective individual articles (ex.: disposable gloves, lab coats, etc.) while handling
radioactive materials and/or potentially infectious material as well as during the assay.
− Do not pipette reagents by mouth.
− Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay.
− All radiological work should be done in a designated area.
− Radioactive materials should be stored in their original container in a designated area.
− A record book for logging receipt and disposal of all radioactive materials should be kept.
− Any radioactive spills should be taken care of immediately in accordance with established
procedures.
− All material of human origin used for the preparation of this kit was tested negative for
HBsAg, anti-HIV and anti-HCV. Since no test at present can guarantee complete absence of
these viruses, all samples and reagents containing biological material used for the assay
must be considered potentially infectious.
− Avoid splashing and aerosol formation; in such cases, carefully wash with a 3% sodium
hypochlorite solution. Any cleaning material used for that purpose must be treated as
potentially infectious and disposed accordingly.
− The sodium azide used as preservative in some reagents may react with lead and copper
plumbing; to prevent build-up of explosive metal azides, the reagents should be discarded
by flushing the drain with large amounts of water.
− According to Italian decree D.L. no. 22 dated 05.02.97, in compliance with EEC directives
(91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all waste products originating from either manual
and/or automated processing are classified as hazardous special waste material (European
classification code 180103, infectious waste or potentially infectious waste). As such, they
must be eliminated (by) delegating them to special enterprises (companies), qualified for
waste collection and disposal.
− All radioactive waste originating from either manual and/or automated processing, must be
eliminated delegating them to special enterprises, qualified for waste collection and
disposal, according to D.Lgs.241/2000.
KS16CTN – 17α-OH PROGESTERONE RIA CT
M471 – Rev. 0 – 09/2007– Pag. 14/24
−
Acquisition, storage, use and disposal of radioactive material (liquid and solid) are subjected
to regulation and ordination of local authorities.
¾ Radioactivity contents to the reference date is shown on the kit external label.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
-
Serum or plasma samples must be kept at 2-8°C.
If the test is not run within 48 hrs., storage at -20°C is recommended.
Avoid successive freezing and thawing.
Serum and heparinized plasma provide similar results (avoid citrate samples):
Y (Serum) = 0.92 x (hep. plasma) + 0.10
r = 1.0
n = 18
- EDTA plasma provides 15% lower results than serum and heparinized plasma:
Y (Serum) = 1.16 x (EDTA plasma) - 0.10
r = 0.99 n = 18
PROCEDURE
•
Bring all the reagents to room temperature prior to use.
•
Thoroughly mix all reagents and samples by gentle agitation or swirling.
•
Prepare a calibration curve for each run, do not use data from previous runs.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Label coated tubes in duplicate for each calibrator, sample and control. For the determination
of total counts, label 2 normal tubes.
Briefly vortex calibrators, samples and controls and dispense 25μl of each into respective
tubes.
Dispense 0.5 ml of Radioactive Conjugate into each tube, including the uncoated tubes for
total counts.
Shake the tube rack gently by hand, to liberate any trapped bubbles.
Incubate for 3 hours at 37°C.
Aspirate (or decant) the content of each tube (except total counts). Be sure that the plastic tip
of the aspirator reaches the bottom of the coated tube in order to remove all the liquid.
Wash tubes with 3 ml of Working Wash solution (except total counts) and aspirate (or decant).
Avoid foaming during the addition of the Working Wash solution.
Let the tubes stand upright for two minutes and aspirate the remaining drop of liquid.
Count tubes in a gamma counter for 1 minute.
ASSAY SCHEME: see page 23
CALCULATION OF RESULTS
KS16CTN – 17α-OH PROGESTERONE RIA CT
M471 – Rev. 0 – 09/2007– Pag. 15/24
1.
2.
Calculate the mean of duplicate determinations.
Calculate the bound radioactivity as a percentage of the binding determined at the zero
calibrator point (0) according to the following formula:
Counts (calibrator, sample or control)
B/Bo (%) =
X 100
Counts (Calibrator 0)
3.
4.
5.
6.
Using a 3 cycle semi-logarithmic or logit-log graph paper, plot the B/B0(%) values for each
calibrator point as a function of the 17α-OH-progesterone concentration of each calibrator
point, reject obvious outliers.
Computer assisted methods can also be used to construct the calibration curve. If automatic
result processing is used, a 4 parameter logistic function curve fitting is recommended.
By interpolation of the sample B/B0(%) values, determine the 17α-OH-progesterone
concentrations of the samples from the reference curve.
For each assay, the percentage of total radioactive conjugate bound in the absence of
unlabelled 17α-OH-progesterone (B0/T) must be checked.
TYPICAL DATA
The following data are for illustration only and should never be used instead of the real time
calibration curve.
17α-OH Progesterone RIA CT
Total count
Calibrator
cpm
B/Bo (%)
48579
0.00
0.15
0.53
1.02
3.10
11.10
ng/ml
ng/ml
ng/ml
ng/ml
ng/ml
ng/ml
19831
15587
10398
7074
2930
1028
100.0
78.6
52.4
35.7
14.8
5.2
PERFORMANCE AND LIMITATIONS
A. Detection limit
Twenty zero calibrators were assayed along with a set of other calibrators.
The detection limit, defined as the apparent concentration two standard deviations below the
average counts at zero binding, was 0.02 ng/ml.
B. Specificity
The specificity was estimated by spiking a pool of 17OH samples (± 0.5 ng/ml) with steroids
which might be present in patient samples.
Added amount Cross-Reactivity
KS16CTN – 17α-OH PROGESTERONE RIA CT
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Compound
17OH-Progesterone
Progesterone
17-α-hydroxypregnenolone
21-deoxycortisol
Pregnenolone
11-deoxycortisol
Corticosterone
11-deoxycorticosterone
Cortisol
Testosterone
Androstenedione
Estradiol
(ng/ml)
(%)
500
1000
1000
500
500
500
500
2500
5000
5000
5000
100
0.7
0.3
0.5
0.022
0.5
ND
0.035
0.008
ND
0.001
0.001
C. Precision
REPRODUCIBILITY
(INTER-ASSAY)
REPEATABILITY
(INTRA-ASSAY)
Serum
N
<X> ± SD
(ng/ml)
CV
(%)
Serum
N
<X> ± SD
(ng/ml)
CV
(%)
A
B
C
10
10
10
0.43 ± 0.03
2.35 ± 0.13
7.55 ± 0.38
6.2
5.6
5.1
A
B
20
20
0.77 ± 0.07
1.97 ± 0.10
9.2
5.2
SD: Standard Deviation; CV: Coefficient of variation
D. Accuracy
DILUTION TEST
Serum
Dilution
Theoretical Concent.
(ng/ml)
Measured Concent.
(ng/ml)
1
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1.92
0.96
0.48
0.24
3.83
2.16
1.13
0.53
0.25
2
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
3.33
1.66
0.83
0.42
6.65
3.32
2.12
0.88
0.39
Samples were diluted with the zero calibrator.
RECOVERY TEST
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Sample
Added
17OH
(ng/ml)
Recovered
17OH
(ng/ml)
Recovered
(%)
1
6.65
5.17
2.93
1.25
0.92
6.10
4.32
2.69
1.22
0.87
92
84
92
98
95
2
7.37
5.90
3.60
2.01
1.69
7.23
5.78
3.57
2.14
1.65
98
98
99
107
98
Conversion factor:
From ng/ml to nmol/L : x 3.03
From nmol/L to ng/ml : x 0.33
To the best of our knowledge, no international reference material exists for this parameter.
Reference method: 50 patient serum samples (values from 0.3 ng/ml to 10.0 ng/ml) were
assayed along with the tritiated reference method. The linear regression analysis is quite
good.
17OH-RIA-CT = 0.99 (3H reference) + 0.06 ng/ml r = 0.96
E. Time delay between last calibrator and sample dispensing
As shown hereafter, assay results remain accurate even when a sample is dispensed 36
minutes after the calibrator has been added to coated tubes.
TIME DELAY
Serum
(ng/ml)
0'
12'
24'
36'
Serum 1
Serum 2
Serum 3
Serum 4
Serum 5
Serum 6
0.50
0.86
1.22
1.86
3.29
4.52
0.58
0.86
1.25
1.90
3.70
4.76
0.56
0.93
1.24
1.93
3.46
5.18
0.56
0.83
1.26
1.93
3.48
4.65
KS16CTN – 17α-OH PROGESTERONE RIA CT
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INTERNAL QUALITY CONTROL
-
-
The percentage of total radioactive conjugate bound in the absence of unlabelled 17α-OHprogesterone (B0/T) must be > 25%.
If the results obtained for Control 1 and/or Control 2 are not within the range specified on
the vial label, the results cannot be used unless a satisfactory explanation for the
discrepancy has been given.
If desirable, each laboratory can make its own pools of control samples, which should be
kept frozen in aliquots. Do not freeze-thaw more than twice.
Acceptance criteria for the difference between the duplicate results of the samples should
rely on Good Laboratory Practises.
REFERENCE INTERVALS
These values are given only for guidance; each laboratory should establish its own normal
range of values.
Concentration range
- 2.5 to 97.5% percentiles (ng/ml)
Number of subjects
Normal males
0.59 – 3.44
72
Normal Females
- Follicular phase
- Luteal phase
0.11 - 1.08
0.95 - 5.00
48
49
Pregnancy
- First trimester
- Second trimester
- Third trimester
2.50 – 9.78
3.40 – 8.50
4.53 – 18.86
43
31
35
SYMBOLS LEGEND: see page 20
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SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, ΣΥΜΒΟΛΑ,
SYMBOLIT, SYMBOLER
EN 980 – EDMA
REF
Codice di riferimento o di ordine / reference or order code / Référence ou numéro de
commande / referencia o número de pedido / referência ou número da encomenda / Referenz
oder Bestellnummer / κωδικός προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı /
referenční nebo objednací číslo
LOT
Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / παρτίδα / parti / šarže
Data di scadenza / expiry date / date d’expiration / Fecha de caducidad / Data de
vencimento/ Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma targhi / datum expirace
IVD
Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic in-vitro / Para uso
diagnóstico In-vitro / aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der INVITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro διαγνωστική χρήση / in –vitro diagnostik kullanım /
pro použití in-vitro
Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines
98/79/EC / marquage CE conforme aux directives IVD 98/79/EC / marcado CE según
directiva de IVD 98/79/CE / marcação-CE segundo a directriz-IVD 98/79/CE / CEMarkierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής
οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD
98/79/EU
Conservare a 2-8°C / keep at 2-8°C / conserver à 2-8°C / Conservar a 2-8°C / conservar a 28°C / Lagerung bei 2-8°C / φύλαξη στους 2-8°C / 2-8°C da saklayınız / skladovat při 2-8°C
Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante / produkt der /
κατασκευάζεται από / tarafından üretilmiştir / výrobce
Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico /
Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik/ Biologicky nebezpečné
Consultare la metodica operativa / consult instructions for use / consulter le mode opératoire
/ consultar las instrucciones de uso / consultar as instruções de uso / Schauen Sie die
Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak bilgiler
/ Sledujte návod k použití
96
Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96 déterminations / suficiente
para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί για
96 τεστ / 96 test için yeterli / dostačující pro 96 testů
RDATE Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de
refêrencia/ Referenzdatum / ημερομηνία βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční
datum
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RCNS
Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec / reconstituir con / reconstituir com /
rekonstituiren mit / ανασυστάται με / ile karıştırma / rekonstituovat
H2O
Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau deionisée ou distillée /
agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes
Wasser / απιονισμένο -απεσταγμένο νερό / deiyonize veya distile su / deionizovaná nebo
destilovaná voda
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BIBLIOGRAFIA – REFERENCES
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Plasma levels of 17-OH-progesterone and testosterone in patients with varicoceles.
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Male infertility due to congenital adrenal hyperplasia: testicular biopsy findings,
hormonal evaluation, and therapeutic results in three patients.
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Neonatal screening program for congenital adrenal hyperplasia in a homogeneous
Caucasian population.
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17-hydroxyprogesterone responses to adrenocorticotropin
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with
KS16CTN – 17α-OH PROGESTERONE RIA CT
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SCHEMA DI DOSAGGIO - ASSAY SCHEME
CAL (0-5)
Campioni/Samples, CTR
CONJ│I125
Attività Totale/
Total Activity
CAL
μl
μl
Campioni / Samples
CTR
μl
-
25
-
25
500
500
500
Incubazione/Incubation
WASH
Conteggio / Counting
3 h a/at 37°C
-
Aspirare / Aspirate
-
3.0 ml
-
Aspirare accuratamente /
Aspirate carefully
Contare le provette per 1 min./Count tubes for 1 minute
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RADIM S.p.A. - Via del Mare, 125 - 00040 Pomezia (Roma) Italia
Tel.: +39 06 91.249.1 - Fax: +39 06 91.249.443
National Order Entry: +39 06 91.249.702
Export Department: +39 06 91.249.701
Customer Care: +39 06 91.249.700
[email protected] - www.radim.com