Terreno BBL in piastra pronto per l`uso per la rilevazione di

 Terreno BBL in piastra pronto per l’uso per la rilevazione di
enterococchi con elevata resistenza a vancomicina e aminoglicosidi=
Enterococcus Screen Agar QUAD Plate with Streptomycin / Gentamicin / Vancomycin
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8809611JAA(01)
2013-08
Italiano
USO PREVISTO
Enterococcus Screen Agar è usato per testare la resistenza elevata degli enterococchi agli aminoglicosidi e alla vancomicina
e per predire il sinergismo di questi antibiotici.
SOMMARIO E SPIEGAZIONE
Gli enterococchi sono notoriamente la causa di un’ampia gamma di infezioni che di norma interessano vie urinarie, addome,
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circolo ematico, endocardio, vie biliari, ustioni e cateteri a permanenza. Enterococcus faecalis causa l’80 – 90% delle
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infezioni, mentre E. faecium è all’origine della maggior parte delle altre. Negli Stati Uniti, gli enterococchi rappresentano oggi
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la quarta causa principale di batteriemia. Le percentuali caso-fatalità per la batteriemia enterococcica vanno dal 12 al 68%,
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con morte dovuta a sepsi nel 4 – 50% dei casi.
Il trattamento delle infezioni enterococciche con sola vancomicina o penicillina non riesce a uccidere gli enterococchi, con
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conseguente recidiva dell’infezione. Da anni, è stato accertato che gli enterococchi hanno bassa resistenza intrinseca a
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svariate -lattamine e antibiotici aminoglicosidici. L’aggiunta di un aminoglicoside a cui l’isolato è risultato sensibile
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determina sinergismo in vitro e in vivo producendo un effetto battericida. Questo effetto sinergistico è attribuito al danno
provocato dalla penicillina o vancomicina all’integrità della parete cellulare, che consente all’aminoglicoside di penetrare e
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inibire la sintesi delle proteine batteriche. L’emergenza di elevati livelli di resistenza a streptomicina (≥ 2000 µg/mL),
gentamicina (≥ 500 µg/mL) e vancomicina (≥ 6 µg/mL) può determinare l’incapacità della penicillina o delle associazioni di
vancomicina e aminoglicosidi di eradicare i microrganismi infettanti. Il test della resistenza elevata a streptomicina,
gentamicina e vancomicina è pertanto importante. L’uso dell’agar infuso cuore-cervello (BHIA) contenente streptomicina
(2000 µg/mL), gentamicina (500 µg/mL) o vancomicina (6 µg/mL) è raccomandato dal Clinical and Laboratory Standards
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Institute (CLSI) per i test di resistenza elevata.
PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Brain Heart Infusion (BHI) Agar è un terreno generico adatto per la coltivazione di un’ampia gamma di microrganismi ed è
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raccomandato per il test di screening su agar per la sensibilità degli enterococchi.
I solidi dell’infuso di carne e i peptoni sono fonti di azoto organico, carbonio, zolfo, vitamine e oligoelementi. Il destrosio è una
fonte di carboidrati. Il terreno è tamponato con fosfato disodico. Streptomicina (2000 µg/mL) e gentamicina (500 µg/mL)
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vengono utilizzate per individuare la resistenza elevata agli aminoglicosidi. Per rilevare la resistenza alla vancomicina, si usa
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vancomicina a 6 µg/mL. I coloranti Food, Drug & Cosmetic (FD&C) sono inerti e vengono aggiunti per facilitare
l’identificazione degli antibiotici.
REAGENTI
Enterococcus Screen Agar
Brain Heart Infusion Agar (BHIA)
Formula approssimata* per L di acqua purificata
Infuso cuore-cervello (solidi) ...................... 8,0 g
Digerito peptico di tessuto animale ............ 5,0 g
Digerito pancreatico di caseina ................ 16,0 g
Cloruro di sodio .......................................... 5,0 g
Destrosio .................................................... 2,0 g
Fosfato disodico ......................................... 2,5 g
Agar ......................................................... 13,5 g
La sezione I contiene BHIA (controllo di crescita).
La sezione II contiene BHIA con 0,5 g/L di gentamicina e 1,02 g/L di colorante FD&C Red #40 (rosso n. 40).
La sezione III contiene BHIA con 6,0 mg/L di vancomicina e 0,56 g/L di colorante FD&C Yellow #5 (giallo n. 5).
La sezione IV contiene BHIA con 2,0 g/L di streptomicina e 0,4 g/L di colorante FD&C Blue #1 (blu n. 1).
*Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di performance.
Avvertenze e precauzioni
Per uso diagnostico in vitro.
Durante tutte le procedure, adottare tecniche asettiche e seguire le precauzioni standard contro i rischi microbiologici. Dopo
l’uso, le piastre preparate, i contenitori dei campioni e gli altri materiali contaminati devono essere sterilizzati in autoclave
prima dello smaltimento. Se si riscontra un’umidità eccessiva, capovolgere il fondo su un coperchio e lasciare asciugare
all’aria per evitare la formazione di aderenze tra la parte superiore e inferiore della piastra durante l’incubazione.
Modalità di conservazione - Al ricevimento, conservare le piastre al buio a 2 – 8 °C. Evitare congelamento e
surriscaldamento. Aprire soltanto al momento dell’uso. Ridurre al minimo l’esposizione alla luce. Le piastre preparate,
conservate nell’involucro originario a 2 – 8 °C sino al momento dell’uso, possono essere inoculate fino alla data di scadenza
e incubate per i tempi di incubazione raccomandati. Prima dell’inoculo, attendere che il terreno si porti a temperatura
ambiente.
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Deterioramento del prodotto - Non usare le piastre se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazione di
colore, essiccamento, fissurazioni o altri segni di deterioramento.
RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Queste piastre non sono destinate all’uso con campioni o colture miste. I microrganismi da testare devono essere prima
coltivati in coltura pura e presuntivamente identificati come Enterococcus spp.
PROCEDURA
Materiale fornito - Enterococcus Screen Agar.
Materiali necessari ma non forniti - Terreni di coltura accessori, reagenti, microrganismi per controllo di qualità e
apparecchiature di laboratorio necessarie per questa procedura.
Procedura del test
1. Preparare l’inoculo sospendendo in una provetta di Trypticase Soy Broth alcune colonie ben isolate dell’isolato
enterococcico da una coltura in piastra di 18 – 24 h e correggere la torbidità in modo da renderla equivalente allo
standard McFarland 0,5.
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2. Inoculare in vari punti ciascuna sezione della piastra con 10 µL della sospensione corretta.
3. Attendere che gli inoculi vengano assorbiti nella superficie agar.
4. Incubare le piastre a 35 ± 2 °C in anaerobiosi per 24/24 h. Se il risultato è negativo entro 24 h, incubare di nuovo i test
della streptomicina per altre 24 h.
Controllo di qualità a cura dell’utente 1. Verificare che le piastre non presentino segni di deterioramento come descritto in “Deterioramento del prodotto”.
2. Controllare le performance inoculando un campione rappresentativo di piastre con colture pure di microrganismi di
controllo stabili che producono reazioni note e attese. Si raccomandano le seguenti colture:
CEPPI PER TEST
RISULTATI ATTESI
Sezione
I
II
III
IV*
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
+
–
–
–
Enterococcus faecalis
ATCC 51299
+
+
+
+
Enterococcus gallinarum
ATCC 49573
+
–
+
–
+ = Crescita > una colonia
– = Nessuna crescita o una colonia
* Se il risultato della sezione IV è negativo, incubare di nuovo per altre 24 h.
Le procedure prescritte per il controllo di qualità devono essere effettuate in conformità alle norme vigenti o ai requisiti di
accreditazione e alla prassi di controllo di qualità in uso nel laboratorio. Per una guida alla prassi di controllo di qualità
appropriata, si consiglia di consultare le norme CLIA e la documentazione CLSI in merito.
RISULTATI
Dopo un’incubazione di 24/24 h, osservare le piastre per verificare la crescita. La crescita sulla sezione I (Controllo BHIA)
indica la presenza di microrganismi vitali nella sospensione del brodo di inoculo e il test è valido. In assenza di crescita, il test
non è valido e deve essere ripetuto.
La crescita su:
sezione II – rosso (BHIA con gentamicina) e/o
sezione III – giallo (BHIA con vancomicina) e/o
sezione IV – blu (BHIA con streptomicina)
indica che l’antibiotico potrebbe non essere sinergistico nella terapia di associazione. L’assenza di crescita indica che è
possibile predire il sinergismo.
LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA
Questo prodotto è destinato all’uso con Enterococcus spp. Talvolta, gli isolati enterococcici con valori CMI di sensibilità agli
antibiotici borderline, possono evidenziare crescita. Questo prodotto offre una metodica di screening per predire l’effetto
sinergistico degli aminoglicosidi con la penicillina o la vancomicina. Dai risultati della streptomicina o della gentamicina non è
possibile predire l’effetto sinergistico di altri aminoglicosidi né si può prevedere l’effetto sinergistico della penicillina dai
risultati della vancomicina.
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La tecnica a scacchiera e i test del tempo di killing sono metodiche definitive per determinare il sinergismo.
Il ceppo di test enterococcico può risultare resistente a penicillina e ampicillina a causa dell’alterazione delle proteine leganti
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la penicillina o della produzione di β-lattamasi. Per le metodiche di test appropriate, consultare il documento CLSI.
PRESTAZIONI METODOLOGICHE
La procedura del test di screening in agar, raccomandata dal CLSI, per rilevare enterococchi con elevata resistenza alla
vancomicina e agli aminoglicosidi, è stata eseguita in uno studio interno su 49 isolati di Enterococcus usando terreni di
screening BBL contenenti BHIA con 500 µg/mL di gentamicina, 6 µg/mL di vancomicina e 2000 µg/mL di streptomicina.
I 49 isolati enterococcici comprendevano 21 E. faecalis, 18 E. faecium, 4 E. gallinarum, 2 E. raffinosus, 1 E. casseliflavus,
1 E. mundtii e 2 E. avium.
I pattern di resistenza per i 49 isolati enterococcici sono indicati nella Tabella 1.
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Tabella 1. Studio interno
(% di correlazione con i risultati attesi)
=
N. totale di ceppi testati
Gentamicina
49
N. di risultati resistenti a
24 ore/risultati attesi
29/29 (100 %)
N. di risultati resistenti a
48 ore/risultati attesi
Vancomicina
49
27/27 (100 %)
=
Streptomicina
49
24/26 (92 %)
26/26 (100 %)
=
La caratterizzazione fenotipica ha incluso l’uso di diluizione in brodo e/o agar per determinare le CMI di gentamicina,
vancomicina e streptomicina. Tra i risultati del test e i risultati attesi vi è stata una correlazione del 100% per tutti i 49 isolati.
Gli studi di riproducibilità (3x/die per 3 giorni) sono stati condotti in due siti esterni con 14 isolati enterococcici comprendenti
7 E. faecalis, 3 E. faecium, 1 E. gallinarum, 1 E. avium, 1 E. casseliflavus e 1 E. raffinosus.
I pattern di resistenza per i 14 isolati enterococcici sono indicati nella Tabella 2.
Tabella 2. Studio di riproducibilità in un centro esterno
(% di correlazione con i risultati attesi)
=
N. totale di ceppi testati
N. totale di test
Gentamicina
14
279
N. di risultati resistenti a
24 ore/risultati attesi
162/162 (100%)
Vancomicina
14
279
135/135 (100%)
14
279
160/162 (99%)
Streptomicina
La caratterizzazione fenotipica ha incluso l’uso di diluizione in brodo e/o agar per determinare le CMI di gentamicina,
vancomicina e streptomicina. Anche in questo caso, tra i risultati del test e i risultati attesi vi è stata una correlazione del
100%.
DISPONIBILITÀ
N. di cat. Descrizione
222201
BBL Enterococcus Screen Agar QUAD Plate with Streptomycin / Gentamicin / Vancomycin, confezione da
10 piastre.
BIBLIOGRAFIA
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resistance in Enterococcus faecalis. J. Clin. Microbiol. 26:250-256.
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=
 = Becton, Dickinson and Company
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