L`antibiogramm Inutile,necessar ed indispensabile

DOSSIER
MASTITI
Per la terapia
di una mastite in atto
il ricorso a tale test
riveste scarsa
L’antibiogramm
Inutile,necessar
ed indispensabile
di
G. BOLZONI - G.A. POSANTE
importanza. Ma
fornisce preziosissime
informazioni per
le cure che bisognerà
realizzare in futuro
l Metodo Kirby-Bauer: dischetti
contenenti antibiotici e crescita
batterica
l Metodo Kirby-Bauer: terreno
addizionato di globuli rossi per
Streptococchi
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ra i principali obbiettivi dell’allevamento
della vacca da latte,
dal punto di vista sanitario,
vi è sicuramente quello di ridurre i casi di mastite ad un
livello accettabile, “fisiologico” o comunque economicamente sopportabile, attraverso idonei interventi di profilassi.
L’ottenimento di questo obbiettivo passa anche attraverso la realizzazione di idonei ed efficaci interventi terapeutici sulle forme di mastite; sia quale cura della malattia in atto, sia quale “prevenzione indiretta” delle potenziali patologie future. L’esempio più eclatante di quest’ultimo aspetto di “terapiaprofilassi” è, del resto, il trattamento delle bovine alla messa in asciutta.
Malgrado sia sempre ed assolutamente vero che “prevenire è meglio che curare”, il ricorso ai farmaci ad azione antibiotica, continua ad essere
un elemento cardine nella terapia della mastite. Pur considerando i molteplici aspetti problematici (costi elevati,
sviluppo di farmacoresisten-
T
Gli autori sono del Centro
di Referenza Nazionale Qualità
Latte Bovino, Istituto Zooprofilattico della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Brescia
za, pericolo di residui, variabilità delle percentuali di guarigione, solo per citarne alcuni) sono infatti più che evidenti i risultati che questa
classe di farmaci ha consentito di ottenere nella zootecnia moderna.
In quest’ambito, il principale
supporto che il laboratorio
può fornire ad allevatori e veterinari per le decisioni gestionali e mediche è tradizionalmente legato all’esame
batteriologico del latte per la
diagnosi eziologica della mastite, ed all’antibiogramma
per le scelte di terapia.
Sull’utilizzo pratico dei risultati dell’antibiogramma esistono però alcuni aspetti
controversi che possono generare incomprensioni e false aspettative tra gli addetti
ai lavori e che, pertanto, sembra utile analizzare e chiarire a scopo informativo.
Con il termine “antibiogramma” si identifica, in generale, un test di laboratorio in
grado di valutare l’efficacia
di uno o più principi attivi
farmacologici nei confronti di
una specie o ceppo batterico
(che di solito è stato isolato da
un campione di materiale biologico e, nel caso specifico, da
un campione di secreto mammario). Il risultato dell’antibiogramma è, quindi, una misura della capacità di un antibiotico di contrastare un determinato ceppo batterico.
L’aspetto teorico della questione è quindi semplice, ma
nella pratica le cose sono invece decisamente complesse,
o meglio, è necessario tener
presente una serie, purtroppo
piuttosto grande e complessa,
di fattori senza i quali le affermazioni precedenti perdono gran parte del loro valore.
Questi fattori possono essere
schematicamente divisi in due
gruppi principali: quelli collegati alla diagnosi eziologica della mastite ed alle relative problematiche di interpretazione del significato patologico degli isolamenti batterici ottenuti che, seppur fondamentali, esulano dalla presente trattazione; quelli direttamente collegati al rapporto tra il risultato dell’antibiogramma ed il suo utilizzo pratico in allevamento.
SCOPO DEL TEST
Abbiamo affermato che “per
definizione”, l’antibiogramma serve a dare informazioni
circa i principi attivi (e quindi i farmaci disponibili sul
mercato) idonei a trattare una forma di mastite in atto.
Se però consideriamo i tempi
minimi necessari ad ottenere
l’esito analitico dal laboratorio (almeno 48-72 ore, nei casi ottimali, fino a superare i
4-6 giorni nei più complessi)
appare evidente che, nella
stragrande maggioranza dei
casi, ciò non rispecchia pie-
a?
io
namente la realtà. L’intervento terapeutico nei confronti
della mastite è, infatti, tanto
più efficace quanto più precoce rispetto all’insorgenza e
ciò è particolarmente vero per
le forme acute, quali quelle
sostenute da Enterobatteri.
Fatte salve le ovvie eccezioni,
per esempio le mastiti croniche, nella maggior parte dei
casi è quindi fondamentale iniziare la terapia nelle prime
24 ore, meglio ancora nelle
prime 4-6 ore. Molto spesso
dunque, l’esito dell’antibiogramma serve, di fatto, a confermare o a contraddire una
scelta terapeutica già fatta.
Tale informazione è però, a
questo punto, già disponibile
all’allevatore in quanto fornita dall’avvenuta o mancata
guarigione della bovina. Sembra dunque più realistico affermare che, nella maggioranza dei casi, lo scopo dell’antibiogramma “non è tanto quello di indirizzare la terapia di una mastite in atto,
quanto invece di fornire informazioni per la terapia delle
mastiti che si presenteranno
in futuro” nel medesimo allevamento e con sintomatologia clinica simile.
In quest’ottica l’antibiogramma serve dunque principalmente a raccogliere nel tempo, dati utili per comprendere se il principio attivo utilizzato in allevamento mantiene la sua efficacia o la perde
nel tempo; quando è opportuno cambiare il prodotto e quale altro farmaco utilizzare; con
quale prodotto intervenire,
precocemente, in determinate forme di mastite in un allevamento.
Tali considerazioni si adattano perfettamente alle mastiti
contagiose, mentre per quelle ambientali il discorso andrebbe completato da alcune
ulteriori precisazioni troppo
complesse e “fuori tema” in
questa sede.
L’antibiogramma viene di norma eseguito secondo due metodiche analitiche principali:
determinazione della M.I.C.
(Minima Concentrazione Inibente); metodo Kirby-Bauer
in piastra.
METODO DI ESECUZIONE
La differenza sostanziale sta
nel fatto che la prima fornisce una valutazione di tipo
quantitativo, mentre la seconda indica un esito di tipo
qualitativo, tradizionalmente espresso con le diciture: Resistente, Intermedio, Sensibile. La prima metodica garantirebbe, in teoria, risultati
confrontabili con quelli delle
concentrazioni antibiotiche
ottenibili in vivo e quindi consentirebbe la scelta del principio attivo “più efficace”. In
pratica, i dati disponibili sulla farmacodinamica di prodotti antibiotici in bovine da
latte in mastite a cui fare riferimento, sono estremamente limitati (vedi oltre). Essa inoltre risulta decisamente più
impegnativa e costosa da realizzare; è soprattutto per questi motivi che nella maggior
parte dei laboratori di servizio, l’antibiogramma viene eseguito con il secondo metodo. Esistono altre metodiche,
più o meno precise o difficili
da realizzare o impegnative e
dispendiose che possono essere utilizzate in funzione di
differenti finalità (vedi box).
In generale, possiamo co-
METODI DI ESECUZIONE
✔ Determinazione della M.I.C. (Minima Concentrazione Inibente). Quantità fisse del batterio in esame sono poste a contatto, in provetta, con diluizioni scalari del principio attivo farmacologico. La maggior diluizione di antibiotico in grado di
impedire la crescita del germe è definita M.I.C. Rappresenta
la metodica di elezione, ma purtroppo la sua applicazione
pratica è limitata dal fatto che è decisamente dispendiosa ed
impegnativa per il laboratorio (problema solo parzialmente
migliorabile con la tecnica in micrometodo).
✔ Metodo Kirby-Bauer in piastra. La coltura batterica ottenuta in brodo di crescita è seminata in quantità più o meno
costante, su specifici terreni di coltura, insieme a dischetti di
carta contenenti quantità predefinite di antibiotico. La mancata crescita del batterio attorno al dischetto contenente, ad
esempio, la penicillina si evidenzia come “alone di inibizione”
e la sua misurazione indicherà se il ceppo in esame è da considerare sensibile o resistente ai farmaci contenenti penicillina.
✔ Diluizione diretta del latte. Il latte mastitico è diluito direttamente in reagenti per la crescita batterica e dopo un’incubazione di 1-6 ore, viene distribuito in micropiastre contenenti diluizioni scalari di antibiotici. L’avvenuta o mancata
crescita del batterio viene valutata attraverso il viraggio di
colore del terreno. Riduce fortemente i tempi ed i costi di esecuzione, ma fornisce esiti che non sono sempre e sicuramente attribuibili al batterio responsabile della mastite (che
non è né isolato, né identificato, ma semplicemente coltivato insieme al latte mastitico e quindi ad eventuali batteri contaminanti).
✔ Diluizione in Agar. Le colture batteriche in quantità più o
meno definite, vengono seminate in piastre di terreno colturale contenenti diluizioni scalari dell’antibiotico. È forse il metodo più preciso, ma è ulteriormente impegnativo e costoso
nell’esecuzione anche rispetto al metodo M.I.C.
✔ Determinazione della M.B.C. (Minima Concentrazione Battericida). Quantità fisse del battere in esame sono seminate
in brodi contenenti diluizioni scalari di antibiotico, successivamente il brodo di coltura è ripetutamente seminato in piastra, ad intervalli di tempo predefiniti con valutazione finale
della concentrazione in grado di determinare una riduzione
standard (3 Log) della quantità di batteri vitali. Comporta un
ulteriore allungamento dei tempi di analisi, dell’impegno del
laboratorio e di crescita dei costi (ulteriormente incrementati se si deve valutare cinetica batterica, per una relazione
tempo/quantità batteri vitali).
G.B. - A.P.
munque dire che nell’ambito
della ricerca (ad esempio per
la sorveglianza dello sviluppo delle farmacoresistenze nei
batteri patogeni per l’uomo)
si privilegiano metodi più
complessi e, tendenzialmente, più precisi, mentre per le
attività routinarie si devono
accettare delle scelte di compromesso in funzione delle esigenze di esiti rapidi, analisi semplici e poco costose.
L’esistenza di differenti metodiche genera comunque un
secondo tipo di difficoltà: gli
esiti forniti non sono infatti
sempre confrontabili tra di loro e, di conseguenza, risulta
difficile aggregare l’enorme
massa di dati ottenibili dall’attività dei diversi laboratori operanti sul territorio per
trarre informazioni generali
e diffondibili a livello nazionale o internazionale, utili a
chi opera in campo.
VALIDAZIONE DEI RISULTATI
Altra fonte di difficoltà è il
fatto che risulta davvero difficile dare un giudizio sulla
accuratezza del risultato di un
antibiogramma, indipendentemente dalla metodica utilizzata. In teoria per poter dare indicazioni terapeutiche
scientificamente rigorose e
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DOSSIER
MASTITI
complete, si dovrebbe disporre, in ogni singolo caso di mastite, del risultato di antibiogrammi espressi come M.I.C.,
delle caratteristiche di farmacodinamica del principio
attivo nei diversi prodotti farmaceutici che lo contengono,
derivate da studi eseguiti su
bovine in lattazione ed in mastite e non soltanto in animali da laboratorio, ed infine,
della casistica relativa a prove sperimentali eseguite in
campo in modo standardizzato che esprima le percentuali
di guarigione osservate.
Solo in questo modo potremmo “validare” il risultato dell’antibiogramma, cioè dare a
tale risultato un sorta di “misura” della sua correttezza rispetto all’utilizzo pratico del
farmaco da esso “consigliato”.
È quasi superfluo dire che la
stragrande maggioranza delle informazioni di cui sopra
non sono, attualmente, disponibili. I dati relativi alla
farmacodinamica, ad esempio, quand’anche disponibili
per la bovina, riguardano
quasi sempre bovine sane e
somministrazioni per via parenterale, mentre è meno frequente che si disponga di dati relativi alla somministrazione intramammaria in corso di mastite.
ATTENDIBILITÀ
La relazione tra risultati in vitro e la situazione in vivo costituisce forse il problema più
importante in quanto contiene, in modo più o meno diretto, tutti gli altri finora citati.
Il confronto tra una coltura
batterica ed una sostanza ad
azione antibiotica realizzato
nelle condizioni di laboratorio è, ovviamente, sostanzialmente diverso da quello che
si realizza all’interno di una
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ghiandola mammaria nel corso di un processo infiammatorio. Nella mammella, ad esempio, l’azione degli antibiotici può esaltare e potenziare la risposta difensiva immunitaria della bovina, ma in
altri casi la può deprimere per
effetto negativo sulle capacità
fagocitanti delle cellule; oppure vi possono essere, nella
mammella mastitica, sostanze naturali che interagiscono
con le molecole antibiotiche.
La diffusione dell’antibiotico
inoltre, nella piastra o nella
provetta, è costante e definita, mentre in mammella può
essere ostacolata, in misura
non costante, da particolari
condizioni fisiche (presenza
di essudato purulento, formazioni fibrose ascessuali, detriti cellulari e frustoli di fibrina) o chimiche (acidità, elettroliti). Dobbiamo poi ricordare che, nella stragrande
maggioranza dei casi, non si
hanno informazioni di ritorno, complete dal punto di vista scientifico, sulla corrispondenza tra i risultati forniti dalle prove di laboratorio
ed il riscontro pratico di campo (guarigione o mancata guarigione) e ciò dipende da numerosi problemi di ordine
pratico ed organizzativo che
sarebbe davvero troppo lungo elencare ed analizzare, ma
che sono ben noti agli addetti ai lavori. Le sperimentazioni finora realizzate in quest’ambito, rappresentano sicuramente, in prospettiva, la
parziale soluzione a questi
problemi, ma sono davvero limitate se confrontate con l’utilizzo complessivo dei farmaci antimastite.
QUALE ANTIBIOTICO
A complicare ulteriormente
quanto detto al punto precedente, vi è poi il fatto che la
composizione dei farmaci (eccipienti, veicolo, associazioni
con altri antibiotici o altre sostanze terapeutiche quali an-
l Metodo Kirby-Bauer: fasi di esecuzione della prova
tiinfiammatori o antiistaminici), non può essere simulata nelle prove di laboratorio
in cui si testa, di fatto, il solo
principio attivo antibiotico,
senza poter tener conto degli
aspetti, di norma migliorativi e “potenzianti”, legati alle
altre componenti del prodotto. In secondo luogo il laboratorio deve, necessariamente, operare una selezione rispetto ai principi attivi, non
potendo testare i ceppi batterici nei confronti di tutti i possibili prodotti farmaceutici disponibili sul mercato. In genere quindi si utilizzano molecole considerate “capofila”
per ciascuna classe di antibiotici, dando per scontato
che il risultato sia estensibile
a tutti i principi attivi di quella classe. Questo tipo di “compromessi” assume maggior rilevanza se si pensa al diffondersi di prodotti contenenti
associazioni di più antibiotici; in questi casi non è sempre
possibile riprodurre in laboratorio l’effetto combinato dei
differenti antibiotici e quindi
la correlazione tra esito analitico e risultato dell’intervento terapeutico può risultare particolarmente debole.
Un cenno meritano anche i
problemi relativi ai valori di
M.I.C., ai dati di farmacodinamica e alla disponibilità di
studi di campo per i germi
mastitogeni. Pur non essendo
in genere direttamente percepiti dagli addetti ai lavori, essi rappresentano comunque
rilevanti condizionamenti per
le possibilità di utilizzo pratico ed efficace degli esiti analitici forniti dal laboratorio. Gli studi sperimentali sulla farmacodinamica delle singole molecole ad azione antibiotica e la definizione delle
M.I.C. nelle condizioni di
campo sono, per ovvie questioni economiche, perlopiù
dedicate alla medicina umana ed ai batteri patogeni per
l’uomo. In campo veterinario
le prove sperimentali si eseguono perlopiù su animali da
laboratorio oppure, nel settore bovino, su animali sani. In
definitiva sono pochi i dati a
disposizione per farmaci antimastite provati in condizione di mastite (a diversi dosaggi, per diversi tempi di
trattamento o vie di somministrazione, e così via).
In conclusione ed in stretta
sintesi, le informazioni mancanti per un utilizzo pratico,
corretto, completo, scientificamente inoppugnabile, dei
risultati delle prove di antibiogramma sono allo stato attuale moltissime ed il lavoro
sperimentale da realizzare,
quindi, ancora enorme.
A titolo di esempio, si può accennare al fatto che,
MASTITE CLINICA, COSA FARE
In presenza di mastite clinica o di sospetto occorre:
✔ prelevare sempre un campione di latte di quarto, secondo
le modalità previste per gli esami batteriologici (prelievo sterile) prima di eseguire qualunque trattamento farmacologico;
✔ a seconda dei casi, congelare il campione, oppure inviarlo
al laboratorio per la diagnosi ed il test dell’antibiogramma;
✔ iniziare al più presto un intervento terapeutico (endomammario e/o parenterale) secondo le modalità e con i prodotti usualmente utilizzati in azienda, in funzione del tipo di
sintomatologia clinica;
✔ valutare clinicamente l’andamento della malattia.
A) In caso di guarigione:
Il campione inviato al laboratorio ed il relativo antibiogramma serviranno come informazioni per ampliare l’archivio dell’allevamento e realizzare una sorveglianza sull’insorgere di
farmacoresistenze. Il campione congelato potrà essere eliminato oppure insieme ad altri inviato periodicamente al laboratorio per valutazioni complessive sulla frequenza degli
agenti mastitogeni e per la sorveglianza sulle farmacoresistenze.
B) In caso di mancata guarigione:
Il campione inviato al laboratorio potrà fornire un’indicazione specifica sul tipo di farmaco da utilizzare quale ulteriore
tentativo terapeutico e, comunque, servire per futuri casi di
mastite della medesima tipologia. Il campione congelato deve essere al più presto inviato al laboratorio allo scopo di ottenere le informazioni necessarie ad instaurare una terapia
alternativa.
G.B. - A.P.
quand’anche disponibili, i dati delle M.I.C. o degli aloni di
inibizione del metodo KirbyBauer, pur avendo carattere
quantitativo, non sono direttamente utilizzabili come indicatori di efficienza (alone
più grande uguale attività terapeutica maggiore). Non è
possibile quindi fare una
“classifica” del farmaco più
“potente” o semplicemente
“più adatto” sulla base di
questi dati.
LIMITI E PREGI
L’insieme dei problemi accennati nei punti precedenti
è più che sufficiente per mostrare l’importanza dei limiti
e dei condizionamenti con cui
ci si deve confrontare. Per
completezza, a questi dovremmo aggiungere, solo per
fare degli esempi: le problematiche di ripetibilità e riproducibilità di una qualsiasi metodica analitica (quindi
anche degli antibiogrammi eseguiti da operatori diversi o
in laboratori diversi). Concludere quindi, che per la te64 ● IZETA ● n. 10 / 2005 ●
rapia della mastite il ricorso
all’antibiogramma, indipendentemente dalla metodica utilizzata, sia sostanzialmente
inutile sembra, a questo punto, quasi ovvio. Per fortuna
non è questa la conclusione
obbligata.
È, infatti, altrettanto corretto affermare che l’antibiogramma può essere, a seconda delle finalità e degli ambiti applicativi per cui è eseguito, un utilissimo supporto
sia per le decisioni terapeutiche in allevamento che per le
attività di ricerca scientifica
(epidemiologiche, farmacologiche, diagnostiche).
Da quest’ultimo punto di vista il ricorso a test di validazione per l’efficacia dei principi attivi è assolutamente indispensabile e deve essere realizzato con i mezzi tecnici a
disposizione, per limitati che
siano. Di fatto ciò che appare ancora inadeguato allo scopo, è la mancanza di prove
standardizzate, e quindi confrontabili, che fornisca in modo sistematico l’efficacia dei
prodotto terapeutico, da latdifferenti principi attivi, e deltazione o da asciutta, più ale loro associazioni, per lundatto ed efficace per quell’alghi periodi di tempo.
levamento e per quel tipo di
Ma aldilà di questo, il risulmastite e soprattutto per tetato dell’antibiogramma asnere sotto controllo nel temsume comunque una valenza
po l’efficacia delle scelte tepositiva anche se rimaniamo
rapeutiche. È probabilmente
nell’ambito dei problemi praquesta la forma più corretta
tici, sanitari, del singolo alleper valutare questo ausilio lavamento. Il problema deve esboratoristico dal punto di visere analizzato sulla base di
sta del veterinario
una valutazione
pratico e dell’allecosto-beneficio e,
vatore.
soprattutto, in re- L'antilazione alle condizioni tipiche di cia- biogramma
UN SEMPLICE
scun allevamento
CONSIGLIO
interessato. In bre- è indispensabile Tralasciando la sove, si può dire che
luzione dei numesoltanto in pochi per tenere
rosi e complessi
casi l’esito dell’anproblemi tecnicotibiogramma costi- sotto controllo
scientifici evidentuisce un valido
ziati in precedensupporto per la te- nel tempo
za, che richiedono
rapia della mastite
evidentemente stuin atto (come ac- l’efficacia
di e valutazioni da
cennato prima,
“esperti”, è possifondamentalmente delle scelte
bile tentare di
per un problema di
schematizzare una
tempi, irrisolvibi- terapeutiche
sorta di linea guile). Nella stragranda comportamende maggioranza
tale per la gestione
dei casi, però, l’esito dell’andel problema “antibiogramtibiogramma può essere “arma” che possa rappresentare
chiviato” così da costituire uun compromesso tra le diffina fonte di informazioni relacoltà ed i limiti suddetti da utivamente allo sviluppo di farna parte, e le esigenze pratimacoresistenze di determinache di veterinari ed allevatoti microrganismi nello speciri dall’altra (vedi box). Quefico allevamento in questiosto schema dovrà, ovviamenne. È fatto notorio che, speste, essere modulato in funzioso, un prodotto utilizzato in
ne della situazione specifica
un allevamento funzioni moldi ciascuna realtà aziendale
to bene (cioè fornisca una
(per esempio, nei casi di forbuona percentuale di guarime di mastite contagiosa), ma
gione nei casi di mastite tratda un punto di vista generale
tati) per un certo periodo, ma
è possibile concludere che
che, con l’andar del tempo,
“malgrado tutti i limiti acpossano cominciare a compacennati, è comunque evidenrire mancate guarigioni o rete che, per la gestione sanitacidive, attribuibili allo sviria della stalla, le informaluppo di ceppi batterici farzioni fornite dall’esame batmacoresistenti caratteristici
teriologico e dall’antibiodi quell’allevamento.
gramma costituiscono eleL’antibiogramma “inutile” o
menti utili, a volte anche per
quasi per curare la mastite in
i casi patologici in atto, ma siatto, diventa in quest’ottica
curamente sempre per afutile se non addirittura indifrontare in modo efficace
spensabile, per scegliere il
quelli futuri”. ●
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