Caratterizzazione molecolare di varietà campane di olivo e

Caratterizzazione molecolare di varietà
campane di olivo e studio della risposta
della drupa alla mosca dell’olivo
F. Alagna (1), D. Scarano (2), P.Varricchio (2),
L. Baldoni (1), G. Corrado (2) and R. Rao (2)
(1) Istituto di Genetica Vegetale, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Via della Madonna Alta 130,
Perugia, 06128, Italy
(2) Dipartimento di Agraria, Università degli Studi di Napoli Federico II, Via Università 100, Portici,
Napoli, 80055, Italy
Riassunto
La conoscenza della diversità molecolare delle varietà di olivo è essenziale per la loro descrizione e
rappresenta un aspetto di notevole importanza economica per la protezione di oli DOP monovarietali.
Il presente lavoro descrive la caratterizzazione della diversità molecolare nelle principali accessioni
campane. Inoltre si riportano i risultati della caratterizzazione di sequenze di olivo indotte dalla
infestazione della drupa da parte delle larve di Bactrocera oleae.
Abstract
The knowledge of the molecular diversity of the olive varieties is essential for their description and it
represents an aspect of considerable economic impact for the protection of monovarietal PDO olive
oil. The present work describes the characterization of molecular diversity of the major accessions
in the Campania region. Additionally, we report the results of characterization of sequences of olive
induced by the infestation of the drupe by larvae of Bactrocera oleae.
Keywords: Olea europea, Bactrocera oleae, SSR, SSH-PCR.
Introduzione
L’olivo (Olea europea L.) è una delle più antiche coltivazioni nei paesi del Bacino del Mediterraneo,
dove rappresenta una preziosa risorsa per l’economia locale, sia per la produzione di olio che di olive
da tavola. Il panorama varietale di olivo è molto ampio, a causa dalla limitata erosione genetica che
caratterizza il germoplasma di olivo coltivato, conseguenza della longevità della pianta e dalla lenta
introduzione di nuovi genotipi. Le varietà di olivo sono caratterizzate da una significativa variabilità
sia per quanto riguarda i tratti morfologici, come la dimensione dei frutti ed il contenuto in olio, che
i caratteri agronomici come la risposta a stress biotici e abiotici (Rotondi et al. 2003) Ad esempio, le
cultivar di olivo si differenziano per il grado di suscettibilità alla mosca dell’olivo, il suo principale
stress biotico nel mondo (Daane et al. 2010), ma i fattori alla base di questo tratto sono ancora
controversi (Loscalzo et al. 1994; Scarpati et al. 1996). Una forte tolleranza, definita principalmente
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in base alla gravità della infestazione, è stata riportata in alcune varietà coltivate (Daane et al. 2010).
Tuttavia, anche le cosiddette cultivar “resistenti” possono subire notevoli attacchi sotto pressione
intensa infestazione (Iannotta et al. 1999) e purtroppo vi sono scarse informazioni sui meccanismi
molecolari che controllano tali aspetti. Più recentemente le analisi molecolari del DNA hanno indicato
che anche dal punto di vista genetico, l’olivo è caratterizzato da una notevole diversità allelica.
Tale diversità è dovuta a diversi fattori, quali la propagazione vegetativa, i meccanismi di auto
incompatibilità, la longevità delle piante e la capacità di sopravvivere in assenza di cure colturali e di
incrociarsi con forme selvatiche. La valutazione della variabilità genetica dell’olivo è uno strumento
importante per la gestione e salvaguardia del germoplasma olivicolo. L’accertamento dell’identità
genetica e l’identificazione delle varietà è stata in molti casi conseguita mediante l’uso di numerosi
marcatori del DNA (RAPD, AFLP, SSR, SNP) (Cipriani et al. 2002; Corrado et al. 2009; Fabbri et al.
1995; Rao et al. 2009; Reale et al. 2006; Sefc et al. 2000). Il primo obiettivo della attività di ricerca è stato
quindi la caratterizzazione molecolare delle varietà di olivo campano per l’identificazione di profili
discriminanti utili anche ai fini della tracciabilità genetica in filiera.
L’attività di ricerca si è inoltre concentrata sulla caratterizzazione molecolare della risposta della
drupa a seguito di infestazione di B. oleae. La nostra analisi trascrittomica ha come obiettivo quello
di rivelare le basi molecolari e le relative vie di segnalazione indotte nell’interazione tra olivo e il
suo più dannoso parassita biotico. Tale studio vuole fornire quindi il primo riferimento molecolare
per lo screening della diversità genetica dell’olivo in relazione ad un carattere di grande interesse
agronomico.
Materiali e metodi
Analisi SSR
Sono state analizzate le seguenti varietà di olivo: Asprinia, Biancolilla, Caiazzana, Carpellese,
Cornia, Minucciola, Ogliarola, Olivo da olio, Ortice, Ortolana, Pampigliosa, Pisciottana, Racioppella,
Ravece, Ritonnella, Rotondella, Ruveia, Salella, Tenacella e Tonda. Il DNA è stato estratto da foglie
ed amplicato come riportato (Corrado et al. 2009). Sono stati impiegati i seguenti loci SSR: DCA3,
DCA4, DCA5, DCA7, DCA9, DCA13, DCA14, DCA15, DCA16, DCA17, DCA18, GAPU45, GAPU71B,
GAPU101, GAPU103, EMO90, EMO-L e UDO43 (Carriero et al. 2002; Cipriani et al. 2002; Sefc et al.
2000). Gli alleli SSR sono stati separati mediante elettroforesi capillare su ABI-Prism 3100-AVANT
(Applied Biosystems). Dopo ispezione manuale dei dati, le dimensioni alleliche sono state
arrotondate omogeneamente al più vicino numero intero sulla base della ripetizione del core. I profili
allelici ottenuti per ciascun campione, sono stati analizzati mediante il software GenAlex 6 (Genetic
Analysis), calcolando i diversi indici genetici. La distanza tra due individui è stata calcolata per ogni
singolo locus e sommata per ottenere una matrice. Per un singolo locus in analisi, considerando l’Iesimo, J-esimo, K-esimo e L-esimo allele, una serie di distanze quadrate sono definite come segue:
d2(II, II) = 0, d2(IJ, IJ) = 0, d2(II, IJ ) = 1, d2(IJ, IK) = 1, d2(IJ, KL) = 2, d2(ii, jk) = 3, e d2(ii, jj) = 4. La matrice delle distanze è
stata impiegata per la costruzione di un dendrogramma con l’algoritimo UPGMA.
Costruzione ed analisi di una libreria sottrattiva in olivo
Ai fini di identificare EST differenzialmente espresse, coinvolte nel meccanismo di interazione
olivo-mosca è stata utilizzata la tecnica suppression subtractive hybridization, SSH (Diatchenko et al.
1996). Sono state costruite due librerie sottrattive da drupe contenenti la galleria larvale, provenienti
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dalla varietà ‘Moraiolo’, caratterizzata da una bassa suscettibilità alla mosca. I trascritti sottratti e
amplificati, sono stati clonati nel vettore plasmidico pCRII-TOPO® (TOPO TA Cloning, Invitrogen).
Per verificare la presenza dell’inserto e valutarne la sua dimensione, il DNA plasmidico, purificato
dalle colonie positive alla selezione blue/white, è stato digerito con l’enzima EcoRI e sequenziato
mediante il metodo Sanger.
Risultati e discussione
Analisi SSR delle cultivar di olivo e diversità genetica
L’analisi molecolare dei 20 genotipi di olivo è stata è stata eseguita con 18 marcatori SSR. Uno
studio precedente condotta nell’ambito del progetto RIOM, ha permesso di selezionare i genotipi
rappresentativi della varietà in esame in base ad una analisi con AFLP (Rao et al. 2009).
La tabella 1 riporta i principali indici genetici descrittivi della popolazione in esame, come valori
mediati su tutti loci. I loci che hanno fornito il maggior numero di alleli (16) sono stati il DCA 9 e
GAPU103, in cui si è osservata la maggiore eterozigosi. Il locus con meno alleli (5) è stato l’EMO-L che
ha mostrato anche la più bassa eterozigosità attesa. Questo locus ha comunque mostrato un indice
di fissazione prossimo allo zero (0.062). Il valore positivo più elevato per l’indice di fissazione è stato
osservato per il locus DCA15 . Per questo locus si sono trovati 7 alleli diversi, con una Eterozigosi
osservata nella popolazione in esame molto bassa (0,150), suggerendo quindi una alta probabilità
della presenza di un allele nullo. La figura 1 mostra le frequenze alleliche per locus. Il loci che hanno
alleli con la più altra frequenza sono stati l’EMO-L, EMO-90 e DCA 13. Gli alleli con la frequenza più
bassa (2.5%) sono invece molto più diffusi, essendo presenti in 10 loci.
Le distanze genetiche sono poi state impiegate per visualizzare le relazioni genetiche esistenti tra
le varietà in esame (figura 2). E’ possibile osservare come gli SSR impiegati riescono a discriminare
tutte le varietà in esame. Inoltre non è possibile osservare una distribuzione delle varietà che sia
concorde con la loro area di diffusione all’interno della regione, a sottolineare al grande variabilità
che esiste in Campania ma anche all’interno delle diverse aree olivicole.
Interazione pianta-mosca
Per studiare l’interazione tra l’olivo e la B. oleae, abbiamo condotto una indagine trascrittomica della
risposta molecolare della drupa. Le identificazioni di geni coinvolti nella risposta dei frutti è stata
eseguita utilizzando una tecnica di ibridazione sottrattiva e PCR soppressiva. La libreria di cDNA
è stata ottenuta utilizzando RNA da frutti con la galleria di alimentazione delle larve (tester) e da
frutti intatti (driver). Dopo selezione blu/bianco e la restr i zione del DNA plasmidico, sono state
identificate 590 colonie ricombinanti su 1.180. I plasmidi ricombinanti con un inserto superiore a 200
bp sono stati sequenziati ed i cloni con basso contenuto informativo (sequenze ripetute, con stretch
omopolimerici, etc.) sono stati scartati. La lunghezza media delle 197 sequenze di olivo selezionate
in questo modo è stata di 303 bp, da un minimo di 69 bp a u n massimo di 766 bp. Per ottenere
sequenze uniche (unigeni), abbiamo effettuato un assembly utilizzando il programma CAP3, che ha
individuato 87 singleton ed ha raggruppato le restanti 111 sequenze in 33 contigs, composti da 2 a 22
EST sovrapposte. Il dataset degli unigeni non ridondanti, a seguito di un traduzione in silico, è stato
confrontato con i database disponibili per trovare somiglianze con sequenze note. Solo tre cloni sono
stati abbinati a sequenze di olivo già disponibili. Solo match con valori di e inferiori a 10e-03 sono
stati usati per assegnare una funzione putativa ai trascritti. Complessivamente, il 39,2% dei unigeni
putativamente codificano per le proteine con una significativa somiglianza con proteine annotate
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in altri organismi. I restanti 7 3 unigeni ( 60,8%) sono stati c onsiderati funzionalmente com e non
identificati. Unigeni con BlastX valore e superiore a 10e-3 sono stati poi confrontati con i database di
nucleotidi. Cinquantadue sequenze hanno rivelato una similarità significativa (e-value inferiore a 10e3). In particolare, 29 EST sono stati annotati scegliendo come banche di sequenze espresse in NCBI.
Una somiglianza significativa per altri 23 cloni è stata trovata analizzando le sequenze trascritte alla
banca dati OLEA EST db. L’analisi bioinformatica degli EST non-ridondanti ha indicato che diversi
processi molecolari sono alterati. Tra esso i principali sono la risposta allo stress, il metabolismo dei
fitormoni, il controllo della trascrizione ed il metabolismo primario. Inoltre, una parte considerevole
delle EST non è stato classificato. La distribuzione delle sequenze in funzione della loro annotazione
funzionale è riportata in figura 3.
Conclusioni
I marcatori molecolari usati hanno mostrato un buon potere discriminante, fornendo un cospicuo
numero di alleli. L’elevata variabilità genetica riscontrata per i campioni analizzati è stata usata
per attribuire a ciascuna varietà un profilo unico identificativo. Inoltre, lo studio delle interazioni
pianta- mosca ha permesso l’identificazione di nuove EST di olivo che possono essere considerate
le prime sequenze putativamente associate a risposte di difesa della pianta di olivo a seguito dell’
infestazione della mosca. L’identificazione di trascritti coinvolti nella difesa alla mosca, offre una
linea di riferimento rispetto al quale effettuare uno screening delle risorse genomiche di olivo
caratterizzate in questa attività. Questi dati, aprono la strada a ulteriori saggi molecolari e biologici
per consentire lo sviluppo di strategie razionali che consentano di migliorare la tolleranza dell’olivo
al suo maggiore stress biotico.
Letteratura citata
Carriero, F., Fontanazza, G., Cellini, F.and Giorio, G. 2002 Identification of simple sequence repeats
(SSRs) in olive (Olea europaea L.). Theoretical and Applied Genetics 104:301-307.
Cipriani, G., Marrazzo, M.T., Marconi, R., Cimato, A.and Testolin, R. 2002 Microsatellite markers
isolated in olive (Olea europaea L.) are suitable for individual fingerprinting and reveal polymorphism
within ancient cultivars. Theoretical and Applied Genetics 104:223-228.
Corrado, G., La Mura, M., Ambrosino, O., Pugliano, G., Varricchio, P.and Rao, R. 2009 Relationships
of Campanian olive cultivars: comparative analysis of molecular and phenotypic data. Genome
52:692-700.
Daane, K.M.and Johnson, M.W. 2010 Olive Fruit Fly: Managing an ancient pest in modern times.
Annual Review of Entomology 55:151-169.
Diatchenko, L., Lau, Y.F.C., Campbell, A.P., Chenchik, A., Moqadam, F., Huang, B., Lukyanov,
S., Lukyanov, K., Gurskaya, N., Sverdlov, E.D.and Siebert, P.D. 1996 Suppression subtractive
hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and
libraries. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93:60256030.
Fabbri, A., Hormaza, J.I.and Polito, V.S. 1995 Random Amplified Polymorphic DNA Analysis of
Olive (Olea-Europaea L) Cultivars. Journal of the American Society for Horticultural Science 120:538542.
Iannotta, N., Perri, I., Tocci, C.and Zaffina, F. 1999 The behaviour of different olive cultivars following
attacks by Bactrocera oleae (Gmel.). Acta Horticolturae:545-548.
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Loscalzo, R., Scarpati, M.L., Verzegnassi, B.and Vita, G. 1994 Olea europaea chemicals repellent to
Dacus oleae females. Journal of Chemical Ecology 20:1813-1823.
Rao, R., La Mura, M., Corrado, G., Ambrosino, O., Foroni, I., Perri, E.and Pugliano, G. 2009 Molecular
diversity and genetic relationships of southern Italian olive cultivars as depicted by AFLP and
morphological traits. Journal of Horticultural Science & Biotechnology 84:261-266.
Reale, S., Doveri, S., Diaz, A., Angiolillo, A., Lucentini, L., Pilla, F., Martin, A., Donini, P.and Lee, D.
2006 SNP-based markers for discriminating olive (Olea europaea L.) cultivars. Genome 49:1193-1205.
Rotondi, A., Magli, M., Ricciolini, C.and Baldoni, L. 2003 Morphological and molecular analyses for
the characterization of a group of Italian olive cultivars. Euphytica 132:129-137.
Scarpati, M.L., LoScalzo, R., Vita, G.and Gambacorta, A. 1996 Chemiotropic behavior of female olive
fly (Bactrocera oleae gmel) on Olea europaea L. Journal of Chemical Ecology 22:1027-1036.
Sefc, K.M., Lopes, S., Mendonca, D., Dos Santos, M.R., Machado, M.L.D.and Machado, A.D. 2000
Identification of microsatellite loci in olive (Olea europaea) and their characterization in Italian and
Iberian olive trees. Molecular Ecology 9:1171-1173.
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Tabella 1: principali indici genetici medi delle varietà campani.
N
Media SE
19,556 0,202
Na
Media SE
9,222 0,778
Ne
Media SE
5,622 0,631
I
Media SE
1,849 0,093
Ho
Media SE
0,748 0,059
He
Media SE
0,789 0,020
uHe
Media SE
0,810 0,021
F
Media SE
0,055 0,070
Legenda:
Na = Numero di differenti alleli;
Ne = Numero di alleli effettivi = 1/(Somma pi ^ 2);
I = Indice di Shannon = -1 * Somma (pi * Ln (pi));
Ho = eterozigosi osservata = Numero di Eterozigiti/N,
He = Eterozigosità Attesa = 1 - Somma pi ^ 2,
UHE = Eterozigosità attesa “unbiased” = (2N/(2N-1)) * He,
F = Indice di Fissazione = (He - Ho)/Si = 1 - (Ho / He), dove pi è la frequenza dell’allele esima per la
popolazione e somma pi ^ 2 è la somma delle frequenze alleliche popolazione squadrati.
N rappresenta il numero di campioni.
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Figura 1: frequenze alleliche per locus nella popolazione analizzata.
Per ciascun locus, indicato sulla sinistra, la lunghezza dei segmenti colorati rappresenta la frequenza
di ogni allele. Le frequenze sono riportate in ordine crescente.
OGLIAROLA
ROTONDELLA
BIANCOLILLA
CARPELLESE
RITONNELLA
RAVECE
RUVEIA
OLIVODAOLIO
SALELLA
ORTOLANA
TENACELLA
ASPRINIA
TONDA
MINUCCIOLA
CAIAZZANA
CORNIA
PISCIOTTANA
PAMPIGLIOSA
ORTICE
RACIOPPELLA
15
10
5
0
Figura 2: le relazioni tra le varietà sono state dedotte con il metodo UPGMA sulla base delle distanze genetiche.
L’albero è in scala, con la lunghezza dei rami nella stessa unità di quelle delle distanze utilizzate per inferire il
dendrogramma.
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2%
2% 2%
2%
7%
2%
38%
9%
17%
19%
metabolic process
response to stimulus
cellular process
biological regulation
developmental process
localization
reproduction
growth
multicellular organismal process
signaling
Figura 3: distribuzione delle sequenze identificate secondo il loro coinvolgimento in diversi processi cellulari,
secondo il vocabolario di Gene Ontology (www.geneontology.org).
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