complete issue - European Annals of Allergy and Clinical Immunology

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Issn 1764-1489
Volume 46 N. 5/2014 – September 2014
European Annals
of Allergy and
Clinical Immunology
THE OFFICIAL JOURNAL OF AAITO | ASSOCIAZIONE ITALIANA ALLERGOLOGI IMMUNOLOGI TERRITORIALI E OSPEDALIERI
THE OFFICIAL JOURNAL OF SPAIC | SOCIEDADE PORTUGUESA DE ALERGOLOGIA E IMUNOLOGIA CLINICA
Proteomic analysis of human nasal
mucosa: different expression profile
in rhino-pathologic states
5/2014
Shrimp allergy beyond Tropomyosin
in Italy: clinical relevance of Arginine
Kinase, Sarcoplasmic calcium binding
protein and Hemocyanin
An unusual case of occupational
asthma in a part time magician.
He has got an allergy surprise
from his top hat!
A plausible allergy to peanut revealed
only by Immunoblot
A case of long-undiagnosed
Common Primary Immunodeficiency
in adulthood
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European Annals of Allergy and Clinical Immunology
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collects reviews, original works and case reports concerning etiology,
diagnosis and treatment of allergic and immunological disorders
includes a section of information coming
from the main international health associations and authorities.
Indicato SOLO negli adulti, al di sopra dei 18 anni
1 - Bodzenta-Lukaszyk A et al., Efficacy and safety profile of fluticasone/formoterol combination therapy compared individual components
administered concurrently in asthma: a randomised controlled trial. Curr Med Res Opin. 2013 Feb 20.
2 - Flutiformo® - Riassunto delle caratteristiche di prodotto
3 - Dissanayake S et al., Fluticasone/formoterol: a new single-aerosol combination therapy for patients with asthma.
Respiratory Medicine (2012) 106(S1), S20–S28
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PER LA PRIMA VOLTA IN ASSOCIAZIONE
(3)
European Annals
of
Allergy and
Clinical Immunology
THE OFFICIAL JOURNAL OF AAITO
ASSOCIAZIONE ITALIANA ALLERGOLOGI IMMUNOLOGI TERRITORIALI E OSPEDALIERI
THE OFFICIAL JOURNAL OF SPAIC
SOCIEDADE PORTUGUESA DE ALERGOLOGIA E IMUNOLOGIA CLINICA
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Marcello Zambito
162
Author Guidelines
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accept for publication suitable manuscripts dealing with the aetiology, diagnosis, and treatment of allergic and immunologic
diseases. These might include the study of methods of controlling immunologic and allergic reactions, human and animal models of hypersensitivity and other aspects of basic and
applied clinical allergy in its broadest sense.We encourage case
reports that focus on topic(s) of extreme contemporary interest.
Paper reporting the results of drug trials will be considered.
European Annals of Allergy and Clinical Immunology also
publishes solicited and usolicited review articles on subjects of
topical interest to clinical and experimental allergy.
Manuscript
We request that all manuscripts should be submitted online
through our web-based peer review system.
Submitted contributions are accepted for publication on the basis of scientific interest and relevance, at the final discretion of
the Editors in Chief, who will have blinded written evaluations
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will receive an electronic page proof for review and approval,
following which the manuscript is published in the print journal and on the journal website.
Following acceptance, Authors are also requested to return both
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pages, around 300 lines.
Manuscripts should be typewritten (double spacing) on one side
of the paper; on a separate sheet, should bear the title of the
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with the name of institution where the work was done.
Generally, papers should be divided into the following parts and
in the order indicated:
1. Summary and key words: english, limited to 15 lines.
2. Introduction: containing the reasons for doing the work.
3. Materials and methods.
4. Results: these should be given concisely; the use of tables
and figures to illustrate the same results will only rarely be
allowed.
5. Discussion: the presentation of results should be separated
from a discussion of their significance.
6. References.
Units and Abbreviations
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1 on the text.
References
References should be in the order:
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Bodtger U, Linnegerg A. Remission of allergic rhinitis: An 8-year
observational study. J Allergy Clin Immunol 2004; 114(6): 1384-8.
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Table of Contents
Original Articles
Proteomic analysis of human nasal mucosa: different expression profile in rhino-pathologic states . . 164
M. Gelardi, R.A. Siciliano, F. Papa, M. F. Mazzeo, E. De Nitto, N. Quaranta, R. Lippolis
Shrimp allergy beyond Tropomyosin in Italy: clinical relevance of Arginine Kinase,
Sarcoplasmic calcium binding protein and Hemocyanin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
M.G. Giuffrida, D. Villalta, G. Mistrello, S. Amato, R. Asero
Case Reports
An unusual case of occupational asthma in a part time magician.
He has got an allergy surprise from his top hat! . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
G. Liccardi, L. Billeri, M. Foglia, C. Sapio, M.A.R. De Giglio, G. D’Amato
A plausible allergy to peanut revealed only by Immunoblot. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
C. Richard, S. Jacquenet, D.A. Moneret-Vautrin
A case of long-undiagnosed Common Primary Immunodeficiency in adulthood. . . . . . . . . . 184
D. Tirotta, V. Durante
ORIGINAL ARTICLES
Eur Ann Allergy Clin Immunol
Vol 46, N 5, 164-171, 2014
M. Gelardi1, R.A. Siciliano2, F. Papa1, M. F. Mazzeo2, E. De Nitto1, N. Quaranta1,
R. Lippolis3
Proteomic analysis of human nasal mucosa:
different expression profile in rhino-pathologic states
Department of Basic Medical Sciences, Neurosciences and Sense Organs, University of Bari, Italy
Institute of Food Sciences, Italian National Research Council (CNR), Avellino, Italy
3
Institute of Biomembranes and Bioenergetics, Italian National Research Council, (CNR) Bari, Italy
1
2
Key Words
Human nasal mucosa; rhinitis;
two-dimensional electrophoresis;
mass spectrometry; proteomics
Corresponding author
Dr. Rosa Lippolis
Institute of Biomembranes and
Bioenergetics (IBBE)
National Research Council (CNR)
c/o Department of Basic Medical Sciences
Neurosciences and Sense Organs
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Phone: +39 080 5448531
Fax: +39 080 5448538
E-mail: [email protected]
Summary
Background. Rhinitis comprises several diseases with varying causes and different clinical
manifestations and pathological features, but treated as a single clinical disorder. As heterogeneous disease, proper differential diagnosis is useful to delineate appropriate therapeutic intervention. Comparative proteomic investigation was aimed to provide information for specific
differentially expressed proteins in rhino pathologic state, that could be used for diagnostic
purpose and therapeutic monitoring. Methods. Proteins extracted from nasal mucosa cells of
patients with different features of rhinitis and from control subjects, were separated by 2-DE.
Proteins differentially expressed were identified by mass spectrometry (MS). Results. Comparative proteomic analyses led to the identification of eighteen proteins differentially expressed in
patients with rhinitis, mainly related to cell defense and innate and acquired immunity. From
that, at least one protein can be a possible candidate as biomarker of disease.
Introduction
The nasal mucosa tissue is a complex organ responsible for
several functions of the nasal airway and, together with the
osteo-meatal complex, is regarded as the critical area of the nasal cavity in the pathogenesis and treatment of various pathologic conditions. Rhinitis is one of the most common health
care problems affecting a high percentage of the population
and having a significant adverse effect on life quality and daily
functioning (1). Historically treated as a single clinical disorder, rhinitis comprises several diseases with varying causes,
each one characterized by distinct clinical manifestations and
pathological features. These include allergic rhinitis affecting
30% of the population, non-allergic vasomotor rhinitis “cellular” (NARES, NARMA, NARESMA) affecting less than
15% of the population and nasal polyposis affecting 4% of
the population (2-3). Many aspects of disease pathophysiology still remain unknown. Currently, clinical diagnosis and
determination of the therapeutic effects mainly depend on the
observation of nasal mucosal changes as clinical presentations,
cellular and molecular characteristics. As it is a heterogeneous
disease, proper differential diagnosis is required to delineate
appropriate therapeutic intervention. This aspect includes
methods for defining disease-specific differences. Proteomics
is a modern approach aimed at decoding information con-
Proteomic analysis of human nasal mucosa: different expression profile in rhino-pathologic states
tained in genomic sequences in terms of protein structures and
functions as well as in the control of biological processes and
pathways. In the biomedical field, the comprehensive study
of the cell proteome is providing insight into the molecular
mechanisms of a variety of physiopathological processes and
disease states. The potential of proteomics in identifying disease biomarkers is promising. However, this potential has yet
to be explored across different subsets of patients with rhinitis.
In this respect, a comprehensive analysis of protein components of nasal mucosa cells could be useful for evaluating the
protein factors that are altered in pathologic states.
In the present study, comparative proteomics was applied to
characterize the nasal mucosal proteome and identify protein
differentially expressed in nasal mucosa cells of patients affected
by different rhino-pathologic diseases.
165
Skin prick test and nasal cytology
Demographics and sample collection
Allergic sensitization was assessed by skin prick test (4) using a
definite panel of allergens (100 IR/mL), including house dust
mites (Dermatophagoides farinae and Dermatophagoides pteronyssinus); cat; dog; grass mix; Compositae mix; Parietaria judaica;
birch, hazel and olive trees; Alternaria tenuis; Cladosporium; and
Aspergilli mix) (Stallergenes, Milan, Italy).
Equivocal skin test results were further investigated by a CAPRAST assay (Phadia, Uppsala, Sweden). Endoscopic examination was performed with a 3.4 mm diameter of flexible fiberscope ENT 2000 (Vision Sciences®, USA). Patients were rated
according to the following objective criteria:
1. Presence of intranasal anatomic alterations (septal deviation,
cartilaginous spurs, Concha bullosa, intranasal tumors).
2. Mucosal appearance (hyperemia, edema, atrophy, areas of
de-epithelialization).
3. Type of secretions (serous, mucous, pus, hematic, exudate-clotted scabs) on the basis of the prick test and nasal cytology.
A case-control study was performed in the Rhinology Clinic of
the Otolaryngology Unit of the University of Bari (Italy). Ethical approval and informed consent were obtained from participating institutions and individuals, respectively. In total eight
volunteers, four patients with rhinitis and four control subjects
were recruited for sample collection. The patient’s history was
taken to determine the presence of a familiar disease (atopy,
asthma and ASA sensibility). The medical case history was also
determined to gain suitable information on asthma, aspirin allergy, headache and/or facial pain, nasal obstruction, type of rhinorrhea, itch, sneezing, daytime or night-time cough, halitosis,
postnasal drip and fever.
Nasal cytology was performed by anterior rhinoscopy. Nasal
mucosa cells were collected from the middle portion of the inferior turbinate by a non-invasive scraping procedure (5). An
aliquot of samples was placed on a glass slide, fixed by air-drying
and then stained by the May-Grunwald Giemsa method (Carlo Erba, Milan, Italy). The slide was observed under a Nikon
E600 light microscope (Nikon, Canada) equipped with a digital
camera (Nikon “Coolpix 3:34”) for the acquisition of microscopic images. Cell preparations were qualitatively evaluated to
confirm the collection of a sufficient number of intact cells and
the absence of evident contamination by blood cells caused by
Materials and methods
Table 1 - Clinical and cytological characteristics of the subjects examined.
Control Subjects
Age
Sex
Prick test
Nasal Cytology
Diagnosis
Control 1
59
F
Neg.
Neg.
Negative
Control 2
24
F
Neg.
Neg.
Negative
Control 3
25
M
Neg.
Neg.
Negative
Control 4
55
M
Neg.
Neg.
Negative
Patient 1
32
F
Neg.
E++++/Mas+++++
NARESMA
Patient 2
23
F
Neg.
E+++
NARES
Patient 3
34
M
Parietaria. Cypress.
N+++
E+/Mast+
Allergic rhinitis
Patient 4
26
M
Olive, Cypress, Ep. Cat
N+++
E++++/Mast++++
Allergic rhinitis with
Nasal polyposis
Rhino-pathologic subjects
166
occasional bleeding. For the rhinocytogram analysis, 50 microscopic fields were read at a magnification of 1000 × to assess the
presence of normal and abnormal cellular elements, along with
microscopic features (spots, special inclusions, etc.) important
for diagnosis. Cell counts, bacterial and fungal analysis, were
carried out by a semi-quantitative grading (6). Based on prick
test results and nasal cytology results, patients were subdivided
into subjects with non-allergic and allergic rhinitis (table 1).
Cellular forms were further subdivided based on their cytotype
as follows: non-allergic rhinitis with eosinophils and mast cells
(NARESMA; eosinophils > 20% and mast cells > 10%) (figure
1, Patient 1); non-allergic rhinitis with eosinophils (NARES;
eosinophils > 20%), (figure 1, Patient 2); allergic rhinitis with
neutrophil and eosinophils, (figure 1, Patient 3); allergic rhinitis with nasals polyposis, neutrophils eosinophils and mast cells,
(figure 1, Patient 4).
Figure 1 - Nasal
cytology: control normal
subjects; Patient 1:
non-allergic rhinitis with
mast cells and eosinophils,
(NARESMA); Patient. 2:
non-allergic rhinitis with
eosinophils (NARES);
Patient. 3: allergic rhinitis; Patient. 4: allergic
rhinitis with nasals polyposis. E: eosinophils; M:
mast cells; N: neutrophils.
May-Grünwald Giemsa
staining, original magnification X 1000.
Figure 2 - Overview of
the 2-DE maps of control and patient subjects.
Protein spots showing
different intensity in the
2-DE maps of the four
patients with respect
to control subjects are
indicated by match ID
numbers.
167
Figure 3 - Quantitative analysis of spots showing different intensity. Each spot is indicated with a match ID.
Figure 4 - Quantitative analysis of spots containing Albumin. Each spot is indicated with a match ID.
Protein extraction from nasal mucosa cells
Three samples of mucosa cells from each subject were collected
separately during the pollen season. Immediately after scraping, recovered cells were washed with ice-cold PBS, pelleted
and preserved at -80°C until analysis. To prepare soluble protein fractions, pelleted cells were thawed on ice and suspended
in lysis buffer containing 7 M urea, 2 M thiourea, 4% (w/v)
3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), 50 mM 1,4-dithio-DL-threitol (DTT) and
protease inhibitors cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
USA).
Cell lysis was achieved by sonication cycles on ice (10 × 10 s
pulses with a 30 s interval between each ultrasonic cycle). The
168
sample was clarified by centrifugation at 13 000 rpm for 10
min at 4°C to remove cellular debris. Protein concentration was
determined using the Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), according to the manufacturer’s
instruction (7). Soluble protein samples were stored at -80°C
until use.
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight
- Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) analyses performed
on a Voyager DE PRO mass spectrometer (Applied Biosystems
Foster City, CA) and database searches (12).
Two-dimensional gel electrophoresis (2-DE)
Validation of nasal cell samples
Proteins were separated by 2-DE essentially as previously described (8,9). 250 μg of each protein sample, diluted in the
IPG strip rehydration buffer, containing 8 M urea, 2% (w/v)
CHAPS, 2% (w/v) DTT, was loaded on a 24-cm IPG strip with
a linear 3-10 pH gradient. Isoelectric focusing was carried out at
20°C using the Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System (GE
Healthcare, Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden) to 70
kVh. After isoelectric focusing the IPG strips were equilibrated
for 15 min in the sodium dodecyl sulphate (SDS) equilibration
buffer (50 mM Tris/HCl, pH 8.8, 6 M urea, 30% (v/v) glycerol, 2% (w/v) SDS, containing 1% (w/v) DTT) and for further
15 min in the same equilibration buffer containing 2.5% (w/v)
iodoacetamide and trace of bromophenol blue. The second-dimensional gel electrophoresis (SDS-PAGE) was carried out using the vertical slab separation unit Ettan Dalt II System (GE
Healtcare). Homogeneous 12,5% polyacrylamide gel was used
in a Laemmli buffer system (10) at a constant current of 15
mA gel-1 and at 10°C. The gels were stained using Brilliant blue
G-colloidal concentrate (Sigma, St. Louis, MO, USA) (11).
Nasal mucosa cells samples from four controls and four rhino-pathologic patients with 34,75 years mean age (range 2359 years) were obtained by a non-invasive nasal scraping procedure followed by their quality evaluation by cytology (table
1). Control samples showed a normal cytology, characterized by
numerous well-formed ciliated cells and some rare neutrophils
(table 1 and figure 1, Control). The cytological analysis of nasal
mucosa of the four rhino-pathologic patients showed a significant infiltration of inflammatory cells with variable percentages
of neutrophils, eosinophil and mast cells (figure 1, P1, P2, P3,
P4 and table 1).
Image analysis of protein patterns
The coomassie-stained 2-DE gels were scanned with an image
scanner at 300 dpi resolution to acquire gel images. Image analysis was performed as reported (12), using Image Master 2-DE
software v. 6.0 (GE Healthcare). Briefly, spot detection was carried out using the optimal values for spot intensity, spot area
and saliency determined by applying real-time filters in order
to minimize the detection of artefacts and to maximize the real
spot detection. Three gels from each sample were used to create
the five match sets with one gel included from each of three
protein preparation repeats. Relative spot volume (% volume),
i.e. digitized staining intensity integrated over the area of the individual spot divided by the sum of volume of all spots in the gel
and multiplied by 100, was used for spot quantification (13).
The match identification number (ID) was used to identify all
spots in a match. Spots present in all the gels of the five classes
and exhibiting an intensity difference between the five samples
with a P value < 0.05, using the two-tailored Student’s t-test,
were considered to be differentially expressed.
Spots of interest were excised from 2-DE gels and in-gel digested using trypsin (14). Protein identification was achieved by
Results
Proteome analysis of nasal mucosa
Comparative proteomic analysis of the nasal mucosa cells from
controls and rhino-pathologic subjects was performed integrating 2-DE and mass spectrometric methodologies. Proteomic
maps showed several hundreds of well-resolved protein spots
distributed over a wide range of pI values and molecular masses
(figure 2). The overall position and number of protein spots
observed in the 2-DE maps were similar in the four control
samples (476 ± 24, 458 ± 32, 470±19, 481± 57 for C1, C2,
C3, and C4 respectively), and in the four patients samples (459
± 37, 448 ± 43, 467 ± 83 and 489 ± 63 for P1, P2, P 3 and P4
respectively). For each subject, three biological samples were obtained and each sample was run in triplicate (figure 1-S and 2-S,
in supplementary materials). The percent of matches between
gels from the same class and from the five different classes was
similar (around 65%). In order to analyze proteins differentially
expressed in the four patient samples with respect to the control samples, only the matched spots present in all gels were
investigated. Among this group of spots, only those showing a
different intensity with a P < 0.05 were considered for further
mass spectrometric analyses. Using this constrained statistical
analysis, no significant variation of spot intensity was revealed
comparing the 2-DE maps of the four-control subjects that can
be therefore considered as homogeneous reference to pathological samples. Eighteen spots marked in figure 2, had different
intensity in the 2-DE maps of the four patients samples compared to the control subjects. The data clearly indicated that
differences in the proteome profile of the four patients samples
were mostly affected by the specific pathology. Spots of interest
169
Table 2 - Identification of proteins differentially expressed in nasal mucosa cells by PMF strategy. Functional classification according to
Gene Ontology and regulation of protein expression level in the four patients.
2-DE maps Image analysis (fold change)d
Spot
IDa
Protein Name
559
Chain A, Human
Mitochondrial Aldehyde
Dehydrogenase
564
Aldehyde dehydrogenase
Gene
Biological process/
Molecular function
Accession number
(NCBInr)
MW
(KDa)
pI
P1
P2
P3
P4
ALDH2
carbohydrate metabolic
process / aldehyde dehydrogenase (NAD) activity
gi|328877202
54875
5.69
(1,04)
(-1,2)
1,17
Down
(-1,85)
ALDH3A1
cellular aldehyde metabolic
process / aldehyde dehydrogenase (NAD) activity
gi|178375
50703
5.99
Down
(-3,5)
Down
(-3,1)
(1,2)
gi|178375
50762
6,00
Down
(-3,45)
Down
(-2,87)
1,2
Down
(-4,31)
platelet degranulation
transport
response to stress
response to nutrient
blood coagulation / DNA
binding
antioxidant activity
gi|3212456
68425
5,60
(-1,29)
Up
(3,49)
1,008
Up
(3,14)
gi|3212456
68425
5,61
(1,085)
Up
(4,54)
(1,3)
Up
(4,41)
gi|3212456
68425
5.62
(-1,3)
Up
(3,5)
(-1,1)
--
--
567
Aldehyde dehydrogenase
ALDH3A1
440
Chain A, Crystal
Structure of Human
Serum Albumin
ALB
452
Chain A, Crystal
Structure of Human
Serum Albumin
ALB
453
Chain A, Crystal
Structure of Human
Serum Albumin
ALB
b
c
Down
(-4,0)
Up
(3,1)
898
Albumin, isoform CRA_p
ALB
gi|119626079
23183
8.20
-- e
0.61±0.31f
875
Hemoglobin subunit beta
HBB
Oxygen transport / heme
binding
gi|4504349
16102
6.75
UP
(2,1)
UP
(2,9)
(-1,6)
Down
(-2.0)
867
Chain A, Human
Peroxiredoxin 5
PRDX5
cellular response to reactive
oxygen species / antioxidant
activity
gi|46015018
18327
7.94
(-1,7)
(-1,7)
Down
(-4,6)
Down
(-3,9)
834
Glutathione S-transferase
GSTA2
glutathione metabolic process / glutathione transferase
activity
gi|825605
25650
8.51
Down
(-13,9)
--
Down
(-6,5)
--
836
842
Chain A, Glutathione
Transferase P1-1
GSTP1
cellular response to reactive
oxygen species /
glutathione transferase activity
gi|11514451
23394
5.74
Down
(-3,5)
Down
(-3,1)
(1,2)
Down
(-4,0)
566
Selenium-binding protein1 isoform
SELENBP1
protein transport /
selenium binding
gi|16306550
52928
5.93
(-1,1)
(-1,7)
(1,8)
Down
(-2,0)
525
Retinal dehydrogenase 1
ALDH1A1
ethanol oxidation /
Ras GTPase activator activity
aldehyde dehydrogenase
(NAD) activity
gi|21361176
55454
6.30
(-1,5)
(-1,58)
(1,26)
(1,37)
869
Thioredoxin isoform 1
TXN
cell redox homeostasis /
peptide disulfide oxidoreductase activity
gi|50592994
12015
4.82
--
Down
(-2,8)
--
--
880
Protein S100-A11
S100A11
negative regulation of DNA
replication /
calcium ion binding
gi|5032057
11847
5.56
immune response /
serine-type endopeptidase
inhibitor activity
gi|239552
innate immune response /
lipid binding
gi|114319015
692
848
Squamous Cell
Carcinoma Antigen
SERPINB4
Palate lung and nasal
epithelium carcinoma
associated protein
BPIFA1
44564
25355
6.35
5.65
(1,0)
Down
(-2,5)
(-1,5)
(-1,5)
UP
(1,8)
down
(-2,0)
(1,3)
UP
(2,4)
--
-(1,4)
Down
(-2,1)
b
c
ID Spot Identification Number.
Theoretical molecular weight (kDa).
Theoretical isoelectric point.
Changes in protein expression levels are reported as the ratio between the normalized protein spot volume from the 2-DE map of Patient (1-4) and that of Control (Vpatient/VControl)
for up-regulated proteins while for down-regulated proteins as the negative reciprocal values (-Vpatient/Vcontrol). Only fold change > 2 are indicated as up or down regulation.
e
The symbol -- indicates that spot containing this protein was not detected in the 2-DE maps of this patient.
f
Spot containing this protein is only present in the 2-DE map of P2.
a
d
170
were identified by Peptide Mass Fingerprint (PMF) strategy and
results are summarized in table 2. The differentially expressed
proteins were classified on the basis of their biological and molecular functions by means of Gene Ontology and belonged to
several functional categories as follows:
(i) proteins involved in cell detoxification and cell defense:
glutathione S-transferase A-2 (GSTA-2), spot ID 834, under
expressed in all the four rhino pathologic subjects, glutathione
transferase P1-1 (GSTP-1) spot ID 842, under expressed in P1,
P2 and P4, chain A, human peroxiredoxin-5 (PRDX5), spot
ID 867, under expressed in all the four pathologic samples, and
selenium binding protein (SELENBP-1), spot ID 566, under
expressed in P2 and P4;
(ii) proteins related to immune responses: squamous cell carcinoma antigen (SERPINB4), spot ID 692, under expressed
in P2 and over expressed in P1 and P4, and palate lung and
nasal epithelium carcinoma associated protein (spot ID 848),
PLUNK, under expressed in P1, P2 and P4;
(iii) Enzymes related to carbohydrate metabolism: chain A, human mitochondrial aldehyde dehydrogenase (ALDH2), spot
ID 559, aldehyde dehydrogenase (ALDH3A1), which migrates
as pearl chains, spots ID, 564, 567, these two protein spots were
under expressed in the P1, P2 and P4;
(iv) oxidoreductase enzymes: retinal dehydrogenase (ALDH1A1), spot ID 525, under expressed in P1 and P2 and thioredoxin isoform 1 (TXN-1), spot ID 869, under expressed in all
the four patients;
(v) a calcium ion binding protein S100-A11 (spot ID 880), under
expressed in P2; and, finally, (vi) proteins arising from the systemic compartment: chain A, crystal structure of human serum
albumin (ALB) Spot ID. 440, 452, 453, over expressed in P2 and
P4 and haemoglobin subunit beta (HBB) spot ID 875, overexpressed in P1 and P2 and under expressed in P4. These results are
shown in figure 2, 3 and 4 and summarized in table 2.
Discussion
The field of human proteomics has the potential to become a
key tool in the characterization of disease biomarkers. In this
report, we present a proteomic analysis of nasal mucosa in patients with different rhinitis. Comprehensive proteomic profiles
of nasal mucosa cells showed high resolution and high reproducibility of the protein pattern, and allowed to obtain preliminary information about disease-related proteins.
Our results revealed that several proteins were differentially
expressed in each rhino-pathologic state (figure 2, 3 and 4).
Eighteen proteins belonging to different functional categories
were identified (table 2). The main functional groups included
proteins related to cell defense as ALDH, GSTA-2, PRDX-5,
SELENBP-1, and proteins associated with human immune response and inflammation marker as SERPINB4 and PLUNK.
These proteins were expressed at high level in the normal nasal mucosa, in line with its role in the first-line defense against
foreign particles as well as in the differentiation of immune responses (15). In patients affected by different kinds of rhinitis,
the above mentioned proteins were differentially expressed. In
particular ALDH, a carbohydrate metabolism related enzyme,
was under expressed in patients P1, P2, and P4. ALDH plays a
major role in the detoxification of exogenously and endogenously generated aldehydes and has protective effects on cells during
environmental stress. The protective action of ALDH is important, as nasal mucosa is constantly exposed to stressors mainly in
the form of cross-reacting substances. Our results could indicate
a direct relation between eosinophil presence and under regulation of ALDH. It could be assumed that the pathologic state
affects the expression level of this protein with a consequent decreased ability of mucosa cells to react to environmental stress.
Also, the expression level of GSTA2 and GSTP1, which play an
important role in protecting cells from cytotoxic reactive oxygen
species and carcinogenic agents (16), and PRDX5, an antioxidant enzyme (17), were under regulated in the four patients.
This feature could affect the cell ability to counteract stressor
action. The SERPINB4 was expressed at high level in patients
P1 and P4 and was down-regulated in patient P2. This protein
belongs to the serine proteinase inhibitor family. SERPINB4
has been reported as serological marker for more advanced squamous cell tumors of the cervix, lung, and oropharynx (18,19).
High expression of SERPINB4, as in patient P1 and P4, could
suggest the onset of a pathological process of the high and lower
airways respiratory epithelium. This finding might pave the way
to further characterization of this protein as a marker of the respiratory epithelium pathology and for therapeutic monitoring.
PLUNC is a protein specifically expressed in the upper airways and
nasopharyngeal regions. It has been suggested to be involved in inflammatory responses to irritants and can play a role in innate immune responses (20). A decreased level of PLUNC was previously
reported in the pooled nasal lavage fluid of current smokers when
compared with non-smokers (21). Our results showed that this
protein is expressed at very low level in the 2-DE maps of patients
P1 and P2 while was detected in similar amount of the control
subjects in patients P3 and P4. These distinct features could indicate a possible role of PLUNC in the pathogenesis of non allergic
rhinitis, suggesting a decreased immune response to stressors and
consequent increase of the inflammatory response of nasal mucosa
cells in these patients. Two oxidoreductase enzymes were also differentially expressed: ALDH1A1, under expressed in patients P2, P3
and P4, and TXN-1, expressed at very lower amount in patient P2
and absent in the other three patients. ALDH1A1 can play a critical role in the maintenance the mucociliary phenotype of epithelial
cells in the upper respiratory tract (22), while TXN-1 is a hydrogen donor for enzymes involved in reductive reactions and there-
fore can play a role in maintaining a reducing cell environment
protecting from oxidative stress. (23). In addition, this protein has
anti-apoptotic effect by binding to the apoptosis signal-regulating
kinases (24). The expression level of TXN-1 is particularly important in the determination of the pathophysiologic state of the cell,
therefore, it could be a potential marker for diagnostic purposes
and therapeutic monitoring of the diseases. It is worth to note the
different expression level of ALB in the four patients. In fact, this
protein was over expressed in patient P2, and P4. Diffusion of albumin across the nasal mucosa has been shown in patients with rhinitis (25), and plasma proteins, mainly albumin, could be involved in
the initial nasal process of polyposis (26).
In conclusion, our preliminary proteomic study revealed, for the
first time, that rhinitis affected the expression levels of several nasal mucosa proteins, mainly involved in cell defense and immunological response. In addition, specific protein expression pattern
was revealed for the different kind of pathologic states. Although
additional studies are needed to assess the possibility to use some
of these proteins as potential markers for diagnostic and therapeutic purposes, the present study further confirms the key role of
proteomics in providing information for a better characterization
of proteins specifically involved in each rhino-pathological state.
Acknowledgments
The authors would like to acknowledge Professor Sergio Papa
(Department of Basic Medical Sciences, Neurosciences and
Sense Organs University of Bari) for comment and support.
This work was supported by FIRB-MERIT ‘Molecular basis in
ageing-related degenerative syndrome’, MIUR (RBNE08HWLZ).
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ORIGINAL ARTICLES
Vol 46, N 5, 172-177, 2014
M.G. Giuffrida1, D. Villalta2, G. Mistrello3, S. Amato3, R. Asero4
Shrimp allergy beyond Tropomyosin in Italy: clinical
relevance of Arginine Kinase, Sarcoplasmic calcium
binding protein and Hemocyanin
Istituto Scienze Produzioni Alimentari CNR, c/o BioIndustry Park S. Fumero, Colleretto Giacosa, (TO), Italy
Allergologia e Immunologia Clinica, Dipartimento di Medicina di Laboratorio, A.O. “S. Maria degli Angeli”, Pordenone, Italy
3
Lofarma SpA, R & D, Milano, Italy
4
Ambulatorio di Allergologia, Clinica San Carlo, Paderno Dugnano (MI), Italy
1
2
Key words
Food allergy; shrimp allergy;
hemocyanin; sarcoplasmic calcium
binding protein; arginine kinase;
allergens
Riccardo Asero
Ambulatorio di Allergologia
Clinica San Carlo
Via Ospedale 21
20037 Paderno Dugnano (MI), Italy
Phone: +39 02 990 38 470
Fax: +39 02 990 38 223
Summary
Background. Little is known about the prevalence and clinical relevance of sensitization to
shrimp allergens other than tropomyosin. Objective. We detected the prevalence of arginine
kinase and sarcoplasmic calcium binding protein sensitization, and identified a high molecular weight allergen that is frequently recognized by Italian shrimp-allergic patients. Methods.
Sera from 40 shrimp-allergic patients underwent the detection of IgE specific for arginine
kinase (rPen m 2) and sarcoplasmic calcium-binding protein (rPen m 4) by ISAC 112 Microarray platform and immunoblot analysis. A high molecular weight shrimp allergen was
identified by N-terminal amino acid sequencing. Results. IgE to rPen m 2 and rPen m 4 were
found in 4/40 (10%) and 6/40 (15%) sera, respectively; two sera reacted to both allergens.
Clinically, 6/8 Pen m 2 and/or Pen m 4 reactors experienced severe allergies to shrimp. On
immunoblot, 4/6 rPen m 4-positive sera showed IgE reactivity at about 20 kDa, whereas no
rPen m 2-positive serum reacted at about 40 kDa. Nineteen (47%) sera showed IgE reactivity
at molecular weights > 60 kDa. Such profile was not associated with IgE reactivity to rPen m
2 or rPen m 4. N-terminal amino acid sequencing of the high molecular weight allergen led
to the identification of hemocyanin. Conclusion. Shrimp arginine kinase and sarcoplasmic
calcium-binding protein are minor allergens sensitizing only 10% -15% of Italian shrimp-allergic patients, but are clinically relevant. Hemocyanin is a clinically relevant high molecular
weight shrimp allergen possibly cross-reacting to house dust mite.
Introduction
Shrimp is a frequent cause of food allergy at all latitudes. Besides tropomyosin, a major allergen that was identified as long
as 18 years ago (1-3), several other allergenic proteins have been
detected in recent years, including arginine kinase (4,5), sarcoplasmic calcium binding protein (6,7), and myosin light chain
(8). Very recently, hemocyanin was identified as one further allergen in a freshwater shrimp as well in other crustaceans (9,10)
along with troponin C (10,11), triosephosphate isomerase (11),
and fatty acid binding protein (FABP) (10). Little is known
about the prevalence of sensitization to these new allergens as
well as about their clinical relevance. In a recent multi-centre
study on more than 100 Italian shrimp-allergic adult patients
investigated by immunoblot analysis and rPen a 1-specific IgE
measurements, only 41% were tropomyosin reactors, whereas
IgE reactivity at molecular weights > 60 kDa was detected in
52% of cases (12). In contrast, IgE reactivity at the molecular weights of arginine kinase (Pen m 2; 40 kDa), sarcoplasmic
calcium binding protein (Lit v 4; 20 kDa), myosin light chain
(Lit v 3; 20 kDa), triosephosphate isomerase (Cra c 8; 27 kDa),
troponin C (Cra c 6; 17 kDa), and fatty acid binding protein
Allergy to minor shrimp allergens in Italy
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
History
d
ab
X
ab
b
b
b
b
ab
b
ab
b
a
a
b
a
x
x
x
b
a
a
b
b
b
b
b
b
a
a
bd
a
a
b
a
bd
bd
a
a
b
___SPT___
Shrimp
Mite
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Neg
Pos
Pos
Pos
ND
Pos
Pos
Pos
ND
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Neg
Pos
Neg
Pos
Neg
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Neg
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
ND
Pos
Pos
Pos
Pos
Pos
Neg
Pos
Neg
Pos
Neg
173
__CAP___
Shrimp
Pen a 1
12,8
3,92
1,71
0,63
9,95
Neg
ND
0,24
ND
Neg
ND
0,28
ND
Neg
ND
Neg
ND
Neg
ND
Neg
ND
Neg
ND
Neg
ND
Neg
1,69
Neg
13,2
0,75
14,8
0,55
ND
Neg
ND
Neg
ND
Neg
ND
56,2
ND
50,6
ND
Neg
ND
Neg
3,12
Neg
7,88
Neg
ND
Neg
ND
Neg
0,18
Neg
ND
Neg
ND
Neg
ND
Neg
0,71
Neg
ND
Neg
ND
Neg
20,0
0,14
ND
Neg
ND
Neg
ND
Neg
ND
Neg
ND
Neg
____ISAC______
Pen m 1 Pen m 2 Pen m 4
10
Neg
Neg
4,3
Neg
Neg
Neg
4
4,2
0,7
Neg
Neg
neg
0,8
neg
0,6
Neg
Neg
Neg
Neg
2,3
Neg
Neg
0,8
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
1
0,4
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
2,5
Neg
2,6
Neg
Neg
3
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
77
Neg
Neg
86
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
1,1
1,3
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
0,6
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
History: a = oral allergy syndrome; b = urticaria/angioedema; d = rhinitis and/or asthma; x = anaphylaxis.
Pen a 1: IgE to tropomyosin detected by ImmunoCAP. Pen m 1, Pen m 2, and Pen m 3: IgE to different
shrimp allergens by ISAC 112 microarray.
Table 1 - Detection of IgE reactivity to Pen a 1, Pen m 1,
Pen m 2 and Pen m 4 in 40
shrimp-allergic Italian patients.
174
(15 kDa) was rather rarely observed (13% altogether). Due to
the absence of a routine assay able to detect IgE reactivity to the
new minor allergens the analysis was not pursued further. Now,
recombinant arginine kinase and sarcoplasmic calcium binding
protein are available as a routine diagnostic means in ISAC microarray assay (Thermofisher, Phadia, Uppsala, Sweden). Thus,
we measured IgE specific for these two allergens in sera from
a group of shrimp-allergic patients included in the previous
study, in order to assess their prevalence and clinical relevance
and to check whether the high molecular weight allergens detected in the previous study were polymers of Pen m 2 or Pen
m 4. Further, since high molecular weight shrimp allergens are
not currently available for in-vitro shrimp allergy diagnosis, the
N-terminal sequencing of the high molecular weight allergen
was carried out as well.
Patients and Methods
Patients
The clinical features of patients have been described in detail before (12). Briefly, the starting population consisted of 116 adults
who were selected in 15 Italian allergy centres from June to December, 2009 based on unequivocal clinical history of shrimp
allergy confirmed by positive skin prick tests (SPT) with fresh
material and/or commercial shrimp extract. In most cases, patients experienced systemic symptoms (urticaria with or without
angioedema, asthma, or anaphylaxis) following the ingestion of
shrimps. Since many of the participating centers were not sufficiently acquainted with emergency practice or did not have
proper facilities to manage systemic allergic reactions, in view of
the severity of many of the reported allergies, confirmative oral
challenges (either blinded or open) were carried out only in doubt
cases. Coded serum samples were kept at -20°C until in-vitro tests
were carried out. 40 randomly selected serum samples out of 64
still available underwent the detection of IgE to arginine kinase
and sarcoplasmic calcium binding protein. 28/40 patients had a
history of systemic reactions. Nine were sensitized to tropomyosin (rPen a 1), as shown by IgE levels > 0.1 kU/l on ImmunoCAP
(ThermoFisher, Uppsala Sweden) (table 1).
Detection of IgE to arginine kinase and sarcoplasmic calcium binding protein
The ISAC 112 Microarray platform (Thermofisher, Phadia,
Uppsala, Sweden) was used to detect serum IgE specific for
arginine kinase (rPen m 2) and sarcoplasmic calcium-binding
protein (rPen m 4) as such allergens are still unavailable in the
ImmunoCAP as single allergens. Reactions sites were incubated
with 30 µL of patients’ serum for 2 hours. After rinsing, washing, and drying, allergen-specific IgE complexes were stained
with a fluorescence-labelled anti-human IgE for 30 min. After
further washings, a laser scanner took fluorescence readings and
results were transformed into numerical data by comparison
with a reference serum standardized against ImmunoCAP IgE.
As a consequence the results, expressed as ISAC standardized
units (ISU/l), are indirectly linked to WHO IRP 75/502 IgE
standard. Levels > than 0.3 ISU/l were regarded as positive, following manufacturer’s recommendations.
Immunoblot analysis
Patients’ sera underwent immunoblot analysis at Lofarma Laboratories, Milan, Italy. Raw shrimp (Pandalus borealis) was homogenized and extracted (5%) in 0.1 M phosphate-buffered
saline (PBS), pH 7.4, under shaking for 2 hours at 4°C. The
protein content, measured after Bradford method, was 1.2 mg/
ml. Immunoblots were carried out under reducing conditions.
The extract was mixed with LDS sample buffer (40% glycerol
and 4% lithium dodecyl sulfate, to prevent adhesion of proteins to glassware and plastic, 4% Ficoll-400, 0.8 M triethanolamine-Cl, pH 7.6, 0.025% phenol red, 0.025% Coomassie
G250, 2 mM EDTA disodium (Nupage Bis-Tris, Novex, Life
Technologies, Milan) and 5% β-mercaptoethanol. The samples
were then denaturated by heating at 100°C for 10 minutes.
Electrophoresis of shrimp extract (25 µg/lane) was carried out in
a 10% polyacrilamide precast gel (Nupage Bis-Tris, Novex, Life
Technologies) at 180 mA for 1 h. The resolved proteins were
transferred for 1 h onto a nitrocellulose membrane according to
Towbin et al. (11). The membrane was saturated with 0.1 mol/L
tris-buffered saline containing 5% fat-free milk powder and incubated for 16 h at 4°C with sera (dilution 1:1.5 in saturation buffer). After 3 washings, bound specific IgE were detected by peroxidase-conjugated anti-human IgE antibodies from goat (1:4000
in saturation buffer; Biospacific, Emeryville, CA, USA) and using
an ECL western blotting kit (GE Healthcare) as substrate.
High molecular weight allergen identification
The high molecular weight allergen protein, detected by the use
of a pool of sera reactive on immunoblot analysis (no. 17, 18, 19,
20, 26, 27 in table 1; figure 1), was identified by N-terminal
amino acid sequencing technique. The selected band was excised
from SDS-PAGE gel, passively eluted and the N-terminal amino
acid sequence analysis was carried out on a Procise 492 protein sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) as described
by Pessione et al. (14). The amino acid sequence was searched
using the MS-Homology software at Protein Prospector web site
(http://prospector.ucsf.edu/prospector/) against both UniProt
KB 2012.03.21 and NCBI nr. 2012.12.3 database. The parameters used were: Order selected Decapoda, no limit for Protein
MW, from 1 to 5 possible amino acid changes allowed.
Figure 1 - Immunoreactive band
submitted to N-terminal amino
acid sequencing. Lane 1: molecular weight markers; Lane 2: SDSPAGE of shrimp extract; Lane 3:
IgE reactivity to the high molecular shrimp allergen by a pool of
sera from patients allergic to both
shrimp and mites; Lane 4: negative
control serum.
Ethics
Since this study was an extension of a former one (12) which had
been carried out with diagnostic purposes on patients who presented spontaneously in the clinics for clinical evaluation of their shrimp
allergy and had already been approved by the local review boards,
no further permission by a central ethical committee was required.
Results
IgE to arginine kinase and sarcoplasmic calcium-binding protein
Table 1 summarizes the shrimp-induced allergic reactions experienced by study patients along with the skin reactivity to
shrimp and house dust mite and the results of both ImmunoCAP and ISAC assays. A total of 8/40 (20%) patients scored
positive for one of the two allergens studied. IgE to rPen m 2
and rPen m 4 were found in 4 (10%) and 6 (15%) cases, respectively; two sera contained IgE against both arginine kinase and
sarcoplasmic calcium-binding protein. Although ISAC is only
a semi-quantitative analysis, specific IgE levels ranged between
0.8 and 4.0 ISU for rPen m 2, and between 0.6 and 4.2 ISU for
rPen m 4. Co-sensitization to arginine kinase and/or sarcoplas-
175
mic calcium-binding protein and to tropomyosin was observed
only in one case (#35, table 1).
Clinically, 6 Pen m 2 and/or Pen m 4 reactors had a history
of systemic allergic reactions to shrimp (anaphylaxis in 1 case,
urticaria/angioedema in 5 cases), whereas 2 had a history of oral
allergy syndrome. Interestingly, anaphylaxis occurred in one patient co-sensitized to both allergens.
House dust mite tropomyosin hypersensitivity
Although the majority of patients (29/38 [76%]) showed a double reactivity to shrimp and house dust mite on skin tests, only
6 (21%) of these reacted to tropomyosin, an allergen that has
been considered as the major cause of the cross reactivity between house dust mite and shrimp. Other 6 mite/shrimp reactors were sensitized to either Pen m 2 and/or Pen m 4.
Of the 8 shrimp-allergic patients not sensitized to house dust
mite only 1 reacted to tropomyosin and another to Pen m 4.
Immunoblot analysis
Shrimp immunoblot analysis scored positive in 28/40 cases (figure 2). Four out of 6 rPen m 4 reactors showed IgE reactivity
at about 20 kDa; the two sera scoring negative at this M.W.
were those showing the lowest rPen m 4 IgE levels on ISAC
microarray (0.8 and 0.6 ISU, respectively). No one of the 4 rPen
m 2-positive sera showed IgE reactivity at about 40 kDa on immunoblot analysis; both co-sensitized patients showed an IgE
reactivity at 20 kDa only. Nineteen sera showed IgE reactivity
at molecular weights > 60 kDa. Such profile was not associated
with IgE reactivity to rPen m 2 or rPen m 4.
Identification of the high molecular weight allergen
The sequence obtained by the N-terminal amino acid sequencing matched with a high grade of homology with the hemocyanin subunit 3 from Homarus americanus (the American lobster) (table 2). Sequences of other hemocyanins from different
crustaceans further confirmed our identification.
Figure 2 - Immunoblot analysis of sera
from patients 1-28. Patients’ numbers
correspond to those in table 1.
176
Table 2 - Identification of the immune reacting protein from fig. 2.
Species
Amino acid sequences
Pandalus borealis
(our sequence)
1
Homarus americanus
9
Cherax destructor
7
Palinurus interruptus
12
Palinurus vulgaris
6
Protein name
UniProt
Entry
NVAQXQHDVNFL
MW
Homology
> 100,000 Da
-
2,903 Da
92%
3,513 Da
67%
NVAQKQHDVNFL
Hemocyanin subunit 3
(fragment)
P82298
1
SDAQKQHDVNYL
Hemocyanin C chain
(fragment)
P83172
1
LLAQKQHDVNYL
Hemocyanin C chain
P80096
75,874
67%
DNAHKQHDVNHL
Hemocyanin
P80888
75,675
58%
X, amino acid not identified by the N-terminal amino acid sequencing; the database contains only the N-terminal part of the molecules.
1
Discussion
One of the aims of the present study was to detect the prevalence
of hypersensitivity to two recently described shrimp allergens,
namely sarcoplasmic calcium binding protein and arginine kinase, in a group of allergic subjects, looking also at their association with tropomyosin sensitization, at their clinical relevance,
and at their possible relationship with IgE reactivity against
high M.W. shrimp allergens that was frequently observed in our
previous study. We demonstrated that both proteins are minor
allergens (i.e., recognized by < 50% of the allergic population),
as in our population sensitization rate ranges between 10% and
15%. Both sarcoplasmic calcium protein sensitization and arginine kinase sensitization were independent on sensitization to
the major allergen, tropomyosin, as only one case of co-sensitization was recorded. Both allergens were found to be clinically
relevant as sensitized patients experienced systemic symptoms in
7/8 cases, including one case of anaphylaxis. Finally, our investigations ruled out the possibility that the high molecular weight
allergens frequently recognized by Italian shrimp-allergic were
actually polymers of Pen m 2 or Pen m 4. The immunoblot assays scored positive at about 20 kDa in most cases of sarcoplasmic calcium-binding protein allergy, whereas no IgE reactivity
was observed at about 40 kDa in patients sensitized to arginine
kinase. The fact that shrimp extract was heated at 100°C for
10 min might have degraded the heat-sensitive arginine kinase,
thus explaining the lack of reactivity at 40 kDa by immunoblotting for sera showing IgE against Pen m 2 in microarray.
The second aim of the present study was to identify the high
molecular weight shrimp allergen so frequently recognized by
Italian allergic patients. N-terminal amino acid sequencing
analysis led to the identification of this allergen as hemocyanin. The first report of hemocyanin as a possible food allergen
appeared as long as more than 20 years ago (15). In that study,
patients allergic to different sorts of marine gasteropods (limpet
and Bolinus brandaris) but also to house dust mite were shown
to co-recognize hemocyanin by direct RAST and inhibition assays using commercial hemocyanin from Keyhole limpet (15).
In a subsequent study (16), the same group detected a possible
involvement of hemocyanin in house dust mite-allergic patients
who experienced severe asthmatic reactions following the ingestion of the terrestrial gasteropod snail. Much more recently, a
study from Thailand identified hemocyanin as an allergen in
a freshwater shrimp (9); in this study, the authors concluded
that this allergen is not cross-reactive. Hemocyanin is an oxygen
carrier protein representing 75-95% of total proteins in hemolymph of crustaceans (9). In the Decapoda order, hemocyanin
is present in the predominant form of hexamers. There are three
categories of crustacean hemocyanins called α (1 or A), β (2 or
B) and γ (3 or C). We identified the hemocyanin C subunit
as an allergen in our shrimp-allergic patients. Some crustacean
hemocyanins are demonstrated to be glycosylated (17). Though
hemocyanin subunits are reportedly species-specific (18-21), it
cannot be excluded that some parts of the protein are phylogenetically conserved and bear allergenic activity. In our previous
study (12), we observed that many patients sensitized to high
molecular weight shrimp allergens showed house dust mite hypersensitivity as well, and clearly showed that HDM was able to
strongly inhibit shrimp IgE reactivity in most cases. This finding is in keeping with that of the older study (15). Further, in
a 2001 review article, Sidenius and co-workers (22) stated that
“most often, more than one allergen is involved in the HDM
snail cross-reactivity in a patient”. One further aspect that deserves to be discussed is the different molecular weight of hemocyanin detected by Thai researchers (about 60-80 kDa; Ref 9)
and by us (about 100 kDa). It is well known that the molecular
weight of homologous proteins in different species may vary
and that this could depend on a different degree of glycosilation. In our hands, hemocyanin appeared clinically relevant as
most patients showing predominant reactivity against shrimp
allergens > 90 kDa (# 17-20, 22, 23, 26-28 in figure 2) had a
history of systemic reactions to shrimp, with anaphylaxis in 3
cases (table 1).
In conclusion, we suggest that hemocyanin is a clinically relevant shrimp allergen and that it is possibly cross-reactive with
shrimp and house dust mite.
Acknowledgements
The authors thank the following colleagues for selecting shrimp-allergic patients whose sera were used for the present study:
R. Ariano, Ospedale di Bordighera, Bordighera (IM), Italy;
M.E. Conte and G.E. Senna, U.O. Allergologia, Azienda
Ospedaliera, Verona, Italy;
M.A. Crivellaro, Servizio di Allergologia Dipartimento di Medicina Ambientale e Salute Pubblica, Università di Padova, Padova Italy;
M. de Carli, Dipartimento di Medicina Interna, Az Ospedaliero-Universitaria Santa Maria della Misericordia, Udine, Italy;
F. della Torre, I.N.R.C.A.-I.R.C.C.S. U.O.C. Pneumologia
generale, U.O. Allergologia, Casatenovo (LC), Italy;
F. Lodi Rizzini, S.S.V.D. Allergologia - Spedali Civili, Brescia,
Italy;
D. Macchia, U.O. Allergologia Immunologia Clinica, Azienda
Sanitaria Firenze, Firenze, Italy;
F. Murzilli, UO Allergologia, Ospedale S.S. Filippo e Nicola,
Avezzano (AQ), Italy.
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CASE REPORTS
Vol 46, N 5, 178-180, 2014
G. Liccardi1, L. Billeri2, M. Foglia3, C. Sapio4, M.A.R. De Giglio1, G. D’Amato1
An unusual case of occupational asthma in a part time
magician. He has got an allergy surprise from his top hat!
Department of Chest Diseases, Division of Pneumology and Allergology. High Speciality “A. Cardarelli” Hospital, Naples, Italy
Department of Laboratory Medicine, University Hospital, Padova, Italy
3
Laboratory of Clinical Pathology “A. Cardarelli” Hospital, Naples, Italy
4
Consultant in Preventive Medicine, “Federico II” University, Naples, Italy
1
2
Key words
Allergy; allergic rhinitis; allergic
sensitization; bronchial asthma;
magician; occupational asthma;
rabbit; pet allergy
Gennaro Liccardi, MD
Department of Chest Diseases,
Division of Pneumology and Allergology
High Speciality “A. Cardarelli” Hospital
Piazzetta Arenella n. 7, 80128 Naples, Italy
Phone: +39 081 747 33 35-4-3
Fax : + 39 081 747 33 31
Summary statement
Rabbit constitutes a risk factor for occupational asthma in susceptible magicians.
Summary
In this report we describe a case of respiratory allergy induced by an unusual occupational exposure to rabbit. The patient worked as a part-time magician in theatres and private parties
and the most popular performance of his show was to pull out a white rabbit from a top hat.
Unfortunately, a few minutes after the extraction of rabbit from top hat, the patient experienced
the onset of upper and lower airway symptoms, and in some occasions he was forced to stop the
show and to use short acting β2 agonists and intramuscular steroids. The results of SPT and evaluation of serological specific IgE (ImmunoCAP and ImmunoCAP ISAC IgE) revealed allergic
sensitization to rabbit (Oryctolagus cuniculus) dander as well as to Parietaria and dust mites.
ImmunoCAP ISAC IgE excluded allergic sensitization to other cross-reacting animal allergens.
Rabbit constitutes a reliable risk factor for allergic sensitization in individuals working as professional / part-time magicians or as animators in some recreational settings (resorts, parties,
charity shows, etc).
Introduction
Exposure to rabbit (Oryctolagus cuniculus) constitutes a well recognized cause of occupational asthma for people in regular contact with this animal in occupational settings such as research
laboratories, breeding, pet shops etc. (1,2). In recent years, rabbits became more popular as pets to have at home, like dogs and
cats, in Italy and in other countries. Although in Italy there are
no official data on the overall number of rabbits living in domestic environments, some indirect indexes suggest a significant
increase in the rate of rabbit ownership, and commercial sources
indicate an increasing business in rabbit breeding as well as in
production of rabbit-related materials such as food, accessories
etc. In these non occupational settings, the prevalence of allergic
sensitization is poorly known; we have shown that in Naples
area (3,4) as well as in Italy (5) the values of prevalence ranges
between 2.65-4.9% and 0.65-4.72% respectively.
In this report we describe a case of respiratory allergy induced by
an unusual professional exposure to rabbit.
Case report
A 30-year-old man referred in our Allergy Centre for the onset
of intermittent nasal and conjunctival symptoms; in addition
he reported severe bronchial symptoms such as cough, wheezing
and dyspnea in some particular circumstances.
Family history was positive for atopy (his father suffered from
allergic urticaria). Although he was a teacher, he worked as a
part-time magician in theatres and private parties. Among the
children, the most popular performance of his show was to pull
An unusual case of occupational asthma in a part time magician. He has got an allergy surprise from his top hat!
out a white rabbit from a top hat. Unfortunately, a few minutes
after the extraction of the rabbit from top hat, the patient experienced the onset of upper and lower airway symptoms and in
some occasions he was forced to stop the show and to use short
acting β2 agonists and intramuscular steroids. It is important to
note that rabbit was not living in patient’s dwelling; the animal
was taken just before the show (6). Patient denied any pet ownership or direct exposure to other mammals.
Skin-prick-test (SPT) was performed with commercial standardized allergenic extracts (ALK- Abello Group and Lofarma
Laboratories, Milan, Italy). The panel included the following
extracts: house dust mites, Parietaria species, grasses, cat and
dog dander, olive, birch, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum and mugwort, plus a positive (1% histamine hydrochloride) and negative (glycerinate solution) control. In addition,
we used dander standardized extracts of other mammals (rabbit,
mouse, rat, hamster, horse, guinea pig and cow). The SPT was
carried out and interpreted according to international guidelines (7), the result was read after 10 min and expressed as the
major diameter of the wheal and its orthogonal. A skin reaction
of 3 mm or greater was considered positive.
A blood sample was taken for the measurement of total IgE and
specific IgE to the same allergens of SPT panel by ImmunoCAP
FEIA as well as by the micro-array technique ImmunoCAP
ISAC (Thermofisher Scientific, Immuno-Diagnostics, Milan,
Italy). A standard spirometry was also carried out.
As monoclonal antibodies-based methods to measure the
amount of rabbit allergen are not available in Italy, we cannot
evaluate the degree of rabbit allergen contamination in patient’s
indoor environments.
The results of SPT revealed allergic sensitization to Oryctolagus
cuniculus dander (the diameters of wheal were 10 x 12 mm),
Parietaria (8 x 9 mm), Dermatophagoides pteronyssinus (9 x 10
mm), D. farinae (9 x 9 mm), positive control induced a wheal
of 7 x 7 mm diameters.
ImmunoCAP total IgE antibodies were 179 kU/L. The values of
ImmunoCAP specific IgE antibodies were the following: Oryctolagus cuniculus dander (e82) - 45.80 kUa/L, Dermatophagoides
pteronyssinus - 3.24 kUa/L, D. farinae - 2.95 kUa/L, Parietaria
- 12.35 kUa/L. The values of ImmunoCAP ISAC IgE were the
following: rPar j 2 - 28 ISU-E, nDer f 1 - 0.8 ISU-E, rDerf 2
- 2.5 ISU-E, nDer p 1 - 2.7 ISU-E, rDer p 2 - 2.9 ISU-E. No
IgE were found against animal cross-reacting allergens such as
lipocalins (Can f 1, Can f 2, Equ c 1, Fel d 4, Mus m 1) and
albumins (Bos d 6, Can f 3, Equ c 3, Fel d 2). When examining,
spirometry revealed normal respiratory values.
The removal of rabbit, as well as an intensive cleaning of clothes
/ items used during the show and indoor environments where
the patient rehearsed the show, resulted in a complete disappearance of all respiratory symptoms during performances.
179
Discussion
This is the first documented case-report of a severe respiratory
allergy induced by occupational exposure to rabbit in a parttime magician. Previously, only a brief correspondence containing few sentences on this topic has been published (8). The high
degree of cutaneous and serological sensitization to rabbit allergens as well as the lack of IgE antibodies against lipocalins and
albumins indicates a selective allergy to rabbit induced by occupational exposure. In other words, the absence of any response
to lipocalins or albumins likely exclude the possibility of a rabbit
sensitization induced by cross-reaction mechanisms (9,10).
Some considerations can be drawn from our case:
1. Rabbit constitutes a reliable risk factor for allergic sensitization in individuals working as professional/part-time magicians
or as animators in some recreational settings (resorts, parties,
charity shows, etc.). This category of workers should avoid to
use rabbits or other less common pets during their shows, if
already sensitized to common pets (cats/dogs).
2. Allergists should query patients regarding direct/indirect contact with any furry animal in addition to exposure to common
pets (cats/dogs). Since keeping “exotic animals” as pets is increasing in all developed countries (11), theoretically all animals
living at home or in strict contact with humans may induce
allergic sensitization.
3. Since it is likely that animal sensitized patients constitute an
“allergic phenotype” (12), SPTs to furry animal allergens should
be performed in all at high risk individuals already sensitized to
cats and/or dogs before beginning an activity involving a strict
contact with less common pets or furry animals, and in those
who wish to own an “exotic” furry animal.
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CASE REPORTS
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C. Richard1, S. Jacquenet1, D.A. Moneret-Vautrin2
only by Immunoblot
Genclis SAS, Vandoeuvre-Lès-Nancy, France
Lorraine-University, Nancy. Durkheim Hospital, Epinal, France. AllergyVigilance Network, Vandoeuvre-Lès-Nancy, France
1
2
Christelle Richard
Genclis, 15 rue du bois de la Champelle
54500 Vandoeuvre-Lès-Nancy, France
Tel: +33 03 83 67 82 11
Fax: +33 03 83 67 89 99
Peanut allergy is currently linked to sensitization to major allergens. Ara h 2 is the leading one and is the best predictor of
allergy, since a level > 0.23 kU/L is observed in 93% of cases,
with a specificity of 97% (1). A level of Ara h 2-specific IgEs >
0.55 kU/L has an absolute specificity and sensitivity of 93% of
cases in adults (2). In young children aged less than 15 months,
sensitivity and specificity have been calculated at 73% and 95%
(3). Most peanut allergens are glycosylated. Sensitization to carbohydrate determinants (CDD) is frequent in pollinic patients
and cases of hymenoptera anaphylaxis (4,5). Such anti-CCD
sIgE could explain positive ImmunoCAP to peanut, in peanut
tolerant patients (6,7). It has been assumed that sensitization to
CCDs is not clinically relevant (6-8). For this reason, we present
a rare case of plausible peanut allergy characterized by a mono-sensitization to CCDs.
A 49 years old female presented in 2012 with serious systemic
reaction including abdominal pain, vomiting, erythema, vertigo and sudation, 2 hours after ingesting approximately 4 g of
Curly® (containing 59% maize flour and 30% peanut flour),
together with 2 glasses of rum-based cocktail and wine. She had
a rather specific past history, since she was not atopic. Prick tests
to 13 common aeroallergens were negative. However, she had
semi-delayed anaphylaxis to mammal meats linked to sensitization to alpha-galactose that had been diagnosed in 2010. Recovery was obtained by avoidance diet, excluding mammal meats,
pork and beef kidney and milk proteins with alcohol (9,10).
Specific IgEs gradually decreased (table 1). She also experienced
anaphylaxis to wasp venom in 2011, linked to sensitization to
Ves v 5. She had concurrently anti-CCD IgEs (table 1). She is
treated by specific immunotherapy at present.
Prick tests to natural roasted peanut, to peanut commercial extract (Stallergenes), to maize flour and to soy were negative on
a skin normally reacting to 9% codeine phosphate. Total IgEs
were 149 kU/L. No IgEs were detected to peanut and recombinant allergens: rAra h 1, rAra h 2, rAra h 3, rAra h 8, rAra h
9 (ImmunoCAP system, Thermo Fisher). Furthermore, sIgE to
rAra h 6 and rAra h 7 were determined by ELISA test performed
in the Genclis lab, and were negative. A basophil activation test
to peanut extract (made from peanut flour, Byrd Mill) was then
performed by flow cytometry identifying CD63 and was positive with a stimulation index > 2 for three concentrations of
peanut extract.
The patient gave her informed consent for an open oral challenge with Curly. She tolerated 14.3 g of the product (peanut
protein equivalent 3.3 g). She refused our offer to repeat the test
with alcohol.
Protein extracts of peanut and Curly® were prepared. Specific
IgE to CCDs were screened using FEIA CAP system (bromelain and HRP), and DPC to ascorbate oxydase. Only CAP to
bromelain was positive (4.84 kU/L). Three inhibition tests were
performed using 100 to 1000 µg/mL of protein as inhibitors
(figure 1). Specific IgE to bromelain were inhibited: 30% by
C. Richard, S. Jacquenet, D.A. Moneret-Vautrin
182
Table 1 - Laboratory results (specific IgE)
Year
Beef meat
(ImmunoCAP)
Pork meat
(ImmunoCAP)
Alpha-galactose
(Home made
ImmunoCAP)
Ves v 5
(ImmunoCAP)
Bromelain
(ImmunoCAP)
Ascorbate
oxidase (DPC)
2010
2011
2012
2013
16.3 kU/L
8.3 kU/L
28.7 kU/L
8 kU/L
209 kU/L
54.3 kU/L
31.7 kU/L
20.0 kU/L
14.0 kU/L
2.28 kU/L
4.84 kU/L
Negative
bromelain 1000 µg/mL, 32% by peanut extract at 500 µg/mL
(51% at 1000 µg/mL) and 57% by Curly® extract at 100 µg/
mL (91% at 500 µg/mL). Immunoblot assays were performed
with peanut, Curly® extracts and bromelain (figure 2). 70 kDa
proteins were not recognized by specific IgE since they bound to
anti-human IgE. Different proteins were recognized by the IgE
in peanut and Curly® extract. Bromelain (22.8 kDa) was recognized by IgE. Inhibition tests were performed using peanut and
Curly® extracts. All the specific proteins recognized by IgE in
peanut and Curly® extract, as well as bromelain, were inhibited
by peanut and Curly® extract. So, the patient’s sIgE recognizing
CCD of bromelain were inhibited by CCD present in peanut
and Curly® extract. This might indicate that CCDs were clinically relevant in this case. However, we cannot exclude sensitization to buried protein epitopes, not available to IgE binding
in the commercial extract as well in native peanut flour and for
prick test. The fact that the oral challenge was negative to 3.3
g of peanut proteins does not exclude allergy in our opinion,
since the oral challenge was not associated to alcohol. Alcohol is
a well-known risk factor for food anaphylaxis, since it promotes
intestinal hyperpermeability and moreover brings more carbohydrate residues (8,11). Unfortunately, the patient declined an
Figure 1 - Specific IgE inhibition to bromelain (k202) performed
by FEIA using a Curly® extract (circles), peanut extract (triangles)
and bromelain (diamonds) as inhibitors.
100%
Inhibition
80%
60%
40%
20%
0%
0
500
Amount of inhibitor ( g protein /mL)
1000
oral challenge with peanut and alcohol. To conclude, in this
case of allergy to peanut, the protein epitopes of seven recombinant peanut allergens were not involved. Cross-sensitization
to CCDs between bromelain, peanut and Curly® was demonstrated. CCDs were only slightly clinically relevant since peanut
allergy was not confirmed by oral challenge with Curly® under
basal conditions and the reaction was only elicited when alcohol was associated with Curly®. Such cases are rare, since only
2/78 peanut-allergic patients may be linked to the presence of
anti-CCD IgE (12).
Figure 2 - 2A: Immunoblot with peanut extract (lane P), Curly®
extract (lane C) and bromelain (lane B). 2B - Immunoblot inhibited
by peanut extract. 2C - Immunoblot inhibited by Curly® extract.
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183
CASE REPORTS
Vol 46, N 5, 184-188, 2014
D. Tirotta1, V. Durante2
A case of long-undiagnosed Common Primary
Immunodeficiency in adulthood
Medicina Interna, Ospedale Cervesi di Cattolica (AUSL Romagna), via Beethoven 1, 47841 Cattolica (RN), Italy
Key words
Immunodeficiency; Common
Variable Immunodeficiency; Primary
Immunodeficiency Disorders
1
[email protected]
2
[email protected]
Summary
Common Variable Immunodeficiency (CVID) is one of the most common causes of Primary
Immunodeficiency Disorders (PIDs) and of Primary Hypogammaglobulinemia in adulthood.
Clinical features include variable combinations of infectious diseases, autoimmune diseases,
lymphoproliferative disorders and gastrointestinal diseases.
In this case report, delayed detection of the disease had a negative prognostic impact, despite
prompt antibiotic and replacement therapy. The unfavourable prognosis was due to multi-organ
failure (namely lungs, heart and liver) and to a number of chronic and acute infectious diseases.
Introduction
Clinical manifestations of immunodeficiency disorders (IDs)
include the following: a) unusual medical condition (i.e. an infection which is unusual in respect to disease agent, complication, duration and severity); b) presence of non-infection-related symptoms, such as bronchiectasis with unknown cause, poor
wound healing, chronic diarrhoea, malabsorption, premature
loss of teeth, autoimmune disorders (especially when occurring
in combination), hematologic disorders, failure to thrive, recurrent aphthous ulcers and, occasionally, c) family history (autosomal recessive disorders, x-linked disorders or clusters) (1).
The commonest IDs in adulthood include Secondary Immune
Dysfunction and Primary Immunodeficiency Disorders (PIDs),
such as IgA deficiency, Common Variable Immunodeficiency
(CVID) and some complement deficiencies (1). The diagnosis
of CVID is established by the following criteria: marked de-
crease in IgG levels (< 4.5 g / l for adults) and in the level of
at least one of the IgM or IgA isotypes; onset at over 2 years
of age; absence of isohemagglutinins and/or poor response to
vaccines; other defined causes of hypogammaglobulinemia excluded (2,3).
In our case, delayed disease recognition negatively affected the
patient’s prognosis. The fatal outcome was ultimately due to
progressive multi-organ failure and to multiple chronic and
acute infectious diseases.
Case report
A 70-year-old male patient presented to our clinic in August
2011 with diarrhoea, loss of appetite, and increased waist circumference.
Detailed anamnesis revealed a history of Toxoplasmosis and
Cytomegalovirus infection 20 years previously (only serolog-
A case of long-undiagnosed Common Primary Immunodeficiency in adulthood
ical markers had been tested for positivity: no DNA analysis
had been carried out directly on the pathogens). The patient
also reported multiple hospitalisations and outpatient visits for
pneumonia (including necrotising pneumonia) and bronchitis,
Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) with flareup episodes associated with bronchiectasis, Secondary Chronic
Pulmonary Heart Disease (NYHA III), Chronic Respiratory
Failure and Permanent Atrial Fibrillation (AF) treated with anticoagulants. In two cases upon admission to hospital, bronchoalveolar lavage and sputum tested positive for Pseudomonas
aeruginosa, Atypical mycobacteria, and Haemophylus. Family
history for immune deficiencies was negative.
In 1994, the patient underwent medical examinations for moderate leukopenia, severe hypogammaglobulinemia and recurrent
respiratory infections. US abdomen, bone marrow aspiration
and biopsy were negative. Flow cytometry analysis of peripheral blood lymphocyte subsets showed mild CD4+ lymphocyte
depletion (Total CD3 T lymphocytes: 87%, range: 70-80; CD
19 B lymphocytes: 5%, range: 5-15; CD4 T lymphocytes: 25%,
range: 35-55; CD8 T lymphocytes: 67%, range: 20-35%).
In August 2008, the patient had episodes of diarrhoea, which
resolved spontaneously after 10 days. Colonoscopy was negative
in this case. In June 2011, the subject was treated unsuccessfully
with metronidazole for persistent diarrhoea and fever secondary
to Giardia lamblia infection. Upon observation, he showed cachexia, rhonchi, basilar crackles, and AF (rate: 78 bpm).
On to hospital admission, laboratory tests revealed the following: mild microcytic anemia (Hb 13.1 g/dl, MCV 65 fl), normal white blood cell and platelet counts (PLT 271000/mmc,
WBC 8190/mmc, N 4360/mmc, L 3030/mmc, M 740/mmc,
E 50/mmc, B 10/mmc), high prothrombin time (PT 3.67), hypokalemia (2.7 mM/l), cholestasis (ALP U/l 237 vs. 129 U/l,
GammaGT 82 U/l vs. 61 U/l), moderate inflammatory syndrome (CRP 34.8 mg l vs. 5 mg/ll), low protein levels (48 g/l
vs. 60 g/l), and Giardia lamblia in stools.
The manifestations requiring medical attentions were in our
view: cachexia, chronic diarrhoea secondary to Giardia lamblia infection, recurrent respiratory infections associated with
hepatomegaly, splenomegaly, ascites, cholestasis, and altered
coagulation. We formulated two diagnostic hypothesis: a) immunodeficiency secondary to liver cirrhosis, lymphoproliferative disorder or viral infection (HIV); or b) primary immune
deficiency with splenomegaly.
Immunodeficiency tests revealed severe hypogammaglobulinemia (gamma globulin: 2.4%, range: 11.1-18.8). Immunoglobulin values were of particular interest: IgA < 0.05 g/l (range: 0.74); IgG 0.72 g/l (range: 7-16); IgM 0.09 g/l (range: 0.4-2.3),
tests were negative for both Bence Jones protein and alkaline
phosphatase bone isoenzyme. Analysis of peripheral blood lymphocyte subsets showed: Total CD3 T lymphocytes: 92%, range:
185
70-80; CD19 B lymphocytes: 3% [90/mmc], range: 5-15; CD4
T lymphocytes: 8 % [242/mmc], range: 35-55; CD8 T lymphocytes: 79% [2394/mmc], range: 20-35; CD4/CD8 ratio
0.1, range: 0.8/5; NK lymphocytes: 6%, range: 8-22%. Both
ELISA and p24 antigen test were negative for HIV.
The clinical scenario now changed to humoral immune and
lymphocyte deficiency (predominantly B-cells CD19+ and
T-cells CD4+) associated with hepatosplenomegaly. Taking into
account the patient’s age, we formulated the following two diagnostic hypothesis: a) primary immunodeficiency (CVID); and
b) immune deficiency secondary to lymphoproliferative disease,
drug intake (especially corticosteroids), or excess loss (nephrotic
syndrome, exudative enteropathy, skin loss).
The patient underwent additional laboratory analyses. Complement C3 and C4 levels were within normal limits, while
chest X-ray and chest-abdomen CT showed bronchiectasis
with bibasal mucus, paratracheal adenopathy (1.2 cm diameter), chronic liver disease with caudate and left lobe hypertrophy, ascites, and enlarged, inhomogeneous spleen (figure 1).
Bone marrow aspiration identified inadequate erythroid maturation, whereas bone marrow biopsy showed maturing trilineage hematopoiesis, moderate CD8+T lymphocytosis, and
significant reduction of plasma cells. Abdominal US revealed
liver with nodular cirrhosis, portal vein ectasia, splenomegaly
(14,1 cm) and moderate ascites (figure 2). Qualitative viral
load tests for HCV RNA and quantitative HBV DNA assays
were negative, as determined by real-time PCR. Antibody-specific serological assays were also negative (ANA, AMA, ASMA,
LKM: IFI test; minor hepatotropic viruses: PCR for CMV e
EBV DNA). Paracentesis showed ascitic fluid lymphocytosis
(4L evacuation: 425/µl WBC, 21% neutrophils, 70% lymphocytes, 1% eosinophils).
To rule out peritoneal TBC we planned a laparoscopic peritoneal biopsy, followed by EGDS. Quantiferon was negative,
while gastroscopy showed duodenal ulcer and biopsies were
negative for lymphoma (MALToma). Based on laboratory tests
results, we diagnosed CVID (Common Variable Immunodeficiency). The patient was put on immunoglobulin replacement
therapy (0.5 g/Kg) administered monthly in a day-hospital
regimen.
From February to March 2012, the patient was again admitted
to our department for hemorrhagic shock following paracentesis. He also presented left pneumonia, with sputum testing positive for Pseudomonas aeruginosa, and reported a new episode
of diarrhoea. At analysis, stool specimens were strongly positive
for Giardia lamblia. Pneumonia was treated with cephalosporin
and peritoneal biopsy was suspended due to the patient’s overall
clinical condition.
On a subsequent admission to hospital, from April to May
2012, the patient showed the following:
186
• Watery diarrhoea with stools testing positive for Giardia
lamblia (subject to therapy with metronidazole 250 mg x 3
followed by albendazole 400 mg x 3) and for Clostridium
difficile (remission 1 month from the start of therapy with
oral vancomycin).
• Persistent left pneumonia with sputum testing positive for
several types of bacteria (namely, Corynebacterium striatum,
Stenotrophomonas maltophila and Pseudomonas aeruginosa).
Based on antibiogram results, the patient was intravenously injected with ceftazidime and levofloxacin, showing signs of clinical improvement. However, persistent radiographic infiltrates
were also detected.
In November 2012, the patient presented again to our department with the following symptoms:
• Severe weight loss and cachexia;
• Dyspnea, cough, global respiratory failure. Chest X-ray
showed bilateral edema, disatelectatic zones, apical fibrosis
and infiltrates in the right upper pulmonary lobe. Bronchoalveolar lavage was positive for multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and S. Aureus, while sputum was positive for
acid-alcohol resistant bacilli (negative BK PCR).
• Diarrhoea with negative stool specimens;
• AF with high ventricular response.
The patient was kept in isolation and treated with high-flow
oxygen, diuretics and antibiotics (imipenem 550 mg x 4 and
levofloxacin750 mg, injected intravenously).
Death occurred in November 2012 from acute pulmonary edema.
Discussion
Incidence of CVID is estimated between 1:10.000 and
1:50.000. The age of onset is usually in the second or third decade of life (3).
At a first glance, there appeared to be an obvious mismatch
between our patient’s age and diagnosis of CVID. However, a
review of the literature suggests that CVID can indeed occur
at any age (4). The French DEFI study group also identified
a subset of CVID, referred to as ‘late onset combined immunodeficiency’ (LOCID), characterised by clinically relevant
T-cell insufficiency and accounting for approximately 8.9%
of CVID cases. The inclusion criteria set by the DEFI group
were: CD4+ T cells below 200/μl and evidence of opportunistic infections (4-6).
In the present case, a history of Cytomegalovirus and Toxoplasma gondii infection and the absence of common clinical
manifestations of LOCID at the time of hospitalisation, such as
lymphopenia in bone marrow biopsies and in the blood stream,
and absence of sarcoid-like granulomas (included pulmonary
granulomas), argued against this diagnosis. The presence of Cy-
tomegalovirus and Toxoplasma gondii infection was determined
on the basis of serological positivity alone, as the DNA of those
pathogens had not been tested.
The patient’s clinical history was characterised by progressive
decline secondary to recurrent respiratory infections and by
abnormal findings in the digestive tract and liver. As reported
in the literature, the clinical phenotype is heterogeneous and
includes (2,7,8,9) (table 1):
• infectious diseases (over 90% of CVID patients had bacterial
pathogens in the upper and lower airways and in the gastrointestinal tract) (2);
• autoimmune diseases (accounting for 20% of CVID cases);
• lymphoproliferative disorders and gastric cancer (approximately 40-50% of CVID cases, possibly due to carcinogenic
pathogens such as Helicobacter pylori and Epstein Barr virus, or to impaired tumour cell surveillance);
• gastrointestinal symptoms: enteritis (Giardia lamblia, Salmonella, Campylobacter), both non-bloody (sprue-like)
and bloody (chronic inflammatory bowel disease) diarrhoea,
asymptomatic or unformed stools (nodular lymphoid hyperplasia of the duodenum and ileum), cholestasis (nodular regenerative hyperplasia or granulomatous hepatitis with
portal hypertension);
• rarely absent complications.
In our case, the unfavourable course could most likely be ascribed to chronic, non-infectious complications. In literature,
the prognosis for CVID is seen as depending on a number of
causes, ranging from bronchiectasis, to enteropathy and autoimmunity and from B cell percentage to Ig and T cell response
(9, 10). Interestingly, the risk of death is also 11 times higher for
patients with non-infectious complications (lymphoma, chronic hepatitis, structural lung disease and chronic gastrointestinal
disease) (7-10).
A delayed diagnosis (from 1994 to 2011) was in the present case
a negative prognostic factor. Indeed, several studies document
that age at diagnosis has a significant impact on the outcome of
the disease (7). The existing literature also suggests that Ig therapy (administered either intravenously or subcutaneously) reduces the recurrence of infections, delays the onset of pulmonary
complications (such as bronchiectasis and respiratory failure),
and allows early detection of other complications (especially
lymphomas and solid tumours) by approximately 10% (9,10).
In conclusion, taking into account the patient’s history, as well
as any signs and symptoms of recurrent infections, is of critical
importance for a successful management of the disease. Specifically, primary immunodeficiencies, most notably CVID, cannot
be ruled out in adulthood, particularly when unusual infections
(or unusual infection manifestations) should occur.
A case of long-undiagnosed Common Primary Immunodeficiency in adulthood
187
Table 1 - Clinical phenotype in CVID (9, modified).
Infections
Respiratory Tract Infections
• Recurrent sinusitis, otitis, bronchitis
• Pneumonia (encapsulated bacteria, rare opportunistic infections due to cellular immunodeficiency: Pneumocystis, HSV, CMV,
Candida albicans, Mycobacterium)
Digestive Tract Infections
• Giardia lamblia, Salmonella, Campylobacter enteritis
Meninges, Skin and Mucosa, Joints
Meningitis, Herpes zoster, oligoarthritis due to Mycoplasma infection, Papillomavirus infection
Abnormal findings in the liver and the digestive tract
• Non-bloody diarrhoea associated with a sprue-like disease (villous atrophy, pernicious anaemia, sprue-like malabsorption) and
bloody diarrhoea resulting from chronic inflammatory bowel disease (Crohn-like disease)
• Nodular lymphoid hyperplasia in the duodenum and ileum (either asymptomatic or associated with unformed stools)
• Nodular regenerative hyperplasia of the liver tissue, or seronegative granulomatous hepatitis. Usually, liver function in CVID
patients is preserved but portal hypertension may develop
• Viral hepatitis (seronegative hepatitis B and C as well as Cytomegalovirus or Epstein Barr virus hepatitis should be ruled out
by searching for hepatitis antigen or viral RNA, respectively)
Nodal and extranodal lymphoproliferative disorders
• Lymphoid hyperplasia (primarily of the lymph nodes and spleen)
• Lymphoma (extranodal diffuse large B-cell lymphoma or Hodgkin lymphoma, often associated with EBV, MALTomi)
• Granulomatosis
• Nodular lymphoid hyperplasia of the gastrointestinal tract
Granulomatous lesion
• Granulomatous interstitial lung disease with poorer prognosis
• Granulomatous disease similar to sarcoidosis (lung and lymph nodes; also liver, skin, spleen, bone marrow, gastrointestinal
tract, brain and kidney, in decreasing frequency)
Autoimmunity
• Thrombocytopenia (Thrombotic Thrombocytopenic Purpura (TTP))
• Autoimmune haemolytic anaemia
• Autoimmune neutropenia and autoimmune cytopenia
• Less frequently: autoimmune thyroid disease, primary biliary cirrhosis, autoimmune hepatitis, vitiligo, pernicious anaemia,
psoriasis, rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus
Dermatologic manifestations
• Alopecia, non-necrotizing granulomas
188
Figure 1 - US abdomen of patient: splenomegaly.
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Figure 2 - Chest CT of patient.
Riassunto delle caratteristiche
del prodotto
1. DENOMINAZIONE DEL MEDICINALE
Flutiformo® 50 microgrammi/5 microgrammi per erogazione, sospensione pressurizzata per inalazione.
Flutiformo® 125 microgrammi/5 microgrammi per erogazione, sospensione pressurizzata per inalazione.
Flutiformo® 250 microgrammi/10 microgrammi per erogazione,
sospensione pressurizzata per inalazione.
2. COMPOSIZIONE QUALITATIVA E QUANTITATIVA
Ogni dose erogata (dalla valvola dosatrice) contiene:
• 50 microgrammi di fluticasone propionato e 5 microgrammi di formoterolo fumarato diidrato. Questo equivale ad a una dose inalata
(dall’erogatore) di circa 46 microgrammi di fluticasone propionato/4,5
microgrammi di formoterolo fumarato diidrato.
• 125 microgrammi di fluticasone propionato e 5 microgrammi
di formoterolo fumarato diidrato. Questo equivale ad una dose
inalata (dall’erogatore) di circa 115 microgrammi di fluticasone
propionato/ 4,5 microgrammi di formoterolo fumarato diidrato.
• 250 microgrammi di fluticasone propionato e 10 microgrammi
di formoterolo fumarato diidrato. Questo equivale ad una dose
inalata (dall’erogatore) di circa 230 microgrammi di fluticasone
propionato/9,0 microgrammi di formoterolo fumarato diidrato.
Per l’elenco completo degli eccipienti, vedere paragrafo 6.1.
3. FORMA FARMACEUTICA
Sospensione pressurizzata per inalazione. La bomboletta contiene
una sospensione liquida di colore bianco-biancastro. La bomboletta
è contenuta in un erogatore di colore bianco con indicatore della
dose integrato di colore grigio e un cappuccio di protezione del boccaglio di colore grigio chiaro.
4. INFORMAZIONI CLINICHE
4.1 Indicazioni terapeutiche
Questa combinazione a dose fissa di fluticasone propionato e formoterolo fumarato (Flutiformo®) è indicata per il trattamento regolare dell’asma quando l’uso di un prodotto di associazione
(corticosteroide per via inalatoria e b2-agonista a lunga durata d’azione) è appropriato, ovvero:
• in pazienti non adeguatamente controllati con corticosteroidi per via
inalatoria e b2-agonisti a breve durata d’azione “al bisogno”
oppure
• in pazienti già adeguatamente controllati sia con corticosteroidi per via
inalatoria che con b2-agonisti a lunga durata d’azione.
Flutiformo® 50 microgrammi/5 microgrammi per erogazione è indicato negli adulti e negli adolescenti al di sopra dei 12 anni.
Flutiformo® 125 microgrammi/5 microgrammi per erogazione è
indicato negli adulti e negli adolescenti al di sopra dei 12 anni.
Flutiformo® 250 microgrammi/10 microgrammi per erogazione è
indicato solo negli adulti.
4.2 Posologia e modo di somministrazione
Posologia
Per uso inalatorio.
Occorre mostrare ai pazienti come utilizzare l’inalatore e che un medico valuti regolarmente la loro asma in modo che il dosaggio di Flutiformo® sia sempre ottimale e venga modificato solo dietro consiglio
medico. La dose deve essere titolata alla dose minima che permette
di mantenere un efficace controllo dei sintomi. Una volta raggiunto
il controllo dell’asma con il dosaggio minimo di Flutiformo® somministrato due volte al giorno, occorre rivalutare il trattamento prendendo in considerazione l’eventualità di modificare la terapia
passando ad un corticosteroide inalatorio da solo. Come regola generale, la dose deve essere titolata alla dose minima che permette
di mantenere un efficace controllo dei sintomi. È estremamente importante controllare regolarmente i pazienti durante la riduzione
della terapia. Non sono disponibili dati sull’uso di Flutiformo® in pazienti con BPCO. Pertanto Flutiformo® non deve essere usato in questa tipologia di pazienti. Il dosaggio di Flutiformo® deve contenere
la dose di fluticasone propionato adatta alla gravità della malattia.
Nota: Flutiformo® 50 microgrammi/5 microgrammi per erogazione
non è appropriato per adulti e adolescenti con asma grave. I medici
prescrittori devono essere consapevoli che nei pazienti con asma, il
fluticasone propionato è efficace quanto altri steroidi per via inalatoria, se ne viene somministrata circa metà della dose giornaliera totale (in microgrammi). Qualora un paziente necessiti di dosi al di
fuori del regime posologico raccomandato, occorre prescrivere dosi
adatte del b2-agonista e del corticosteroide per via inalatoria in inalatori separati oppure dosi adatte del solo corticosteroide per via
inalatoria. Flutiformo® viene erogato attraverso un inalatore pressurizzato predosato (pMDI) con indicatore della dose integrato. Ogni
inalatore fornisce almeno 120 erogazioni (60 dosi).
Flutiformo® 50 microgrammi/5 microgrammi per erogazione, sospensione pressurizzata per inalazione
Dose raccomandata per adulti e adolescenti al di sopra
dei 12 anni
Flutiformo® 50 microgrammi/5 microgrammi per erogazione, sospensione pressurizzata per inalazione: due inalazioni (puff) due volte al
giorno, assunte normalmente alla mattina e alla sera. Se il paziente
continua a presentare asma scarsamente controllata, la dose giornaliera totale del corticosteroide inalatorio può essere aumentata
somministrando questo prodotto di associazione a un dosaggio successivo più elevato, ovvero Flutiformo® 125 microgrammi/5 microgrammi per erogazione, sospensione pressurizzata per inalazione,
due inalazioni (puff) due volte al giorno.
Solo per adulti
Se il paziente continua a presentare asma scarsamente controllata, la dose giornaliera totale può essere ulteriormente aumentata somministrando questo prodotto di associazione al dosaggio
massimo, ovvero Flutiformo® 250 microgrammi/10 microgrammi
per erogazione, sospensione pressurizzata per inalazione, due inalazioni (puff) due volte al giorno. Il dosaggio massimo va usato
solo negli adulti, non deve essere somministrato ad adolescenti
al di sopra dei 12 anni.
Bambini al di sotto dei 12 anni
L’esperienza nei bambini al di sotto dei 12 anni è limitata (vedere
paragrafi 4.4, 4.8, 5.1 e 5.3). L’uso di Flutiformo® sospensione pressurizzata per inalazione a qualsiasi dosaggio non è raccomandato
nei bambini al di sotto dei 12 anni.
In questo gruppo d’età Flutiformo® non deve essere usato.
Flutiformo® 125/5 microgrammi per erogazione, sospensione pressurizzata per inalazione
Dose raccomandata per adulti e adolescenti al di sopra
dei 12 anni
Flutiformo® 125 microgrammi/5 microgrammi per erogazione, sospensione pressurizzata per inalazione: 2 inalazioni (puff) due volte
al giorno, assunte normalmente alla mattina e alla sera. In caso di
asma adeguatamente controllata è possibile passare i pazienti al
dosaggio minimo di questo prodotto di associazione, ovvero Flutiformo® 50 microgrammi/5 microgrammi per erogazione. La dose
per un paziente deve essere titolata alla dose minima che consente
di mantenere un efficace controllo dei sintomi.
Solo per adulti
Se il paziente continua a presentare asma scarsamente controllata,
la dose giornaliera totale può essere aumentata somministrando
questo prodotto di associazione al dosaggio massimo, ovvero Flutiformo® 250 microgrammi/10 microgrammi per erogazione, sospensione pressurizzata per inalazione, due inalazioni (puff) due volte al
giorno. Il dosaggio massimo va usato solo negli adulti, non deve essere somministrato ad adolescenti al di sopra dei 12 anni.
Bambini al di sotto dei 12 anni
Non sono disponibili dati sull’impiego di Flutiformo® a questo dosaggio nei bambini. L’esperienza nei bambini al di sotto dei 12 anni
è limitata (vedere paragrafi 4.4, 4.8, 5.1 e 5.3). L’uso di Flutiformo®
sospensione pressurizzata per inalazione a qualsiasi dosaggio non
è raccomandato nei bambini al di sotto dei 12 anni.
Flutiformo® 250 microgrammi/10 microgrammi per erogazione, sospensione pressurizzata per inalazione
Dose raccomandata per adulti
Flutiformo® 250 microgrammi/10 microgrammi per erogazione, sospensione pressurizzata per inalazione: 2 inalazioni (puff) due volte
al giorno, assunte normalmente alla mattina e alla sera. In caso di
asma adeguatamente controllata è possibile passare i pazienti a un
dosaggio inferiore di questo prodotto di combinazione, ovvero Flutiformo® 125 microgrammi/5 microgrammi per erogazione o, eventualmente, Flutiformo® 50 microgrammi/5 microgrammi. La dose per
un paziente deve essere titolata alla dose minima che consente di
mantenere un efficace controllo dei sintomi.
Bambini e adolescenti al di sotto dei 18 anni
Non sono disponibili dati sull’impiego di Flutiformo® a questo dosaggio nei bambini o negli adolescenti. L’esperienza nei bambini è
limitata (vedere paragrafi 4.4, 4.8, 5.1 e 5.3).
L’uso di Flutiformo® sospensione pressurizzata per inalazione a qualsiasi dosaggio non è raccomandato nei bambini
al di sotto dei 12 anni.
Flutiformo® 250 microgrammi/10 microgrammi per erogazione non deve essere usato negli adolescenti.
Tuttavia i dosaggi inferiori (50 microgrammi/5 microgrammi per erogazione o 125 microgrammi/5 microgrammi per erogazione) possono essere usati negli adolescenti.
Gruppi speciali di pazienti
Non sono necessari aggiustamenti della dose nei pazienti anziani.
Non sono disponibili dati sull’uso di Flutiformo® in pazienti con compromissione epatica o renale (vedere paragrafo 5.2). Questi pazienti
devono essere monitorati regolarmente da un medico per garantire
una titolazione alla dose minima che permette di mantenere un efficace controllo dei sintomi. Poiché le frazioni di fluticasone e formoterolo che raggiungono la circolazione sistemica sono eliminate
principalmente per via epatica, è possibile attendersi un aumento
dell’esposizione nei pazienti con grave insufficienza epatica.
Informazioni generali
La monoterapia con corticosteroidi inalatori rappresenta il trattamento di prima linea per la maggior parte dei pazienti. Flutiformo®
non è indicato per il trattamento iniziale dell’asma di grado lieve.
Per i pazienti con asma grave la terapia con corticosteroidi per via
inalatoria deve essere istituita prima di prescrivere un prodotto di
combinazione a dose fissa. Occorre richiamare l’attenzione dei pazienti sul fatto che Flutiformo® deve essere utilizzato quotidianamente per trarne il massimo beneficio, anche in assenza di sintomi.
Per nessun motivo i pazienti che usano Flutiformo® possono utilizzare altri b2-agonisti a lunga durata d’azione. Qualora i sintomi
dell’asma si manifestino nell’intervallo tra le dosi, per un sollievo immediato occorre assumere un b2-agonista a breve durata d’azione
per via inalatoria. Per i pazienti attualmente trattati con corticosteroidi per via inalatoria a dosi moderate-alte, con gravità della malattia tale da giustificare chiaramente due terapie di mantenimento,
la dose iniziale raccomandata corrisponde a due inalazioni due volte
al giorno di Flutiformo® 125 microgrammi/5 microgrammi per erogazione. Per pazienti che hanno difficoltà a sincronizzare l’erogazione aerosol con l’inspirazione si raccomanda l’impiego di un
distanziatore con Flutiformo®. L’unico distanziatore raccomandato
per l’uso con Flutiformo® è AeroChamber Plus®. I pazienti devono
essere istruiti all’uso corretto e alla manutenzione dell’inalatore e
del distanziatore, verificando la loro tecnica inalatoria per assicurare
la distribuzione ottimale del farmaco inalato ai polmoni. Con l’uso
di un distanziatore occorre sempre ri-titolare il farmaco alla dose minima efficace.
Modo di somministrazione
Per garantire la corretta somministrazione del medicinale, un medico
o altri professionisti sanitari devono mostrare al paziente come utilizzare l’inalatore. L’utilizzo corretto dell’inalatore pressurizzato predosato (pMDI) è essenziale per il successo del trattamento. Si deve
consigliare al paziente di leggere con attenzione il Foglio illustrativo
e di seguire le istruzioni per l’uso e le figure ivi riportate. L’erogatore
è dotato di un indicatore della dose integrato che conta il numero
di erogazioni (puff) rimanenti. Quando il numero si avvicina a zero,
occorre avvisare il paziente di contattare il medico prescrittore per
richiedere un nuovo inalatore. L’inalatore non deve essere utilizzato
se l’indicatore della dose mostra uno “0” (zero).
Attivazione dell’inalatore
Prima di usare l’inalatore per la prima volta o se l’inalatore non è
stato usato per 3 giorni o più o è stato esposto a temperature fredde
o vicine allo zero (vedere paragrafo 6.4), è necessario attivarlo.
• Togliere il cappuccio di protezione dal boccaglio e agitare bene l’inalatore.
• Erogare una dose (puff) tenendo l’inalatore lontano dal viso. Questo passaggio deve essere ripetuto 4 volte.
• L’inalatore deve sempre essere agitato immediatamente prima dell’uso.
Ogni qualvolta sia possibile, i pazienti devono essere in piedi o seduti
in posizione eretta quando effettuano l’inalazione.
Passaggi da seguire quando si utilizza l’inalatore
1. Togliere il cappuccio di protezione dal boccaglio e controllare che
il boccaglio sia pulito e privo di polvere e sporcizia. Agitare l’inalatore immediatamente prima di ogni erogazione (puff).
2. Espirare completamente e il più lentamente e profondamente
possibile.
3. Tenere la bomboletta in senso verticale, con il corpo dell’erogatore
rivolto verso l’alto, e collocare il boccaglio tra le labbra. Tenere l’inalatore in posizione verticale con il/i pollice/i alla base del boccaglio e l’indice/gli indici sulla parte superiore dell’inalatore. Non
mordere il boccaglio.
4. Al tempo stesso inspirare lentamente e profondamente dalla
bocca. Dopo aver iniziato a inspirare, premere la parte superiore
dell’inalatore per erogare una dose (puff) e continuare a inspirare
in modo costante e profondo.
5. Continuare a trattenere il respiro il più a lungo possibile senza
sforzarsi (idealmente per circa 10 secondi), quindi espirare lentamente. Non espirare nell’inalatore.
6. Tenere l’inalatore in posizione verticale per circa mezzo minuto,
agitarlo, quindi ripetere i passaggi da 2 a 5.
7. Dopo l’uso riporre il cappuccio di protezione sul boccaglio.
IMPORTANTE: i passaggi da 2 a 5 non devono essere eseguiti
troppo velocemente.
Si può consigliare ai pazienti di esercitarsi davanti a uno specchio.
Se dopo l’inalazione si osserva una nebbiolina fuoriuscire dall’inalatore o dai lati della bocca, occorre ripetere la procedura dal
passaggio 2. Per pazienti con una presa debole può essere più facile tenere l’inalatore con entrambe le mani appoggiando gli indici
sulla parte superiore della bomboletta ed entrambi i pollici alla
base dell’inalatore.
Dopo ogni inalazione i pazienti devono risciacquarsi la bocca, fare
gargarismi con acqua o lavarsi i denti ed espellere eventuali residui
per minimizzare il rischio di candidosi orale o disfonia.
Pulizia
Per le istruzioni sulla pulizia dell’inalatore occorre avvisare i pazienti
di leggere attentamente il Foglio illustrativo.
L’inalatore deve essere pulito una volta alla settimana.
• Togliere il cappuccio di protezione dal boccaglio.
• Non estrarre la bomboletta dall’alloggiamento in plastica.
• Pulire l’interno e l’esterno del boccaglio e l’alloggiamento in plastica con un panno o fazzoletto asciutto.
• Riporre il cappuccio di protezione sul boccaglio rispettando l’orientamento corretto.
• Non immergere la bomboletta metallica in acqua.
Occorre informare i pazienti che necessitano di un distanziatore AeroChamber Plus® di leggere le istruzioni del produttore per assicurarsi di conoscere le procedure corrette per l’uso, la pulizia e la
manutenzione del dispositivo.
4.3 Controindicazioni
Ipersensibilità ai principi attivi o ad uno qualsiasi degli eccipienti (vedere paragrafo 6.1).
4.4 Avvertenze speciali e precauzioni di impiego
La gestione dell’asma deve generalmente avvenire secondo un programma graduale, monitorando la risposta dei pazienti mediante
esami clinici e test di funzionalità polmonare. Flutiformo® non deve
essere usato nel trattamento dei sintomi acuti dell’asma che necessitano di un broncodilatatore a breve durata e rapida insorgenza d’azione. Occorre avvisare i pazienti di portare sempre con
sé il farmaco di emergenza che utilizzano in caso di attacco asmatico acuto. L’uso profilattico di Flutiformo® in caso di asma da esercizio fisico non è stato studiato. Per tale uso è consigliabile ricorrere
a un differente broncodilatatore a rapida insorgenza d’azione. Occorre ricordare ai pazienti di assumere la dose di mantenimento
come prescritto, anche in assenza di sintomi. I pazienti non devono
iniziare il trattamento con Flutiformo® durante un’esacerbazione
o in caso di peggioramento significativo o deterioramento acuto
dell’asma. Durante il trattamento con Flutiformo® possono manifestarsi esacerbazioni o eventi avversi seri correlati all’asma. È necessario chiedere ai pazienti di continuare il trattamento
avvisandoli tuttavia di consultare un medico qualora non riescano
a controllare i sintomi dell’asma o essi peggiorino dopo l’avvio
della terapia con Flutiformo®. Flutiformo® non deve essere usato
come trattamento di prima linea per l’asma. Qualora sia necessario
un uso più intenso di broncodilatatori a breve durata d’azione per
attenuare i sintomi dell’asma oppure qualora l’efficacia di tale terapia si riduca o i sintomi dell’asma persistano, i pazienti devono
essere visitati da un medico quanto prima poiché tali segni possono essere indicativi di un deterioramento nel controllo dell’asma
e può essere necessario modificare la terapia. Un deterioramento
improvviso e progressivo nel controllo dell’asma è potenzialmente
fatale e il paziente deve essere visitato in urgenza, valutando l’opportunità di aumentare la terapia corticosteroidea. Il paziente deve
essere visitato anche qualora il dosaggio corrente di Flutiformo®
non permetta un controllo adeguato dell’asma, prendendo in considerazione l’introduzione di terapie corticosteroidee aggiuntive.
Una volta ottenuto il controllo dei sintomi dell’asma, occorre soppesare l’eventualità di ridurre gradualmente la dose di Flutiformo®.
È importante controllare regolarmente i pazienti durante la riduzione della terapia. Flutiformo® deve essere utilizzato alla dose minima efficace (vedere paragrafo 4.2). Dato il rischio di
esacerbazione, nei pazienti con asma il trattamento con Flutiformo® non deve essere interrotto bruscamente bensì sospeso
gradualmente sotto la supervisione del medico prescrittore. Un’esacerbazione dei sintomi clinici dell’asma può essere provocata da
un’infezione batterica acuta del tratto respiratorio che necessita
di una terapia antibiotica appropriata, con un aumento della dose
dei corticosteroidi per via inalatoria e un breve ciclo di corticosteroidi orali. Come farmaco di emergenza va utilizzato un broncodilatatore per via inalatoria a rapida insorgenza d’azione. Come tutti
i medicinali contenenti corticosteroidi, Flutiformo® deve essere
somministrato con cautela a pazienti con tubercolosi polmonare,
tubercolosi quiescente o infezioni delle vie aeree di origine micotica, virale o di altro tipo. Tali infezioni devono sempre essere adeguatamente trattate se si utilizza Flutiformo®. Occorre cautela nel
somministrare Flutiformo® a pazienti con tireotossicosi, feocromocitoma, diabete mellito, ipokaliemia non corretta o pazienti con
predisposizione a bassi livelli sierici di potassio, a cardiomiopatia
ostruttiva ipertrofica, stenosi aortica sottovalvolare idiopatica, ipertensione grave, aneurismi o altri gravi disturbi cardiovascolari come
cardiopatia ischemica, aritmie cardiache o grave insufficienza cardiaca. Dosi elevate di b2-agonisti possono provocare un’ipokaliemia potenzialmente grave. La somministrazione concomitante di
b2-agonisti e farmaci in grado di indurre o potenziare un effetto
ipokaliemico, p.es. derivati della xantina, steroidi e diuretici, può
potenziare un possibile effetto ipokaliemico del b2-agonista. Si
raccomanda particolare cautela con l’uso variabile di broncodila-
tatori di emergenza in quadri di asma instabile, di asma grave
acuto (poiché l’ipossia può aumentare il rischio associato) e in altre
condizioni accompagnate da una maggiore probabilità di insorgenza di effetti avversi a causa dell’ipokaliemia. In tali circostanze
è opportuno monitorare i livelli sierici di potassio. Occorre cautela
con i pazienti che presentano un prolungamento dell’intervallo
QTc. Formoterolo può indurre un prolungamento dell’intervallo
QTc. Come per tutti i b2-agonisti, occorre valutare l’opportunità
di sottoporre i pazienti diabetici a controlli aggiuntivi della glicemia. Occorre cautela quando si effettua il passaggio alla terapia
con Flutiformo®, in particolare se vi sono motivi per credere che
una precedente terapia steroidea sistemica abbia compromesso la
funzionalità surrenalica. Come per altre terapie inalatorie, dopo
l’assunzione può verificarsi broncospasmo paradosso a causa di
un aumento immediato del respiro sibilante e della dispnea. Il
broncospasmo paradosso risponde a un broncodilatatore a rapida
insorgenza d’azione per via inalatoria e deve essere trattato immediatamente, interrompendo subito la terapia con Flutiformo®,
visitando il paziente e istituendo, se necessario, una terapia alternativa. I corticosteroidi inalatori, in particolare se assunti a dosi
elevate e per periodi protratti, possono provocare effetti sistemici,
con probabilità comunque molto inferiori rispetto ai corticosteroidi
orali. I possibili effetti sistemici includono sindrome di Cushing,
segni Cushingoidi, soppressione surrenalica, ritardo di crescita in
bambini e adolescenti, riduzione della densità minerale ossea, cataratta, glaucoma e, in casi più rari, una serie di effetti psicologici
e comportamentali inclusi iperattività psicomotoria, disturbi del
sonno, ansia, depressione o aggressività (soprattutto nei bambini).
Pertanto è importante controllare regolarmente il paziente e ridurre
la dose di corticosteroidi per via inalatoria alla dose minima che
permette di mantenere un efficace controllo dell’asma. Il trattamento prolungato con corticosteroidi inalatori a dosi elevate può
provocare soppressione surrenalica e crisi surrenalica acuta. Sono
particolarmente a rischio i bambini e gli adolescenti al di sotto dei
16 anni trattati con dosi elevate di fluticasone propionato (tipicamente ≥ 1.000 microgrammi/die). Casi molto rari di soppressione
surrenalica e crisi surrenalica acuta sono stati descritti anche in
pazienti trattati con fluticasone propionato a dosi comprese tra
500 e <1.000 microgrammi. Gli eventi che potrebbero potenzialmente scatenare una crisi surrenalica acuta includono traumi, interventi chirurgici, infezioni o qualsiasi rapida riduzione del
dosaggio. I sintomi di presentazione sono tipicamente vaghi e possono comprendere anoressia, dolore addominale, calo ponderale,
stanchezza, cefalea, nausea, vomito, ipotensione, riduzione dello
stato di coscienza, ipoglicemia e crisi convulsive. In periodi di stress
o in caso di intervento chirurgico d’elezione occorre valutare l’opportunità di somministrare un trattamento aggiuntivo con corticosteroidi sistemici. I benefici di fluticasone propionato per via
inalatoria dovrebbero minimizzare la necessità di assumere steroidi
orali, ma i pazienti che passano dagli steroidi orali a fluticasone
propionato possono essere a rischio di compromissione della riserva surrenalica per lungo tempo. Anche i pazienti che in passato
hanno già avuto bisogno di una terapia corticosteroidea di emergenza ad alte dosi possono essere a rischio. Questa possibile compromissione deve sempre essere tenuta presente in situazioni di
urgenza ed elettive che possono provocare stress e occorre valutare
l’opportunità di un trattamento corticosteroideo appropriato. A seconda dell’entità della compromissione surrenalica può essere necessario un consulto specialistico prima di sottoporre il paziente a
procedure elettive. Con una possibile compromissione della funzionalità surrenalica occorre monitorare regolarmente il funzionamento dell’asse ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA).
La somministrazione combinata di fluticasone propionato con potenti inibitori del CYP3A4 comporta un maggior rischio di effetti
indesiderati sistemici (vedere paragrafo 4.5). Occorre richiamare
l’attenzione del paziente sul fatto che questo inalatore contenente
un prodotto di combinazione a dose fissa è una terapia profilattica
e come tale deve essere utilizzato regolarmente, anche in assenza
di sintomi, per trarne un beneficio ottimale. L’uso di un distanziatore può comportare un possibile aumento nei depositi polmonari
e un potenziale aumento dell’assorbimento sistemico e di eventi
avversi sistemici. Poiché le frazioni di fluticasone e formoterolo che
raggiungono la circolazione sistemica sono eliminate principalmente per via epatica, è possibile attendersi un aumento dell’esposizione nei pazienti con grave insufficienza epatica. I pazienti
devono essere avvisati che Flutiformo® contiene una piccola quantità di etanolo (circa 1,00 mg per erogazione) che tuttavia è irrisoria e non pone rischi per la loro salute.
Popolazione pediatrica
Si raccomanda di monitorare regolarmente la statura dei bambini
che ricevono un trattamento con corticosteroidi per via inalatoria
protratto nel tempo. In caso di rallentamento della crescita, è necessario rivedere la terapia allo scopo di ridurre la dose dei corticosteroidi inalatori, se possibile, alla dose minima che permette di
mantenere un efficace controllo dell’asma. Va inoltre valutata l’eventualità di indirizzare il paziente a un pediatra specialista in disturbi respiratori.
Sono disponibili solo dati limitati sull’impiego di Flutiformo® in bambini al di sotto dei 12 anni.
Si raccomanda di NON utilizzare Flutiformo® in bambini al
di sotto dei 12 anni fino a quando non saranno disponibili
ulteriori dati.
4.5 Interazioni con altri medicinali
ed altre forme di interazione
Non sono stati effettuati studi formali di interazione con Flutiformo®.
Flutiformo® contiene sodio cromoglicato a livelli non farmacologicamente rilevanti. I pazienti non devono sospendere eventuali farmaci contenenti cromoglicato. Fluticasone propionato, uno dei
principi attivi di Flutiformo®, è un substrato del CYP3A4. La co-somministrazione di potenti inibitori del CYP3A4 (p.es. ritonavir, atazanavir, claritromicina, indinavir, itraconazolo, nelfinavir, saquinavir,
ketoconazolo, telitromicina) e Flutiformo® per brevi periodi di tempo
provoca effetti di rilevanza clinica secondaria, ma occorre cautela in
caso di trattamento a lungo termine evitando, se possibile, la cosomministrazione con tali farmaci. Occorre in particolare evitare la
somministrazione concomitante con ritonavir a meno che i benefici
siano superiori al maggior rischio di effetti indesiderati sistemici associato ai glucocorticoidi. Non vi sono dati su questa interazione per
il fluticasone propionato per via inalatoria, ma si prevede un marcato
aumento dei livelli plasmatici di fluticasone propionato. Sono stati
segnalati casi di sindrome di Cushing e di soppressione surrenalica.
Le alterazioni del tracciato ECG e/o l’ipokaliemia che possono derivare dalla somministrazione di diuretici non risparmiatori di potassio
(come i diuretici d’ansa o tiazidici) possono essere aggravate in misura acuta dai b-agonisti, in particolare se si supera la dose raccomandata di questi farmaci. Benché la rilevanza clinica di questi effetti
sia sconosciuta, si consiglia cautela nella somministrazione concomitante di b-agonisti e diuretici non risparmiatori di potassio. I derivati della xantina e i glucocorticosteroidi possono potenziare il
possibile effetto ipokaliemico dei b-agonisti. Inoltre, L-dopa, L-tiroxina, ossitocina e alcol possono compromettere la tolleranza cardiaca ai b2-simpaticomimetici. Il trattamento concomitante con
inibitori delle monoaminossidasi, compresi agenti con proprietà simili
come furazolidone e procarbazina, può provocare reazioni ipertensive. I pazienti sottoposti ad anestesia concomitante con idrocarburi
alogenati sono esposti a un alto rischio di aritmie. L’uso concomitante di altri farmaci b-adrenergici può avere un effetto potenzialmente additivo. L’ipokaliemia può aumentare il rischio di aritmie in
pazienti trattati con glicosidi digitalici. Come altri b2-agonisti, formoterolo fumarato deve essere somministrato con estrema cautela
a pazienti trattati con antidepressivi triciclici o inibitori delle monoaminossidasi, sia durante il periodo di trattamento che nelle due settimane successive alla sua sospensione, o con altri farmaci che
prolungano l’intervallo QTc come antipsicotici (incluse le fenotiazine),
chinidina, disopiramide, procainamide e antistaminici. I farmaci di
cui è noto l’effetto di prolungamento dell’intervallo QTc possono aumentare il rischio di aritmie ventricolari (vedere paragrafo 4.4). Qualora sia necessario somministrare per qualsiasi via farmaci
adrenergici aggiuntivi, occorre procedere con cautela in quanto possono potenziare gli effetti farmacologicamente prevedibili di formoterolo a carico del sistema nervoso simpatico. La somministrazione
concomitante di antagonisti dei recettori beta-adrenergici (b-bloccanti) e formoterolo fumarato può avere un effetto di inibizione reciproca sull’azione dei due farmaci. I beta-bloccanti possono inoltre
provocare un quadro di grave broncospasmo in pazienti asmatici.
Pertanto, in questa popolazione non devono essere usati. È importante notare che i b-bloccanti sono contenuti nei colliri per il trattamento del glaucoma. Tuttavia, in determinate circostanze, p.es. come
profilassi in seguito a infarto del miocardio, è possibile che non vi
siano altre alternative accettabili. In questo caso si potrebbe valutare
un trattamento con b-bloccanti cardioselettivi, benché la loro somministrazione richieda cautela.
4.6 Fertilità, gravidanza e allattamento
Gravidanza
I dati relativi all’uso di fluticasone propionato e formoterolo fumarato, somministrati sia singolarmente che in associazione ma in inalatori separati, o di questo prodotto di combinazione a dose fissa,
Flutiformo®, in donne in gravidanza sono in numero limitato. Gli
studi sugli animali hanno mostrato una tossicità riproduttiva (vedere
paragrafo 5.3). La somministrazione di Flutiformo® durante la gravidanza non è raccomandata e deve essere presa in considerazione
solo se il beneficio previsto per la madre è superiore ai possibili rischi
per il feto. In tal caso, si deve usare la dose minima efficace che permette di mantenere un adeguato controllo dell’asma. Visto il potenziale di interferenza dei b-agonisti con la contrattilità uterina, l’uso
di Flutiformo® per la gestione dell’asma durante il travaglio da parto
deve essere limitato alle pazienti per le quali il beneficio risulta superiore ai rischi.
Allattamento
Non è noto se fluticasone propionato o formoterolo fumarato vengano
escreti nel latte materno. Il rischio per i lattanti non può essere escluso.
Pertanto occorre decidere se interrompere l’allattamento o la somministrazione di Flutiformo®/astenersi dalla terapia con Flutiformo® tenendo
in considerazione il beneficio dell’allattamento per il bambino e quello
del trattamento per la madre.
Fertilità
Non vi sono dati relativi agli effetti della somministrazione di Flutiformo® sulla fertilità. Negli studi sugli animali non sono emersi effetti sulla fertilità in seguito alla somministrazione individuale dei
due principi attivi a dosi clinicamente rilevanti (vedere paragrafo 5.3).
4.7 Effetti sulla capacità di guidare veicoli
e sull’uso di macchinari
Flutiformo® non altera o altera in modo trascurabile la capacità di
guidare veicoli o di usare macchinari.
4.8 Effetti indesiderati
Gli effetti indesiderati associati all’uso di Flutiformo® durante lo sviluppo
clinico sono riportati nella tabella seguente, elencati per classe sistemicoorganica e classificati in base alle seguenti categorie di frequenza: molto
comune (≥1/10); comune (da ≥1/100 a <1/10); non comune (da
≥1/1.000 a <1/100); rara (da ≥1/10.000 a <1/1.000), molto rara
(<1/10.000) e non nota (la frequenza non può essere definita sulla base
dei dati disponibili).
All’interno di ciascuna classe di frequenza, gli effetti indesiderati
sono riportati in ordine decrescente di gravità.
Classe sistemico-organica
Evento avverso
Frequenza
Infezioni e infestazioni
Candidosi orale
Sinusite acuta
Rara
Disturbi del metabolismo
e della nutrizione
Iperglicemia
Non comune
Disturbi psichiatrici
Sogni anomali
Agitazione
Insonnia
Rara
Iperattività psicomotoria, ansia, Non nota
depressione, aggressione,
modificazioni comportamentali
(prevalentemente nei bambini)
Patologie del sistema nervoso
Cefalea
Tremore
Capogiri
Disgeusia
Non comune
Patologie dell’orecchio
e del labirinto
Vertigini
Rara
Patologie cardiache
Palpitazioni
Extrasistolia ventricolare
Non comune
Angina pectoris
Tachicardia
Rara
Patologie vascolari
Ipertensione
Rara
Patologie respiratorie,
toraciche e mediastiniche
Esacerbazione dell’asma
Disfonia
Irritazione della gola
Non comune
Dispnea
Tosse
Rara
Secchezza delle fauci
Non comune
Diarrea
Dispepsia
Rara
Patologie della cute
e del tessuto sottocutaneo
Rash
Rara
Patologie
del sistema muscoloscheletrico
e del tessuto connettivo
Spasmi muscolari
Rara
Patologie sistemiche
e condizioni relative alla sede
di somministrazione
Edema periferico
Non comune
Astenia
Rara
Patologie gastrointestinali
Come per altre terapie inalatorie, può insorgere broncospasmo paradosso con un aumento immediato del respiro sibilante e della dispnea
dopo la somministrazione. Il broncospasmo paradosso, che risponde
a un broncodilatatore per via inalatoria a rapida insorgenza d’azione,
deve essere trattato immediatamente, la terapia con Flutiformo® deve
essere sospesa e il paziente deve essere visitato istituendo, se necessario, una terapia alternativa. Poiché Flutiformo® contiene sia fluticasone propionato che formoterolo fumarato, si può verificare lo stesso
quadro di effetti indesiderati osservato in relazione ai due principi attivi.
Gli effetti indesiderati elencati di seguito sono associati a fluticasone
propionato e formoterolo fumarato, ma non sono stati riscontrati durante lo sviluppo clinico di Flutiformo®. Fluticasone propionato: reazioni
di ipersensibilità tra cui orticaria, prurito, angioedema (soprattutto facciale e orofaringeo), reazioni anafilattiche. Possono manifestarsi effetti
sistemici dei corticosteroidi per via inalatoria, in particolare se somministrati a dosi elevate e per periodi di tempo prolungati, che includono
sindrome di Cushing, segni Cushingoidi, soppressione surrenalica, ritardo di crescita in bambini e adolescenti, riduzione della densità minerale ossea, cataratta e glaucoma, disturbi del sonno, contusioni,
atrofia cutanea e predisposizione alle infezioni. La capacità di adattamento allo stress può risultare compromessa. Tuttavia, questi effetti
sistemici si verificano con probabilità molto inferiori in seguito a terapia
con corticosteroidi inalatori rispetto a corticosteroidi orali. Il trattamento protratto nel tempo con dosi elevate di corticosteroidi inalatori
può portare a una soppressione surrenalica clinicamente significativa
con crisi surrenalica acuta. Durante periodi di stress (traumi, interventi
chirurgici, infezioni) può essere necessaria una copertura aggiuntiva
con corticosteroidi sistemici. Formoterolo fumarato: reazioni di ipersensibilità (tra cui ipotensione, orticaria, edema angioneurotico, prurito,
esantema), prolungamento dell’intervallo QTc, ipokaliemia, nausea,
mialgia, aumento dei livelli ematici di lattato. Il trattamento con b2agonisti come formoterolo può provocare un aumento dei livelli ematici di insulina, di acidi grassi liberi, di glicerolo e di corpi chetonici.
Reazioni di ipersensibilità sono state osservate in pazienti che utilizzano farmaci con sodio cromoglicato per via inalatoria come principio
attivo. Benché il sodio cromoglicato sia un eccipiente di Flutiformo® e
sia presente solo in bassa concentrazione, non è noto se le reazioni di
ipersensibilità siano dipendenti dalla dose. Nell’eventualità poco probabile che Flutiformo® provochi una reazione da ipersensibilità, il trattamento deve basarsi sulle raccomandazioni standard per le reazioni
da ipersensibilità, con l’uso di antistaminici e altre terapie al bisogno.
È possibile che Flutiformo® debba essere sospeso immediatamente instaurando, se necessario, una terapia alternativa per l’asma. Disfonia
e candidosi orale possono essere attenuati con gargarismi o risciacqui
della bocca con acqua o lavandosi i denti dopo aver usato il prodotto.
La candidosi sintomatica può essere trattata con una terapia antimicotica topica continuando il trattamento con Flutiformo®.
4.9 Sovradosaggio
Non sono disponibili dati ottenuti da studi clinici sul sovradosaggio
di Flutiformo®. Tuttavia, di seguito vengono riportati i dati sul sovradosaggio dei singoli principi attivi.
Formoterolo fumarato
Un sovradosaggio di formoterolo provocherebbe probabilmente
un’esagerazione degli effetti tipici dei b2-agonisti. In tal caso potrebbero verificarsi le seguenti reazioni avverse: angina, ipertensione
o ipotensione, palpitazioni, tachicardia, aritmia, prolungamento dell’intervallo QTc, cefalea, tremore, nervosismo, crampi muscolari, secchezza delle fauci, insonnia, spossatezza, senso di malessere,
convulsioni, acidosi metabolica, ipokaliemia, iperglicemia, nausea e
vomito. Il trattamento di un sovradosaggio di formoterolo prevede
la sospensione del farmaco e l’istituzione di un’adeguata terapia sintomatica e/o di supporto. Può essere preso in considerazione un uso
prudente di b-bloccanti cardioselettivi, tenendo presente il rischio di
broncospasmo associato a tali farmaci. Non vi sono evidenze sufficienti per stabilire se la dialisi possa avere effetti positivi in caso di
sovradosaggio di formoterolo. Si raccomanda di sottoporre il paziente a monitoraggio cardiaco. Qualora sia necessario sospendere
la terapia con Flutiformo® a causa di un sovradosaggio del b-agonista contenuto nel medicinale, si deve prendere in considerazione
un’adeguata terapia steroidea sostitutiva. Occorre monitorare i livelli
sierici di potassio in quanto può insorgere ipokaliemia e valutare
eventualmente una terapia sostitutiva con potassio.
Fluticasone propionato
Un sovradosaggio acuto di fluticasone propionato non costituisce in
genere un problema clinico. L’unico effetto dannoso provocato dall’inalazione di una dose elevata di farmaco in un breve periodo di
tempo è la soppressione della funzione dell’asse ipotalamo-ipofisisurrene (HPA) che generalmente si normalizza nell’arco di alcuni
giorni, come documentato dalle misurazioni dei livelli di cortisolo
plasmatico. Il trattamento con il corticosteroide inalatorio deve proseguire alla dose raccomandata per garantire il controllo dell’asma.
Sono stati riferiti rari casi di crisi surrenalica acuta. Sono particolarmente a rischio i bambini e gli adolescenti al di sotto dei 16 anni
trattati con dosi elevate di fluticasone propionato (tipicamente ≥
1.000 microgrammi/die). I sintomi di presentazione possono essere
vaghi (anoressia, dolore addominale, calo ponderale, stanchezza, cefalea, nausea, vomito e ipotensione). I sintomi tipici di una crisi surrenalica comprendono una riduzione dello stato di coscienza,
ipoglicemia e/o crisi convulsive. L’uso cronico di dosi molto elevate
può provocare atrofia della corteccia surrenale con soppressione
dell’asse HPA. Può essere necessario monitorare la riserva surrenalica. I possibili effetti sistemici includono sindrome di Cushing, segni
Cushingoidi, soppressione surrenalica, ritardo di crescita in bambini
e adolescenti, riduzione della densità minerale ossea, cataratta e
glaucoma (vedere paragrafo 4.4). Nell’ambito della gestione di un
sovradosaggio cronico, in situazioni di stress può essere necessario
somministrare corticosteroidi per via orale o sistemica. Tutti i pazienti
considerati in sovradosaggio cronico devono essere trattati come se
fossero dipendenti dagli steroidi somministrando loro una dose di
mantenimento adeguata di un corticosteroide sistemico. Una volta
stabilizzati, occorre continuare la terapia con un corticosteroide inalatorio alla dose raccomandata per ottenere il controllo dei sintomi.
5. PROPRIETÀ FARMACOLOGICHE
5.1 Proprietà farmacodinamiche
Categoria farmacoterapeutica: Formoterolo e altri medicinali per le
malattie ostruttive delle vie respiratorie.
Codice ATC: R03AK07
Meccanismo di azione ed effetti farmacodinamici
Flutiformo® contiene sia fluticasone propionato che formoterolo fumarato
i cui meccanismi d’azione sono descritti separatamente di seguito. Questi
farmaci appartengono a due classi differenti (uno è un corticosteroide
sintetico, l’altro un agonista selettivo del recettore b2-adrenergico a lunga
durata d’azione) e, come per altre combinazioni di corticosteroidi inalatori
e agonisti b2-adrenergici a lunga durata d’azione, si osservano effetti additivi in termini di riduzione delle esacerbazioni asmatiche.
Fluticasone propionato è un glucocorticoide sintetico trifluorurato
che, per via inalatoria, esercita una potente azione antinfiammatoria
sui polmoni. Fluticasone propionato riduce i sintomi e le esacerbazioni dell’asma ed è associato a un numero inferiore di effetti avversi
rispetto ai corticosteroidi sistemici.
Formoterolo fumarato è un agonista selettivo del recettore b2-adrenergico a lunga durata d’azione. Se inalato, svolge localmente nei
polmoni un’azione broncodilatatoria. L’effetto broncodilatatorio insorge rapidamente, nell’arco di 1-3 minuti e dura almeno 12 ore
dopo una dose singola.
Flutiformo®
In studi clinici della durata di 12 settimane condotti su adulti e
adolescenti l’aggiunta di formoterolo a fluticasone propionato ha
migliorato i sintomi asmatici e la funzionalità polmonare, riducendo
le esacerbazioni. L’effetto terapeutico di Flutiformo® è risultato superiore a quello del solo fluticasone propionato. Non esistono dati
comparativi a lungo termine su Flutiformo® vs. fluticasone propionato. In uno studio clinico di 8 settimane su Flutiformo® l’effetto
del medicinale sulla funzionalità polmonare è stato quantomeno
pari a quello della combinazione di fluticasone propionato e formoterolo fumarato somministrati in due differenti inalatori. Non
sono disponibili dati comparativi a lungo termine su Flutiformo®
vs. fluticasone propionato e formoterolo fumarato. Gli studi clinici
con durata fino a 12 mesi, condotti su pazienti adulti e adolescenti,
non hanno evidenziato segni di attenuazione degli effetti terapeutici di Flutiformo®. Sono emersi trend dose-risposta per Flutiformo®
per gli endpoint basati sui sintomi, con benefici incrementali per
le dosi elevate rispetto alle basse più probabili nei pazienti con
asma più grave.
Popolazione pediatrica
In uno studio della durata di 12 settimane su pazienti pediatrici, con
una fase di estensione di 6 mesi tesa a valutare la sicurezza a lungo
termine, 210 bambini nella fascia d’età 4-12 anni sono stati trattati
con una dose di mantenimento di Flutiformo® (2 inalazioni di 50/5
microgrammi due volte al giorno) o con un comparatore a combinazione fissa. Durante le 12 settimane dello studio la funzionalità polmonare dei bambini trattati con Flutiformo® è risultata quantomeno
identica a quella dei bambini trattati con il comparatore. Dopo lo
studio principale era possibile partecipare a una fase di estensione
di 6 mesi, completata da 205 pazienti trattati con Flutiformo®, durante la quale il farmaco è risultato sicuro e ben tollerato.
5.2 Proprietà farmacocinetiche
Assorbimento
L’assorbimento sistemico di fluticasone propionato assunto per via
inalatoria avviene principalmente attraverso i polmoni e mostra una
correlazione lineare con la dose nell’intervallo di 500-2.000 microgrammi. L’assorbimento è inizialmente rapido, poi prolungato. Gli
studi pubblicati sul dosaggio orale del farmaco approvato vs. non
approvato hanno dimostrato che la biodisponibilità assoluta sistemica orale di fluticasone propionato è trascurabile (<1%) per la combinazione di due fattori: un assorbimento incompleto dal tratto
gastrointestinale e un esteso metabolismo di primo passaggio.
Distribuzione
Fluticasone propionato assunto per via endovenosa è ampiamente
distribuito nell’organismo. La fase iniziale di eliminazione è rapida e
coerente con la sua elevata solubilità lipidica e la capacità di legame
tissutale. Il volume di distribuzione corrisponde mediamente a 4,2
l/kg. La percentuale di fluticasone propionato legato alle proteine
plasmatiche umane è in media del 91%. Fluticasone propionato presenta un legame debole e reversibile con gli eritrociti e non è legato
in misura significativa alla transcortina umana.
Metabolismo
Fluticasone propionato presenta un’elevata clearance totale (media:
1.093 ml/min), di cui la clearance renale rappresenta meno dello
0,02%. Questo tasso molto elevato indica un’ampia clearance epatica. L’unico metabolita circolante rilevato nell’uomo è il derivato
acido 17b-carbossilico di fluticasone propionato, formato mediante
la via della sottofamiglia dell’isoforma 3A4 del citocromo P450
(CYP3A4). Rispetto al composto parentale questo metabolita presenta in vitro un’affinità inferiore (ca. 1/2.000) per il recettore glucocorticoide del citosol polmonare nell’uomo. Altri metaboliti rilevati
in vitro da colture cellulari di epatoma umano non sono stati riscontrati nell’uomo.
Eliminazione
L’87-100% di una dose orale viene escreto nelle feci, fino al 75%
come composto parentale. È inoltre presente un metabolita maggiore
non attivo. Fluticasone propionato somministrato per via endovenosa
mostra una cinetica con andamento poliesponenziale e ha un’emivita
terminale di circa 7,8 ore. Una percentuale inferiore al 5% di una dose
radiomarcata è escreta nelle urine sotto forma di metaboliti, il resto
viene escreto nelle feci come composto parentale e metaboliti.
I dati sulla farmacocinetica plasmatica di formoterolo sono stati raccolti su volontari sani in seguito all’inalazione di dosi superiori al-
l’intervallo raccomandato e su pazienti con BPCO in seguito all’inalazione di dosi terapeutiche.
Assorbimento
In volontari sani che hanno inalato una singola dose da 120 microgrammi, formoterolo fumarato è stato assorbito rapidamente nel plasma e ha raggiunto la concentrazione massima di 91,6 pg/ml entro 5
minuti dall’inalazione. In pazienti con BPCO trattati per 12 settimane
con formoterolo fumarato alla dose di 12 o 24 mg due volte al giorno
sono state osservate concentrazioni plasmatiche in intervalli compresi
tra 4,0 e 8,9 pg/ml e 8,0 e 17,3 pg/ml rispettivamente a 10 minuti e
a 2 e 6 ore post-inalazione. Studi sull’escrezione urinaria cumulativa
di formoterolo e/o dei suoi enantiomeri RR e SS hanno evidenziato un
aumento lineare dell’assorbimento correlato alla dose in seguito a inalazione di polvere secca (12-96 microgrammi) o erogazione di formulazioni aerosol (12-96 microgrammi). Dopo 12 settimane di
somministrazione di formoterolo in polvere alla dose di 12 o 24 microgrammi due volte al giorno, l’escrezione urinaria di formoterolo immodificato è aumentata del 63-73% in pazienti adulti con asma, del
19-38% in pazienti adulti con BPCO e del 18-84% in pazienti pediatrici. Questo dato è indicativo di un accumulo modesto e autolimitante
di formoterolo nel plasma in seguito a somministrazione ripetuta.
Distribuzione
Formoterolo ha una capacità di legame con le proteine plasmatiche
del 61-64% (del 34% prevalentemente con l’albumina). Non si osserva saturazione dei siti di legame nell’intervallo di concentrazione
raggiunto con le dosi terapeutiche. Le concentrazioni di formoterolo
utilizzate per valutare la capacità di legame con le proteine plasmatiche sono risultate superiori a quelle osservate nel plasma in seguito
all’inalazione di una dose singola da 120 microgrammi.
Metabolismo
L’eliminazione di formoterolo avviene principalmente attraverso il
metabolismo. La glucuronidazione diretta è la principale via di biotrasformazione, un’altra via è la O-demetilazione seguita da un’ulteriore glucuronidazione. Le vie minori di eliminazione includono la
solfoconiugazione e la deformilazione seguita da solfoconiugazione.
Isoenzimi multipli catalizzano la glucuronidazione (UGT1A1, 1A3,
1A6, 1A7, 1A8, 1A9, 1A10, 2B7 e 2B15) e la O-demetilazione (CYP
2D6, 2C19, 2C9 e 2A6) di formoterolo, pertanto formoterolo presenta un basso potenziale di interazione metabolica con altri farmaci.
A concentrazioni terapeuticamente rilevanti il farmaco non ha inibito
gli isoenzimi del citocromo P450. Formoterolo presenta un profilo
cinetico simile dopo somministrazione singola e ripetuta, il che indica
l’assenza di autoinduzione o di inibizione del metabolismo.
Eliminazione
In pazienti asmatici e pazienti con BPCO trattati per 12 settimane
con formoterolo fumarato alla dose di 12 o 24 microgrammi due
volte al giorno, rispettivamente il 10% e il 7% circa della dose sono
stati recuperati nelle urine come formoterolo immodificato. Questa
percentuale è risultata pari al 6% circa della dose in pazienti pediatrici asmatici che hanno ricevuto più dosi da 12 o 24 microgrammi.
Gli enantiomeri RR e SS rappresentano rispettivamente il 40% e il
60% del recupero urinario di formoterolo immodificato in seguito
alla somministrazione di dosi singole (12-120 microgrammi) a volontari sani e di dosi singole e ripetute a pazienti asmatici. Dopo una
singola dose orale di 3H-formoterolo, il 59-62% della dose è stato
recuperato nelle urine e il 32-34% nelle feci. La clearance renale di
formoterolo è pari a 150 ml/min. In seguito a inalazione, i dati sul
profilo cinetico plasmatico e sulla velocità di escrezione urinaria di
formoterolo in volontari sani indicano un’eliminazione bifasica, con
emivite terminali pari rispettivamente a 13,9 e 12,3 ore per gli enantiomeri RR e SS. Il picco di escrezione viene raggiunto rapidamente,
entro 1,5 ore. Il 6,4-8% circa della dose è stato recuperato nelle
urine sotto forma di formoterolo immodificato, con gli enantiomeri
RR e SS responsabili rispettivamente del 40% e del 60%.
Flutiformo® (combinazione di fluticasone propionato/formoterolo
fumarato)
Una serie di studi ha indagato le caratteristiche farmacocinetiche di fluticasone propionato e formoterolo fumarato valutati individualmente rispetto alla loro associazione in Flutiformo®, somministrati sia
separatamente che in combinazione. Questi studi presentano tuttavia
un’elevata variabilità inter- e intrastudio. In generale emerge una tendenza
che indica che l’esposizione sistemica a fluticasone e formoterolo in combinazione fissa è inferiore a quella dei due componenti individuali somministrati in combinazione. Non è stata dimostrata l’equivalenza
farmacocinetica tra Flutiformo® e i suoi componenti individuali. Non sono
disponibili dati comparativi a lungo termine su Flutiformo® vs. fluticasone
propionato e formoterolo fumarato (vedere paragrafo 5.1).
Assorbimento
Flutiformo® – fluticasone propionato
In seguito all’inalazione di una singola dose da 250 microgrammi di fluticasone propionato ottenuta da 2 erogazioni di Flutiformo® 125 microgrammi/5 microgrammi in volontari sani è stato osservato un rapido
assorbimento plasmatico, con una concentrazione massima media di
32,8 pg/ml entro 45 minuti dall’inalazione. In pazienti asmatici trattati
con dosi singole di fluticasone propionato ottenuto dall’inalazione di
Flutiformo®, le concentrazioni plasmatiche massime medie di 15,4 pg/ml
e di 27,4 pg/L sono state raggiunte rispettivamente entro 20 minuti e
30 minuti dalla somministrazione di 100 microgrammi/10 microgrammi
(2 erogazioni di Flutiformo® 50 microgrammi/5 microgrammi) e di 250
microgrammi/10 microgrammi (2 erogazioni di Flutiformo® 125 microgrammi/5 microgrammi). In studi che hanno valutato la somministrazione
di dosi multiple a volontari sani, con dosi di Flutiformo® pari a 100 microgrammi/10 microgrammi, 250 microgrammi/10 microgrammi e 500
microgrammi/20 microgrammi sono state raggiunte concentrazioni plasmatiche massime medie di fluticasone pari rispettivamente a 21,4, 25,934,2 e 178 pg/ml. I dati relativi alle dosi da 100 microgrammi/10
microgrammi e 250 microgrammi/10 microgrammi sono stati generati
utilizzando un nebulizzatore privo di distanziatore, quelli relativi alla dose
da 500 microgrammi/20 microgrammi sono stati generati utilizzando
un nebulizzatore dotato di distanziatore. In volontari sani l’uso di un distanziatore AeroChamber Plus® aumenta la biodisponibilità sistemica
media di fluticasone (equivalente all’assorbimento polmonare) del 35%
rispetto alla somministrazione di Flutiformo® mediante un dispositivo
pMDI privo di distanziatore. In volontari sani l’uso di un distanziatore
AeroChamber Plus® diminuisce la biodisponibilità sistemica media di
formoterolo del 25% rispetto alla somministrazione di Flutiformo® mediante un dispositivo pMDI privo di distanziatore. Ciò è probabilmente
dovuto a una riduzione dell’assorbimento gastrointestinale con l’utilizzo
del distanziatore, che compensa il previsto aumento corrispondente
nell’assorbimento polmonare.
Flutiformo® - formoterolo fumarato
In seguito alla somministrazione di una dose singola di Flutiformo®
a volontari sani, una dose da 20 microgrammi di formoterolo fumarato ottenuta con 2 erogazioni di Flutiformo® 250 microgrammi/10
microgrammi ha prodotto una concentrazione plasmatica massima
media di 9,92 pg/ml entro 6 minuti dall’inalazione. Con dosi multiple
di 20 microgrammi di formoterolo fumarato ottenuti con 2 erogazioni di Flutiformo® 250 microgrammi/10 microgrammi è stata raggiunta una concentrazione plasmatica massima media di 34,4 pg/ml.
Distribuzione
Non esistono attualmente dati sulla capacità di legame con le proteine plasmatiche specifici per fluticasone propionato o formoterolo
fumarato contenuti in Flutiformo®.
Metabolismo
Non esistono attualmente dati sul metabolismo di fluticasone propionato o formoterolo fumarato rispetto all’inalazione di Flutiformo®.
Eliminazione
Fluticasone propionato assunto con l’inalazione di 2 erogazioni di
Flutiformo® 250 microgrammi/10 microgrammi ha un’emivita terminale di circa 14,2 ore.
Formoterolo fumarato assunto con l’inalazione di 2 erogazioni di
Flutiformo® 250 microgrammi/10 microgrammi ha un’emivita terminale di circa 6,5 ore. Una percentuale inferiore al 2% di una singola dose di formoterolo fumarato inalato con Flutiformo® viene
escreta nelle urine.
5.3 Dati preclinici di sicurezza
La tossicità osservata negli studi sugli animali con formoterolo fumarato e fluticasone propionato, somministrati separatamente o in
combinazione, consiste principalmente in effetti associati a un’attività farmacologica esagerata. Gli effetti sul sistema cardiovascolare
sono correlati alla somministrazione di formoterolo e comprendono
iperemia, tachicardia, aritmie e danno miocardico. La co-somministrazione dei due principi attivi non ha provocato né un aumento
della tossicità né l’insorgenza di reperti inattesi. Gli studi sulla riproduzione condotti con Flutiformo® su ratti e conigli hanno confermato
i noti effetti embrio-fetali dei due componenti individuali, tra cui ritardo di crescita fetale, ossificazione incompleta, letalità embrionale,
palatoschisi, edema e alterazioni scheletriche. Tali effetti sono stati
osservati a esposizioni inferiori a quelle attese usando la dose massima clinica raccomandata. Un’esposizione sistemica molto alta a
formoterolo ha provocato un certo calo della fertilità in ratti maschi.
Test standard in vitro e in vivo condotti individualmente sui due componenti non hanno evidenziato genotossicità. Non sono stati condotti studi sulla cancerogenicità della combinazione. Non è emerso
un potenziale cancerogeno per fluticasone propionato. In seguito
alla somministrazione di formoterolo è stato osservato un lieve aumento nell’incidenza di tumori benigni del tratto riproduttivo nelle
femmine di topo e ratto. Tale riscontro è considerato un effetto di
classe nei roditori esposti, per periodi protratti, a dosi elevate di b2agonisti e non è indicativo di un rischio potenziale di cancerogenicità
nell’uomo. Studi preclinici su HFA 227 non rilevano rischi particolari
per l’uomo sulla base di studi di tossicità a dosi ripetute, genotossicità, cancerogenicità e tossicità della riproduzione.
6. INFORMAZIONI FARMACEUTICHE
6.1 Elenco degli eccipienti
Sodio cromoglicato
Etanolo anidro
Eptafluoropropano HFA 227
6.2 Incompatibilità
Non pertinente.
6.3 Periodo di validità
2 anni. Validità della confezione aperta: 3 mesi dall’apertura della
bustina di alluminio.
6.4 Precauzioni particolari per la conservazione
Conservare a temperatura non superiore a 25°C. Non refrigerare o
congelare. Se l’inalatore viene esposto a temperature vicino allo zero,
occorre avvisare il paziente che deve lasciarlo a temperatura ambiente per 30 minuti e riattivarlo prima dell’uso (vedere paragrafo
4.2). La bomboletta contiene un liquido pressurizzato. Non esporre
a temperature superiori a 50°C. Non forare, rompere o bruciare,
anche se apparentemente vuota.
6.5 Natura e contenuto del contenitore
120 erogazioni per inalatore.
L’erogatore è di colore bianco con un indicatore della dose integrato
di colore grigio e un cappuccio di protezione del boccaglio di colore
grigio chiaro.
La sospensione è contenuta in una bomboletta pressurizzata di alluminio sigillata con una valvola dosatrice standard. La bomboletta
è inserita in un erogatore predosato dotato di copriboccaglio (entrambi in polipropilene) e un indicatore della dose integrato che segnala il numero di erogazioni (puff) rimanenti. Ogni contenitore
eroga 120 dosi. L’inalatore assemblato è avvolto in un foglio laminato di alluminio all’interno di una scatola in cartone.
Confezioni:
1 inalatore (120 erogazioni)
Confezione multipla da 3 inalatori (120 erogazioni).
È possibile che non tutte le confezioni siano commercializzate
6.6 Precauzioni particolari per lo smaltimento
e la manipolazione
Nessuna istruzione particolare.
Per istruzioni dettagliate sull’uso del medicinale vedere paragrafo
4.2 (Posologia e modo di somministrazione).
7. TITOLARE DELL’AUTORIZZAZIONE
ALL’IMMISSIONE IN COMMERCIO
Mundipharma Pharmaceuticals Srl
Via G. Serbelloni, 4 - 20122 Milano, Italia
8. NUMERO(I) DELL’AUTORIZZAZIONE
ALL’IMMISSIONE IN COMMERCIO
AIC n.042294013
Flutiformo 50 microgrammi/5 microgrammi
1 inalatore da 120 erogazioni
AIC n.042294025
AIC n.042294037
AIC n. 042294049
3 inalatori da 120 erogazioni
AIC n. 042294052
3 inalatori da 120 erogazioni
AIC n. 042294064
3 inalatori 120 erogazioni
9. DATA DELLA PRIMA AUTORIZZAZIONE/RINNOVO
DELL’AUTORIZZAZIONE
13/05/2013
10. DATA DI REVISIONE DEL TESTO
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The official Journal of the “Associazione Italiana Allergologi Immunologi Territoriali
e Ospedalieri” (Italian Association of Hospital Allergists and Immunologists - AAITO)
and the “Sociedade Portuguesa de Alergologia e Imnunologia Clinica” (Portuguese Society
of Allergology and Clinical Immunology - SPAIC)
indexed in PubMed and Scopus
collects reviews, original works and case reports concerning etiology,
diagnosis and treatment of allergic and immunological disorders
includes a section of information coming
from the main international health associations and authorities.
Indicato SOLO negli adulti, al di sopra dei 18 anni
1 - Bodzenta-Lukaszyk A et al., Efficacy and safety profile of fluticasone/formoterol combination therapy compared individual components
administered concurrently in asthma: a randomised controlled trial. Curr Med Res Opin. 2013 Feb 20.
2 - Flutiformo® - Riassunto delle caratteristiche di prodotto
3 - Dissanayake S et al., Fluticasone/formoterol: a new single-aerosol combination therapy for patients with asthma.
Respiratory Medicine (2012) 106(S1), S20–S28
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(3)
Issn 1764-1489
Volume 46 N. 5/2014 – September 2014
European Annals
of Allergy and
Clinical Immunology
THE OFFICIAL JOURNAL OF AAITO | ASSOCIAZIONE ITALIANA ALLERGOLOGI IMMUNOLOGI TERRITORIALI E OSPEDALIERI
THE OFFICIAL JOURNAL OF SPAIC | SOCIEDADE PORTUGUESA DE ALERGOLOGIA E IMUNOLOGIA CLINICA
Proteomic analysis of human nasal
mucosa: different expression profile
in rhino-pathologic states
5/2014
Shrimp allergy beyond Tropomyosin
in Italy: clinical relevance of Arginine
Kinase, Sarcoplasmic calcium binding
protein and Hemocyanin
An unusual case of occupational
asthma in a part time magician.
He has got an allergy surprise
from his top hat!
only by Immunoblot
A case of long-undiagnosed
Common Primary Immunodeficiency
in adulthood

complete issue - European Annals of Allergy and Clinical Immunology

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